VSVDC ChươngIII 2016

Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Chương III SINH LÝ HỌC VI SINH VẬT Nội dung chương 3.1 Dinh dưỡng trao đổi chất - Nhu cầu dinh dưỡng vsv - Các kiểu dinh dưỡng vsv - Các hình thức vận chuyển qua màng vsv - Quá trình trao đổi chất: phân giải tổng hợp 3.2 Sinh trưởng phát triển vsv - Lý thuyết sinh trưởng - Đặc điểm sinh trưởng vsv môi trường - Một số phương pháp xác định sinh trưởng vsv 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 3.1.1 Dinh dưỡng vi sinh vật 3.1 Dinh dưỡng trao đổi chất 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Chất dinh dưỡng vi sinh vật chất VSV hấp thu từ môi trường xung quanh sử dụng làm nguyên liệu cho trình sinh tổng hợp cho trình trao đổi lượng tế bào a Thành phần hóa học tế bào • Nước thành phần chủ yếu tế bào vi sinh vật Nước chiếm khoảng 70-80% khối lượng thể vi sinh vật • Các thành phần lại: - protein: 50% trọng lượng khô TB (TLKTB) - Carbohydrate: chiếm 10% TLKTB - Lipid: chiếm 10% TLKTB - Nucleic acid chiếm 20% TLKTB - Các chất vô cơ: chiếm 3% TLKTB 8/26/2016  Nước thành phần thiếu để vi sinh vật - Nước (cung cấp H O) - Carbon: carbon hữu (polysacarit, protein, lipit); carbon vô (CO2, muối carbonat)  cung cấp lượng cho TB - Nitrogen: N hữu (protein, axit amin), vô (muối amon NH4+, muối nitrat NO3-), phân tử N2 (vsv cố định đạm) - Muối khoáng (P, K, Na, S…) - Các chất đăc hiệu (vitamin, kháng sinh…) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Nước b Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê sinh trưởng Chức sinh lý nước tế bào là:  Hoà tan chuyển vận chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng sản phẩm trao đổi chất  Tham gia vào hàng loạt phản ứng hóa học tế bào  Duy trì cấu hình thiên nhiên ổn định đại phân tử protein, acid nucleic  Là thể dẫn nhiệt tốt, hấp thu tốt nhiệt lượng sinh trình trao đổi chất khuếch tán kịp thời bên để trì ổn định nhiệt độ bên tế bào  Duy trì hình thái bình thường tế bào 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Nhu cầu vsv nước: Aw (Water activity): độ hoạt động nước P: áp lực dung dịch Po: Áp lực nước  Nước nguyên chất Aw =  VSV chịu áp (MT có Aw thấp): số nấm men nấm mốc chịu hạn – xerophilic fungi)  Aw < 0,6: VSV ngừng sinh trưởng 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 8/26/2016 Nguồn cung cấp C, lượng, điện tử vsv 3.1.2 Các kiểu dinh dưỡng VSV Nguồn Carbon)  Căn vào khả đồng hoá VSV nguồn dinh dưỡng Carbon phân hai nhóm: - Nhóm vsv tự dưỡng (autotrophs): Đồng hoá nguồn dinh dưỡng chất vô - Nhóm vsv dị dưỡng (heterotrophs): Đồng hoá nguồn dinh dưỡng chất hữu  Căn vào nguồn lượng sử dụng: - Nhóm vsv quang (phototrophs): Sử dụng lượng từ ánh sáng mặt trời ánh sáng nhân tạo - Nhóm vsv hóa (chemotrophs): Sử dụng lượng từ phản ứng hóa học xảy tế bào - Tự dưỡng (autotroph) - Dị dưỡng (heterotroph) Nguồn lượng - Quang (phototroph) - Hóa (chemotroph) Nguồn cung cấp điện tử - Vô - Hữu 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê  Căn nguồn lượng nguồn Cacbon mà VSV sử dụng để đồng hoá chất, chia làm nhóm dinh dưỡng: - Tự dưỡng quang (Photoautotroph ) - Tự dưỡng hóa (Chemoautotroph) - Dị dưỡng quang (Photoheterotroph) - Di dưỡng hóa (Chemoheterotroph)  Nếu nguồn dinh dưỡng đồng hóa Ni-tơ: - Tự dưỡng amin - Dị dưỡng amin 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 11 CO2 nguồn C nhất/ chủ yếu Nguồn C chất hữu Nguồn lượng ánh sáng tự nhiên/nhân tạo Nguồn lượng lượng hóa học thu từ trình oxy hóa hợp chất tế bào Sử dụng phân tử vô dạng khử để cung cấp điện tử Sử dụng phân tử hữu để cung cấp điện tử 10 a Tự dưỡng quang năng: Là nhóm VSV sử dụng lượng ánh sáng mặt trời/nhân tạo để đồng hoá nguồn C chủ yếu CO2 với nguồn cung cấp H hợp chất vô  VSV có sắc tố quang hợp: bacteriochlorophyll a, b, c, d hay carotenoid  VSV quang năng:Tảo lục, vi khuẩn lam, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (họ Chlorobiaceae), vi khuẩn lưu huỳnh tía (họ Chromatiaceae) 8/26/2016 12 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 b Dị dưỡng quang năng: c Tự dưỡng hoá năng: • Là nhóm VSV sử dụng lượng ánh sáng để đồng hoá CO2 nguồn cung cấp H hợp chất hữu rượu, axit hữu đơn giản • Thuộc loại có giống vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục, màu tía Rhodospirillum rubrum (xoắn khuẩn màu hồng hay đỏ tía) • Là nhóm VSV sử dụng lượng từ oxy hoá chất vô để đồng hoá C vô (CO2) • Nhóm vsv tự dưỡng hóa năng: VK phân giải lưu huỳnh, VK phân giải sắt, VK nitrat, nitrit hóa, VK oxy hóa methane, VK sử dụng hydrogen… • Sơ đồ tổng quát: VK oxy hóa hợp chất vô để giải phóng lượng  tham gia vào trình tổng hợp cac chất dinh dưỡng 8/26/2016 13 d Dị dưỡng hoá năng: • Là nhóm VSV sử dụng lượng từ oxy hoá chất hữu để thực trình sinh tổng hợp chất cần thiết cho tế bào • Phần lớn nhóm VSV thuộc nhóm này: phần lớn vi khuẩn, nấm, protozoa) • Tuỳ theo loại VSV khác mà tiến hành trình oxy hoá cho lượng khác nhau: 8/26/2016 15 8/26/2016 14 3.1.3 Hấp thu chất dinh dưỡng VSV  Các chất vận chuyển qua màng tế bào chất thông qua hai chế:  Vận chuyển thụ động (Khuếch tán đơn giản): Các chất qua màng NSC nhờ chênh lệch nồng độ hai phía màng (không tiêu tốn lượng tế bào)  Vận chuyển chủ động: Các chất qua lại màng NSC nhờ liên kết với phân tử vận chuyển đặc biệt nằm màng Những phân tử gọi pecmeaza (protein thấm) Vận chuyển chủ động cần tiêu tốn lượng tế bào 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 16 a1: Khuếch tán đơn giản (simple diffusion): a Vận chuyển thụ động  Các phân tử qua màng nhờ chênh lệch nồng độ (trong