Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng sinh RHAMNOLIPDS

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN NHẰM NÂNG CAO SẢN LƢỢNG SINH RHAMNOLIPIDS Giáo viên hƣớng dẫn : ThS Nguyễn Ngọc Huyền Sinh viên thực : Nguyễn Thị Mỹ Linh Lớp : CNSH 12-01 HÀ NỘI – 2016 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN NHẰM NÂNG CAO SẢN LƢỢNG SINH RHAMNOLIPIDS Giáo viên hƣớng dẫn : ThS Nguyễn Ngọc Huyền Sinh viên thực : Nguyễn Thị Mỹ Linh Lớp : CNSH 12-01 HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu thực khóa luận tốt nghiệp, em hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp Trong thời gian này, em nhận đƣợc động viên, quan tâm, hƣớng dẫn giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, gia đình bạn bè Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học — Viện Đại học Mở Hà Nội, ngƣời giảng dạy cho em kiến thức hữu ích trình học kiến thức cho sau Em xin gửi lòng cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Ngọc Huyền, ngƣời định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn, bảo tận tình đồng hành giúp đỡ em suốt thời gian làm thực nghiệm viết khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán nhân viên làm việc Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch động viên, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận Và em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành gia đình bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ em nhiều Do thời gian thực khóa luận có hạn nên khóa luận em thiếu sót Em mong đƣợc đóng góp ý kiến thầy cô bạn để khóa luận em đƣợc hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2016 Ngƣời thực Nguyễn Thị Mỹ Linh h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT 1.2 TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPIDS (RL) 1.2.1 Cấu trúc RL 1.2.2 Tính chất RL 1.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp RL 1.2.4 Nguồn thu nhận RL 1.2.5 Các điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp RL 10 1.2.6 Đặc điểm chủng vi sinh vật sinh RL 13 1.2.7 Cơ chế diệt vi sinh vật RL 15 1.2.8 Ứng dụng RL 16 1.2.9 Hƣớng nghiên cứu nâng cao sản lƣợng RL 18 1.3 ĐỘT BIẾN SINH HỌC 19 1.3.1 Khái niệm đột biến sinh học phân loại đột biến 19 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu gây chết tần số phát sinh đột biến 20 1.3.3 Cơ chế đột biến tia cực tím 21 1.3.4 Hệ thống sửa chữa bảo vệ AND 23 1.3.5 Phát đột biến nấm vi khuẩn 26 II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 28 2.1.4 Môi trƣờng 29 Nguyễn Thị Mỹ Linh -i- Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Đột biến tia UV 30 2.2.2 Chọn lọc đột biến dƣơng tính định tính 30 2.2.3 Chọn lọc đột biến dƣơng tính định lƣợng 31 2.2.4 Định lƣợng RL 31 2.2.5 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng 2.2.6 P.Fluorescens HS5 thể đột biến P fluorescens HS5-M19 33 Phân tích trình tự gen 16S- rARN chủng đột biến 33 P.fluorescens HS5-M19 2.2.6.1 Tách chiết ADN tổng số 2.2.6.2 Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN thể đột biến 33 P.fluorescen HS5-M19 kỹ thuật PCR 34 2.2.6.3 Tinh sản phẩm PCR 35 2.2.6.4 Điện di AND gel agarose 36 2.2.6.5 Đọc trình tự đoạn gen chứa vùng gen đặc hiệu 36 2.2.7 Động thái trình tổng hợp RL từ chủng P fluorescens HS5 thể đột biến P fluorescens HS5-M19 37 2.2.8 Kiểm tra tính ổn định thể đột biến P fluorescens HS5-M19 37 2.2.9 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí 37 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Nghiên cứu tạo đột biến chủng P fluorescens HS5 39 3.2 Chọn lọc đột biến dƣơng tính định tính 41 3.3 Chọn lọc đột biến dƣơng tính định lƣợng 43 3.4 