Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng sinh RHAMNOLIPDS

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt CHHBM là một trong số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học.. VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT Trong những năm gần đâ

NHẰM NÂNG CAO SẢN LƢỢNG SINH RHAMNOLIPIDS

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHẰM NÂNG CAO SẢN LƢỢNG SINH RHAMNOLIPIDS

Trong thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp Trong thời gian này, em đã nhận được sự động viên, quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học

— Viện Đại học Mở Hà Nội, những người đã giảng dạy và cho em những kiến thức hữu ích trong quá trình học và cả kiến thức cho sau này

Em xin gửi lòng cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Ngọc Huyền, người

đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và luôn đồng hành giúp đỡ em trong suốt thời gian làm thực nghiệm và viết khóa luận

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới toàn thể các cán bộ nhân viên làm việc tại Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã động viên, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành khóa luận này

Và em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với gia đình và bạn

bè đã động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ em rất nhiều

Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn nên bài khóa luận của em vẫn còn những thiếu sót Em rất mong được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để bài khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn nữa

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2016

Người thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Linh

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.2.2 Chọn lọc đột biến dương tính bằng định tính 30 2.2.3 Chọn lọc đột biến dương tính bằng định lượng 31

2.2.5 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng

P.Fluorescens HS5 và thể đột biến P fluorescens HS5-M19 33 2.2.6 Phân tích trình tự gen 16S- rARN của chủng đột biến

2.2.6.5 Đọc trình tự đoạn gen chứa vùng gen đặc hiệu 36 2.2.7 Động thái của quá trình tổng hợp RL từ chủng P

fluorescens HS5 và thể đột biến P fluorescens HS5-M19 37 2.2.8 Kiểm tra tính ổn định của thể đột biến P fluorescens HS5-M19 37

3.1 Nghiên cứu tạo đột biến chủng P fluorescens HS5 39 3.2 Chọn lọc đột biến dương tính bằng định tính 41 3.3 Chọn lọc đột biến dương tính bằng định lượng 43 3.4 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng

P.fluorescens HS5 và thể đột biến P fluorescens HS5-M19 45 3.5 Phân tích trình tự gen 16S-rARN của thể đột biến

3.5.2 Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN của thể đột biến

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHHBM Chất hoạt hóa bề mặt

CHHBMHH Chất hoạt hóa bề mặt hóa học

CHHBMSH Chất hoạt hóa bề mặt sinh học

mN/m Đơn vị đo sức căng bề mặt (milli Newton/mét)

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal inhibition concentration) DPI Phương pháp chiếu trực tiếp (Direct plate irradiation)

LPI Phương pháp chiếu dịc lỏng (Liquid plate irradiation)

BER Cơ chế cắt sửa bazơ

NER Cơ chế cắt sửa nucleotit

CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

bp base pair (cặp bazơ)

CFU/ml Số đơn vị khuẩn lạc trong 1ml mẫu

RhlA 3-hydroxyacl-ACP:3hydro-xyacyl-ACP

O-3-hydroxyacyltransferase RhlB Enzym rhamno-syltransferase I

RhlC Enzym rhamno-syltransferase II

HAA 3-(3hydroxyalkanoyloxy)

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp RL từ Pseudomonas putida 9

Hình 1.4 Khuẩn lạc P.fluorescens trên môi trường KingB và phát

quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 365nm 14

Hình 1.5.B Màng tế bào của bào tử động và sự giống nhau của các thành

phần phân tử màng tế bào với một phân tử RL 16 Hình 1.5.C Cơ chế phân giải bào tử động của RL

(RL xen vào giữa màng tế bào của bào tử động) 16

Hình 1.8 Cơ chế quang tái hoạt hóa sửa chữa ADN 24 Hình 1.9 Sửa chữa sự sai khác ADN do tia UV gây ra 26 Hình 2.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa OD490nm và lượng

HS5-M19 với một số chủng vi khuẩn có họ hàng gần gũi 50

Hình 3.8 Sự sai khác sau khi giải trình tụ 16S-rARN của thể đột biến

P.fluorescens HS5-M19 khi so sánh với chủng P.flourescens

DVL3A

51

Hình 3.9 Sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp RL của P.flourescens

HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19 53

Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót của vi khuẩn sau xử lý đột biến bằng tia UV 40 Bảng 3.2 Bảng tổng hợp khả năng sinh RL của các thể đột biến 43 Bảng 3.3 Kết quả xác định hàm lượng RL từ các thể đột biến tuyển chọn 43 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng

P.flourescens HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19 46

Bảng 3.6 Sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp RL của

P.flourescens HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19 52

Bảng 3.7 Định tính khả năng sinh tổng hợp RL của chủng P.flourescens

HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua các thế hệ 54 Bảng 3.8 Hàm lượng RL từ chủng P.flourescens HS5 và thể đột biến

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là một trong

số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học Hàng năm trên toàn

thế giới sản xuất CHHBM trung bình 10 triệu tấn và lợi nhuận thương mại ước

tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong sản xuất và cuộc sống Tuy nhiên, CHHBM được tổng hợp từ hóa học lại không tự phân hủy được và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010)

Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) đầu tiên được Beyer

tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1 (Beyer,1946) Từ đó

đến nay, CHHBMSH được tập trung nghiên cứu nhiều do chúng có ưu điểm không gây độc và khả năng tự phân hủy cao vì thế không gây ô nhiễm môi trường

Trong số các CHHBMSH thì Rhamnolipids (RL) được biết đến nhiều nhất

RL thuộc nhóm glycolipids và có cấu tạo từ 1 hoặc 2 đơn vị axit béo kỵ nước hydroxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 đơn vị L-rhamnose bằng liên kết β-gly-cosidic hình thành các nhóm ưa nước RL có nhiều tính chất ưu việt như: 1/ hoạt tính bề mặt; 2/ khả năng nhũ hóa; 3/ khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi rộng; 4/ khả năng bị phân hủy sinh học; 5/ độc tính thấp; 6/ khả năng

β-diệt vi sinh vật như Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium

globoum và Penicillium funiculosum (Haba et al., 2002, Luiz et al., 2012)

Trên thế giới, sản xuất RL đã được triển khai rộng rãi ở nhiều nước như:

Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc… Theo Sonali và cộng sự (2011), chủng P.aeruginosa

