BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC
TÌM HIỂU SỰ LUU HANH VIRUT RUBELLA 6 TRE EM 1-14
TUỔI VÀ PHỤ NU MANG THAI 3 THÁNG ĐẦU TẠI HÀ NỘI,
HẢI PHÒNG VÀ THANH HOÁ
Chủ nhiệm đề tài: GS TS Huỳnh Phương Liên
Trang 2BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC
BỘ Y TẾ
VIEN VE SINH DỊCH TẾ TRUNG ƯƠNG
"Tên đề tài:
TÌM HIỂU SỰ LƯU HÀNH VIRUT RUBELLA Ở TRẺ EM 1-14 TUỔI VÀ PHỤ NỮ MANG THAI 3 THÁNG ĐẦU TẠI HÀ NỘI,
HẢI PHÒNG VÀ THANH HOÁ
Chủ nhiệm đề tài: GS TS Huỳnh Phương Liên Các cán bộ thực hiện đề tài: Nguyễn Thị Thắng Nguyễn Thị Út Nguyễn Thị Thường Nguyễn Thị Quý Nguyễn Hiển Thanh Nguyễn Hồng Hạnh Đỗ Sỹ Hiển Hoàng Văn Tuấn œ m Ø P0 Đ YE
Thời gian thực hiện đề tài: 2000-2004
Trang 3DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BAO CAO VSDTTƯ TCMRQG MMR ARN ORF KDa PBS E (El, E2) Cc HTH TKTU RT-PCR UCNKHC (HI) TCYTTG ELISA CPE DTBS 1U OPD TMB
Vệ sinh Dịch tế Trung ương
Tiêm chủng mở rộng quốc gia
Measles Mump Rubella: Sdi, Quai bi, Rubella Axit ribonucleic Open Reading Frame: Khung doc md KiloDalton Photphate Buffer Saline: Dém mudi photphat Envelope: Vo Capsid
Huyét thanh hoc
Thần kinh trung ương
Phan ứng chuỗi polymeraza ngược
Trang 4MUC LUC
Trang
I ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU «c2 1
1 Đặt vấn GE coos cccececcssseesossvesosssecesstsscesseseesessusssesssevesssivessrasecsestareeeseeserssaceessenees 1 2 Muc thu nghién Cutu 1
TL TONG QUAN .Ô 2
1 Lịch sử nghiên cứu bệnh sốt phát ban do virut rubelia Virut Rubella 2 2 Virut rubÏa - - «cv TH TT HT TH HH TH rếc 3 KN si 0 cac na 9 (9.0.6 ng ốẽ ố 17 5 Dự phòng rubella - ¬— tre, 19 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 h8) n 22 PO 0015.20.11 8N" 22
IV KET QUA VA BAN LUẬN . 2< se 2Exest+2zxeevvrsevoresserrvrsee 35
1 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ phơi nhiễm Rubella ở trẻ 1-14 tuổi - 35
2 Nghiên cứu sự phơi nhiễm rubella ở phụ nữ có thai 3 tháng đầu 41
3 Tìm hiểu các khuyết tật bẩm sinh có liên quan đến Rubella 44
4 Chẩn đoán xác định phát ban do Rubella ở một số tỉnh miền Bắc
và miền Trung năm 2000-2003 Q.21 re 46
V KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 2. -EE2++ee©222EEZvvzadecovvevrrexee 48
Trang 5LOI CAM ON
Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, chúng tôi xin chân thành
cảm ơn các cơ quan:
Chương trình Tiêm chủng mở rộng quốc gia - Trung tam YTDP Hai Phong
- Trung tam YTDP Thanh Hoa - Bénh vién Nhi Trung uong
Trang 6I ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1 Dat van đề
Rubella là bệnh sốt phát ban do virut Bệnh thường xảy ra vào mùa xuân-hạ
Rubella có mặt trên cả 4 châu lục và ở mọi lứa tuổi nếu không được dự phòng bằng văcxin Bệnh có các triệu chứng lâm sàng mở đầu với các biểu hiện: sốt, đau đầu, buồn nôn, ho, đau họng, đau các khớp và phát ban có thể sưng các hạch ở cổ Là bệnh sốt có
phát ban nên thường khó phân biệt với một số bệnh như bệnh sởi, bệnh tinh hồng nhiệt, phát ban do virut Dengue hoặc do Coxsackie Với rubella, cdc triệu chứng lâm sàng sẽ nhẹ nhàng qua đi nhưng điều cần quan tâm nhất là các biến chứng do rubella ở những trẻ sinh ra từ các bà mẹ bị nhiễm virut trong thời kỳ mang thai Hiện nay, ở nước ta chiến dịch tiêm văcxin sởi mũi 2 cho trẻ em 1-10 tuổi đã khống chế và từng bước thanh toán bệnh sởi Do vậy, việc giám sát bệnh sốt phát ban để loại trừ những trường
hợp mắc sởi sau chiến địch tiêm chủng là hết sức cần thiết Để tài này cũng chỉ bước đầu đánh giá mức độ phơi nhiễm ở trẻ em, nhóm phụ nữ mang thai và chẩn đoán hồi cứu một số trẻ mang dị tật bẩm sinh nghỉ do virut rubella
2 Mục tiêu nghiên cứu
Để góp phần giám sát sởi, chẩn đoán phân biệt sởi và rubella của chương trình TCMRQG đề tài nhằm hai mục đích:
2.1 Chẩn đoán xác định sốt phát ban do rubella trong các vụ dịch sốt phát ban nghỉ SỞI
2.2_ Nghiên cứu đánh giá tỷ lệ nhiễm với rubella ở trẻ em 1-14 tuổi và phụ nữ mang
Trang 7II TONG QUAN
1 Lịch sử nghiên cứu bệnh sốt phát ban do virut rubella
Vào giữa thế kỷ 18, lần đầu tiên 2 nhà khoa học người Đức đã miêu tả về bệnh sốt phát ban rubella, đó là Bergen và Orlow Lúc bấy giờ người ta thường gọi với cái tên của Đức là “Rötcln” và trở thành một cái tên quen thuộc là “Sởi Đức” (German Measles) Trong nhiều năm, sốt phát ban không phân biệt được với sởi, tỉnh hồng nhiệt (Scarlet fever) và một số bệnh nhiễm khuẩn khác có phát ban Hội nghị quốc tế y học năm 1881 ở London đã chính thức lấy tên là bệnh rubella và từ đó các sự kiện lịch sử
chính của rubella bắt đầu được ghi nhận:
-_ 1881: Hội nghị Quốc tế tại London đã chấp nhận tên rubella - 1938: Đã chứng minh tác nhân gây bệnh phát ban rubella là virut
- 1941 Grey (Australia) lần đầu tiên phát hiện các thương tổn bẩm sinh do rubella gây Tả
- 1962: Phân lập được virut rubella trên tế bào và thực hiện thử nghiệm trung hòa trên
nuôi cấy tế bào -
- 1963-1964: Dịch sốt phát ban xảy ra ở châu Mỹ và châu Âu: Thống kê của Enders
va Milk me mang thai nhiễm, hậu quả tổn thương bam sinh mắt 78%, điếc 66%, thiểu năng vận động 62% và TBS 58%
- 1965-1967: Nghiên cứu thành công văcxin sống giảm động lực và thử nghiệm lâm
sàng
-_ 1967: Chẩn đoán huyết thanh học bằng kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (HỊ)
- 1969: Tại Mỹ đã nghiên cứu và sử dụng 3 chủng: HPV-77:DE-5 (duck embryo),
HPV-77:DK-12 (dog kidney) và GMK-3:RK-53 (rabbit kidney) để sản xuất văcxin Sau đố chủng HPV-77:DK-12 không được sử dụng vì khi tiêm văcxin từ chủng này thường kèm theo các triệu chứng đau khớp Cũng năm 1969, Mỹ quyết định đưa
văcxin vào tiêm phòng cho trẻ 4-5 tuổi
- 1970: Ở Anh quốc đồng thời nghiên cứu chủng Cendehill và sản xuất văcxin bằng
chủng này để tiêm phòng cho trẻ em gái 11-14 tuổi
- 1971: Mỹ nghiên cứu kết hợp 3 loại văcxin sống giảm động lực là Sởi, Quai bị và