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng P.fluorescens HS5 thể đột biến P fluorescens HS5-M19 3.5 3.5.1 Phân tích trình tự gen 16S-rARN thể 45 đột biến P.fluorescens HS5-M19 47 Tách chiết ADN tổng số 47 Nguyễn Thị Mỹ Linh - ii - Lớp: CNSH-1201 h 3.5.2 u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN thể đột biến P.fluorescen HS5-M19 kỹ thuật PCR 48 3.5.3 Trình tự 16S-ARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 48 3.6 Động thái trình tổng hợp RL từ chủng P fluorescens HS5 thể đột biến P fluorescens HS5-M19 51 3.7 Kiểm tra tính ổn định thể đột biến P fluorescens HS5-M19 53 IV KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Nguyễn Thị Mỹ Linh - iii - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT RL Rhamnolipids CHHBM Chất hoạt hóa bề mặt CHHBMHH Chất hoạt hóa bề mặt hóa học CHHBMSH Chất hoạt hóa bề mặt sinh học mN/m Đơn vị đo sức căng bề mặt (milli Newton/mét) MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal inhibition concentration) DPI Phƣơng pháp chiếu trực tiếp (Direct plate irradiation) LPI Phƣơng pháp chiếu dịc lỏng (Liquid plate irradiation) BER Cơ chế cắt sửa bazơ NER Cơ chế cắt sửa nucleotit PRE Enzym quang phục hồi CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide PCR Polymerase Chain Reaction (chuỗi phán ứng polymerase) ADN Acit deoxyribonucleic TAE Tris-acetate bp base pair (cặp bazơ) CFU/ml Số đơn vị khuẩn lạc 1ml mẫu RhlA 3-hydroxyacl-ACP:3hydro-xyacyl-ACP O-3hydroxyacyltransferase RhlB Enzym rhamno-syltransferase I RhlC Enzym rhamno-syltransferase II HAA 3-(3hydroxyalkanoyloxy) SRE Syringomycin E AP Apyrimdin Nguyễn Thị Mỹ Linh - iv - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Cấu trúc RL Hình 1.2 Con đƣờng sinh tổng hợp RL từ Pseudomonas putida Hình 1.3 Hình 1.4 Đặc điểm hình thái chủng Pseudomonas Khuẩn lạc P.fluorescens môi trƣờng KingB phát 13 quang dƣới ánh sáng tia cực tím bƣớc sóng 365nm 14 Biểu đồ ly giải bào tử động Màng tế bào bào tử động giống thành 16 phần phân tử màng tế bào với phân tử RL 16 Hình 1.5.A Hình 1.5.B Hình 1.5.C Cơ chế phân giải bào tử động RL (RL xen vào màng tế bào bào tử động) 16 Hình 1.6 Thymine dirmer đƣợc tạo UV 22 Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 1.9 Hình 2.1 Cơ chế đột biến tia UV Cơ chế quang tái hoạt hóa sửa chữa ADN Sửa chữa sai khác ADN tia UV gây Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan OD490nm lƣợng rhamnose Mật độ tế bào vi khuẩn tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến 22 24 26 tia UV 40 Hình 3.2 Khuẩn lạc môi trƣờng thạch CTAB sau thời gian chiếu tia UV 42 Hình 3.3 Phổ điện di ADN tổng số tách chiết từ thể đột biến Hình 3.1 Hình 3.4 32 P.fluorescens HS5-M19 47 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S-rARN thể 48 đột biến P.fluorescens HS5-M19 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR cặp mồi GF1 GR1 48 Hình 3.6 Trình Tự gen 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 49 Hình 3.7 Mức độ tƣơng đồng di truyền thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 với số chủng vi khuẩn có họ hàng gần gũi 50 Nguyễn Thị Mỹ Linh -v- Lớp: CNSH-1201 h Hình 3.8 u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Sự sai khác sau giải trình tụ 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 so sánh với chủng P.flourescens 51 DVL3A Hình 3.9 Sinh trƣởng khả sinh tổng hợp RL P.flourescens 53 HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 Nguyễn Thị Mỹ Linh - vi - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG Trang 32 34 Bảng 1.1 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Phân loại CHHBMSH Kết OD490 theo lƣợng