COD lên men ở khoảng nhiệt độ 30 - 35˚C đạt sản lượng RL là 9,8 g/l Theo

Roberta, sản lượng RL thu được từ chủng P.aeruginosa LB1 đạt 7,6 g/l (Roberta

et al., 2010) Bên cạnh hướng nghiên cứu sinh tổng hợp RL từ P.aeruginosa thì

gần đây các nhà khoa học còn phát hiện chủng P.chlororaphis, P.putida,

P.fluorescens cũng có khả năng sinh tổng hợp RL P.chlororaphis có khả năng

tạo RL lên tới 10g/l (Nereus et al.,2004; 2007)… Hiện nay ở Việt Nam, Lại Thúy

Hiền và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn Rhodoccocus ruber TD2 có

khả năng tạo CHHBMSH, với hàm lượng thô đạt được là 13,7 g/l trong điều kiện nhiệt độ 30˚C, PH 8-9 (Lại Thúy Hiền, 2010)

Bộ môn nghiên cứu Công nghệ sinh học Sau thu hoạch đã tuyển chọn

được 36 chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh RL Lượng RL sinh tổng hợp

từ 36 chủng dao động từ 1,2 - 8,4 g/l, trong đó chủng P.aeruginosa HW20 và

P.fluorescens HS5 có khả năng sinh RL cao hơn cả, tương ứng là 8,0 và 8,4 g/l

Tuy nhiên, so với trên thế giới sản lượng này vẫn còn thấp Do vậy, việc tạo chủng

vi sinh vật để có khả năng sinh tổng hợp RL cao là rất cần thiết Zhu và cộng sự (2007) đã gây đột biến với mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp RL trên

P.aeruginosa zju.u1M bằng chiếu tia UV; Abbas và cộng sự (2003) nghiên cứu

tạo đột biến trên P.aeruginosa MM1011 bằng chất

N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) Do đó, tác nhân đột biến được xem như có tiềm năng trong việc cải thiện năng suất RL ở vi khuẩn Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng c o sản ượng

Rh mno ipids”

MỤC TIÊU:

- Lựa chọn được 01 thể P.fuorescens đột biến có khả năng sinh RL lớn hơn 12g/l

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu tạo chủng đột biến có khả năng sinh RL cao bằng tia UV

- Lựa chọn thể đột biến có khả năng sinh tổng hợp RL cao

- Xác định hàm lượng RL từ các thể đột biến lựa chọn

- Quan sát đặc điểm hình thái của chủng tự nhiên P.fuorescens HS5 và thể đột biến P.fluorescens HS5-M19

- Phân tích trình tự gen 16S-rARN của thể đột biến P.fuorescens HS5-M19

- Nghiên cứu động thái sinh tổng hợp RL của chủng tự nhiên P.fuorescens HS5 và thể đột biến P.fluorescens HS5-M19

- Nghiên cứu tính ổn định của chủng tự nhiên P.fuorescens HS5 và thể đột biến

P.fluorescens HS5-M19

I TỔNG QUAN

1.1 VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT

Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là một trong số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học Hàng năm

trên toàn thế giới sản xuất trung bình 10 triệu tấn và lợi nhuận thương mại

ước tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và cuộc sống Người ta ước tính, trong thời gian hơn 1 thập kỷ qua, nhu cầu về CHHBM đã tăng 300% trong ngành công nghiệp hóa chất Hoa Kỳ Tuy nhiên, CHHBM được tổng hợp từ hóa học lại không tự phân hủy được và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010)

Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) đầu tiên được

Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1

CHHBMSH là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật Tất cả CHHBMSH là hợp chất lưỡng cực có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo) Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa 2 chất (có thể là chất lỏng - chất lỏng, chất lỏng - chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng

và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng - chất lỏng và chất lỏng - chất rắn) So với CHHBMHH thì CHHBMSH có nhiều ưu điểm hơn: 1/ Có khả năng phân hủy sinh học; 2/ Hầu như không có độc tính hoặc có độ độc thấp; 3/

Có tính dung hợp sinh học và tiêu hóa được nên thường được dùng trong mỹ phẩm, dược phẩm hay thậm chí làm phụ gia thực phẩm; 4/ Sản xuất có hiệu quả kinh tế (có thể được sản xuất từ phụ phẩm công, nông nghiệp) 5/ Có tính đặc hiệu (các CHHBMSH ở dạng phức hợp chất hữu cơ với các nhóm chức đặc trưng nên thường có hoạt tính chuyên biệt); 6/ Tính hiệu quả ở các điều kiện cực

đoan về nhiệt độ, pH và muối CHHBMSH thường được ứng dụng trong xử lý môi trường (diệt vi sinh vật gây bệnh và độc tố, phân hủy sinh học, giải độc, dừng trong xử lý ô nhiễm dầu ) (Lại Thúy Hiền, 2010)

 Phân loại các chất hoạt hóa bề mặt sinh học

Không giống như CHHBMHH thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHHBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra Nhìn chung, CHHBMSH được chia thành hai loại: CHHBMSH có khối lượng phân tử thấp gồm các glycolipid (RL, SLs, MELs ), lipopeptid, photpholipid CHHBMSH khối lượng phân tử cao gồm các chất cao phân tử và các CHHBM dạng hạt (thực phẩm nhũ tương và biodispersan) Phần lớn CHHBMSH tích điện âm hoặc không tích điện, phần

kỵ nước là các axit béo chuỗi dài hoặc các dẫn xuất của chúng và phần ưa nước có thể là cacbonhydrate, amino axit, phosphate hoặc peptide dạng vòng

Candida bombicola Candida apicola Candida antartica

Lipopeptid

Surfactin/Iturin/Fengycin

Viscosin

Bacillus subtilis Pseudomonas

Lichenysin

Serrawettin

Bacillus licheniformis Serratia marcescens

1.2 TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPIDS (RL)

1.2.1 Cấu trúc của RL

Rhamnolipids (RL) là loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học được biết đến nhiều nhất RL thuộc nhóm glycolipids và có cấu tạo từ 1 hoặc 2 đơn vị axit béo kỵ nước β-hydroxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 đơn vị L-rhamnose bằng liên kết β-gly- cosidic hình thành các nhóm ưa nước RL được cấu tạo bởi ba nguyên tố cacbon, nitơ và oxy RL có hai loại: mono-rhamnolipids (Rha-C8-C10, Rha-C10-C10…) và di-rhamnolipids (Rha-Rha-C8-C10, Rha-Rha-C10-C10…) Mono-rhamnolipids có

