Khái niệm Chương II Hình thái, cấu tạo, sinh sản vi sinh vật Virus nhóm vi sinh vật nhỏ bé, không quan sát kính hiển vi quang học Thành phần hoá học đơn giản, cấu tạo tế bào, sống ký sinh nội bào bắt buộc 2.3 Virus Hình thái virus 2.3.1 Hình thái, kích thước virus a Hình thái virus • Dạng hình cầu: virus cúm, virus quai bị… • Dạng hình que: virus đốm thuốc lá, virus đốm khoai tây • Dạng hình khối: virus đậu mùa, virus khối u người động vật, virus đường hô hấp • Dạng hình nòng nọc: virus ký sinh vi khuẩn - thực khuẩn thể (phage) b Kích thước virus • Rất nhỏ, số virus có kích thước tương đương kích thước phân tử • Kích thước xác định KHV điện tử, chiều dài dao động từ 20nm – 14000nm (0.2 – 14 µm) Dạng hình que Dạng hình khối Dạng hình cầu Dạng hình nòng nọc c Đặc điểm chung virus: • Kích thước nhỏ bé: nanomet (nm=1/109m) • Không có cấu tạo TB: Chỉ mang loại acid nucleic (DNA RNA) bao bọc lớp protein • Ký sinh nội bào bắt buộc: Không có hệ thống sinh tổng hợp protein, khả trao đổi chất, enzyme hô hấp enzyme chuyển hóa • Không nhân lên môi trường dinh dưỡng bình thường (môi trường giàu axit amin, môi trường tổng hợp nhân tạo, môi trường TB tổ chức sống) • Sinh trưởng theo cấp số nhân, không tăng trưởng khối lượng kích thước • Không tạo màng lipid riêng Một số virus biến đổi màng TB vật chủ tạo thành màng bao virus • Phương thức vận chuyển khuyếch tán • Không chịu tác động kháng sinh mức độ TB Phân biệt: Virion, viroid prion: 2.3.2 Cấu tạo virus Virus có khả tạo thành tinh thể: - Virion: hạt/tinh thể virus hoàn chỉnh (vỏ protein + lõi axit nucleic) - Viroid: virus không hoàn chỉnh, gồm ARN dạng vòng , vỏ bọc protein Gây bệnh cho thực vật - Prion: Sialoglycoprotein mạch đơn gọi PrP 27-30 có khối lượng phân tử 27000-30000 daltons, không chứa axit nucleic Gây bệnh động vật Kuru, CreutzfeldtJakob (mad cow), Alzheimer… - Virus thiếu hụt: khiếm khuyết phần gen Chỉ nhân lên có mặt hạt virus khác - Giả virus (pseudovirion): hạt virus nhận vật liệu di truyền tế bào chủ trình chép thay cho axit nucleic virus a Cấu tạo chung (Virus trần): gồm có phần Vỏ protein (Capsid) bao bọc phần lõi axit nucleic Vỏ capsid hình thành từ đơn vị hình thái (gọi capsome) Trật tự xếp capsome khác định hình thái virus: – Cấu trúc xoắn: capsome ghép lại với thành vòng theo chiều xoắn lò so – Cấu trúc khối: capsome xếp tạo thành khối đa diện tam giác – Cấu trúc đặc biệt (thực khuẩn thể, virus đậu mùa…) Lõi (bộ gen) virus: axit nucleic DNA RNA (ds/ss) mang thông tin di truyền; Chiếm 1-2% trọng lượng TB virus b Cấu tạo đặc biệt (Virus có vỏ): • Ngoài thành phần trên, số virus có thêm lớp vỏ (envelope) • Vỏ lipoprotein tạo thành từ hai lớp lipid xen kẽ với phân tử protein (glycoprotein/gai protein: thành phần kháng nguyên vỏ) • VD: virus cúm, đậu mùa Cấu trúc xoắn virus