rhamnose Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.3 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Tỷ lệ sống sót vi khuẩn sau xử lý đột biến tia UV Bảng tổng hợp khả sinh RL thể đột biến 35 40 43 Bảng 3.3 Kết xác định hàm lƣợng RL từ thể đột biến tuyển chọn 43 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 46 Bảng 3.5 Định lƣợng ADN tổng số 49 Bảng 3.6 Sinh trƣởng khả sinh tổng hợp RL P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 Bảng 3.7 Định tính khả sinh tổng hợp RL chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua hệ Bảng 3.8 52 54 Hàm lƣợng RL từ chủng P.flourescens HS5 thể đột biến 55 P.flourescens HS5-M19 qua hệ Nguyễn Thị Mỹ Linh - vii - Lớp: CNSH-1201 h 3.5 u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Phân tích trình tự gen 16S - rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 3.5.1 Tách chiết ADN tổng s Từ khuẩn lạc đặc trƣng thể đột biến Pseudomonas fluorescens HS5–M19, đƣợc tiến hành nuôi cấy tách chiết ADN tổng số sử dụng kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen), sau định lƣợng ADN thu đƣợc cách đo quang phổ máy Biophotometer plus chƣơng trình đo ADN Kết đƣợc trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Định lƣợng ADN tổng số Mẫu Tỉ lệ Tỉ lệ A260/A230 Nông độ ADN (ng/μl) A260/A280 P.fluorescens HS5-M19 1,96 1,89 199 Kết cho thấy ADN tổng số cho số A260/A230 khoảng 1,8-2,0 A260/A230 lớn 1,5 chứng tỏ quy trình tách chiết đảm bảo độ tinh cần thiết Kết thực nghiệm điện di gel agarose 1% cho thấy AND tổng số thu đƣợc từ thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 không bị đứt gãy, băng gọn, Nhƣ chất lƣợng AND đảm bảo độ tinh lƣợng phù hợp cho phân tích PCR Hình 3.3 Phổ điện di ADN tổng số tách chiết từ thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 (chạy lặp lại lần) Nguyễn Thị Mỹ Linh - 47 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội 3.5.2 Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 kỹ thuật PCR Phản ứng PCR đƣợc tiến hành sử dụng ADN tổng số thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 làm sợi khuôn, cặp mồi đặc hiệu GF1, GR1 chu trình nhiệt nhƣ nêu phần phƣơng pháp Kết điện di đồ sản phẩm PCR đƣợc thể hình 3.4 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 Ghi chú: Đƣờng chạy M: thang ADN chuẩn Đƣờng chạy 2: sản phẩm PCR từ ADN tổng số thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 Kết hình 3.4 cho thấy đoạn gen đƣợc nhân lên có kích thƣớc xấp xỉ 1400 bp điều chứng tỏ khuếch đại đƣợc gen 16S-rARN 3.5.3 Trình tự 16S-rARN củ thể đột biến P.f uorescens HS5-M19 Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự máy đọc trình tự gen tự động (ABI Prism 100 Sequencer) Viện Công nghệ sinh học Kết phân tích trình tự cho thấy đoạn gen thu đƣợc thể đột biến P.flourescens HS5-M19 có kích thƣớc 1348bp (hình 3.5) Nguyễn Thị Mỹ Linh - 48 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR cặp mồi GF1 GR1 Ghi chú: + Đƣờng chạy M: thang ADN chuẩn + Đƣờng chạy 2: sản phẩm PCR từ ADN tổng số thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 + Đƣờng chạy 4: sản phẩm PCR từ ADN tổng số thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 sau qua trình tich kit PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen) Hình 3.6 Trình Tự gen 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 Trình tự gen chủng đƣợc đƣa lên Ngân hàng liệu sở GenBank công cụ BLAST NCBI để phân tích Kết định danh, sơ đồ phân loại so sánh sai khác sau giải trình tự 16S-rARN Nguyễn Thị Mỹ Linh - 49 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 với chủng P.fluorescens DVL3A đƣợc thể hình 3.7 hình 3.8 