Rubella (MMR)
- 1972: Anh quốc chủ trương tiêm chủng cho các đối tượng có nguy cơ như phụ nữ
tuổi sinh đẻ, trẻ em gái 12-14 tuổi
-_ 1977: Chương trình tiêm chủng mở rộng tại Mỹ đã tiêm chủng văcxin cho trẻ em gái và phụ nữ ở tuổi có nguy cơ mắc rubella
- 1978-1979: Dịch sốt phát ban Rubella để lại hậu quả 124 ca dị tật bẩm sinh do mẹ mắc rubella trong thời kỳ mang thai
- 1979: Mỹ sử dụng chủng RA27/3 (human diploid fibroblast) để sản xuất văcxin (Meruvax-II), và tất cả các chủng khác đều không được sử dụng tiếp
Trang 8- 1988: Bộ Y tế nước Anh đã chỉ đạo tiêm chủng MMR cho tất cả các trẻ em trước tuổi đi học - 1996: Tại Anh kế hoạch tiêm văcxin cho trẻ em gái bị gián đoạn do đó tiêm mũi 2 MMR cho trẻ 4-5 tuổi - 1997: Mỹ thay đổi chiến lược tiêm chủng MMR mũi 1 từ 12-15 tháng tuổi, mũi 2 từ 4-6 tuổi
Ghỉ chú: MMRI?: Sởi (chúng Moralen), quai bị (chúng Jeryl Lynn} Rubella (chủng
HPV77:DE-5); MMR phái mình của Anh: Sởi (chủng Schwartz), quai bị (chủng Jeryl Lynn) va Rubella (ching RA27/3)
Cho đến nay'väcxin rubella đơn hoặc phối hợp với sởi và quai bị được tiêm phòng
đầy đủ cho trẻ em ở các nước phát triển, còn ở các nước đang phát triển vẫn còn là vấn đề cần được quan tâm, rubella chưa được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng
Do vậy, việc trẻ em bị phơi nhiễm rubella cũng là điều tất yếu 2 Virut rubella
2.1 Tém tat nghién citu 6 phong thi nghiém
Nam 1962, Parkman, Buescher va Artenstein đã phát hiện sự có mặt của virut
rubella ở tế bào thận khi tiên phát bằng kỹ thuật interference.cũng trong năm này, đồng thời 2 nhà khoa học Weller và Neva đã tìm thấy thương tổn tế bào bào thai tiên phát
1962- 1964, Parkman, Buescher, Artenstein đã thử nghiệm thành công kỹ thuật ˆ trung hoà, ngưng kết hồng cầu, ngăn ngưng kết hồng cầu
1967, Stewart và cộng sự đã nghiên cứu dịch tế huyết thanh học
1967, Best và cộng sự, 1968 Homes và cộng sự đã quan sát siêu cấu trúc của virut rubella qua kính hiển vi điện tử
Cuối năm 1980 đến đầu năm 1990, nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc phân
tử và sự nhân lên của virut rubella và thấy rằng virut rubella phát triển chậm trên nuôi
cấy tế bào và ở một số loại tế bào, không quan sát thấy CPE dưới kính hiển vi quang
học
2.2 Xếp loại
- Rubella duge xép vao chi (genus) Rubivirus thudc ho (family) Togaviridae Có quan
hệ thân thiện với các Arbovirus nhóm A (Frey 1994) Không giống cdc togavirus khác, virut rubella không có vật chủ là động vật không xương sống và các động vật chân khớp
-_ Virut rubella chứa vật liệu di truyền là ARN, có vỗ bọc Chỉ có duy nhất mot type
kháng nguyên, không phản ứng chéo với các thành viên khác trong nhém togavirus
2.3 Hình thể và cấu trúc
- Hat virut cé đường kính trung bình 58nm và có đường kính của lõi (core) la 30nm
(Homes, Murphy, Halonen, Harrison 1968)
-_ Lõi được bao bọc bởi một lớp lipit kép và trên bể mặt của lớp vỏ (envelope) có các gai nhú dài 5-6nm, các gai nhú này chính là các hợp phần cla céc glycoprotein El
và E2 Nhìn tiêu bản cất lát dưới kính hiển vi của các tế bào gây nhiễm với virut
rubella có thể thấy vùng giới hạn giữa lõi và vỏ
Trang 9-_ Hạt virut đa dạng, lớp vỏ mảnh dẻ, kiểu đối xứng của Nucleocapsid làm cho nó khó
bền vững, khi phân tích về chuyển động quay ở lớp màng của hạt virut cho thấy lõi
có 1T=3 icosahedral đối xứng và có 32 capsomers (Matsumoso va Higashi 1974)
- Duy trì sự bền vững của virut bằng cách thêm MgSO¿ vào môi trường nuôi cấy vì
lipid ở phần vỏ của hạt virut rubella bị bất hoạt bởi các chất tẩy rửa, formaline, ánh sáng đèn cực tím, pH thấp, nhiệt độ, amantadine và các dung môi hoà tan
Hình 1 : Nhuém dm ban virut rubella (Banatvala va Best)
2.4 Cấu trúc hệ gen vả chức năng
Hé gen cua virut rubella 14 một sợi đơn ARN, phân cực dương ARN là yếu tố
gây nhiễm nhưng rất yếu (Hovi và cộng sự, 1970) Chiểu dài của ARN là 9762 nucleotit bao gồm đầu 3° poly (A) và đầu cuối 5” (Frey 1994) Đầu nắp được dịch mã
như một sự nhan biét 1 ribosome Theo Frey (1994), thành phần các base nitơ của hệ gen là: A (14,9%); C (38,7%); U (15,4%) và G (30,8%)
Hệ gen có 2 khung đọc mở ORE (Open Reading Frame) và có một vài điểm giống alphavrrus (Dominguez, Wang và Frey 1990) Đầu 5” gồm ORF có 6345 nucleotit mã hoá cho 2 protein phi cấu trúc (nontructure protein) là p150 và p90 Trong khi đó ORF đầu 3° có chiều dài 3189 nucleotit (6509- 9697) mã hoá cho protein cấu trúc là C (Capsid), céc glycoprotein E2 va El Hai ORF cing phiên mã như nhau và duge tach riéng ra boi 123 nucleotit va Polyadenylated- ARN phu duge đậy lại, và
được sao chép lại từ ARN âm bản Như vậy, đầu khởi động là nucleotit 6433 (U) Frey
1995 Các dòng ADN được sản sinh ra và sử dụng để tổng hợp các ARN gây nhiễm (Wang, Dominguez và Frey 1994)
Trinh tự ở đầu 5° và 3° của ARN của virut rubella có thể tạo thành một dạng cấu
Trang 108 1 2 3 4 5 & 7 8 8 10 kb t 1 4 1 AL i 1 el 1 }
nonstructural ORF structural ORF
tuc „si M X P H R CÍE2 ri poly (Al, | Transiation p200 i | Proteolytic cleavage Transcription p180 Ỷ pao Bren nane se hana nope š BA enh eee ¥ Subgenomic RNA Wt —"baaly (abn Ỷ Translation pioo Ý Co-and post ¥ tansiational processing Gapsid
Hình 2: Sơ đô mô tả quá trình dịch mã tạo ra các protein cấu trúc và phì cấu trúc của virut rubella
(Lee J va Bowden DS, 2000): Hệ gen của virut rubella bao gồm 2 khung đọc mở không có chồng lớp, vớt
ORF đầu 5` mã hoá cho các protein phi cấu trúc và ORF đầu 3" mã hoá cho các protein cấu trúc Một polyprotein
chưa hoàn chỉnh là p200 được dịch mã từ ORF dau 5’ cia hé gen ARN virut rubella va qua phan cat Cis tao
thành 2 protein phi cấu trúc là p150 và p90 Cac vi trí cha cdc axit amin duoc coi 1A motif nhu methyltransferase (M), X motif, papain-like cysteine protease (P), helicase (H), and replicase (R) déu nam trén ORF dau 5° Cac