đốm thuốc (Tobaco mosaic virus ) Quan sát KHV có dạng hình que 10 Cấu trúc khối (polyhedral virus) Quan sát KHV: hình khối hình cầu 2.3.3 Đặc điểm sinh sản virus Cấu trúc lớp vỏ virus cúm • Sự nhân lên virus, gồm giai đoạn: Các “gai” glycoprotein – yếu tố độc lực virus cúm: Neuraminidase (NA): NA 19 subtype Giúp virus giải phóng khỏi TB • Hemagglutinin (HA): gây ngưng kết hồng cầu; có 18 loại HA khác Giúp virus xâm nhập: gắn với chuỗi polysaccharide bề mặt TB vật chủ 11 12 Giai đoạn 1.Hấp thụ lên bề mặt tế bào (adsoption) • Trên bề mặt tế bào hạt virus có điểm thụ thể (Recetor) tương ứng với có hấp thụ virus lên bề mặt tế bào tác động lực hút điện động chúng • Thụ thể có tính đặc hiệu cao loại virus hấp thụ gây nhiễm cho loại tế bào định Giai đoạn.2 Giai đoạn xâm nhập virus vào tế bào Virus xâm nhập vào bên tế bào theo chế sau - Thực bào hay ẩm bào - Tiết enzyme đục thủng lỗ màng TB Tế bào chủ tiết men phân huỷ protein vỏ làm cho axit nucleic virus giải phóng - tượng gọi lột vỏ hay cởi áo virus Sự cởi áo diễn không bào 13 tiêu hoá, tế bào chất hay nhân Giai đoạn Giai đoạn tổng hợp thành phần virus a) Bước tổng hợp mARN - bước chép thông tin: • Sự tổng hợp mARN theo khuôn mẫu axit nucleic (ADN, ARN) - thiết kế virut • mARN thực nhiệm vụ làm khuôn mẫu cho tổng hợp axit nucleic điều khiển trình tổng hợp protein b) Bước tổng hợp protein sớm • mARN chuyển thông tin di truyền virus đến polyriboxom TB để tiến hành tổng hợp protein sớm: - Protein ức chế: đình hoạt động tế bào chủ - Protein hoạt hoá: enzyme ADN- polymerase ARN - polymerase xúc tiến trình tổng hợp ADN ARN 14 Giai đoạn Giai đoạn lắp ráp c Bước tổng hợp thành phần virus (lõi vỏ) - Sự tổng hợp axit nucleic • Virus trần: phần tử protein kết hợp với để tạo thành vòng cung protein capsid axit nucleic nhồi vào vòng cung khép kín lại • ARN virus tổng hợp nguyên sinh chất tế bào chủ • ADN (trừ nhóm Poxvirus) tổng hợp nhân tế bào chủ • Với virus có vỏ: lắp ráp axit nucleic với vỏ capsid trên, vỏ virus khoác bọc lại virus chui qua màng tế bào - Sự tổng hợp protein cấu trúc - protein muộn Giai đoạn Giai đoạn giải phóng • Quá trình tổng hợp protein cấu trúc thường xảy sau tổng hợp axit nucleic Quá trình thực nhờ mARN sARN, xảy tế bào chất TB • Các protein muộn không cấu trúc cần cho tổng hợp virion mà có enzyme cần cho trình chín enzyme dùng giải phóng virus khỏi tế bào chủ -Cơ chế nổ tung: Virus tiết enzyme phá hủy màng TB virus ạt chui TB chủ bị tan rã hoàn toàn -Cơ chế từ từ: Virus tiết enzyme chọc thủng lỗ màng tế bào chui từ từ TB tồn thời gian - Cơ chế bắc cầu: số virus (Herpes, đậu) truyền từ TB bị nhiễm sang TB lành thông qua cầu nối nguyên sinh chất hình thành tế bào 16 15 Đọc thêm: Cơ chế tác động thuốc kháng virus 2.3.4 Sự sinh sản Bacteriophage Amantadine: Tác dụng giai đoạn 