Hình 3.7 Mức độ tƣơng đồng di truyền thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 với số chủng vi khuẩn có họ hàng gần gũi Nguyễn Thị Mỹ Linh - 50 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Hình 3.8 Sự sai khác sau giải trình tụ 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 so sánh với chủng P.flourescens DVL3A Từ kết thu đƣợc kết luận: - Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen 16S-rADN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 sau nhân lên có chiều dài 1348bp trình tự nucleotide có độ tƣơng đồng cao đạt tới 99% so sánh với trình tự đoạn gen chủng P fluorescens đƣợc công bố Ngân hàng Dữ liệu gen Quốc tế 3.6 Động thái trình tổng hợp RL từ chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 Chúng tiến hành lên men P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 điều kiện tƣơng tự nhau: môi trƣờng lên men mNA, Nguyễn Thị Mỹ Linh - 51 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội nhiệt độ 30˚C, tốc độ lắc 180 vòng/phút Động thái sinh trƣởng sinh tổng hợp RL P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 đƣợc biểu bảng 3.6 hình 3.9 Kết thu đƣợc cho thấy có tăng trƣởng chủng đột biến so với chủng tự nhiên Đối với chủng đột biến, tế bào đạt tới pha cân sau 36 lên men Chủng tự nhiên đạt tới pha cân sau 48 lên men Lƣợng RL đƣợc sản xuất từ chủng đột biến đạt tối đa 15,9 g/l sau 60 lên men, chủng tự nhiên 8,5 g/l sau 72 Bảng 3.6 Sinh trƣởng khả sinh tổng hợp RL chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 Thời gian lên men (giờ) P.flourescens HS5 Mật độ tế bào P.flourescens HS5 (cfu/ml) Lƣợng RL (g/l) P.flourescens HS5-M19 Mật độ tế bào P.flourescens HS5M19 (cfu/ml) Lƣợng RL (g/l) 1,30 x 106 0,8 6,00 x 108 0,5 12 2,30 x 106 1,7 7,60 x 109 2,5 24 9,40 x 108 2,9 2,20 x 1010 5,8 36 6,50 x 109 5,1 3,10 x 1010 13,6 48 1,10 x 1010 7,4 2,80 x 1010 15,2 60 1,20 x 1010 8,3 2,90 x 1010 15,9 72 1,05 x 1010 8,5 2,50 x 1010 15,5 84 3,20 x 109 8,3 2,50 x 1010 14,9 96 3,20 x 109 8,35 2,15 x 1010 15,3 Nguyễn Thị Mỹ Linh - 52 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Hình 3.9 Sinh trƣởng khả sinh tổng hợp RL chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5 – M19 3.7 Kiểm tra tính ổn định thể đột biến P.flourescens HS5 – M19 Khả sinh RL chủng đột biến qua hệ đƣợc kiểm tra thí nghiệm định tính môi trƣờng CTAB xác định hàm lƣợng RL môi trƣờng lỏng Từ hệ giống thứ chủng tự nhiên P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 đƣợc cấy truyền liên tiếp nhiều lần môi trƣờng thạch nghiêng NA (từ F1 đến F6) Từ hệ tƣơng ứng đƣợc nhân nuôi môi trƣờng canh thang NB 30˚C 24 Nhỏ 10 µl dịch giống môi trƣờng CTAB Sau ngày qua sát hình thành vùng màu xanh đậm xung quanh giếng môi trƣờng màu xanh nhạt Kết đƣợc trình bày bảng 3.7 Nguyễn Thị Mỹ Linh - 53 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.7 Định tính khả sinh tổng hợp RL chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua hệ Vi sinh vật Thế hệ Đƣờng kính vùng xanh đậm (cm) F1 0,4 F2 0,5 F3 0,4 F4 0,5 F5 0,4 F6 0,4 F1 1,0 F2 1,0 P.flourescens HS5- F3 1,1 M19 F4 1,1 F5 1,0 F6 1,0 P.flourescens HS5 Kết cho thấy khả sinh tổng hợp RL chủng tự nhiên P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua hệ thay đổi, thể qua đƣờng kính vùng xanh đậm tƣơng ứng 0,4 – 0,5 cm 1,0 – 1,1 cm Nhƣ kết luận sơ chủng đột biến có tính ổn định Tuy nhiên khảo sát khả sinh tổng hợp RL qua việc đo đƣờng kính vùng xanh đậm xung quanh khuẩn lạc môi trƣờng màu xanh nhạt mang tính chất định tính Để khẳng định chắn tính ổn định chủng đột biến ta cần khảo sát hàm lƣợng RL môi trƣờng lỏng Giống đƣợc cấy truyền liên tiếp