trường hợp chất không điện phân) hay chênh lệch điện (trường hợp ion) hai phía màng  Kiểu vận chuyển không tiêu tốn lượng tế bào vi sinh vật  Có hình thức vận chuyển thụ động: - Khuếch tán đơn giản (simple diffusion) - Khuếch tán xúc tiến (kt gia tốc- facilitated diffusion) - Sự thẩm thấu (osmosis )  Là hình thức vận chuyển chất hòa tan từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp không tiêu tốn lượng  Sự khác biệt nồng độ chất bên màng NSC tạo nên gradient nồng độ phần tử chất từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp đạt tới cân động hai bên màng mà không đòi hỏi phải cung cấp lượng  KTĐG phụ thuộc vào động (kinetic energy) phần tử nên khuếch tán xảy nhanh (1) nhiệt độ tăng, (2) gradient nồng độ lớn (3) vật thể có kích thước nhỏ  Lipid, chất tan lipid oxy, nitơ, CO2, vitamin tan dầu (như vitamin A, D, E, K), rượu, cồn 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 17 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 18 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 a2 Khuếch tán xúc tiến (facilitated diffusion) • Là khuếch tán nhờ vai trò protein mang • Đặc điểm: Tốc độ khuếch tán tăng dần đến mức tối đa dừng lại, nồng độ chất khuếch tán tiếp tục tăng  Những chất vận chuyển khuếch tán xúc tiến: có kích thước lớn không màng phương thức khuếch tán đơn giản (glucose, mannose, galactose, xylose, arabinose phần lớn acid amin) Khuếch tán đơn giản 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 19 • Là tượng vận chuyển thụ động phân tử nước từ nơi có nồng độ nước cao (nồng độ chất hòa tan thấp) tới nơi có nồng độ nước thấp (nồng độ chất hòa tan cao) 20  Môi trường có nồng độ chất tan cao nồng độ chất tan tế bào  Môi trường Ưu trương  Môi trường có nồng độ nước cao nồng độ nước tế bào  môi trường Nhược trương Phân tử nước vận chuyển môi trường có nồng độ nước chất tan khác ?  Nồng độ nước/chất tan cân môi trường TB  MT đẳng trương TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 21 b Vận chuyển chủ động - Hình thức vận chuyển thực qua vai trò protein xuyên màng đặc hiệu, đóng vai trò bơm hoạt động nhờ ATP để đẩy ion Na+, K+, H+, Ca2+, I-, Clhoặc phân tử nhỏ acid amin, monosaccharide ngược lại chiều gradient nồng độ chúng - Các hình thức vận chuyển chủ động; + Bơm ion (ion pump – vận chuyển chủ động nguyên phát) + Đồng vận chuyển (cotransport – VCCĐ thứ phát) + Nhập bào (endocytosis) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 22 b1: Bơm ion: Bơm Natri-kali - Là hình thức vận chuyển sử dụng lượng ATP nhằm đưa chất tan ngược chiều gradient nồng độ chúng 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Hiện tượng thẩm thấu (Osmosis) a3 Thẩm thấu (osmosis) 8/26/2016 8/26/2016 23 • Bơm natri - kali (bơm Na+ - K + - ATPase): bơm Na+ khỏi tế bào, đồng thời bơm K + vào tế bào Bơm natri - kali có màng loại tế bào • Bơm natri - kali protein mang có hai phân tử protein dạng cầu, to nhỏ Chưa biết chức phân tử protein nhỏ Protein to có vị trí tiếp nhận (receptor) đặc hiệu với Na+ mặt vị trí tiếp nhận (receptor) đặc hiệu với K + mặt Ở mặt trong, gần receptor tiếp nhận Na+ có enzyme ATPase • Khi có Na+ gắn mặt K + gắn mặt phân tử protein mang enzyme ATPase hoạt hoá, phân giải phân tử ATP giải phóng lượng Năng lượng làm thay đổi hình dạng phân tử protein mang, để đưa Na+ K + vào tế bào 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 24 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Video: Bơm Na - K 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 25 b2: Đồng vận chuyển (cotransport) • Những chất chiều với Na+ gọi "đồng vận-symport", chất ngược chiều gọi "đối vận -antiport" hay "đổi chỗ" TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 26 b4 Nhập bào (endocytosis) • Là trình vận chuyển lúc chất qua màng • Ví dụ: Bơm Na+ - K+ - ATPase hoạt động tạo nồng độ Na+ cao bên màng tế bào Nồng độ cao năng, có xu hướng làm Na+ khuếch tán vào bên trong, Na+ vào "kèm theo" chất khác gắn vào chất mang chung với Na+ 8/26/2016 8/26/2016 27 • Là hình thức vận chuyển tế bào có nhân thật (Eukaryotes)  Thực bào (phagocytosis- tế bào ăn): Hấp thu chất dinh dưỡng chất rắn,có kích thước lớn • Các sản phẩm tiếp xúc với màng tế bào màng tế bào lõm vào tạo túi thực bào, túi thực bào tách khỏi màng tế bào màng lại trở trạng thái bình thường  Ẩm bào (pinocytosis - tế bào uống): trình diễn trên, khác chất nhập bào dịch lỏng chất tan có kích thước nhỏ • Tiêu hóa qua receptor trung gian (receptor-mediated endocytosis): màng tế bào lõm vào receptor protein đặc biệt gắn với chất nhập bào để tạo thành túi thực bào 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 28 Video: Vận chuyển qua màng vsv Vận chuyển qua receptor trung gian nấm men 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 29 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 30 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 3.2 Trao đổi chất vsv (metabolism) Bài tập: Cho biết hình thức vận chuyển hình 3.2.1 Khái niệm chung a Khái niệm trao đổi chất: Là chuyển hoá có liên quan đến qúa trình tổng hợp phân huỷ tế bào Trao đổi chất gồm có hai trình đồng hoá dị hoá • Quá trình đồng hoá (anabolism): Tổng hợp chất hữu phức tạp từ chất đơn giản (quá trình chế biến lại chất dinh dưỡng hấp thụ thành chất riêng tế bào loại vi sinh vật) Quá trình trình sử dụng lượng • Quá trình dị hoá (catabolism): trình phân cắt phân tử hữu phức tạp (từ TA) thành phân tử đơn giản cung cấp lượng (ATP) cho hoạt động sống TB  Quá trình tạo lượng  Ở vi sinh vật, trình TĐC tổng hợp phản ứng hoá học diễn tế