1 đơn vị đường L-rhamnose, còn di-rhamnolipids có 2 đơn vị đường L-rhamnose

RL là sản phẩm thứ cấp được sinh ra từ quá trình phân hủy hydrocarbon hoặc carbonhydrate của một số loài vi sinh vật Các loài vi sinh vật khác nhau sản xuất các rhamnolipid khác nhau Một số loài chỉ sản xuất

hoặc dạng mono (Pseudomonas chlororaphis) hoặc dạng di (Burkholdera

plantarii) trong khi một số loài khác lại tạo ra cả hỗn hợp các rhamnolipid

dạng mono và di (Pseudomonas aeruginosa)

RL có cấu trúc lưỡng cực với cực ưa nước và cực kỵ nước, nhờ đó làm tăng khả năng tiếp xúc và phân hủy hydrocacbon (hình 1.1) Khối lượng phân

tử của RL nằm trong khoảng 504-650 (Lại Thúy Hiền, 2010)

1.2.2 Tính chất của RL

RL có mùi xà phòng nhẹ RL dạng bột có màu trắng, ở dạng dung dịch thì trong suốt, có màu ngà vàng và ổn định ở 100°C Vì RL đa dạng về cấu trúc hóa học nên có nhiều tính chất như khả năng tạo nhũ hóa, giữ ẩm, tạo bọt, hoạt hóa bề mặt…(http://www.rhamnolipid.com/)

- Hoạt tính bề mặt: RL có thể làm giảm sức căng bề mặt của nước và sức

căng bề mặt giữa nước và hexadecane RL từ P.aeruginosa làm giảm sức căng

bề mặt của nước xuống 26 mN/m và sức căng bề mặt của nước với hexadecane xuống dưới l mN/m RL có nồng độ mixen tối thiểu thấp hơn từ 10 đến 40 lần

so với chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) (Lại Thúy Hiền, 2010)

- Khả năng nhũ hóa: RL có thể làm ổn định hoặc làm mất ổn định dạng nhũ hóa RL cao phân tử có khả năng nhũ hóa tốt hơn RL có khối lượng phân

tử thấp RL cao phân tử có nhiều lợi thế hơn bởi chúng bao phủ các giọt dầu,

do đó hình thành dạng nhũ hóa ổn định Tính chất này đặc biệt hữu hiệu trong việc tạo dạng nhũ hóa giữa dầu và nước trong các ngành mỹ phẩm, thực phẩm

và nông nghiệp

- Khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi rộng: hoạt tính bề mặt của RL không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như nhiệt độ và pH Đây cũng là tính chất quan trọng để ứng dụng RL trong sản xuất nông nghiệp, khi ở các điều kiện môi trường và khí hậu có nhiều thay đổi mà không làm thay đổi hoạt tính của RL

- Khả năng bị phân hủy sinh học: không giống với CHHBMHH, RL có thể phân hủy dễ dàng trong môi trường đất, nước và đặc biệt thích hợp với các ứng dụng liên quan đến môi trường như phục hồi sinh học

- Độc tính thấp: các CHHBMSH nói chung và RL nói riêng hầu như không độc Vì vậy rất nhiều công ty trên thế giới đã ứng dụng CHHBMSH trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, nông nghiệp (thuốc kháng sinh, thuốc diệt nấm )

- Ngoài các đặc tính nêu trên, RL còn có khả năng diệt vi sinh vật Chúng

ức chế tác nhân gây bệnh sinh bào tử động như Phythium và các loài

Phytophthora RL cũng có hoạt tính ức chế sự phát triển của một số loài nấm

khác như Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum và

Penicillium funiculosum Bên cạnh đó, khả năng kháng một số loài vi khuẩn

gram âm và gram dương của RL cũng đã được ghi nhận, trong đó Klebsiella

pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis và Micrococcusluteus được

xem là những chủng nhạy cảm nhất với RL (Haba et al , 2002, Luiz et al., 2012)

1.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp RL

Con đường sinh tổng hợp RL đã được làm sáng tỏ bởi Michael (1997)

và Andreas (2011) RL được cấu tạo bởi rhamnose và axit béo β-hydroxy Rhamnose được tổng hợp từ glucose-6-phosphat thông qua 5 bước chuyển

hóa liên tiếp (Rahim et al, 2000) Các axit béo β-hydroxy được tổng hợp từ

acetyl-CoA (Zhu and Rock, 2008) Sau đó, một cụm gen sẽ điều khiển quá trình tổng hợp RL từ rhamnose và axit béo RhlA và RhlB là hai protein cần

thiết cho sản xuất RL được mã hóa bởi gen rhlA và rhlB RhlA có vai trò ổn

định RhlB trong màng tế bào RhlAB chịu trách nhiệm điều khiển enzym rhamnosyltransferase I Quá trình tổng hợp RL trải qua 3 phản ứng enzym Đầu tiên, hai axit béo β-hydroxy đã hoạt hóa được liên kết với nhau nhờ enzym RhlA (3-hydroxyacyl-ACP:3-hydro-xyacyl-ACP O-3-hydroxyacyltransferase) tạo thành một dimer, gọi là 3-(3hydroxyalkanoyloxy) alkanoate (HAA) Dưới tác dụng của RhlB (enzyme rhamno-syltransferase I), HAA sẽ kết hợp với dTDP-L-rhamnose để tạo thành mono rhamnolipid Enzym rhamnosyltransferase II (RhlC) chịu trách nhiệm gắn thêm một nhóm rhamnose với mono-rhamnolipid để tạo thành di- rhamnolipid

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp RL từ Pseudomonas putida

1.2.4 Nguồn thu nhận RL

RL là sản phẩm thứ cấp chủ yếu được sinh ra từ quá trình phân hủy

carbonhydrate của một số loài thuộc chi Pseudomonas sp (Benincasa et al, 2002; Ahmad et al., 2011; Andreas et al, 2011; Mohammed et al, 2012; Seema et al., 2012) Các chủng này được phân lập từ nước thải dầu mỏ, các

mẫu nước và trầm tích biển, đất rừng ngập mặn, mẫu đất nhiễm xăng Các loài vi sinh vật khác nhau sản xuất lượng RL khác nhau Trong số các vi sinh

vật sinh tổng hợp RL thì Pseudomonas aeruginosa được nghiên cứu nhiều

hơn cả bởi khả năng tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao, dễ lên men và

cho sản lượng cao hơn so với các vi sinh vật sinh khác Tuy nhiên, P

aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội cho người và động vật, vì vậy các nhà

khoa học trên thế giới không ngừng nỗ lực nghiên cứu nhằm phát hiện ra

chủng Pseudomonas sp sản sinh RL với sản lượng cao mà không gây bệnh

Gần đây, rất nhiều tác giả đã công bố khả năng tạo RL từ Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas desmolyticum, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas luteola, Pseudomonas putida (Dilsad and Belma, 2009; Milena et al., 2012; Sneha et

al, 2012; Mohammed et al., 2012) Một số loài chỉ sản xuất hoặc dạng

mono-rhamnolipids (Pseudomonas chlororaphis) hoặc dạng di-mono-rhamnolipids trong khi một số loài khác lại tạo ra cả rhamnolipid dạng mono và di (P.aeruginosa)