nhiều lần thạch nghiêng NA ta thu đƣợc hệ giống khác Giống hệ đƣợc lên men sinh tổng hợp RL môi trƣờng mNB thời gian ngày Tách chiết RL từ dịch lên men ta thu đƣợc kết sau: Nguyễn Thị Mỹ Linh - 54 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.8 Hàm lƣợng RL từ chủng P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua hệ Vi sinh vật Thế hệ Lƣợng RL (g/l) F1 8,4 F2 8,2 F3 8,2 F4 8,3 F5 8,4 F6 8,4 F1 15,7 F2 15,3 P.flourescens HS5- F3 15,7 M19 F4 15,4 F5 15,6 F6 15,6 P.flourescens HS5 Khả sinh RL từ chủng tự nhiên P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua hệ thay đổi, lƣợng RL tƣơng ứng 8,2 – 8,4 g/l 15,3 – 15,7 g/l Nhìn chung lƣợng RL sau hệ ổn định Do chủng đột biến có tính ổn định Nguyễn Thị Mỹ Linh - 55 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN - Xử lý đột biến chủng tự nhiên P.flourescens HS5 tia UV với tham số sau: 1/ Khoảng cách chiếu: 10 cm; 2/ Thời gian chiếu: 90 giây; 3/ Bƣớc sóng 254 nm - Tỷ lệ sống sót thể đột biến dao động từ 3,3% đến 2,3% sau 90 giây xử lý - Trong 206 thể đột biến có khả sinh RL có 161 thể đột biến có khả sinh RL thấp chủng bố mẹ (chiếm 78,2%), thể đƣờng kính vòng xanh đậm xung quanh khuẩn lạc ≤ 0,4 cm, 45 thể đột biến có khả sinh RL cao chủng bố mẹ (chiếm 21,8%), thể đƣờng kính vòng xanh đậm xung quanh khuẩn lạc ≥ 0,4 cm - Lƣợng RL sinh tổng hợp từ chủng bố mẹ P.flourescens HS5 8,4 g/l, từ 45 thể đột biến dao động từ 8,5 – 15,2 g/l, đa số thể đột biến cho sản lƣợng RL cao chủng bố mẹ không đáng kể, nhiên thể đột biến P.flourescens HS5-M19 có khả sinh tổng hợp RL cao hẳn, đạt 15,2 g/l - Không có khác biệt hình thái khuẩn lạc, tế bào, khả sinh sắc tố flourescin tự nhiên P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5M19 Cả hai chủng phát triển đƣợc nhiệt độ từ 5˚C đến 30˚C, không phát triển 42˚C - Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen 16S-rARN thể đột biến P.fluorescens HS5-M19 sau nhân lên có chiều dài 1348bp trình tự nucleotide có độ tƣơng đồng cao đạt tới 99% so sánh với trình tự đoạn gen chủng P.fluorescens đƣợc công bố Ngân hàng Dữ liệu gen Quốc tế - Thể đột biến P.flourescens HS5-M19 đạt tới pha cân sau 36 lên men chủng tự nhiên P.flourescens HS5 sau 48 lên men Lƣợng RL đƣợc sản xuất từ thể đột biến đạt tối đa 15,9 g/l sau 60 lên men, chủng tự nhiên 8,5 g/l sau 72 - Khả sinh RL từ chủng tự nhiên P.flourescens HS5 thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua hệ thay đổi, lƣợng RL tƣơng ứng 8,5 - 8,4 g/l 15,3 - 15,7 g/l Nhìn chung lƣợng RL sau hệ ổn định Do chủng đột biến có tính ổn định Nguyễn Thị Mỹ Linh - 56 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lại Thúy Hiền (2010) Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học từ vi sinh vật biển số ngành công nghiệp xử lý môi trƣờng Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ đề tài Nguyễn Ngọc Huyền cộng (2016) Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học Syringomycin E (SRE) Rhamnolipid (RL) diệt nấm để bảo quản số trái hạt nông sản Đề tài cấp nhà nƣớc, mã số KC.07.13/11-15 Nguyễn Nhƣ Hiền (2005) Di truyền tế bào Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2012) Nghiên cứu quy trình sản xuất số mẫu chuẩn vi sinh vật quy mô phòng thí nghiệm Đề tài cấp Viện Tài liệu tiếng Anh Abbas, T., Fatemeh, K.and Mahnaz, M A (2004) Improved Production of Rhamnolipids by a Pseudomonas aruginosa Mutant Iranian Biomedical Journal 8(1):25-31 Amhad, M A., Rudolf, H., Francois, L., Markus, M M., Eric, D (2011,J Rhamnolipids: Detection, analysis, Biosynthesis, Genetic Regulation and Bioengineering ot Production Biosurfactants, Microbiology Monographs:13-55 