bào, gồm hai dạng: Hô hấp Lên men 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 31 32 3.2.2 Quá trình hô hấp vi sinh vật Đường phân Là trình oxi hóa khử hợp chất hữu cơ, chủ yếu carbonhydrate  Đối với vsv trình oxi hóa khử thực cách tách H khỏi chất chuyển cho chất nhận khác nhau: oxi phân tử (O2), chất hữu chất vô  VSV có kiểu hô hấp: Yếm khí hiếu khí Đối với hô hấp carbonhydrate  giống trình đường phân • Là chuỗi phản ứng hóa học biến glucose thành axit pyruvic giải phóng NL  Lưu ý: Xem lại chu trình Kreb, Chuỗi hô hấp, vận chuyển điện tử phần Hóa sinh đại cương 8/26/2016 33 a Hô hấp hiếu khí Ở vsv nhân thật, glucose bị oxi hoá tận cho 36 ATP; Ở nhân sơ 38 ATP  Hô hấp hiếu khí nguồn cung cấp lượng ATP cho hoạt động sống TB Quá trình hô hấp diễn ty thể (TB nhân thật) màng NSC (TB nhân sơ)  Một số nấm sợi, vi khuẩn oxi hóa không triệt để hợp chất hữu  CO2 H2O mà tạo sản phẩm trung gian axit hữu cơ: - Nấm Aspergillus niger  cho axit oxalic - Nấm Mucor, Rhizopus  cho axit fumaric - Vi khuẩn axitic thuộc giống Acetobacter  oxi hoá ethanol  axit axetic TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 34 b Hô hấp yếm khí  Quá trình hô hấp diễn điều kiện có oxy để chuyển hóa glucose thành CO2 cung cấp lượng (ATP) cho TB  Gồm giai đoạn: đường phân, Kreb cycle, chuỗi vận chuyển điện tử  Chất nhận điện tử: Oxy phân tử  Sản phẩm cuối cùng: 8/26/2016 8/26/2016 35 • Là trình phân giải hợp chất carbohydrate điều kiện oxy • Gồm giai đoạn: Đường phân  chu trình Kreb chuỗi hô hấp, vận chuyển điện tử giống hô hấp hiếu khí • Trong ĐK oxy: NADH+H+ bi oxy hóa trở lại thành NAD+  Mục đích: để tái tạo NAD+ trình đường phân tiếp tục điều kiện oxy • Chất nhận điện tử: chất vô cơ: NO3-, SO42-, CO32- NO3- (nitrate) bị khử  thành NO2- (nitrite) - SO42- (sulfate) bị khử  H2S (hydrogen sulfide) - CO32- (carbonate) bị khử  CH4 (methane) • Tạo thành 2-36 ATP • Khả sinh ATP thấp so với hô hấp hiếu khí phần chu trình Kreb diễn điều kiện oxy Một số vk Pseudomonas, Bacillus oxy hóa nitrit nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O) khí N2  có vai trò quan trọng vòng tuần hoàn N tự nhiên 36 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 3.2.3 Lên men a.Lên men lactic : Pyruvat tạo thành trình đường  Là trình oxy hóa không hoàn toàn đường glucose hợp chất hữu khác điều kiện oxy  Axit pyruvic hình thành trình đường phân không tham gia vào chu trình Kreb, chuỗi hô hấp  bị khử để tạo thành a lactic, ethanol sản phẩm khác  Giải phòng lượng nhỏ lượng: ATP  Chất nhận điện tử cuối cùng: hợp chất hữu  Sản phẩm tạo thành qua trình lên men nhờ vsv: - Ethanol + CO2 - Các dung môi hữu cơ: acetone, butanol - Các axit hữu cơ: a lactic, a axetic - Vitamin, kháng sinh, hormone, axit amin… Các trình lên men  gọi theo sản phẩm tạo thành • Lên men lactic • 8/26/2016 Lên men rượu TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 37 b Lên men rượu  A pyruvic hình thành trình đường phân bị khử thành ethanol CO2 qua hai bước sau: - Bước 1: Pyruvate bị khử carboxyl nhờ pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde - Bước 2: Acetaldehyde bị khử thành ethanol nhờ NADH enzyme alcohol dehydrogenase Ứng dụng: -Sản xuất cồn - Sản xuất rượu/bia, đồ uống có gas, dấm…  Ethanol hình thành lên men tiếp đê hình thành axit acetic (dấm) nhờ vk Acetobacter  Axit acetic lên men tiếp  methan (CH4) vk Methanosarcina 39 Đặc điểm: - Quá trình phân giải xơ trải qua giai đoạn khác với tham gia enzyme Cellulase khác là:  C1: Cellobiohydrolase  Cx: Endoglucanase Exoglucanase  -glucosidase - Sản phẩm trình phân giải: glucose -Các vsv phân giải xơ TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Glucose (fructose) Lactic acid + ATP Lên men lactic dị hình: trình lên men mà sản phẩm cuối thu axit lactic có có sản phẩm khác axit axetic, ethylic, CO2… Ứng dụng: Sản xuất a lactic công nghiệp; Lên men sản phẩm sữa (sữa chua, phomat…); sản phẩm thực vật (muối dưa…); Ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhai lại; Sản xuất chế phẩm probiotics… 8/26/2016 38  Quá trình phân giải VSV: trình phân giải chất dinh dưỡng môi trường thành chất đơn giản nhờ enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulase …)  Sản phẩm trình phân giải VSV hấp thu để sinh tổng hợp thành phần tế bào tiếp tục phân giải theo kiểu hô hấp hay lên men •Sự phân giải hợp chất không chứa N •Sự phân giải hợp chất chứa N 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 40  Vi sinh vật hiếu khí: - Một số giống niêm vi khuẩn Cytophaga, Sporocytophaga, Cellulomonas - Một số loài vi khuẩn: giống Bacillus, Clostridium - Một số loài thuộc giống xạ khuẩn Streptomyces - Nấm mốc: Trichoderma, Aspergillus  Vi sinh vật yếm khí: điển hình loài vi khuẩn sống cỏ loài nhai lại Ruminococcus - Ứng dụng: Các enzyme phân giải cellulose phân lập từ vsv ứng dụng lĩnh vực: Phân giải xơ (cellulose) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê cuối axit lactic Vi sinh vật phân giải xơ: a Sự phân giải hợp chất không chứa N 8/26/2016 Lên men lactic đồng hình: Là trình lên men mà sản phẩm 3.2.3 Quá trình phân giải hợp chất môi trường  Được thực nấm men môt số vi khuẩn 8/26/2016 phân bị oxi hóa nhờ enzyme lactase dehydrogenase thành a lactic + Sản xuất phân bón vi sinh (nấm trichoderma….) + Tham gia phân giải chất xơ đất tăng độ phì nhiêu đất, cung cấp chất dinh dưỡng cho trồng + Sử dụng enzyme từ vsv cellulase … để sản xuất chất tẩy sinh học (bột giặt….) 