1.2.5 Các điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp RL

Đối với mỗi loại vi sinh vật, yêu cầu về thành phần môi trường nuôi cấy là khác nhau, song tất cả các vi sinh vật tạo RL đều có khả năng sử dụng nguồn carbon hòa tan trong nước hoặc không tan trong nước Tuy nhiên, nguồn cacbon không tan trong nước như dầu thực vật, đặc biệt hiệu quả trong việc thúc đẩy sản xuất RL Thông thường, vi sinh vật phát triển được trên môi trường có nguồn cacbon không tan là do nó có khả năng nhũ hóa các hợp chất

này (Desai and Banat, 1997; Banat et al., 2000) Nguồn cacbon được sử dụng

cho sản xuất RL là glycerol, dầu đậu nành, dầu olive, dầu ngô, dầu cá, sucrose, galactose, lactose, fructose, maltose, dextrose, arabinose, sữa Sản xuất RL phụ thuộc nhiều vào đặc tính chủng giống và trên những nguồn cơ

chất khác nhau Một số chủng P aeruginosa và P.chlororaphis tạo sản lượng

RL cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn cacbon là glucose (Nereus

et al., 2004, Parthasarathi and Sivakumaar, 2009) Tuy nhiên, một số chủng

khác lại sinh tổng hợp RL tối đa trên môi trường có nguồn cacbon là dầu ngô,

dầu olive, dầu canola, dầu đậu tương, glycerol và manitol (Rahman et al.,

2002, Rahman et al., 2002, Celia et al., 2010) Trong sản xuất RL, để giảm

giá thành sản phẩm, ngoài việc nâng cao hoạt tính chủng giống bằng phương pháp đột biến và biểu hiện gen thì việc sử dụng các nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền cho lên men chủng sinh RL cũng rất được quan tâm Sản lượng RL cao cũng

đã được ghi nhận khi sử dụng nguồn cacbon là rỉ đường và phế thải dầu dán (Dilsad and Belma, 2009)

Cùng với nguồn cacbon thì nguồn nitơ và khoáng chất cũng đóng một vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp RL Nguồn nitơ được sử dụng trong sản xuất RL chủ yếu là nước chiết nấm men, pepton, ure, trypton, casein, và một số hợp chất vô cơ như (NH4)2SO4, NH4NO3 và NaNO3 Một số nghiên cứu chỉ ra rằng NaNO3 thích hợp cho sinh tổng hợp RL (Prescott et al, 2002, Tugba 2008, Soniyamby et al., 2011) Tuy nhiên, một số ý kiến khác cho rằng,

sản xuất RL với nguồn nitơ là nitrate thì vi khuẩn cần phải chuyển hóa nitrate thành dạng khử để sử dụng Khử nitrate là một quá trình tiêu tốn năng lượng,

do vậy so với amoni thì nitrate không phải là nguồn nitơ thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Cần lưu ý đến hàm lượng nitơ bổ sung sao cho nồng độ nitơ vừa

đủ để tạo sinh khối, sau khi nồng độ sinh khối đạt số lượng tới hạn thì vi sinh vật cần sử dụng hết nguồn nitơ và cacbon trong việc sản xuất RL (Mohammad

et al., 2012) Các muối Al2(SO4)3 và BaSO4 trong môi trường có ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh tổng hợp RL Ngược lại, CuSO4, MnSO4 và ZnSO4 đã làm tăng sản lượng RL so với mẫu đối chứng (Sonali et al., 2011)

Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi sinh vật và sinh tổng hợp RL đó là pH, nhiệt độ, thời gian lên men, tốc độ lắc Các nghiên cứu về nhiệt độ lên men và pH môi trường đã chỉ ra rằng, lượng RL

thu được tối đa từ chủng Pseudomonas sp khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30˚C- 40˚C

và pH là 6,5-7,0 Theo tác giả Sonali và cộng sự (2011), chủng P.aeruginosa

OCD lên men ở khoảng nhiệt độ 30 - 35°C đạt sản lượng RL là 9,8 g/1, ngược lại nếu nuôi cấy ở nhiệt độ dưới 25°C và trên 37°C, lượng RL thu được thấp

Chủng P.aeruginosa MTCC 424 sinh tổng hợp RL cao nhất ở 37°C và môi

trường lên men có pH 7, còn đối với môi trường có pH dưới 6 hoặc trên 8,

lượng RL tạo thành giảm (Praveesh et al., 2010) Nhìn chung, hầu hết các

chủng có khả năng sản xuất RL tối ưu đều phát triển ở điều kiện pH trung

tính, thường dao động ở khoảng pH 7 ± 0,2 (Rahman et al., 2002, Roberta et

al., 2010) Các nghiên cứu chỉ ra rằng với mỗi loại vi sinh vật khác nhau thì

thời gian lên men thu nhận RL cũng rất khác nhau, thời gian sinh tổng hợp

RL thường từ 3 đến 7 ngày Sinh tổng hợp RL từ chủng P.aeruginosa MTCC

424 đạt cao nhất là 5,7 g/1 sau 7 ngày lên men (Praveesh et al., 2010) Còn với chủng P.chlororaphis NRRL B-30761 thì thời gian tối thích cho việc tạo

RL chỉ mất 5 ngày Đối với một số chủng khác thời gian thu nhận RL cao

nhất chỉ sau 3 ngày lên men như chủng Psedomonas sp sau 3 ngày lên men cho khả năng tạo RL cao nhất là 7,6 g/1 (Soniyamby et al., 2011) Chủng

P.aeruginosa ATCC 9027 cũng cho sản lượng RL đạt cao nhất là 8,5 g/1 chỉ

sau 3 ngày lên men Bên cạnh, nhiệt độ và thời gian lên men, tốc độ lắc và độ oxy hòa tan cũng ảnh hưởng nhiều đến quá trình sản xuất RL Theo Roberta,