protein cấu trúc được tổng hợp từ một tiểu hé gen ARN 24S dich ma tir ORF dau 3’ Một polyprotein chưa hoàn chỉnh là p100 được dịch mã từ tiểu hệ gén ARN và trải qua một số lần phân cắt, phiên mã muộn, biến đổi để cuối
cùng tạo ra các protein thành thục là C, E2 và E1 RUBELLA VIRUS icosahedral nucieosapsid RMA ‡siogla-2r anded 64114+0xasttSe}
Hình 3: Hình thái của vữut rubella
Trang 11Đường kính: 50- 70nm Tỷ trong: Trong sucrose: 1,16- 1,19g/ml; Trong CsCl;: 1,12- 1,23g/ml Hệ số lắng: 240S 2.5.2 Nucleocapsid Duong kinh: 30- 40nm Cấu trúc đối xứng Tỷ trọng: Trong CsCl;: 1,4 + 0,4g/ml Hệ số lắng: 150S Trọng lượng phân tử: 2600- 4000kDa 2.5.3 Axit nucleic ~ Soi ARN don, phan cực dương Ty trong: 1,634g/ml Hệ số lắng: 38- 40S Trọng lượng phân tử: 3.10-4.10Da Độ đài: 5-6nm 2.5.4 Thành phần hoá học ARN: 2,4% Lipid: 18,8% Protein: 74,8% Cacbonhydrat: 4,0% 2.5.5 Polypeptid chi yếu
Envelope: E1 (58 kDa) va E2 (42-47 kDa) Nucleocapsid: C (33-38 kDa)
2.5.6 Độ bén viing:
Bén ving nhiét: + 4°C bén vitng > 7 ngay
+ 375C bị bất hoạt 0,1-0,4 log10 TCID 50/ml/gid + 56°C bi bat hoạt 1,5- 3,5 log10 TCTD 50/ml/giờ + 70°C bị bất hoạt 5,5 log10 TCID 50/ml/giờ
+ Ở -70°C bền vững trong nhiều năm
Đông khô: Bền vững lâu dài nhiều năm
Độ pH thích hợp: pH 6,0- 8,1; không bền vững ở pH quá kiểm và quá axit
Nhạy với tia cực tím: mất hoạt tính trong 40 giây1350 w/cm”; bị bất hoạt 7,0 log10
TCTD 50/0,1ml/giờ
Cảm quang: Labile, K = 0,07/phút trong PBS
Siêu âm: Bền vững > 9 phút
2.6 Sự nhân lên của virut
Virut rubella tiếp xúc với thụ thể của tế bào Thụ thể này không nhận biết được, cơ quan đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết và tiếp nhận là phân tử lipid ở
` màng tế bão Chu kỳ nhân lên được thực hiện ở trong nguyên sinh chất, quá trình thâm
Trang 12nhập, cởi áo (bộc lộ ARN) giống như các Alphavirus Hạt virion được hoàn thiện trong lớp vỏ và vận chuyển đến lớp trong màng tế bào Ở độ pH thấp, protein C trong màng tế bào chuyển thành lipid có thể hoà tan và kết hợp capsid với màng của virut, ARN được lớp vỏ của virut bọc lại pH thấp cũng còn có khả năng châm ngòi cho một thay đổi thích hợp trong vỏ glycoprotein và gắn kết màng của virut với màng của tế bào rồi giải phóng ARN của virut vào nguyên sinh chất của tế bào
Hạt virion có chứa 2115 axit amin Polyprotein được mã hoá bởi đầu gần 5° ORF
Polyprotein này bị phân huỷ để tạo ra các protein phi cấu trúc có thể hoạt hoá bên
trong tế bào chủ để tổng hợp một sợi ARN âm và sau đó sử dụng làm khuôn mẫu để
tạo thành sợi ARN duong mdi va ARN 243 Sợi ARN âm chỉ có mặt ở dạng sợi kép và chức năng như một công cụ để tổng hợp ARN dương
Polyprotein có trọng lượng phân tử 110 kDa được tách khỏi tế bào chủ, tạo ra 3 protein cau tric: 2 glycoprotein El va E2 va protein capsid Protein C cua virut thiéu hoạt tính tự phân chia trong Alphavirus Tất cả protein cấu trúc được vận chuyển đến
bộ máy Golgi của tế bào để hoàn thiện
Các nghiên cứu của Frey và cộng sự (1994) cho thấy: Chu kỳ nhân lên của virut
rubella ở tế bào động vật không xương sống chậm và ít hiệu quả hơn Alphavirus Chu kỳ nhân lên cao nhất (đỉnh) là 48 giờ sau khi gây nhiễm trên tế bào thận khi (Vero) Protein cấu trúc của virut rubella lần đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật kết tủa
miễn dịch là 26 giờ sau khi gây nhiễm tế bào và bằng miễn dịch huỳnh quang (TF), tất cả tế bào có phát quang ở nguyên sinh chất sau khi gây nhiễm 48 giờ Còn ARN lần đầu tiên được phát hiện 12 giờ sau khi gây nhiễm và đỉnh ở 26 giờ Các loại tế bào
khác nhau sẽ có tốc độ và thời gian nhân lên khác nhau, tuỳ thuộc vào độ nhạy của từng loại tế bào chủ đối với virut
2.7 Polypeptid
Forng và Frey (1995), sử dụng kỹ thuật kết tủa miễn dịch (IP) để xác định protein phi cấu trúc trong tế bào gây nhiễm và đã xác định thứ tự trong ORF đầu 5’ 14 NH,- p150- p90- COOH chức năng còn chưa biết Bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cho thấy những kháng thể gắn p150 phát quang ở vùng quanh nhân Không có các kháng thể gắn protein phi cấu trúc phát quang ở nhân tế bào
- Protein C cé 293- 300 axit amin trong chuỗi peptid đài có trọng lượng phân tử 33 kDa và không glycosyl hoá
-_ Chuỗi polypeptid của E1 và E2 tương ứng là 282 và 481 axit amin - Mang El va E2 bao lấy Glycoprotein và bộc lộ trên bề mặt của hạt virut
Protein E1 có trọng lượng phân tử 58 kDa và khi phân tích trình tự axít amin cho thấy chúng cố 3 vị tf glycosyl hod liên kết với Nucleoprotein (N- linked glycosylation) Ngược lại số lượng vị trí glycosyl hoá liên kết với Nucleoprotein trên phân tử protein E2 lại phụ thuộc vào từng chủng Ví dụ như ở các chủng M33 và HPV- 77 có 4 vị trí, trong khi đó ở các chủng Therien và RA27/3 lại chỉ có 3 vị trí (Qiu, 1992) Protein E2 được coi là màng vận chuyển đến gần điểm tận cùng của protein C, Trong các hạt virion hoàn chỉnh thì E1 và E2 tồn tại như protein cấu trúc bậc hai khác loại, tạo bởi những chuỗi móc xích cầu nối disulphit và trồi lên bể mặt của vỏ như
Trang 13Glycoprotein cia virut rubella da duoc tach chiét từ Escherichia coli v6i vector là
Vaccina va Barculovirus 2.8 Khang nguyén
Kháng nguyên HA: Bằng những phương pháp xử lý dịch tế bào nhiễm virut
rubella khác nhau cho thấy: Khi xử lý với EDTA sẽ tách thành phân HA từ các yếu tố
ức chế không đặc hiệu bằng cách loại bỏ ion Ca?* (Furukawa, 1967) Kháng nguyên
HA cồn có thể tách chiết từ tế bào BHK-21 gây nhiễm virut rubella hoặc tế bào Vero có pH kiềm (Halonen, Steward, 1967) Xử lý với ctc và Tween 80 thì ngăn hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HA) và tăng hiệu giá kháng nguyên vì Ca?! làm cho thành phần HA gắn vào hồng cầu Việc loại bỏ các yếu tố ức chế ngưng kết không đặc hiệu trong