Andreas, W., Till, T., Torsten, T A., Pamela, W., Johannes, H., Carsten, M R W., Benjamin, K., Michaela, Z., Susanne, W., Rudolf, H., Christoph, S., Frank, R.and Lars, M.B (2011) Growth independent rhamnolipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440 Wittgens et al Microbial Cell Factories Banat, I.M., Makkar, R.S and Cameotra, S.S.,( 2000) Potential commercial applications of microbial surfactants, Appl Microbiol Biotechnol 53, 495-508 Nguyễn Thị Mỹ Linh - 57 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội Benincasa, M., Contiero, J., Manresa, M A., Moraes, I O (2002) Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source Journal of Food Engineering 54: 283 – 288 Bayer, M Rosenberg, A Perry, D L gutnick, E Rosenberg and I Ofek (1984).Bacterial adherence to hydrocarbons: a useful technique for studying cell surface hydrophobicity FEMS Microbiol Lett 22:3 289-295 Célia F C da Rosa, M Michelon, , (2010) Production of a rhamnolipidtype biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa LBM10 grown on glycerol 9(53),9012-9017 Desai J D and Banat I M (1997), Microbial production of surfactants and their commercial potential Micro- biol Molecular Biol Rev 61, 47-64 Dilsad, O and Belma, A.(2009) Biosurfactan production in sugar beet molasses by some Pseudomonas sp J Environ.Biol.30(1): 161 – 163 10 Dubois, M., Gilles, K A., Hamilton, J K., Rebers, P A and Smith, F (2013) Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances 11 Giani, C., Main, F., Wullbrandt, D., Taunus, H., Rothert, R., Meiwes, J (1996) Pseudomonas aerugisa and its use in a process for the biotechnological preparation of L-rhamnose United State Patent Patent Number 5,501,966 12 Haba, E., Pinazo, A., Jauregui, O., Espuny, M.J., Infante, M R., Manresa, A (2002) Physico-chemical characterization and antimicrobial propertiest of the rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCBIM 40044 Biotechnology and Bioengineering.Vol.81(3): 316-322 13 Hironobu, I and Tetsuya, O (2011) The Mechanisms of UV Mutagenesis J.Radiat.Res.52: 115-125 14 Kevin, L and Alice, W (2001) UV mutagenesis in Escherichia coli K12: Cell survival and mutation frequency of the chromosomal genes lacZ, Nguyễn Thị Mỹ Linh - 58 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội rpoB, ompF, and ampA Journal of Experimental Microbiology and Immunology (JEMI) 1:32 – 46 15 Luiz, F D et al (2012) Characterization of rhamnolipids produced by wildtype and engineered Burkholderia kururiensis Appl Microbiol Biotechnol 16 Michael, E S et al (1997) Biosurfactants Their Identity and Potential Efficacy in the Biological Control of Zoosporic Plant Pathogens Department of Plant Pathology, University of Arizona, Tucson 17 Milena G R., Gordana, G., Miroslav, M V and Ivanka, K (2012) Production and characterization of rhamnolipids from Pseudomonas aeruginosa san-ai J Serb Chem Soc 77 (1) 27 - 42 18 Mohammed, E B., Saad, M., Mostefa, N., Abdelkarim, T., Hadj, A B and Bouziane, A (2012) Isolation and Comparison of rhamnolipids Production in Pseudomonas aeruginosa P.B:2 and Pseudomonas flourescens P V: 10 Open Access Scientific Reports.1(12): – 19 Mulligan, C N., Cooper, D G And Gibbs, B F (1989) Enhanced biosurfactant production by a mutant Bacillus subtilis strain Appl Microbiol Biotechnol 31: 486-489 20 Nereus W Gunther, IV, Alberto Nuñez, William Fett, and Daniel K Y Solaiman (2004) Production of Rhamnolipids by Pseudomonas chlororaphis, a Nonpathogenic Bacterium, 2288-2293 21 Praveesh, B V., Soniyamby, A R., Mariappa, C., Kavithakumari, P and Palaniswamy, M (2010) Production of Biosurfactant using