ở chế độ khuấy 500 vòng/phút, độ thoáng khí 1vvm thì sản lượng RL thu

được từ chủng P.aeruginosa LB1 chỉ đạt 4,1 g/l Nhưng nếu tăng tốc độ

khuấy lên 800 vòng/phút thì sản lượng RL tăng lên gần gấp 2 lần, đạt 7,6 g/1

và sản lượng RL cao nhất thu được khi tốc độ sục khí là 2vvm và tốc độ

khuấy 800 vòng/phút (Roberta et al.,2010) Đối với chủng P.aeruginosa BYK

2 KCTC 18012P, khả năng sinh tổng hợp RL thích hợp nhất với tốc độ lắc

200 vòng/phút, tốc độ sục khí là 21/phút Ngược lại, với chủng P.aeruginosa

OCD, sản lượng RL đạt cao nhất là 9,8 g/1 sau 4 ngày lên men ở 30°C, pH 7

với tốc độ khuấy 125 vòng/phút (Sonali et al., 2011)

Thu hồi và tạo sản phẩm là công nghệ quan trọng trong sản xuất RL từ

vi sinh vật Quá trình tách chiết và thu nhận RL có thể miêu tả tóm tắt như sau: dịch lên men được ly tâm để loại bỏ xác tế bào và thu dịch nổi Dịch nổi được điều chỉnh đến pH 2 bằng 10% HCl hoặc 6N H2SO4 Ly tâm, thu kết tủa Phần kết tủa được hòa với một số dung môi như ethyl acetate, acetone, methanol, hệ dung môi chloroform/methanol Tiếp đến loại bỏ dung môi, thu

nhận RL (Nereus et al., 2007; Qinhong et al., 2007; Dilsad and Belma, 2009; Roberta et al., 2010, Ahmad et al., 2011, Milena et al., 2011) Hiện nay, một

số phương pháp dùng để định tính và định lượng RL là sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng cao áp Sản phẩm bột RL có thể được tạo bằng phương pháp sấy

phun, cô chân không hay đông khô (Michael et al., 1997)

1.2.6 Đặc điểm của chủng vi sinh vật sinh RL

Các nhà khoa học trên thế giới đã không ngừng nỗ lực nghiên cứu

nhằm phát hiện ra chủng Pseudomonas sp sản sinh RL với sản lượng cao mà không gây bệnh Pseudomonas được phận loại như sau:

chất hữu cơ tổng hợp và tồn tại khá lâu trong môi trường nước thải Pseudomonas

được chia thành hai nhóm là nhóm phát quang và nhóm không phát quang

 Đặc điểm hình thái:

Pseudomonas sp là trực khuẩn gram âm (-) Trực khuẩn có thể là hình que

thẳng hoặc hơi cong, kích thước 0,5-1 x 1,5-5 μm Không tạo bào tử Phát triển ở

điều kiện hiếu khí Thường di động với một hoặc nhiều roi Hầu hết Pseudomonas

có oxidase dương tính, nhưng thỉnh thoảng có chủng oxidase âm tính Vi khuẩn tạo sắc tố pyocin (sắc tố xanh), fluorescin (sắc tố vàng) và pyorubin (sắc tố nâu)

A Tế bào chủng Pseudomonas sp B Pseudomonas sp dưới kính hiển vi điện tử

Hình 1.3 Đặc điểm hình thái chủng Pseudomonas sp

 Đặc điểm nuôi cấy:

Pseudomonas sp có nhiều loại ưa lạnh, nhiệt độ tối thiểu là -2˚C đến

5˚C, tối thích là 20 - 25˚C Phần lớn không phát triển được ở môi trường axit

(pH dưới 4,5) Khuẩn lạc Pseudomonas được nuôi cấy trên môi trường thạch

Centrimide (là môi trường KingA có bổ sung axit Nalidixic và tetradonium bromide) nhằm ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương, tạo điều kiện

thuận lợi cho Pseudomonas sp phát triển Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, tròn,

hơi lồi, bóng, nhẵn, đường kính 0,1 – 0,4 cm, tế bào hình que, không có bào

tử, có khả năng di động, gram âm Trên môi trường Centrimide, hai loại phát quang được quan sát thấy dưới dèn UV tại bước sóng 365nm Khi cấy các chủng này lên môi trường KingB, chỉ một loại phát quang được quan sát thấy

Điều này được lý giải một số chủng Pseudomonas tạo hai sắc tố pyocyanin

và pyoverdin, một số chủng chỉ tiết sắc tố pyoverdin

Hình 1.4 Khuẩn lạc P.fluorescens trên môi trường KingB và phát quang

dưói ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 365nm

 Đặc điểm sinh ý và sinh hóa

Để xác định Pseudomonas, các đặc điểm hóa sinh sau thường được

thực hiện: nhuộm gram, thí nghiệm oxidase, catalase, urease, SIM indole-motility), O/F (oxi hóa - lên men) và môi trường lên men glucose, lên men carbonhydrat, thí nghiệm MRVP (methyl đỏ và Voges-Proskauer), thí nghiệm citrate, thủy phân gelatin, sản sinh siderophore và sản sinh HCN Tất

(sulfide-cả Pseudomonas đều có hoạt tính amylase và protease, đồng thời lên men

được nhiều loại đường và tạo màng nhầy Trong môi trường pH dưới 5,5 vi

khuẩn Pseudomonas sẽ bị kìm hãm phát triển và kìm hãm phát triển và kìm

hãm sinh tổng hợp protease Nồng độ muối trong nước tới 5-6% thì sinh

trưởng của vi khuẩn này bị ức chế hoàn toàn Pseudomonas là chủng vi khuẩn

rất có ích trong việc xử lý nước thải Nó có thể làm giảm chỉ số COD của nước thải bằng cách phân hủy các hợp chất hữu cơ, benzene, naphtalen, pyridine, thậm chí loại bỏ được cả kim loại nặng…