huyết thanh thử nghiệm làm cho hiệu quả của phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu càng cao
Kháng nguyên kết hợp bổ thể (CF): Phần lớn kháng nguyên có tỷ trọng 1,19 đến
1/23 g/ml trong sucrose gradient và kết hợp với hoạt tính HA, có một phần nhỏ kháng
nguyên hoà tan Các thành phần kháng nguyên này có thể kết hợp với Ribonucleoprotein lõi của virut Muốn có hiệu quả kháng nguyên cao cần cô đặc dịch tế bào nhiễm virut rubella hoặc chiết xuất bằng dung dịch pH kiểm
Khi nhiễm virut rubella thì kháng thể xuất hiện kháng lại 3 protein cấu trúc nhưng protein E1 biểu thị miễn dịch trội Những nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng để xác định một vài epitop biểu lộ hoạt tính trung hoà hoặc ngưng kết hồng cầu Năm 1992, Chaye và Mitchell đã phân tích và xác định chúng phân bố ở axít amin
245-285 Hoạt tính trung hoà thì phân bố từ axít amin 211-239 Huyết thanh người
phản ứng với các peptid tổng hợp ở axít amin 214- 285 của protein EI, có thể đây là vùng biểu lộ hoạt tính trung hoà chủ yếu Protein tái tổ hợp cũng nằm trên epitop này
Tác giả Newcombe 1994 thấy epitop chứa hoạt tính trung hoà cũng còn nằm ở Glycoprotein E2 từ 1-26 Còn các epitop khác được giới hạn giữa axít amin 51 và 105 Ít nhất có 2 epitop có mặt trên protein C
Cả 3 protein cấu trúc đều có epitop tế bào T, nhưng vùng phản ứng miễn dịch đã
được xác định trong protein capsid 9-29, 255-280, ở E2 là 54-74 và EI là 273- 284,
358- 377 và 402- 422 Mối liên quan về vị trí kháng nguyên cpitop của những tế bào T này còn chưa rõ
Sự khác nhau về tính chất kháng nguyên:
Chủng virut rubella giảm độc lực Cendehill có hoạt tính gây nhiễm thấp hơn các chủng hoang dại đối với thỏ và các động vật phòng thí nghiệm khác
Chủng RA 27/3 và Cendehill khác với các chủng virut rubella hoang đại về đặc điểm phát triển trên tế bào, hình dạng đám hoại tử và tính mẫn cảm với nhiệt độ Điều này cho thấy quá trình chuyển hoá glycoprotein trong thể Golgi của virut rubella ở các chủng giảm độc lực thấp hơn chủng hoang dại Sự phát triển của chủng văcxin HPV77- DE5 tương tự như chủng M33
Có nhiều thử nghiệm để phân biệt chủng giảm độc lực và chủng hoang đại tuy nhiên sự khác nhau này cũng được quan sát bằng thử nghiệm trung hoà chéo và động lực kháng thể trung hoà (Best, 1990)
Các nghiên cứu gần đây dùng kháng thể đơn dòng trong thử nghiệm trung hoà, ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), miễn dịch enzym (EIA) cho 9 chủng virut rubella có cả
Trang 144 ching vacxin la Cendehill, RA27/3, HPV77-DE5 va TO336 (Best 1992) Tat ca 9
chủng này đều không thấy biểu lộ sự khác nhau
Trình tự axít nucleic bộc lộ 5 điểm thay đổi về nucleotid được tìm thấy trong trình
tự 1300 nucleotid của vùng mã hoá EI của chủng virut rubella văcxin RA27/3, nhờ đó
có thể phân biệt giữa chủng này với các chủng virut rưbella phân lập được (Frey 1994) 3 Hình ảnh lâm sàng và bệnh lý
3.1 Giới thiệu
Năm 1941 Mc Alister Gregg- Bác sỹ nhãn khoa người Australia đã công bố một
công trình nghiên cứu về đục thuỷ tỉnh thể bẩm sinh mà mẹ có tiền sử mắc bệnh “Sởi Đức = German Measles” ở 3 tháng đầu mang thai Ông theo đõi 78 trẻ đều mắc bệnh
đục thuỷ tỉnh thể (Congenital cataract) tương tự như nhau Số trẻ em này đều được sinh ra ở New South Wales sau dịch sốt phát ban do rubella vào năm 1940 Các bệnh tim tiên thiên chiếm 66% Tiếp tục theo dõi, người ta phát hiện một số trẻ mà mẹ trong 3 tháng đầu mang thai mắc sốt phát ban rubella đều sinh ra các con có các dị tật: tim tiên
thiên, đục thuỷ tỉnh thể bẩm sinh, điếc, dị tật đầu nhỏ, không đủ trọng lượng khi sinh
(Swan, Gregg 1944 va Wesselhoeft 1947)
1963 Lần đầu tiên ở Mỹ phan lap duoc virut rubella
1964 Gregg và cộng sự đã theo đối một số bà mẹ mang thai trong 16 tuần đầu có sốt, phát ban và chẩn đoán xác định là rubella thì 96% số trẻ bị đị tật bẩm sinh
1965 ở Mỹ bắt đầu nghiên cứu văcxin phòng rubella
1969 văcxin phòng bệnh sốt phát ban rubella bắt đầu được đưa ra sử dụng ở Mỹ
3.2 Triệu chứng lâm sàng và mối liên quan giữa lâm sàng và vừữut học
Thời kỳ ủ bệnh do nhiễm rubella là 14 đến 21 ngày sau đó các triệu chứng xuất
hiện đột ngột: + Sốt nhẹ + Phát ban
+ Các hạch Lympho ở cổ và nách
+ Đau khớp và đau mình, thường xuất hiện trước 1 đến 2 ngày trước khi khởi bệnh
Ban xuất hiện đầu tiên ở mặt sau đó phát triển xuống thân và chân tay bệnh nhân Ban thường tồn tại khoảng 3 ngày hoặc có thể lâu hơn
Sinh thiết (Biopsy) mẫu bệnh phẩm từ da bệnh nhân cho thấy không chỉ phân lập được virut ở vùng đa có ban mà ở cả vùng da không có ban (Heggie 1978)
Trong vụ dịch có thể dùng gammaglobulin tiêm cho các cháu đang ở thời kỳ ủ
bệnh sẽ ngăn ngừa được tiến triển của bệnh và không phát ban
Hạch Lympho xuất hiện sớm, có thể 7-10 ngày trước khi phát ban và tồn tại lâu sau khi ban lặn
Biến chứng do rubella hiếm khi gặp, bệnh thường nhẹ nhàng qua đi, song biến chứng viêm não có thể xây ra với tỷ lệ 1/10000 (Krugman và Ward 1968) Tuy nhiên, năm 1987 ở Nhật Bản xảy ra một vụ dịch phát ban do rubella lại xuất hiện biến chứng rất nhiều so với các vụ dịch trước Tại một số vùng ở Nam Mỹ, những bà mẹ khi mang
Trang 15hai tật trên (Eckstein và cộng sự 1996) Riêng về biến chứng viêm não lên tới 1/1600
ca (Morirechi 1990)
Một biến chứng thường gặp là giảm tiểu cầu và gây ra ban xuất huyết, chảy máu đường tiết niệu, chảy máu da day
Biến chứng khác cũng thường gặp ở 60% phụ nữ nhiễm Rubella là viêm các khớp
như khớp ngón tay, cổ tay, khớp gối, khớp nách thường kéo dài từ 3 ngày đến một tháng nhưng không để lại di chứng
Việc tiêm phòng văcxin rubella cho bé gái ở tuổi day thi là cần thiết và đó là
phương pháp dự phòng đặc hiệu nhất
Trong chẩn đoán huyết thanh học, ở những người nhiễm rubella bị viêm đa khớp