1, tức ức chế hòa nhập virus vào bên tế bào ký chủ - Ribavirin: Tác dụng giai đoạn 2, tức ức chế virus (đặc biệt virus cúm) tổng hợp RNA nó, từ ức chế chép virus bên tế bào Cũng thuộc loại này, Acyleovir ức chế tổng hợp DNA virus Herpes - Zidovudine (Retrovir, gọi tắt AZT): Ðây thuốc trị HIV Cơ chế thuốc ức chế phiên mã ngược RNA thành DNA HIV làm cho HIV ngưng phát triển, không sinh sản Cũng thuộc loại có Didanosine, Zalcitabine, Lamivudine - Oseltamivir (Tamiflu): Thuốc có tác dụng giai đoạn cuối, tức ngăn không cho virus cúm chép trưởng thành phóng thích khỏi tế bào cách ức chế men neuraminidase (chính kháng nguyên N lớp vỏ virus 18 cúm) - 17 • Thuốc ức chế protease: Indinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir (điều trị HIV) Cơ chế tác động: làm cho men phân giải đạm HIV không hoạt động không nhân lên! • Gamma globulin Interferon: Gamma globulin ngăn virus xâm nhập vào TB có chứa kháng thể chống lại kháng nguyên bề mặt nằm lớp vỏ virus Còn Interferon kháng virus cách ngăn cản virus tổng hợp protein, RNA DNA TB Sự kháng thuốc: Thay đổi hình dạng để kháng thuốc - virus (cúm A) chế chỉnh sửa sai sót trình chép dẫn đến biến đổi cấu trúc gen virus xuất phân type virus với kháng nguyên - Virus cúm trao đổi, trộn lẫn chất liệu gen để chuyển từ loài sang loài khác sản sinh virus lai phân type virus Do vào lúc này, virus "đích tác dụng" số thuốc kháng virus, vào lúc khác, lại thay đổi không "đích tác dụng" thuốc 19 b Nuôi cấy phôi gà phát triển a Nuôi cấy động vật thí nghiệm • Ứng dụng trong: Phân lập virus; Nghiên cứu đặc tính sinh học virus; Cơ chế gây bệnh thể/các tổ chức riêng biệt; Chế tạo vacxin (dại, viêm não) • Loại động vật: Chọn động vật cảm thụ thích ứng với loại virus dùng gà giò cho virut newcastle, chuột nhắt trắng cho virus viêm não, sóc cho virus cúm, lợn choai cho virus dịch tả lợn • Vị trí gây nhiễm: chọn dựa vào tính chất gây bệnh loại virus mục đích nghiên cứu nhỏ mũi/tiêm vào khí quản (virus đường hô hấp); tiêm vào não (virus hướng thần kinh: dại, viêm não); vạch da (virus hướng thượng bì virus đậu); tiêm vào xoang bụng với virus hướng phủ tạng Nhược điểm: Nuôi cấy phức tạp tốn kém, dễ gây lây lan bệnh; Vấn đề “súc quyền” 20 Nuôi cấy virus phôi gà • Được sử dụng rộng rãi đa số virus phát triển phôi gà • Phương pháp đơn giản thuận lợi, kinh tế, cho kết nhanh thu lượng virus lớn thời gian ngắn • Tùy thuộc vào loại virus mà chọn tuổi phôi thích hợp lựa chọn đường tiêm vào tổ chức khác phôi: Virus đường hô hấptiêm túi niệu túi ối, virus hướng da tiêm màng niệu đệm, virus hướng thần kinh tiêm vao túi lòng đỏ, màng niệu đệm não • Sau tiêm dùng parafin vô trùng gắn lỗ tiêm tiếp tục ấp 36oC/ 2-3 ngày theo dõi biến đổi đại thể tổ chức phôi để đánh giá phát triển virus 2.3.5 Nuôi cấy virus gây bệnh động vật 