41 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 42 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Một số nấm sợi có khả phân giải chất xơ tốt Phân giải xylan • Xylan loại hemicenlullose phân bố rộng tự nhiên có nhiều thành phần tế bào thực vật, rơm rạ, bẹ ngô, trấu… - Vi sinh vật phân giải xylan: sinh enzyme xylanase + Những VSV phân giải cellulose phân giải xylan +Trừ vài loại VSV (Clostridium) hầu hết enzyme xylanase sinh có mặt xylan chất cảm ứng - Quá trình phân giải: nhờ enzyme xylanase + Hemicellulose (xylan) bị thủy phân nhờ xylanase  thu hexose (mannose, galactose ) pentose (arabinose, xylose) Vi nấm Trichoderma sp Aspergillus 8/26/2016 Mucor Ứng dụng: Enzyme xylanase thu từ vsv ứng dụng để: - Sản xuất phân bón vi sinh hữu - Phân giải chất xơ đất  cung cấp dinh dưỡng cho - Sử dụng hemicellulase sản xuất rượu vang nho Fusarium TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 43 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 44 Sự phân giải pectin •Pectins tồn dạng: Rhamnogalacturonans, Arabinans, Galactans Arabinogalactans •Vi sinh vật phân giải pectin: VK (Bacillus), xạ khuẩn (Streptomyces nocardia), Nấm mốc (Mucor stolonifer), Nấm men (Saccharomyces fragilis) •Quá trình phân giải pectin: Nhờ enzyme pectinase gồm loại: Pectin acetylesterase, Rhamnogalacturonase, Polygalactorunase Pectin esterase • Sản phẩm trình phân giải: Các pectin bị thủy phân  tạo thành chất hòa tan axit galacturonic, arabinose, xylose, galactose, axit acetic, methanol • Phần lớn pectin có loại hạt có dầu (đỗ tương, hạt hướng dương, hạt cải dầu…) Trong ngũ cốc (ngô 5-7%) với tỷ lệ thấp • Trong thành phần nonstarch polysaccharide (NSP) đỗ tương, pectin chiếm tỷ lệ lớn 50-55%, tồn hai dạng: Arabinogactactan Galacturonan Động vật dày đơn enzyme tiêu hóa pectin 45 46 Sự phân giải lignin: Ứng dụng trình phân giải pectin vsv  Các vsv có khả phân giải pectin sử dụng để sản xuất enzyme pectinase công nghiệp Enzyme thu được sử dụng lĩnh vực:  Trong sản xuất nước rượu nho: Enzyme pectinase sử dụng nhằm mục đích tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả, làm dung dịch  Sản xuất thức ăn gia súc: pectinase bổ sung vào thức ăn để tăng khả tiêu hóa chất xơ động vật dày đơn  Công nghiệp sợi, dệt, làm bao bì… (đay, gai Ngâm vào bể có vsv phân giải pectin  sợi đay, gai rời nhau, bóng sạch)  Phân giải hợp chất xơ đất  cung cấp chất dinh dưỡng cho trồng  Sản xuất phân bón vi sinh hữu 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 47 • Vi sinh vật phân giải lignin: -Nấm (Acomycestes, Basidiomycetes); Xạ khuẩn (Streptomyces) Vi khuẩn (Pseudomonas Flavobacterium, Agrobacterium ) • Quá trình phân giải: VSV tiết enzyme Ligninase gồm Lignin peroxidase; Manganese peroxidase; Laccase • Các sản phẩm phân giải lignin: axit a gallic, a protocatechic VSV huy động phần vào tổng hợp chất mùn đất, phần khác bị oxi hoá tiếp thành chất vô • Ứng dụng lĩnh vực - Xử lý rác thải; Sản xuất phân bón vi sinh hữu Phân giải chất xơ đất  tăng độ phì nhiêu cho đất Sản xuất nhiên liệu sinh học (cồn…) Chế biến thức ăn chăn nuôi : 48 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Tóm tắt trình phân giải lignin chất xơ khác 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 49 • Vi sinh vật phân giải tinh bột: - -amylase: Vi khuẩn (Bacillus subtilis, B licheniformis, B megaterium; Lactobacillus brevis…), Nấm men (Candida sitophila, C.japonica); Nấm sợi, Xạ khuẩn - -amylase: chủ yếu thực vật Một vài vsv có sinh -amylase như: Bacillus megaterium, B polymyxa, B cereus; Streptomyces… - Glucoamylase: Nấm sợi sản sinh nhiều nhóm vsv (Aspergillus sp., Rhizopus sp., Endomyces sp….) Ứng dụng: - Sản xuất thực phẩm - Sản xuất rượu, bia -Chế biến thức ăn chăn nuôi: lên men cám gạo, bột ngô với nấm men… - Xử lý nước thải … 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 51 50 Phân giải hợp chất carbohydrate vsv cỏ: VSV cỏ (chủ yếu vi khuẩn)  lên men carbohydrate đê giải phóng lượng + khí (CH4, CO2) axit béo bay (VFA): a axetic, a.propionic, a butyric (95%) 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 52 VSV phân giải lipid: Anaerovibrio lipolytica - VSV tiết enzyme lipase thủy phân lipid  glycerol axit béo - Glycerol lên men  axit béo bay - Axit béo vk sử dụng để tổng hợp phospholipid màng TB - VSV cỏ khử axit béo không no  axit béo no VSV thủy phân lipid nhờ tiết enzyme lipase  thành sản phẩm cuối glycerol axit béo: - Glycerol chuyển hóa thành dihyroxyacetone phosphate  tham gia vào trình đường phân  sản phẩm cuối pyruvate - Axit béo bị oxi hóa  axetyl CoA  tham gia vào chu trình Kreb TS Nguyễn Thị Tuyết Lê • Đơn vị cấu tạo tinh bột -glucose liên kết với liên kết glucosid Trong tinh bột có hai thành phần amylose (20%) amylopectin (80%) • Vi sinh vật phân giải tinh bột có khả tiết môi trường enzyme amilase • Enzyme Amylase phân giải tinh bột: α-amylase, -amylase, γamylase (glucoamylase) • Sản phẩm cuối trình thủy phân tinh bột đường đơn (glucose, mannose…) Phân giải lipid vsv cỏ: Phân giải lipid 8/26/2016 Phân giải tinh bột 53 54 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 b Sự phân giải hợp chất có chứa N Phân giải protein • Vi sinh vật phân giải protein: Hầu hết VSV phân giải protein mức độ khác nhau, hoạt tính protease cao thuộc giống nấm mốc vi khuẩn • Enzyme: protease, peptidase Quá trình phân giải protein axit amin protease peptidase • Quá trình phân giải: - Axit amin tế bào hấp thu, phần sử dụng tổng hợp protein tế bào, phần tiếp tục phân giải thành NH3 - Các hợp chất C lại tham gia vào chu trình Kreb bị khử carboxyl thành  CO2 sản phẩm trung gian khác Ứng dụng trình phân giải protein vsv: - Chế biến thực phẩm: tương, xì dầu, nước mắm….