cashew nut shell liquid as the carbon source from Pseudomonas aeruginosa MTCC 424 Global Jounal of Biotechnology & Biochemistry 5(4): 216-219 22 Prescott LM, Harely JP, Klein DA (2002) Microbiology, McGraw – hill 23 Qinhong, W., Xiangdong, F., Baojun, B., Xiaolin, L., Patrick, J S., William, A G., Yongchun, T (2007) Engineering Bacteia for Production of Rhamnolip as an Agent for Enhanced Oil Recovery Biotechnology and Bioengineering: 842-853 Nguyễn Thị Mỹ Linh - 59 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội 24 Rahim, R., Burrows, L L et al (2000) Involvement of the rml locus in core oligosaccharide and O polysaccharide assembly in Pseudomonas aeruginosa Microbiology, 2803-2814 25 Rahman, K.S.M.; Banat, I.M.; Thahira-Rahman, J.; Thayumanavan, T.; Lakshmanaperumalsamy, P Bioremediation of Gasoline contaminated soil by a bacterial consortium amended with poultry litter, coir pith and rhamnolipid biosurfactant Bioresource Technol 2002, 81: 25-32 26 R Parthasarathi and P.K Sivakumaar (2009) Effect of Different Carbon Sources on the Production of Biosurfactant by Pseudomonas fluorescens Isolated from Mangrove Forests (Pichavaram), Tamil Nadu, India Global J Environ Res., (2): 99-101 27 Roberta, B L., Siddhartha, S G., Lireny, A G G., Jonas, C (2010) Effect of C/N Ratio and Physicochemical Conditions on the Pseudomonas aeruginosa Applied and environmental microbiology, 985 - 989 28 Rubina, A., Shafqat, F., Syed, S A (2010) Improvement of pencillin G acylase expression in Escherichia coli through UV induced Brazilian Journal of Microbiology 41(4): 1133-1141 29 Rubina, A., Shafqat, F., Syed, S A (2010) Improvement of penicillin G acylase expression in Escherichia coli through UV induced Brazilian Journal of Microbiology 41(4): 1133-1141 30 Sambrook, J and Rusell, W D (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual Volume 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 31 Seema, D and Nakuleshwar, D J (2012) Isolation of biosurfactantproducing marine bacteria African Journal of Environmental Science and Technology 6(6): 263-266 32 Siegmund, I and Wagner, F (1991) New method for detecting rhamnolipid excreted by Psedomonas species during growth on mineral agr Biotechnology Techniques 5(4): 265-268 Nguyễn Thị Mỹ Linh - 60 - Lớp: CNSH-1201 h u n t t nghi p Vi n Đại học Mở Hà Nội 33 Sneha, K S., Padmapriya, B and Rajeswari, T (2012) Isolation and Screening of biosurfactants Produced by Pseudomonas aeruginosa from Oik Spilled Soils Intrenational of Pharmaceutical & Biological Archives 3(2): 321-325 34 Sonali Sahoo, Sriparna Datta et al., J And Sci Res, (2011) Optimization of Culture condition for Biosurfactant Production from Pseudomonas aeruginosa OCD1, 2(3): 32-36 35 Soniyamby AR, Praveesh BV, Vimalin Hena J, Kavithakumari P, Lalitha S, Palaniswamy M (2011) Enhanced production of biosurfactant from isolated Pseudomonas sp growing on used edible oil 3:50–52 36 Tugba Subasioglu., And E Cansunar., (2008) Nutritional Factors Effecting Rhamnolipid Production by a Nosocomial Pseudomonas aeruginosa, 36 (1), 77-81 37 Zhu, K., Rock, C O (2008) RhlA converts beta-hydroxyacyl-acyl carrier protein intermediates in fatty acid synthesis to the beta-hydroxydecanoylbeta-hydroxydecanoate component of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa J Bacteriol 190: 3147-3154 38 Zhu, Y., Gan, J., Zhang, G., Yao, B., Zhu, W., Meng, Q (2007) Reuse of waste frying oil for production of rhamnolipids using Pseudomonas aeruginosa zju.u1M Journal of Zhejiang University SCIENCE ISSN 1673-565X 8(9): 1514-1520 Nguyễn Thị Mỹ Linh - 61 - Lớp: CNSH-1201