1.2.7 Cơ chế diệt vi sinh vật của RL

RL là một chất diệt nấm và chất ức chế bào tử động Cơ chế RL tiêu diệt

bào tử động của một số tác nhân gây bệnh thực vật như Pythium

aphanidermatum, Phytophthora capsici và Plasmopara lactucae-radicis đã

được Michael và cộng sự (1997) làm sáng tỏ: khi RL tiếp xúc với bào tử động của 3 loài trên ở nồng độ từ 5-30µg/ml đã làm cho toàn bộ các bào tử động ngừng di chuyển và bị ly giải trong thời gian dưới 1 phút Nồng độ cần thiết để chất hoạt hóa bề mặt ly giải bào tử động phụ thuộc vào sự nhạy cảm của bào tử động và dạng RL (Hình 1.5.A-C) Trong hầu hết các trường hợp, dirhamnolipid

ly giải bào tử động bằng hoặc tốt hơn các monorhamnolipid Cơ chế ly giải bào

tử động của RL là khi bào tử động tiếp xúc với RL, RL xen vào giữa và phá vỡ màng tế bào của các bào tử động Điều này có thể quan sát được trên kính hiển

vi Sau khi thêm RL, sự vận động của bào tử động ngừng lại và bào tử động bị tan ra Ngược lại, ở mẫu không có RL, bào tử động của mỗi loài bơi xấp xỉ khoảng 20 giờ Điều này được giải thích dựa trên cấu trúc hóa học màng của bào tử động Màng của bào tử động có cấu tạo gồm 51% là protein và 49% là lipid Thành phần lipid chính là glycolipid và lipid trung tính, đặc điểm này khác với các phospholipid thường được tìm thấy ở màng của hầu hết các loại vi khuẩn và các sinh vật nhân thật, điều đó cũng lý giải vì sao RL ức chế được các loại nấm có bào tử động

Hình 1.5.A Biểu đồ ly giải bào tử động

Hình 1.5.B Màng tế bào của bào tử động và sự giống nhau của các thành

phần phân tử màng tế bào với một phân tử RL

Hình1.5.C Cơ chế phân giải bào tử động của RL (RL xen vào giữa màng tế bào của bào tử động) 1.2.8 Ứng dụng của RL

RL được nghiên cứu từ năm 1946 Đến năm 2008, Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ (EPA) đã cấp chứng chỉ thương mại hóa cho các sản phẩm RL và cho phép úng dụng sản phẩm này trong công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp Hiện nay, RL đã được sản xuất bởi một số công ty như: Rhamnolipids Inc của Mỹ, Urumqi Unite Bio – Technology; Hangzhou Pharma và Chem của Trung Quốc (http://www.rhamnolipid.com/)

RL có thể được ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, hóa chất, ngành công nghiệp hóa dầu là

do nó có một số tính chất như: tạo nhũ hóa, giữ ẩm, tạo bọt,… Các ứng dụng của RL trong tạo chế phẩm diệt vi sinh vật gây bệnh và sinh độc tố trên nông sản và hoa quả đã đạt nhiều thành công RL được sử dụng trong thuốc trừ sâu

do khả năng diệt nấm, diệt vi khuẩn gram âm, gram dương và vai trò của chất hoạt hóa bề mặt như tác nhân làm ẩm, chất hoa tan, chất ổn định, chất nhũ hóa

và chất tạo bọt

Các nghiên cứu đã tiến hành để đánh giá khả năng kiểm soát sinh học

của chủng Pseudomonas sp sản xuất RL Thử nghiệm được thực hiện trong

nhà kính trồng cây thủy canh với điều kiện kiểm soát nhiệt độ trong khoảng 24-32˚C Kết quả cho thấy, không có bào tử động nào quan sát được trên mẫu

lá đã phun chủng Pseudomonas sp R4 Điều này có thể là do các chất hoạt

hóa bề mặt đã đủ nồng độ để phân giải tất cả các bào tử động làm cho chúng hoàn toàn bị ly giải Khi trồng cây, hệ thống tưới nước chung có thể lây lan nhiều các nguồn bệnh Chỉ cần hòa tan một lượng nhỏ RL trong nước sẽ giúp

ức chế được sự lây lan của các tác nhân gây bệnh cây và đồng thời nhũ hóa phức chất dinh dưỡng và tạo điều kiện cho thực vật hấp thụ tốt các chất dinh

dưỡng (Michael et al., 1997)

Năm 2002, Haba và cộng sự đã chứng minh, chủng Pseudomonas

RL47T2 được phân lập từ cây bị bệnh có hoạt tính chống lại các nấm gây bệnh

cây RL47T2 không có khả năng ức chế A.niger, Penicillium chrysogenum và

Arueobasidium pullulans khi được khảo nghiệm (MIC > 256 µg/ml) Trong khi

đó RL có hoạt tính kháng nấm cao với các chủng Penicillium funiculosum,

Gliocadium virens, Chaetonium glonosum và Fusarium solani ở các giá trị

MIC lần lượt là 16µg/ml, 32µg/ml, 64µg/ml và 75µg/ml RL có hoạt tính

kháng B.cinerea (nấm gây bệnh thối xám trên vỏ quả nho và thối khô mắt hay

thối cuống quả trên táo) với MIC là 170µg/ml Sự sinh trưởng và phát triển của

Rhizoctonia solani – tác nhân gây bệnh đốm mặt tại vùng thân và rễ cây lúa mì

và các loại ngũ cốc khác – đã bị ức chế ở MIC là 109 µg/ml Hoạt tính kháng

Colletotrichum gloeosprioides (vi sinh vật gây bệnh than thư trong dâu tây) là

yếu ở MIC 276 mg/ml (Haba et al., 2002)

Các nhà khoa học trên thế giới đã kết hợp RL và SRE (Syringomycin E)

để tạo hỗn hợp SRE và RL có phổ diệt vi sinh vật rộng và hiệu quả cao cho phòng chống các nấm gây bệnh và sinh độc tố trên lương thực (ngô, lạc, đậu,…) và trái cây (nho, táo, đào,…)

1.2.9 Hướng nghiên cứu nâng cao sản lượng RL

Các nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành

RL, song chủng vi sinh vật có ý nghĩa quyết định hơn cả Vì vậy, việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp RL cao đóng vai trò quan trọng trong sản xuất RL là sản phẩm thứ cấp chủ yếu được sinh ra từ quá

trình phân hủy carbonhydrate của một số loài thuộc chi Pseudomonas sp (Benincasa et al., 2002; Amhad et al., 2011; Andreas et al., 2011; Mohammed et al., 2012; Seema et al, 2012) Các chủng này được phân lập từ

nước thải dầu mỏ, các mẫu nước và trầm tích biển, đất rừng ngập mặn, mẫu đất nhiễm xăng Tuy nhiên, các chủng khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp

RL không giống nhau (Michael et al., 1997) Để nâng cao sản lượng RL cũng như hạn chế mầm bệnh cơ hội P.aeruginosa, đã có nhiều hướng nghiên cứu

khác nhau như tiến hành đột biến hoặc biểu hiện gen cho sinh tổng hợp RL từ

vi khuẩn này Đột biến để nâng cao sản lượng RL bằng hóa chất hay chiếu tia

UV cũng đã được nghiên cứu Tác giả Abbas và cộng sự (2004) đã sử dụng N-methyl-N’-nitro-nitrosoguanidin để tạo ra thể đột biến sản sinh RL cao gấp

10 lần so với chủng bố mẹ RL thu được có sức căng bề mặt thấp 28 mN/m và

có nồng độ mixel tối thiểu là 9 mg/l Sản lượng RL thu được từ đột biến

chủng P.aeruginosa bằng tia UV cao gấp 2-3 lần, đạt 24,6 g/l so với chủng bổ

mẹ (Zhu et al.y 2007) Các nghiên cứu trong những năm gần đây đã tiến hành tách gen rhlAB chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp RL từ chủng P.aeruginosa

và biểu hiện trong các hệ biểu hiện như P.putida, Burkholderia kururiensis,

Escherichia coli và nấm men Chủng P.putida tái tổ hợp có khả năng sinh

tổng hợp RL đạt 90 g/1 (Andreas et al., 2011) Khả năng sinh tổng hợp RL từ chủng tái tổ hợp Burkholderia kururiensis tăng đến 626% (5,67g/l) so với chủng tự nhiên P.aeruginosa PAOl (0,78g/l) (Luiz et al., 2012) Bên cạnh hướng nghiên cứu sinh tổng hợp RL từ P.aeruginosa thì gần đây các nhà khoa học còn phát hiện chủng P.chlororaphis cũng có khả năng sinh tổng hợp RL

Chủng vi khuẩn này rất an toàn cho người, động thực vật, môi trường và có khả

năng tạo RL lên tới 10 g/1 (Nereus et al, 2004; 2007)

 Nguyên nhân

Do tác nhân của môi trường ngoài cơ thể (thường là do tác động của con người) như:

- Tác nhân vật lý: tia phóng xạ, tia cực tím, nhiệt độ

- Tác nhân hóa học: ảnh hưởng của các chất hóa học như N-methyl-N’- nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), nicotine, cosinsin, dioxine

- Do nguyên nhân bên trong cơ thể: Những biến đổi bất thường trong sinh lý, sinh hóa trong tế bào (xuất hiện một cách tự nhiên)

Các tác nhân này khi sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ở nhiễm sắc thể,

gậy ra đột biến gen liên quan tới cấu trúc của gen làm thay đổi một hay nhiều nucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm Đây là loại đột biến có ý nghĩa trong sản xuất, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫn đến làm mất khả năng tạo RL (đột biến âm tính) hay tăng cường

 Phân oại

Căn cứ vào tính chất xuất hiện đột biến, có thể phân chia thành các dạng như sau:

- Đột biến gen: là những biến đổi trong cấu trúc của gen xảy ra ở cấp

độ phân tử tại một điểm nào đó trên phân tử ADN và có liên quan đến sự thay đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide trong gen Có rất nhiều kiểu biến đổi về cấu trúc gen Trong đó, những biến đổi liên quan đến một cặp nucleotit trong gen được gọi là đột biến điểm Trong tự nhiên, tất cả các gen đều có thể bị đột biến nhưng với tần số rất thấp (10-6

– 10-4 ) Tuy nhiên tần số đột biến có thể thay đổi tùy thuộc vào loại tác nhân đột biến, liều lượng tác nhân gây đột biến và cường độ tác động các tác nhân gây đột biến

Các dạng đột biến gen tại một điểm thường gặp:

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến

- Liều lượng chiếu: được đặc trưng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử Thực nghiệm cho thấy những đột biến dương thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử

từ 0,1 - 1%, còn đột biến âm thường xuất hiện ở liều lượng chiếu có độ sống sót cao hơn

- Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánh sáng thường (bước sóng λ = 320 - 480 nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50 - 80% tế bào được phục hồi do tác dụng của men photolyase Hiện tượng này gọi là quang phục hoạt

Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh

lí của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV

Có hai phương pháp chiếu tia UV đó là phương pháp chiếu trực tiếp (direct plate irradiation - DPI) và phương pháp chiếu dịch lỏng (liquid plate irradiatio - LPI) Phương pháp DPI: trải dịch nuôi cấy vi khuẩn lên đĩa petri chứa môi trường thạch và chiếu tia UV ở thời gian thích hợp Phương pháp LPI: chiếu tia UV lên dịch nuôi cấy vi khuẩn ở thời gian thích hợp và trải dịch

đã chiếu tia UV lên môi trường thạch

1.3.3 Cơ chế của đột biến bằng tia cực tím

Đối với các vi sinh vật các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia cục tím

và một số hóa chất

Tia cục tím (hay con gọi tia tử ngoại, tia UV) có bước sóng dài (10-5–

10-6cm) nên khó tạo ion, có lẽ chỉ tác động đến những chất hấp thu nó trực tiếp Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của ADN đã được chúng minh ADN hấp thụ tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 254nm, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến

Tia cực tím có năng lượng thấp được hấp thụ bởi các bazơ purine và pyrimidin biến nó thành dạng hoạt hóa và kích động Vì năng lượng của tia này thấp nên khả năng đâm xuyên vào mô chậm và thường chỉ xuyên vào lớp

bề mặt tế bào của sinh vật đa bào, nên nó thường có tác dụng gây đột biến đối với sinh vật đơn bào Cơ chế hấp phụ UV và gây tạo chất dễ hoạt hóa, khi cytosine + UV + H2O sẽ tạo thành cytosine hydrat, khi có 2 thymine nằm gần cạnh nhau + UV sẽ tạo thành thymine C5 = C5 thymine (thymine dimer) Các dimer cytosine-cytosine và cytosine-thymine cũng được tạo ra nhưng rất ít

Tất cả các dimer đều có khả năng ngăn cản quá trình sao chép ADN Đó cũng chính là lý do tại sao tia UV có thể giết chết đƣợc các vi sinh vật

Hình 1.6 Thymine dirmer đƣợc tạo ra bởi UV (Cytosine có thể hình thành một dimer giống nhau)