(nấm Aspergillus oryzae…) - Xử lý chất thải chăn nuôi, rác thải… - Sản xuất enzyme protease từ vsv quy mô công nghiệp - Phân giải hợp chất chứa N đất  tăng độ phì nhiêu đất, cung cấp chất dinh dưỡng cho trồng 8/26/2016 55 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 56 Sự phân giải urê • Urê hợp chất hữu đơn giản chứa tới 46,6% N • Urê thành phần N hữu chủ yếu nước tiểu động vật (chiếm (2,2%) • Nêu đặc điểm trình phân giải hợp chất vi sinh vật • Ứng dụng tác hại trình phân giải vi sinh vật đời sống • Các vi khuẩn, số xạ khuẩn nấm mốc có khả sinh enzyme urease có khả phân giải tốt urê Các vi khuẩn phân giải urê thường sống hiếu khí yếm khí tuỳ tiện, chúng phát triển tốt môi trường trung tính kiềm, sử dụng nguồn N mà không sử dụng nguồn C urê urease urease 8/26/2016 57 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 58 Tóm tắt hoạt động phân giải tổng hợp VSV 3.2.4 Các trình tổng hợp chất hữu • Là trình sử dụng nguyên liệu thu từ trình phân giải hấp thu qua màng để tổng hợp nên thành phần tế bào vsv Đây trình tiêu tốn lượng TB - Tổng hợp polysaccharide - Tổng hợp Lipids - Tổng hợp amino acids protein - Tổng hợp axit nucleic 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 59 60 10 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 a Tổng hợp polysaccharide vsv dị dưỡng Tổng hợp polisaccharide TB vsv - Polysaccharide tham gia cấu tạo thành TB VSV như: peptidoglycan, lipopolysaccharide VK, glucan cellulose VSV nhân thật  Các polysaccharide tổng hợp từ nguồn sau: - Hợp chất Carbon đường đơn (glucose…) - Hợp chất phi carbon (lactate, pyruvate, glycogenic, amino acids, propionate, glycerol, dihydroxyacetone dicarboxylic acids)  Quá trình tổng hợp:  Các hợp chất phi carbon  tham gia vào đường Gluconeogenesis pentose phosphate để tổng hợp glucose  đường phân  Glucose đường phân  tham gia vào chu trình Kreb  UDP-glucose ADP-glucose - UDP-glucose (uridine diphosphate glucose): Là tiền chất để tổng hợp màng TB VK Glucose bị phosphoryl hóa nhờ enzyme hexokinase glucokinase  glucose-6phosphate  UDP glucose nhờ enzyme UDP glucose phosphorylase: tiền chất để tổng hợp cellulose, lipopolysaccharide, peptidoglycan - ADP-glucose (Adenosine diphosphate glucose): tiền chất để tổng hợp 61 glycogen VK b Cố định quang hợp CO2 8/26/2016 Tổng hợp glycogen VK TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 62 c Sinh tổng hợp lipid  Glucose tham gia trình đường phân  chuyển hóa thành glyceraldehyde 3phosphate  dihydroxyacetone phosphate  Glycerol  Axit pyruvic hình thành trình đường phân  Kreb cycle  Acetyl CoA  axit béo  Lipid tổng hợp từ axit béo glycerol Các vsv tự dưỡng sử dụng CO2 làm nguồn C chủ yếu VSV cố định CO2 qua đường TĐC: - Chu trình Calvin-Benson: VSV nhân thật - Con đường 3hydroxypropionate bi-cycle: cổ khuẩn (Thermoproteus, Sulfolobus) vk Chlorobium, Desulfobacter - Chu trình Kreb/TCA khử: VK sinh CH4, khử sulfate, vk sinh acetat 8/26/2016 63 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 64 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 66 d Sinh tổng hợp axit amin protein Tất amino acid tổng hợp trực tiếp gián tiếp từ sản phẩm trung gian trình phân giải hợp chất carbohydrate, đặc biệt chu trình Kreb Phản ứng amin hóa/trao đổi amin: Axit hữu + nhóm amin  axit amin Một số vsv không thực trình này, mà cần phải có sẵn axit amin để tổng hợp protein Nhiều VK nấm sử dụng glutamatedehydrogenase để chuyển nhóm amin từ glutamate aa TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 65 Sinh tổng hợp purine pyrimidine 8/26/2016 11 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 e Quá trình cố định N2 - Một số VSV có khả cố định N không khí chúng có enzyme nitrogenase  phá vỡ mối liên kết bền vững phân tử N2 (NN) Vi sinh vật cố định nitơ: VSV cố định nitơ gồm có nhóm vi khuẩn • Vi khuẩn cố định nitơ tự do: Có giống chủ yếu Azotobacter, Clostridium vi khuẩn lam sống tự do, hai giống quan trọng Azotobacter Clostridium • Vi khuẩn lam: Anabaena azollae sống cộng sinh với bèo hoa dâu (Azolla) có khả cố định N nhờ vào hệ thống nitrogenase chúng Hoạt tính cố định N vào khoảng 1-2,5 = mol/g/giờ, có ý nghĩa quan trọng ruộng lúa • Vi khuẩn cộng sinh: Vi khuẩn nốt sần rễ họ đậu Tổng hợp protein vsv: nhóm nhân sơ nhân thật TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 8/26/2016 67 Cơ chế cố định N 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 68 Ứng dụng trình tổng hợp vsv: • Sự cố định N cần có enzyme Nitrogenase • Nitrogenase dễ bị bất hoạt O2 VK hiếu khí phải có chế giữ N2-ase không tiếp xúc với O2 • Enzyme xúc tác phản ứng chuyển N2 thành Ammonia (NH3) - Sản xuất axit amin, enzyme, axit hữu cơ, kháng sinh… - Sản xuất sinh khối (sinh khối prôtêin đơn bào giàu dinh dưỡng: sinh khối tảo, nấm men…) - Sản xuất gôm sinh học sử dụng sản xuất kem, làm chất phụ gia, chất thay huyết tương… - Chế biến thức ăn chăn nuôi: thức ăn lên men Ứng dụng trình phân giải vsv: Chế biến thực phẩm: - Làm tương, làm nước mắm, Nấu rượu, bia… - Muối dưa cà, Làm sữa chua… Môi trường: Xử lý chất thải… Công nghiệp nhẹ: dệt, giấy… 69 3.3 Sinh trưởng vi sinh vật T0=0 Phút T2= 40 phút • Sinh trưởng vi khuẩn tăng số lượng tế bào quần thể, tăng kích thước TB • Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển vsv nghiên cứu biến đổi quần thể 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 70 3.3.1 Lý thuyết sinh trưởng VSV Sinh trưởng vsv gì?  