là yếu tố làm tăng kháng thể đặc hiệu kháng rubella
Thực tế lâm sàng cho thấy phát ban và viêm khớp do rubella thường rất khó chẩn đoán và phân biệt với các bệnh khác như Chikumgunya, Ross Rive virut và Papova
virut B19 Những nghiên cứu về huyết thanh học cho thấy mối liên quan về tiền sử nhiễm rubella và tình trạng miễn dịch cũng không được rõ ràng, đặc biệt là Ở người
lớn Điều này cũng dễ hiểu vì bệnh không phát ban hoặc triệu chứng lâm sàng không rõ ràng có thể chiếm tới 25%
Mối liên quan giữa lâm sàng và virut học diễn biến như sau: Virut ở dịch hạ hầu
có thể xuất hiện một tuần trước và tồn tại 7-10 ngày sau khởi bệnh Virut còn phát hiện được ở phân, nước tiểu nhưng chỉ trong thời gian ngắn Vì vậy, khó phân lập virut từ
các mẫu bệnh phẩm này và các chất bệnh phẩm này không hẻ đóng vai trò quan trọng trong việc truyền bệnh
3.3 Dịch té học
Hình 4: Phát ban xuất huyết ở trẻ sơ sinh bị nhiễm rubella trong bào thai bệnh nhí bị
tim bẩm sinh và đục thuỷ tỉnh thể (Banatvala và Bes0)
Trang 16Rubella có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, ở các nước nhiệt đới trước
khi có văcxin để tiêm cho trẻ em thì bệnh thường xảy ra vào mùa xuân và đầu mùa hạ, ở trẻ em và cả người lớn Phụ nữ trong nhóm tuổi sinh đẻ, tỷ lệ miễn dịch khoảng 80- 85% Trẻ em 9-11 tuổi khoảng 50% (Bowdle 1970) Ở các nước phát triển như Mỹ, Anh quốc, Canada đã tiêm văcxin từ lâu, vì vậy tỷ lệ các dj tat bam sinh do rubella rat hiếm
Năm 1993-1996 dịch sốt phát ban do rubella đồng thời với virut Pavo B19 ở Anh
quốc và Wales, phần lớn là nam giới và chính là những người chưa được tiềm văäcxin
Nhiều nước đang phát triển vì chưa đủ văcxin tiêm phòng thì tỷ lệ mắc ở trẻ em nhiều
hơn các nước ôn đới Các dị tật bẩm sinh do rubella chưa đánh giá được đầy đủ
- ea Bát đầu tiêm chủng văo¿n phối
Đổ, Phụ nữ có thai hợp sởi, quai bị và rubella (MMR) 80 4 bệnh nhân chẩn đoán phòng thí nghiệm Hình 5: Chẩn đoán xác định rubella ở Anh quốc và Wales 1984-1996 (Miller va cộng sự 1997) 3.4 Đáp ứng miễn dịch
Dép ting khang thé IgG, IgM, IgA xuất hiện rất nhanh sau khi phát ban IgG kháng rubella đặc hiệu tồn tại suốt đời nhưng giảm dần ở mức rất thấp trong người già
Kháng thể IgG chủ yếu là IgG1 và IgG3 được phát hiện ở hầu hết các mẫu huyết thanh,
chỉ tìm thấy IgG4 trong một số trường hợp (Morgan- capner 1988) IgM thường xuất hiện 4 ngày sau khi ban mọc và tồn tại 4-12 tuần nhưng các tuần cuối ở hiệu giá thấp nên có phát hiện được hay không còn phụ thuộc vào kỹ thuật xét nghiệm
Kháng thể IgM có thể tồn tại được một năm sau khi nhiễm rubella tự nhiên hoặc
đáp ứng kháng thể sau khi tiêm văcxin Đáp ứng kháng thể IgA ở trong huyết thanh
Trang 17IgAl khang thé IgD va IgE xuat hién nhanh sau khi khỏi bệnh và tổn tại ít nhất 6
thang (Michell va Tingle, 1992), mot diéu dac biét là đáp ứng kháng thể ở nam nhanh hơn ở nữ giới
Bằng kỹ thuật miễn dịch thẩm thấu (immunoblotting) để phát hiện kháng thể đặc
hiệu rất khó khăn Tuy nhiên tác giả Zhang (Mỹ, 1992) đã chứng minh được kháng thể EI và E2 hiệu quả hơn nếu sử dụng 2 mercaptoethanol Kết quả cho thấy hiệu quả E1
lớn hơn E2 và đáp ứng với kháng thể kháng C rất mạnh
3.5 Các dị tật bẩm sinh do rubella
Các trẻ em sinh ra mắc các tật bẩm sinh về tim, mắt, thính giác sau vụ dịch
rubella bùng nổ năm 1963 - 1964, nhưng chưa có nghiên cứu chứng minh xác định có rubella hay không ở các bà mẹ này, đó là điều rất đáng tiếc Khó xác định hơn là một số trẻ bị tật bẩm sinh mà sinh ra trước vụ dịch 1963- 1964 với các bệnh giảm tiểu cầu, chảy máu, viêm tai các nghiên cứu thống kê, đánh giá về bệnh sốt phát ban do virut rubella cũng chưa đầy đủ Sau vụ dịch này các nhà khoa học đã quan tâm nhiều hơn và theo dõi những trẻ sinh trong vùng trước đó có dịch rubella và mang các tật bẩm
sinh.Cooper 1975, theo đối một số trẻ có các tật khi vừa sinh ra và chỉ tồn tại vài tuần
lại hết, không để lại di chứng Thai trong dạ con phát triển chậm nhưng hoàn chỉnh
Ngay sau khi đẻ đã quan sát thấy ở trẻ sơ sinh này có các tốn thương mắt, tim va tai
Một vài trường hợp chết trong tháng đầu do xuất huyết nội tạng Tỷ lệ % phân lập virut đương
Tuổi của trê sơ sinh và trẻ em
Hình 6: Tỷ lệ phân lập được vừut ở trẻ sơ sinh bị nhiễm rubella bào thai
Trang 18}_ Tiêm chúng văcxin a z= 2 œ oO & wo oOo 2 5 2 2 : coal 3 E + ` AY / ÀN ơn Mắc rubella tổng thể re ` \ — ~ Rubella ở người >15 tuổi -~>~ Rubella bam sinh Nam
Hình 7: Tỷ lệ mắc rubella và hội chứng rubella bẩm sinh ở Mỹ (1966-1993) Số ca rubella/100.000 (hệ thống giám sát bệnh quốc gia USA) Số ca mắc hội chứng rubella bẩm sứnh/100.000 trẻ để sống (CDC-USA-1I994) Ngày sau khởi bệnh 2 4 kg 6 6 10 42 14 bevel 18 19 2 KT trung hoa + UCNKHC (NT+HI) KT gây tan huyết (SRH) KT lqG đặc hiệu KT lgM dậc hiệu ˆ Phát ban Sốt Đau khớp Hach Lympho Triệu chứng lâm sàng Chấn đoán HTH Dịch hạ hấu Mau Phan Nước tiểu Phân lập virut 2 4 6 & 0 13 14 16 18 20 22 24 20 29 2Q Hình 8; Sự liên quan về lâm sang va virut hoc cia bénh Rubella (Banatvala va Best) 3.5.1 Điếc
Peckham 1972 theo d6i 218 tré hic mới sinh hoàn toàn bình thường, nhưng chúng
đã bị nhiễm Rubella lúc mẹ mang thai Khi lên 1-4 tuổi thì 50 cháu (23%) bị điếc 85
cháu 6-8 tuổi được khám lại cho thấy 9 cháu bị hỏng thính giác Trong số này, 90% huyết thanh dương tính với rubella, điều này cho thấy khả năng điếc là do rubella bẩm
sinh
Trang 193.5.2 Bénh tim
Dị tật bẩm sinh thường xảy ra ở hệ thống tim mạch Nhiều nghiên cứu cho thấy thương tổn thường gặp nhất là các mạch tim, thông liên nhĩ, thông liên thất, ít gặp hơn là viêm cơ tim bẩm sinh Có thể ảnh hưởng đến động mạch thận, động mạch phổi
3.5.3 Tổn thương thần kinh trung ương
Khoảng 25% trẻ nhiễm rubella bào thai khi sinh ra có các triệu chứng thần kinh, thường là viêm não, chứng ngủ gà, ảo ảnh, thóp phồng, tăng limpho bào ở dịch não tuỷ,