Hình 1.7 Cơ chế đột biến bằng tia UV

Đầu tiên tia UV làm cho hai gốc cytosine (C) liền kề hình thành một dimer Trong quá trình sao chép ADN, cả hai sợi đơn đƣợc sử dụng nhƣ sợi khuôn để tổng hợp nên các sợi mới Cytosine dimer bắt cặp với adenine (A) thay vì guanine (G) hình thành sợi mới Trong quá trình sao chép ADN tiếp

theo, CC bị thay thế thành TT Mặc dù cytosine dimer có thể được khôi phục nhưng đột biến không được phát hiện bởi hệ thống sửa chữa ADN

1.3.4 Hệ thống sửa chữa và bảo vệ ADN

Phân tử ADN là đối tượng tác động của các gốc tự do trong các phản ứng ion hóa do hóa chất hoặc các chất alkyl hóa tạo ra Các sai hỏng trong quá trình sao chép ADN có thể được sửa chữa nhờ một hệ thống gọi là hệ thống sửa sai và bảo vệ ADN Nhờ hệ thống này mà các thông tin di truyền của sinh vật ổn định và sinh vật mới có khả năng sống sót trên trái đất

* Sự hồi phục s u tác hại củ ti UV ở Prokaryote nhờ hi n tượng

qu ng tái hoạt h

Dưới tác dụng của tia UV, các đột biến gen sinh ra do tạo các pyrimidine dimer Nếu sau khi xử lý tia UV, ta đưa mẫu ra ngoài ánh sáng thì phần lớn sai hỏng được phục hồi Hiện tượng này được gọi là quang tái hoạt hóa (photoreactivation) Năm 1949, Albert Keiner đã phát hiện thấy hiện

tượng quang tái hoạt hóa ở E.coli Khi đưa các tế bào E coli vừa được xử lý

tia UV ra ngoài ánh sáng thường, hầu như các sai hỏng đều được sửa chữa, các nghiên cứu sau đó đã chứng minh được rằng năng lượng của ánh sáng thường đã hoạt hóa một loại enzym có tên là enzym quang phục hồi (PRE) có khả năng cắt các vòng pyrimidine dimer (thường là các thymin dimer) Đầu tiên, enzym này nhận biết và gắn đặc hiệu vào các dimer (ở trong bóng tối) Khi chỗ sai hỏng được chiếu sáng, năng lượng được sử dụng nhờ phức hệ enzym biến thymin dimer thành các monomer Sau đó, enzym tách ra (hình 1.8) Ở người và các sinh vật Eukaryote, người ta chưa phát hiện thấy có enzym này

Hình 1.8 Cơ chế quang tái hoạt hóa sửa chữa ADN

* Các cơ chế sử chữ ở Prokaryote và Eukaryote

Vào đầu những năm 1960, ngoài enzym quang tái hoạt hóa PRE, người

ta còn phát hiện thấy ở E.coli một hệ thống sửa chữa ADN mà không cần sự

có mặt của ánh sáng Hệ thống này được thực hiện trên cơ chế cắt sửa (excision repair), một cơ chế được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa và có

ở cả Prokaryote và Eukaryote, gồm các bước cơ bản sau:

1 Phát hiện lỗi và cắt bỏ lỗi nhờ một enzym Phản ứng có thể cắt một bazơ, một nucleotit hoặc vài nucleotit gần chỗ lỗi Kết quả để lại một lỗ trống trên chuỗi xoắn kép

2 Enzym polymeraza I lấp chỗ trống bằng cách chèn d-ribonucleotit

bổ sung với nucleotit trên mạch đối Những bazơ bổ sung này sẽ được đưa vào gắn phía đầu 3’- OH trên mạch đang sửa

3 Enzym nối ADN ligaza sẽ hàn gắn khe hở phía sau đầu 3’- OH của bazơ vừa đưa vào và lỗ trống được khép kín ADN plymeraza I được phát

hiện bởi Arthur Kornberg, khi ông nghiên cứu vai trò của enzyme sửa chữa

đột biến polAl ở E.coli do tác nhân gây đột biến tia UV gây ra Các tế bào

mang đột biến polAl không có enzyme polymeraza I và rất nhạy cảm với bức

xạ UV Rất nhiều khả năng các tế bào này cũng không thể lấp lỗ trống sau phản ứng cắt thimin dimer

Hiện nay, có hai cơ chế cắt sửa được biết tới đó là: cắt bazơ và cắt sửa nucleotit

Cơ chế cắt sửa bazơ (BER) có chức năng phục hồi các bazơ nitơ sau khi bị biến đổi do thủy phân ngẫu nhiên do các tác nhân hóa học Đầu tiên, hệ thống BER nhận dạng các bazơ bị biến đổi enzym ADN glycosylaza đặc hiệu với từng loại bazơ Ví dụ, enzyme uracin-AND glycosylaza nhận biến bazơ lạ trong ADN Sau đó enzyme này bị cắt liên kết glycosid giữa bazơ với đường, tạo một vị trí apyrimdin (AP) là vị trí bị mất pyrimidine Tiếp đến, enzyme

AP endoucleaza sẽ nhận biết phân tử đường bị mất bazơ và cắt khung đường ngay tại vị trí AP Lỗi sai vừa tạo ra sẽ được enzyme ligaza hoàn thành nốt phần còn lại (hệ thống BER hoạt động thông qua enzyme ADN glycosylaza,

AP endonucleaza, ADN ligaza Trên hình, U không phải là bazơ bổ sung với

G, bị cắt hay thay thế bằng bazơ C) Mặc dù enzym glycosylaza được nhắc tới

nhiều ở E.coli nhưng ở Eukaryote nó vẫn chưa được biết nhiều Hiện nay,

chưa có mô hình cụ thể nào về hoạt động của BER trong các bệnh ở người và động vật nên việc đánh giá cơ chế BER ở Eukaryote còn là vấn đề cần làm sáng tỏ

Cơ chế sửa sai thứ hai là cơ chế cắt sửa nucleotit (NER), khác với cơ chế trên, cơ chế này sửa các lỗi sai lớn hơn Lần đầu tiên được Howard

Fianders và các cộng sự đã tìm ra cơ chế này ở E.coli Đầu tiên ADN bị gây

đột biến (tia UV) tạo thành các pyrimidime dimer Sau đó có một nhóm gen uvr (gen sửa chữa đột biến do tia UV gây ra) Có 3 kiểu đột biến uvrA, uvrB, uvrC sẽ nhận biết và cắt bỏ các sai hỏng trên ADN Quá trình được hoàn tất nhờ enzym polymeraza I và ADN liagaza (hình 1.9 )