Nó khác với sinh trưởng sinh vật bậc cao? T1=20 phút 8/26/2016 71 • Nghiên cứu sinh trưởng vsv tiến hành quần thể cá thể TB có kích thước nhỏ, thời gian sinh trưởng ngắn khó tách biệt xác định chi tiết khối lượng kết cấu tế bào để đánh giá sinh trưởng • Các phương pháp nghiên cứu - Đếm số lượng tế bào - Xác định trọng lượng tế bào (sinh khối) - Phân tích hàm lượng thành phần hoá học ARN, ADN, protein sản phẩm trao đổi chất (rượu, axit hữu ) - Xác định hệ số hô hấp (sự hấp thu O2 hay CO2 thải CO2 hay O2) 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 72 12 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 a Cơ sở lý thuyết sinh trưởng Ví dụ: Nuôi cấy tế bào E.coli môi trường dinh dưỡng Biết thời gian hệ E coli 20 phút Tính số lượng TB E coli thu sau 240 phút nuôi cấy Có thể biểu thị tăng số lượng tế bào nói theo cấp số nhân: 21 22 23 24 25 26 … 2n Công thức tính số lượng TB thời điểm: Biết tế bào vi khuẩn có thời gian hệ 60 phút Hãy tính thời gian cần thiết để từ tế bào nuôi cấy ban đầu tăng lên đến 8192 tế bào kết thúc nuôi cấy Nt: Số lượng TB tính thời điểm kết thúc nuôi cấy N0: số lượng TB ban đầu thời điểm bắt đầu nuôi cấy n: Số lần TB phân chia Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus vào môi trường dịch thể, sau 920 phút thu 10.240 TB vi khuẩn Hỏi thời gian hệ TB Bacillus phút? Thời gian hệ (g): Là thời gian cần thiết để tế bào tăng gấp đôi số lượng quần thể Đơn vị tính (phút, giờ) Ví dụ: Nuôi cấy TB E coli phòng thí nghiệm 37oC quần thể TB phân chia 18 lần Hỏi thời gian hệ E coli bao nhiêu?  6h = x 60 phút = 360 phút  Thời gian hệ E coli g= 360 : 18 = 20 phút = 0,33 Tốc độ sinh trưởng (R): Là số hệ sinh đơn vị thời gian n R= t logNt – logNo = 0,301 t 73 Nuôi cấy TB vi khuẩn Bacillus subtilis A 15 TB vi khuẩn B subtilis B môi trường LB dịch thể Sau 24h nuôi cấy chủng A thu 2048 tế bào, chủng B thu 3840 TB Hỏi chủng sinh trưởng nhanh hơn?  Tốc độ sinh trưởng VSV phụ thuộc vào: - Loài vi khuẩn - Môi trường dinh dưỡng - Yếu tố ngoại cảnh (Nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm…) 74 b Quy luật sinh trưởng vsv Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (hệ thống đóng) • Nuôi cấy tĩnh (hệ thống đóng): môi trường không bổ sung chất dinh dưỡng không loại bỏ sản phẩm trao đổi chất • Sinh trưởng vsv biểu đường cong sinh trưởng gồm có giai đoạn/pha: - Pha lag (pha tiềm tàng) - Pha log (pha logarith) - Pha cân - Pha tử vong 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 75 Pha lag (pha tiềm tàng): • Không tăng số lượng tế bào  Nguyên nhân: tế bào vsv cần có thời gian để thích ứng với điều kiện chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động Đó thời gian cần cho tổng hợp enzyme thành phần cần thiết cho trình chuyển hoá • Độ dài pha phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tuổi tế bào, giống, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy • Nếu cấy tế bào trẻ, giai đoạn sinh trưởng nhanh vào môi trường không khác môi trường nuôi cấy cũ điều kiện nuôi cấy thích hợp không xuất pha lag 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 77 Đồ thị đường cong sinh trưởng 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 76 Pha logarit (pha sinh trưởng theo luỹ thừa) • Số lượng tế bào tăng lên nhanh theo luỹ thừa Tế bào có kích thước điển hình, có tương tự thành phần hoá học hoạt tính sinh lý trao đổi chất Tế bào có đề kháng cao với điều kiện ngoại cảnh • Độ dài độ cao đường biểu diễn pha phụ thuộc vào yếu tố giống, dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy  Trong môi trường tự nhiên (đất, nước…), pha log vi khuẩn có diễn không? Tại sao? 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 78 13 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Pha ổn định (cân bằng) • Số lượng tế bào trạng thái cân động học - số lượng tế bào sinh cân với số lượng tế bào chết  sinh khối TB ổn định • Nguyên nhân: nồng độ chất giảm dần, tích luỹ dần chất độc xuất yếu tố bất lợi làm cho tốc độ sinh trưởng giảm dần Pha tử vong • Số lượng TB sống giảm theo luỹ thừa số lượng tế bào tổng cộng không giảm • Một số loài vi khuẩn có hình thành nha bào • Nguyên nhân: nồng độ chất dinh dưỡng giảm thấp, trao đổi chất tế bào giảm mạnh, xuất phân huỷ chất dự trữ tế bào; Thêm vào tích luỹ tăng cao chất độc làm chết hàng loạt tế bào 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 79 Sinh trưởng kép • Khi chuyển TB sinh trưởng logarith vào môi trường khác với môi trường trước  có xuất pha lag • Nguyên nhân: thích ứng vi khuẩn với điều kiện nuôi cấy (tổng hợp enzyme mới) • Đặc trưng tượng sinh trưởng kép đường cong sinh trưởng gồm hai pha lag hai pha log 8/26/2016 Đường cong sinh trưởng kép E.coli nuôi cấy môi trường Glucose - Sorbitol TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 80  Quy luật sinh trưởng điều kiện nuôi cấy liên tục • Nuôi cấy liên tục (hệ thống mở): Là môi trường bổ sung liên tục chất dinh dưỡng đồng thời loại bỏ chất thải  trì cân động học • Trong phương pháp thể tích bình nuôi cấy giữ không đổi, cách điều chỉnh tốc độ môi trường vào sản phẩm cuối trình nuôi  TB cung cấp điều kiện môi trường không đổi • Hệ thống nuôi cấy Chemostat 8/26/2016 Đường cong sinh trưởng môi trường nuôi cấy liên tục Ứng dụng phương pháp nuôi cấy liên tục: Trong sản xuất sinh khối protein, sản xuất chế phẩm sinh học (enzyme, kháng sinh …), sản xuất chế biến thực phẩm (bia, sản phẩm lên men…) Chemostat TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 81 Trong nuôi cấy, nhân giữ giống : Nhân giống môi trường chuẩn với điều kiện thuận lợi dùng giống gốc trẻ để rút ngắn pha lag chuyển nhanh sang pha log nhằm thu số lượng