1.Soi trưng đánh dấu, đục lỗ Tiêm trứng, gắn Paraffin nuôi cấy Thu hoạch phôi đánh giá 21 Đánh giá biến đổi đại thể tổ chức phôi 22 niệu Nuôi cấy virus cúm A phôi gà 10 ngày tuổi thu dịch túi c Nuôi cấy tế bào tổ chức • Nuôi cấy tế bào mô người động vật môi trường dinh dưỡng tự nhiên gồm huyết động vật, nước ép thai, chất đệm hay môi trường tổng hợp gồm axit amin, hydratcacbon, lipit, muối khoáng có thêm huyết để chúng phân chia tăng số lượng tế bào Cấy virus vào TB • Virus sinh trưởng tăng số lượng làm thoái hóa TB: gây biến đổi đặc trưng tế bào - CPE (Cytopathic Effect): Thu tế bào mô nuôi cấy MT nhân tạo Gây nhiễm virus vào tế bào - Dung giải tế bào (lysis cells) - Hình thành không bào bên tế bào (vacuolation) - Hình thành TB lớn đa nhân (syncytia) - Xuất thể vùi (inclusion bodies) • Căn vào CPE quan sát kính hiển vi quang học để đánh giá kết nuôi cấy 23 CPE tế bào trước sau gây nhiễm với virus cúm 24 2.3.6 Hiện tượng cản nhiễm Interferon a Hiện tượng cản nhiễm (interference) • Khái niệm: Sự xâm nhiễm số loại virus vào tế bào trước ngăn cản nhân lên virus xâm nhiễm vào tế bào • Có thể phân biệt tượng cản nhiễm khác nhau: - Hiện tượng cản nhiễm đồng loại: hai virus loại cản - Hiện tượng cản nhiễm dị loại: Hai virus khác loại cản - Hiện tượng tự cản nhiễm: Do loại virus trình nhân lên ngăn cản lại cháu xâm nhiễm vào tế bào khác • Ưng dụng tượng cản nhiễm kỹ thuật gây miễn dịch, sử dụng virus độc lực yếu để ngăn ngừa cảm nhiễm sau virus có độc lực mạnh 25 26 2.3.7 Sự đề kháng virus b Interferon Tất TB động vật có khả sinh interferon Là protein hình thành TB bị nhiễm virus hay nguồn thông tin lạ tế bào (vi khuẩn, độc tố nấm mốc…) Interferon tác dụng chống virus bên TB mà có tác dụng vào TB sinh AVP (antiviral protein) Không có tác dụng bảo vệ tế bào gốc - tế bào sinh interferon mà bảo vệ tế bào bên cạnh Interferon có tác dụng đặc hiệu loại TB cần bảo vệ Quá trình virus xâm nhập vào TB: - Lysis: gây dung giải TB virus sinh sản, nhân lên TB phá hủy TB để giải phóng - Lysogeny: Khi virus xâm nhập vào TB giải phóng gen phân cắt thành mảnh gắn vào NST TB chép nhân lên NST TB TB không bị phá hủy Ngăn cản virus loại vào sau Hiện tượng cản nhiễm Ứng dụng điều trị bệnh ung thư (virotherapy): virus tìm tiêu diệt TB u ác tính không làm tổn hại TB lành VD: Rigvir Latvia sản xuất ; OncoVEX GM-CSF BioVex sản xuất Virus đề kháng yếu với nhân tố ngoại cảnh a Nhân tố vật lý - Nhiệt độ: Virus ưa nhiệt độ thấp, chịu nhiệt độ cao kém: Đa số virus bất hoạt 55-60o C 5-30 phút, số chịu nhiệt độ 6580o C/ 30 phút - Các tia xạ âm thanh: Các tia xạ tia tử ngoại, tia rơn-ghen, 27 Đề cương ôn tập chương II tia , tia làm bất hoạt nhanh chóng tất virus; Sóng âm cao tần có khả làm tan virut thành mảnh b Nhân tố hóa học - Độ pH: Đa số virus chịu độ pH từ đến Mức pH