tăng protein trong dịch não tuỷ, liệt cứng thể nhẹ và một số các tổn thương thần kinh
khác xảy ra muộn 6 tháng sau khi sinh
Viêm não lan toả do rubella hiếm hơn Có 20 ca đã được thông báo trong nghiên cứu của một số tác giả Pháp, Đức và Mỹ Các triệu chứng biểu hiện từ 8-19 tuổi (Itabashi va Creamer 1975 Berry 1976)
Người ta đã phát hiện được virut rubella từ não bệnh nhân bằng phương pháp phân lập trên tế bào Mặt khác, còn tìm thấy virut rubella ở tế bào lympho của bệnh
nhân Hiệu giá kháng thể IgG và có thể IgM trong huyết thanh hoặc trong dịch não tuỷ tăng protein và globulin miễn dịch Bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang có thể
phát hiện trong tổ chức não nhưng không thấy kháng nguyên rubella
3.5.4 Tổn thương ở mắt
-_ Võng mạc tổn thương đến 50% ở trẻ em mắc rubella bẩm sinh (Reife 1974) -_ Đục thuỷ tỉnh thể và dẫn tới mù
3.5.3 Bệnh đái đường
Là một biến chứng hiếm xảy ra & rubella bdm sinh Nhung sau dich rubella
1963-1964 cho thấy có 9 trong 45 trẻ (20% ở Australia) và 30 trong 242 trẻ (12,4% ở
Mỹ) phải dùng Insulin để điều trị 3.5.6 Tổn thương xương
Có thể phát hiện bằng X-quang, khoảng 20% số trẻ rubella bam sinh tim thay cdc vùng xương không bình thường và các biểu hiện này ở các xương dài Nhưng trong vòng 1-2 tháng thì trở lại bình thường
Bảng 1: Tỷ lệ thương tổn bẩm sinh ở trẻ sơ sinh bị nhiễm rubella
Trang 20ud TỶ lê % những khuvét tat dic hié
” Xust huyét so sinh Iw ae
Duc thuy tinh sống nhằn TS ấp : ì eae: ———— Mà 2 ` kế) & , te oh Tuéi thai (tháng) Hình 9: Mối liên quan giữa rubella bẩm sinh và tuổi thai (Cooper và cộng sự, 1969) 3.5.7 Các bệnh xảy ra muộn
Trẻ 3-12 tháng có thể biểu hiện phát ban rubella mãn tính, ia chảy kéo dài, viêm phổi và tý lệ chết cao Thường dùng Corticoid để điều trị
Một số tác giả như Tardieu 1980 đã chứng minh những đứa trẻ mắc rubella bẩm
sinh sau đó vài năm xuất hiện các triệu chứng lâm sàng về tai, mắt và viêm não lan toả bán cấp Cũng có những trường hợp mang di chứng do rubella nhưng khi xây dựng gia đình, sinh con lại bình thường và không bị các đị tật
Ở Mỹ, vụ địch rubella 1963 — 1965 xảy ra đã có rất nhiều trường hợp phải mang di chứng Trong nghiên cứu theo dõi 125 bệnh nhân đã mắc rubella bẩm sinh cho thấy tổn thương mắt chiếm 78%, tổn thương thính giác 66%, thiểu năng tỉnh thần và vận
động 62% và các bệnh về tim bẩm sinh là 58%: Thường gặp nhất là tổn thương mắt kết
hợp với thính giác hoặc bệnh tim 3.6 Sinh bệnh học
Nguy cơ của bào thai bị nhiễm virut rubella khi thai còn rất bé ở vài tháng đầu Virut lưu thông trong máu và rau thai Virut giải phóng ra sau đó 6 ngày rồi phát ban
và tồn tại có thể lâu hơn Thai nhiễm virut qua rau thai và virut gây tồn thương các phủ
tạng Năm 1966, trong một nghiên cứu của Tondury và Smith cho thấy: khi theo dõi
57 trẻ có mẹ đã bị nhiễm rubella trong 3 tháng đầu mang thai thì 68% trẻ sinh ra bị các dị tật bẩm sinh Phân tích số trẻ này cho thấy: Mẹ nhiễm virut rubella ở tháng đầu 'mang thaithì nguy cơ di tật 80%, các thương tổn xuất hiện 10 ngày sau khi mẹ phát
Trang 21ban Các nghiên cứu ¿z„vifro trên tế bào bào thai cho thấy virut rubella làm tổn thương
nhiễm sắc thể làm tế bào phân chia chậm hơn các tế bào không bị nhiễm Các cơ quan
của trẻ bị nhiễm virut rubella nhỏ hơn trẻ bình thường, các thương tổn nội mô của bào thai do virut rubella gây ra xuất huyết ở các mao mạch làm xơ cứng các nội tạng như gan, cơ tim virut rubella cũng phân lập được từ trẻ sơ sinh mà mẹ nhiễm virut rubella trong 3 tháng đầu mang thai
3.6.1 Sự tôn lưu của vữut
Nhiễm virut trong thời kỳ có thai ở 3 tháng đầu thì virut tồn tại trong suốt thời gian mang thai và nếu thai sẩy thì có thể phân lập được virut ở hầu hết các phủ tạng của
thai chết lưu
Có thể phát hiện virut ở dịch mũi họng, nước tiểu, phân, địch não tuỷ, nước mắt của trẻ sơ sinh 3 tháng tuổi với tỷ lệ 50-60%; nhưng ở trẻ 9-12 tháng, khả năng phân lập virut chỉ còn 10% (Cooper và Krugman 1967) Đặc biệt vài tuần sau sinh thì lượng virut có mặt trong các dịch tiết cao và nguy cơ lây nhiễm bằng đường tiếp xúc với trẻ
khác là rất dễ dàng Thậm chí có thể phân lập được virut ở trẻ em đục thuỷ tỉnh thể đã 3 tuổi (Menser 1967) và từ dịch não tuỷ của trẻ bị tổn thương hệ thần kinh trung ương
18 tháng tuổi (Desmond 1967)
Bằng miễn dịch huỳnh quang, Ziring 1977 đã phát hiện được kháng nguyên
rubella ở tuyến giáp trạng trẻ 5 tuổi mắc bệnh Hashimoto Bằng phương pháp phân lập
virut rubella trên tế bào đã phát hiện từ não một trẻ em 12 tuổi bị viêm não lan toả
(Cremer, Itabashi 1975) Các nghiên cứu còn cho thấy ở thần kinh trung ương, tế bào
hình sao là loại tế bào virut rubella nhân lên và tập trung cao độ
Câu hỏi đặt ra là virut rubella tồn tại như thế nào trong thời kỳ mang thai cũng
như trẻ sơ sinh trong năm đầu thì còn chưa rõ Có lẽ do làm tổn thương hệ thống miễn
dịch trung gian tế bào? hay tổng hợp Interferon kém? tất cả hình như gợi ý cho thấy sự dung nạp miễn dịch chọn lọc đối với protein E1 có thể đồng vai trò quan trọng (Mauracher và cộng sự, 1993)
Bảng 2: Những biểu hiện lâm sàng chính của rubella bẩm sinh (Dudgeon 1975 & Cooper 1985) Loai bénh Các biểu hiện - — Sẩy thai Biểu hiện chung: - _ Trọng lượng sơ sinh thấp - Chậm phát triển tỉnh thần
- Thinh giác giảm 1 tai hoặc 2 tai Hệ thống thính giác: - Điếc l tai hoặc cả 2 tai
Trang 22Nhiing nghién cttu invitro cla Chantler va Tingle (1980) cho thay su nhan lén cla virut rubella trong té bao Lympho T, đại thực bào (Macrophage) và cũng có thể tồn tại
trong tế bào Lympho B gây ra ức chế tổng hợp protein của tế bào chủ, và nhiều giả thiết khác được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và thử nghiệm trên tế bào Lympho T