tế bào lớn có hoạt tính cao thời gian ngắn  Cần cấy truyền giống nhân giống định kỳ sản xuất, tế bào VSV chưa giai đoạn già, thoái hoá  Công tác nghiên cứu giống mặt hoạt động sinh lý khác VSV cần thiết phải tiến hành pha log pha số lượng tế bào lớn, có lực trao đổi chất mạnh, có hình thái đặc tính sinh lý điển hình TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 82 Trong chế biến thực phẩm, sản xuất chế phẩm sinh học: c Ứng dụng quy luật sinh trưởng vsv 8/26/2016 8/26/2016 83 Để đạt hiệu cao chế biến sản xuất chế phẩm sinh học cần phải tạo điều kiện để tế bào vsv phát triển nhanh đạt số lượng tế bào lớn: tế bào đạt nhanh tới giai đoạn sinh trưởng luỹ thừa trì sinh trưởng ổn định chúng giai đoạn  Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục (dụng cụ Chemostat): Mục đích: - Sản phâm thu pha log có trình trao đổi chất cao, khả sinh tổng hợp cao, có số lượng tế bào lớn nên tích luỹ sản phẩm sinh học cao - Không thời gian thay môi trường 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 84 14 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 Trong bảo quản giống VSV, nguyên vật liệu thức ăn - Trong bảo quản giống VSV: Phải đảm bảo giống có tỷ lệ chết thấp, đảm bảo hoạt tính sinh học đặc tính di truyền - Phương pháp tiến hành cụ thể là: Sau giống đạt tới sinh trưởng tốt pha log dùng biện pháp bảo quản để không cho chuyển sang giai đoạn sinh trưởng (pha ổn định tử vong), sử dụng biện pháp bảo quản lạnh, đông khô, bảo quản lớp dầu vô trùng… TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 8/26/2016 85 3.3.3 Đặc điểm sinh trưởng vsv môi trường a Môi trường đặc (rắn)  Môi trường có sử dụng chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar) Một số loại môi trường chủ yếu: - Môi trường dinh dưỡng: + Môi trường đơn giản/MT sở  peptone + agar; môi trường nước thịt peptone + Môi trường phức tạp: có bổ sung chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + chất khoáng chất đặc hiệu - Môi trường chọn lọc: Dựa nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt tưu tiên sinh trưởng số VSV (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…) - Môi trường chẩn đoán/ phân biệt: Có thành phần hóa chất giúp phân biệt vsv mắt thường (Ví dụ: môi trường 87 MacConkey phân biệt E coli Salmonella) Phòng trị bệnh - Phòng bệnh: sử dụng biện pháp loại trừ VSV để giảm nguy gây nhiễm làm khả gây bệnh VSV - Trong trị bệnh: phải ý chữa trị kịp thời, sớm tốt bệnh phát, vi trùng pha lag chuyển sang pha log số lượng tế bào có độc tính chưa cao đặc biệt tế bào nhạy cảm với nhân tố ngoại cảnh (các thuốc điều trị) bệnh dễ khỏi thời gian khỏi bệnh nhanh 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 86  VSV sinh trưởng môi trường đặc (rắn) hình thành khuẩn lạc  Khuẩn lạc tập trung số lượng lớn tế bào nơi, hình thành từ tế bào ban đầu  Sự sinh trưởng đánh giá thông qua tiêu chí: - Số lượng khuẩn lạc (đếm phương pháp pha loãng nồng độ) - Hình thái, kích thước khuẩn lạc - Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc - Màu sắc khuẩn lạc; Mùi môi trường  Hai dạng khuẩn lạc thường gặp: - Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn, mặt láng bóng, nhẵn - Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh  Khuẩn lạc nhầy, khuân lạc con, khuẩn lạc mảng … Một số loại môi trường rắn 88 Một số dạng khuẩn lạc vsv Casein media: chọn lọc Protease/casease Thạch máu (blood agar) MT chọn lọc: Salmonella agar) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Môi trường thạch ống 89 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 90 15 Vi sinh vật đại cương 8/26/2016 b Môi trường dịch thể (lỏng) Hình thái • Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch) • Đánh giá sinh trưởng qua tiêu chí: - Đếm số lượng tế bào - Độ đục môi trường (so màu): đục hay dạng bông, dạng vẩn mây - Sự lắng hay kết tủa: dầy hay mỏng, xốp hay kết chặt, dạng hạt hay keo - Hình thành màng: màng tròn hay màng kín, bề mặt màng thô hay mịn, dầy hay mỏng - Sinh khí - Màu, mùi môi trường Bề mặt Rìa/ bờ viền 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 91 8/26/2016 Đục lắng Môi trường Trypticase soy nuôi cấy Enterobacter TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 92 Đọc thêm: Môi trường bán rắn Môi trường có từ 0,2-0,7% thạch Được sử dụng để quan sát khả di động vsv Phản ứng lên men đường Mycobacterium Phle: cặn, màng, không đục 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 93 c.Một số phương pháp xác định số lượng vsv 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 94 Phương pháp pha loãng nồng độ: đếm số lượng khuẩn lạc thạch đĩa  Phương pháp đếm trực tiếp kính hiển vi: - Mỗi TB VSV sống phát triển thành đơn vị khuẩn lạc (colony forming unit – CFU)  Sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer  Ứng dụng cho vsv có kích thước lớn nấm men, vi tảo, vk lam  đếm nhanh  Nên sử dụng kính hiển vi phản pha để tránh nhầm lẫn - Mẫu pha loãng trước  nuôi cấy môi trường thạch đĩa rắn  đếm số lượng khuẩn lạc đĩa  tính số lượng vsv có 1g/1ml mẫu Nhược điểm: không phân biệt TB sống chết; độ xác không cao với mật độ 106/ml  mức độ đục mà mắt thường phát Mức độ đục máy phát từ 107 – 108/ml - Phương pháp không xác môi trường nuôi cấy bị tạp với số lượng nhỏ vk khác - Đặc biệt pha suy vong trình sinh trưởng, số lượng TB chết cao  Kết cho mật độ TB cao  không phân biệt TB sống TB chết - Là kỹ thuật nhằm ước lượng số vk lớn có mẫu  95% số lượng vk nằm khoảng xác định - Sử dụng vk không phát triển môi trường rắn - Thường sử dụng để kiểm tra vk coliform mẫu nước (Kiểm tra lên men đường lactose  a lactic) - Pha loãng mẫu  dãy ống/9 ống  đếm số ống dương tính - Kết so sánh với bảng MPN: Đơn vị MPN/ml 98 Phương pháp màng lọc (membrane filtration) - Sử dụng số lượng vk mẫu nhỏ để phát với phương pháp khác: Kiểm tra coliform mẫu nước uống  VK thị - Lấy tối thiểu 100ml mẫu nước  lọc qua màng lọc vi khuẩn có đường kính lỗ lọc nhỏ  vi khuẩn không qua được, nằm lại màng lọc - Màng lọc sau lọc đặt vào đĩa Petri có dung dịch nuôi cấy  VK mọc màng lọc  đếm số lượng khuẩn lạc 99 Màng nuôi MT lactose glucuronide agar Khuẩn lạc màu vàng màu xanh nước biển: coliform; Khuẩn lạc màu xanh cây: E.coli 100 Các phương pháp xác định gián tiếp: Xác định sinh khối - VSV nuôi cấy MT dịch thể/lỏng  lọc/ly tâm  loại bỏ dung dịch  cân toàn phần cặn (xác TB) - Phương pháp không phân biệt TB chết TB sống Xác định sản phẩm TĐC: - Trong trình sinh trưởng, vsv tiến hành trình TĐC  sản phẩm trình hô hấp, lên men: axit lactic, rượu, axit hữu cơ, CO2 … Định lượng sản phẩm  Tốn 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 101 8/26/2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 102 17 [...]... viền 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 91 8/26 /2016 Đục lắng căn Môi trường Trypticase soy nuôi cấy Enterobacter TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 92 Đọc thêm: Môi trường bán rắn Môi trường có từ 0,2-0,7% thạch Được sử dụng để quan sát khả năng di động của vsv Phản ứng lên men đường Mycobacterium Phle: cặn, màng, không đục 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 93 c.Một số phương pháp xác định số lượng vsv 8/26 /2016 TS... các axit amin để tổng hợp protein Nhiều VK và nấm sử dụng glutamatedehydrogenase để chuyển nhóm amin từ glutamate aa TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 65 Sinh tổng hợp purine và pyrimidine 8/26 /2016 11 Vi sinh vật đại cương 8/26 /2016 e Quá trình cố định N2 - Một số VSV có khả năng cố định N không khí do chúng có enzyme nitrogenase  phá vỡ được 3 mối liên kết rất bền vững trong phân tử N2 (NN) Vi sinh vật cố... mol/g/giờ, có ý nghĩa quan trọng trong ruộng lúa • Vi khuẩn cộng sinh: Vi khuẩn nốt sần trong rễ cây họ đậu Tổng hợp protein ở vsv: nhóm nhân sơ và nhân thật TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 8/26 /2016 67 Cơ chế cố định N 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 68 Ứng dụng của quá trình tổng hợp ở vsv: • Sự cố định N cần có enzyme Nitrogenase • Nitrogenase dễ bị bất hoạt bởi O2 vì vậy các VK hiếu khí phải có các cơ chế... TB • Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển của vsv là nghiên cứu sự biến đổi của một quần thể 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 70 3.3.1 Lý thuyết sinh trưởng của VSV Sinh trưởng ở vsv là gì?  Nó khác gì với sinh trưởng ở sinh vật bậc cao? T1=20 phút 8/26 /2016 71 • Nghiên cứu sự sinh trưởng của vsv được tiến hành đối với quần thể không phải trên 1 cá thể... các thành phần hoá học như ARN, ADN, protein hoặc các sản phẩm trao đổi chất (rượu, axit hữu cơ ) - Xác định hệ số hô hấp (sự hấp thu O2 hay CO2 và sự thải CO2 hay O2) 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 72 12 Vi sinh vật đại cương 8/26 /2016 a Cơ sở lý thuyết về sự sinh trưởng Ví dụ: 1 Nuôi cấy 5 tế bào E.coli trong môi trường dinh dưỡng Biết thời gian thế hệ của E coli là 20 phút Tính số lượng TB E coli... đang ở giai đoạn sinh trưởng nhanh vào môi trường không khác môi trường nuôi cấy cũ và điều kiện nuôi cấy rất thích hợp thì có thể không xuất hiện pha lag 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 77 Đồ thị đường cong sinh trưởng 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 76 Pha logarit (pha sinh trưởng theo luỹ thừa) • Số lượng tế bào tăng lên nhanh theo luỹ thừa Tế bào có kích thước điển hình, có... của pha này phụ thuộc vào các yếu tố như giống, dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy  Trong môi trường tự nhiên (đất, nước…), pha log ở vi khuẩn có diễn ra không? Tại sao? 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 78 13 Vi sinh vật đại cương 8/26 /2016 Pha ổn định (cân bằng) • Số lượng tế bào ở trạng thái cân bằng động học - số lượng tế bào sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi  sinh khối TB ổn định • Nguyên... loạt tế bào 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 79 Sinh trưởng kép • Khi chuyển các TB đang sinh trưởng logarith vào môi trường mới khác với môi trường trước đó  có sự xuất hiện pha lag mới • Nguyên nhân: do sự thích ứng của vi khuẩn với điều kiện nuôi cấy mới (tổng hợp các enzyme mới) • Đặc trưng của hiện tượng sinh trưởng kép là đường cong sinh trưởng gồm hai pha lag và hai pha log 8/26 /2016 Đường cong... sinh lý điển hình nhất TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 82 Trong chế biến thực phẩm, sản xuất các chế phẩm sinh học: c Ứng dụng quy luật sinh trưởng của vsv 8/26 /2016 8/26 /2016 83 Để có thể đạt được hiệu quả cao trong chế biến và sản xuất các chế phẩm sinh học cần phải tạo điều kiện để tế bào vsv phát triển nhanh đạt số lượng tế bào lớn: tế bào đạt nhanh tới giai đoạn... log có quá trình trao đổi chất cao, khả năng sinh tổng hợp cao, có số lượng tế bào lớn nên sự tích luỹ sản phẩm sinh học sẽ cao - Không mất thời gian thay môi trường 8/26 /2016 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 84 14 Vi sinh vật đại cương 8/26 /2016 Trong bảo quản giống VSV, các nguyên vật liệu và thức ăn - Trong bảo quản giống VSV: Phải đảm bảo giống có tỷ lệ chết thấp, đảm bảo được hoạt tính sinh học và đặc tính