3.6.2 Nguy cơ đối với thai nhỉ
Trong 3 tháng đầu khi mang thai nếu các bà mẹ bi nhiém virut rubella thi 75-
100% thai nhỉ khi sinh ra bị các di tật bẩm sinh Một số các bà mẹ không xét nghiệm
theo dõi về các tật bẩm sinh này, đặc biệt ở các nước đang phát triển (Enders 1982,
Miller 1982, Grillner 1983) Nhiều trẻ em mới sinh bình thường, nhưng sau vài tháng hoặc vài năm mới phát hiện con mình bị các tật bẩm sinh như điếc, thần kinh kém phát
triển
Mẹ mang thai sau 3 tháng: Rất khó phân lập được virut rubella từ trẻ sơ sinh hoặc
thai 3 tháng tuổi Các nghiên cứu về huyết thanh học đã xác định mẹ nhiễm virut rubella trong 3 tháng đầu thì trẻ sơ sinh bị nhiễm rất cao Ngược lại, mẹ nhiễm virut rubella sau 3 tháng mang thai thì có thể phát hiện, kiểm tra IgM 25-33% là mẹ nhiễm
virut rubella vào tuần 16-20 mang thai Tuy nhiên các cơ quan được hình thành vào
tuần 12 và đáp ứng kháng thể có thể bị giới hạn Nhiều các thông báo của các tác giả
cũng chứng minh rằng nguy cơ nhiễm khoảng 17% ở tuần 13-16 và 5,9% vào tuần 17-
20 của thời kỳ mang thai
4 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Chẩn đoán lâm sàng nhiễm virut rubella không thể phân biệt được với các bệnh sốt phat ban khác, mà phải có chẩn đoán xác định ở phòng thí nghiệm Đặc biệt, các bệnh phát ban giống như virut rubella trong thời kỳ mang thai Virut rubella phát triển trên tế bào nuôi rất chậm và thậm chí rất khó nhận biết hiện tượng huỷ hoại tế bào
(CPE), nên chẩn đoán huyết thanh học là tốt nhất Hiệu giá kháng thể có thể phát hiện được bằng nhiều phương pháp: HAI (ngăn ngưng kết hồng cầu), EIA, LA (Latex
agglutination), SRH (Single radial haemolysis), Mặc dù kháng thể HAI xuất hiện 1
hoặc 2 ngày sau phát ban, các kháng thể EIA, LA, SRH có thể kéo dài 7 đén 8 ngày
Kháng thể IgM có thể phát hiện được bằng phương pháp ELISA như tóm bắt IgM, đây là phương pháp thích hợp nhất
Bộ sinh phẩm EIA sử dụng chẩn đoán kháng thể đặc hiệu IgM đang được thương
mại hoá Đây là kỹ thuật đặc hiệu và nhậy nhất nên được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để giám sát huyết thanh học Theo Hudson và Morgan (1996) thì IgM đặc hiệu cho rubella xuất hiện trong vòng 4 ngày sau khi khởi ban và tồn lưu 4 đến 12 tuần Trên 4 tuần, sau khi khởi ban việc phát hiện IgM sẽ phụ thuộc vào độ nhậy của kỹ thuật chẩn đoán
Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ tóm bắt kháng thể MACRIA (IgM Antibody
Capture Radio Immuno Assay) được Tenden nghiên cứu năm 1982 và đã sử dụng ở
Anh quốc Kháng thể đặc hiệu IgM và IgG kháng virut rubella có thể được phát hiện trong nước bọt bằng cách sử dụng kỹ thuật này Các kết quả rất tương quan với kháng
thể trong huyết thanh Thời gian tốt nhất để phát hiện kháng thể "TeM là từ ¡ đến 5 tuần sau khởi bệnh
Tái nhiễm rubella được kết hợp với tăng nồng độ kháng thể, đôi khi hiệu giá rất
-cao, đáp ứng kháng thể IgM cũng có thể xuất hiện nhưng thường là thấp và chỉ tạm thời chứ không như sơ nhiễm Yêu cầu vẻ chẩn đoán gồm hồi cứu tiền sử có tiếp xúc
Trang 23voi rubella, tiém vacxin phdng bệnh rubella, phát ban do rubella không? Điều đó rất
khó chấn đoán phân biệt giữa sơ nhiễm và tái nhiễm và nếu như máu thử nghiệm lấy
trước khi tiếp xúc hoặc ngay sau khi tiếp xúc thì cũng chưa tạo được kháng thể Tuy
nhiên, vẫn có thể chẩn đoán phân biệt được tái nhiễm và sơ nhiễm bằng thử nghiệm tìm hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgG của những ca bệnh mới sơ nhiễm gần thì thấp hơn những ca tái nhiễm
4.1 Đánh giá rubella ở phụ nữ có thai
Chú ý lời khai của bệnh nhân về ngày phát bệnh Lấy máu ngay sau khi khởi
bệnh càng sớm càng tốt Mẫu máu lấy trong vòng 3-4 ngày đầu khởi bệnh thì sẽ có khả năng phát hiện được kháng thể bằng kỹ thuật HAI và EIA Tìm động lực kháng thể
phải lấy máu hai lần Lần 2 cách lần 1 ít nhất từ 5-7 ngày Hầu hết bệnh nhân xuất hiện kháng thể một vài ngày sau khi khởi bệnh, đáp ứng kháng thể có thể đến 10 ngày Nhiều bệnh nhân ở giai đoạn sau cấp tính, hiệu giá kháng thể tăng đến mức tối đa, nhưng nó không có ý nghĩa gì cho việc chẩn đoán cho bệnh nhân mới nhiễm gần đây hay đang nhiễm Nếu xuất hiện triệu chứng lâm sàng thì phải tiến hành lấy máu xét
nghiệm IgM ngay để có thể xử lý kịp thời (giữ thai hay không) Phụ nữ trước mang thai nên xét nghiệm, nếu kháng thể IgG kháng virut rubella (-) thì phải tiêm vãăcxin ngay
Nồng độ kháng thể < 10-15 IU/mi thì được coi là âm tính
4.2 Phân lập và dinh loai virut rubella
Bệnh phẩm có thể phân lập trên tế bào hoặc bằng kỹ thuật PCR Phân lập virut ít
khi dùng để chẩn đoán vì rất mất thời gian và tốn kém Việc phân lập virut chỉ để
nghiên cứu dịch tễ học phân tử của virut rubella ;
Virut rubella có thể tạo đám hoại tử trên các dòng tế bào RKI13, SIRC va Vero
bằng hiện tượng giao thoa trên tế bào thận khỉ xanh (GMK) tiên phát (Parkman và Buecher, 1962) và các tế bào thận khi khác hoặc sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immuno fluorescence) hoặc miễn dịch gấn kết peroxydasse (Immuno peroxydase) để phát hiện kháng nguyên trong tế bào RK13, BHK21, Vero K¥ thuat
nhậy nhất để phân lập virut rubella là cấy truyền 1-2 lần trên tế bào Vero, tiếp đến cấy
trên tế bào RKI13 và sau đó có thể định loại bằng miễn dịch huỳnh quang (Best và
O”Shea, 1995) Tuy nhiên, phân lập virut phải làm nhanh chóng, tối thiểu phải mất 3 tuần mới có kết quả Kỹ thuật này thường được thực hiện ở các phòng thí nghiệm đặc
biệt
Sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện ARN của virut rubella và phải cần có đoạn mồi (primer) của vùng E1 như miêu tả của Bosma 1995, Kết quả của kỹ thuật này có thể so sánh với việc phân lập virut; và cũng đã được ứng dụng chẩn đoán virut rubella trước và sau sinh Bằng kỹ thuật như EIA định lượng kháng thể IgG cho thấy
những trường hợp sơ nhiễm gần hiệu giá kháng thể thấp hơn trường hợp tái nhiễm
4.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm về rubella bẩm sinh
Chương trình giám sát quốc gia rubella bẩm sinh ở Anh quốc đã xếp loại những trường hợp nghỉ ngờ rubella bẩm sinh theo tiêu chuẩn dưới đây:
4.3.1 Phát hiện kháng thể đặc hiệu IgM trong huyết thanh ở trẻ mới sinh Sử đụng MAC-EIA là thích hợp nhất Ở trẻ em 1-3 tháng tuổi có triệu chứng đều có thể phát
hiện IgM ya 6 tré 3-6 tháng tuổi vẫn còn phát hiện thấy IgM Ở trẻ 6 -12 tháng tuổi, tỷ
Trang 24Nếu không phát hiện được IgM bằng MAC-EIA trong thời kỳ sơ sinh thì loại trừ được
rubella bẩm sinh
4.3.2 Phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu trong huyết thanh hoặc nước bọt tại thời điểm
mà kháng thể mẹ truyền không còn nữa (Ví dụ: thai tháng thứ 8) Có thể đây là kỹ
thuật hữu hiệu khi đã quá muộn để xét nghiệm IgM.-
4.3.3 Phân lập virut rubella hoặc xác định ARN bằng phương pháp RT-PCR (Bosma 1995) trong bệnh phẩm như dịch ngoáy họng ở trẻ sơ sinh Điều kiện phân lập virut rubella không thể làm ở các Bệnh viện hoặc viện không chuyên khoa, nhung RT-PCR có thể ứng dụng cho dịch hút trong đục thuỷ tỉnh thể để chẩn đoán kháng nguyên rubella bẩm sinh Dịch hút xong được bảo quản trong điều kiện lạnh, dung dịch bảo
quản là NaCI1 0,85%, rồi gửi đến phòng thí nghiệm để xét nghiệm (Bosma, 1995)
Bảng 3: Tiêu chuẩn xếp loại rubella bẩm sinh
Nhiễm Rubella bẩm sinh
- Khong di tat do rubella nhưng có nhiễm bẩm sinh
~_ Xác định bằng phân lập virut hay phát hiện kháng thể IgM
đặc hiệu hoặc có kháng thể IgG ở trẻ sơ sinh
Hội chứng Rubella bẩm sinh
- Xác định -_ Các thương tổn do rubella điển hình có thêm IgM(+) và có IgG lúc mới sinh; Hoặc có 2 hoặc nhiều hơn các tổn thương đo rubella, và xác định được mẹ nhiễm trong thời kỳ mang thai
- Tương hợp -_ Có 2 hoặc nhiều thương tổn do rubella mà khơng có chẩn
đốn phịng thí nghiệm hoặc một thương tổn do rubella Xác
định mẹ nhiễm trong thời kỳ thai nghén
- Có thể xảy ra + - Những phát hiện lâm sàng tương hợp với số liệu phòng thí
nghiệm không kết luận được, hoặc chỉ có tổn thương do
rubella và mẹ nhiễm trong thời kỳ thai nghén
- Không xếp loại được - _ Thiếu thông tin để xác định hoặc loại trừ virut Rubella phân
lập được từ phân, nước tiểu, nước mắt, địch não tuỷ và dich tiết nước mũi, họng của trẻ sơ sinh
Cooper va Krugman (1967) phan lập được virut rubella từ dịch mũi họng ở hầu hết trẻ sơ sinh bị nhiễm lúc mới sinh Nhưng trẻ 3 tháng tuổi giảm còn 60% và 9-12
tháng tuổi còn 10% Tuy nhiên, virut rubella có thể tồn tại ở các vị trí khác có thể lâu
hơn Tỷ lệ chết chu sinh cao ở các trường hợp (+) virut rubella có thể phân lập được ở hầu hết các sinh thiết phủ tạng từ các trẻ sơ sinh nhiễm virut rubella và chết sau sinh
Trẻ phân lập được virut rubella có thể bị mất kháng thể glycoprotein E1 và có thể
không phát hiện được kháng thể HAI một cách liên tục Để xác định tình trạng miễn
dịch của những trẻ đã đến khám muộn có thể cần thiết dùng thử nghiệm EiA và LA,
phát hiện kháng thể cho tất cả Polypeptide của virut rubella 5 Du phong rubella
5.1 Vdcxin rubella
Chủng virut rubella đầu tiên giảm độc lực là một nghiên cứu của Viện NIH-USA
‘Ching nay duge phân lập từ một tân binh mắc rubelia cấp tính, sau đó chủng được làm
Trang 25giảm độc bằng cấy truyền 77 lần trên tế bào thận khi xanh (vevirut Rubellaet monkey
kidney) Tiếp theo thử nghiệm bước đầu trên khi kết quả là có bảo vệ Sau đó tiếp tục làm giảm độc lực bằng cách cấy truyền 5 lần trên tế bào phôi vịt
Trong một thời gian ngắn, một chủng văcxin virut rubclla tiếp tục được nghiên cứu làm giảm độc lực trên tế bào thận thỏ và trên tế bào lưỡng bội của người RA27/3 Vacxin từ chủng RA27/3 có nguồn gốc phân lập từ thận bào thai khi đã nhiễm rubclla
Ching này đã được sử dụng rộng rãi khắp thế giới để sản suất văcxin Mặc dù ở Nhật
Bản, một số chủng văcxin virut rubella cũng được phát triển nhưng hiện nay vẫn đang
sử dụng chủng RA27/3 Các số liệu thử nghiệm về rubella cho thấy chúng có tính miễn
dịch, được bảo vệ và thử thách Những người tiêm văcxin thải virut rubella qua đường
mũi, họng nhưng +virut không còn có khả nang gây bệnh Những nghiên cứu về các chủng virut rubella để sản xuất văcxin đã được Banatvala và Best tổng kết (1989) và
Best (1991)
3.2 Chương trình tiêm chúng văcxin
Vãcxin rubella được ra đời ở Mỹ 1969 và ở Anh quốc 1970 Ở Mỹ, đường lối dự phòng các bệnh trẻ em được để ra nhằm mục dích ngăn chặn đường lây truyền của virut Việc tiêm phòng văcxin cho trẻ em ở trước tuổi đi học làm giảm nguy cơ phụ nữ
mang thai bị nhiễm rubella Tỷ lệ tiêm vãcxin càng cao thì rõ ràng càng làm giảm đáng kể các tật bẩm sinh mắc phải Tuy nhiên, 1989 và 1990 sốt phát ban do virut rubella lại xảy ra ở phụ nữ không tiêm văcxin ở một vài nơi của Mỹ, hậu quả để lại các dị tật bẩm
sinh ở trẻ em (Lindegren và cộng sự 1991)
Ngược lại, chương trình tiêm văcxin có lựa chọn mới bắt đầu ứng dụng ở Anh
quốc là tiêm cho bé gái tuổi dậy thì và cho các phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ Sau đó, họ
khuyến cáo rằng: Tất cả phụ nữ mang thai đều phải xét nghiệm, nếu kháng thể rubella
(-) thì yêu cầu tiêm vacxin Mac dù 90% bé gái ở tuổi dậy thì đã tiêm và chỉ một phần phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ chỉ có 2-3% tiêm văcxin vì vậy số còn lại vẫn có khả năng bị nhiễm khi rubella ở cộng đồng Chính vì vậy, cái đích tiêm văcxin là chương trình trong toàn cộng đồng cần phải thực hiện ở trẻ trai và gái ở độ tuổi đến trường phải được thực hiện (Banatvala 1987) Hiện nay, tiêm 3 loại văcxin cùng phòng 3 bệnh MMR
(Sởi, quai bị, Rubella) ở 15 tháng tuổi, và tiêm MR (Sởi, Rubella) cho tất cả trẻ 5 đến
16 tuổi để dự phòng dịch sởi, quai bị và rubella 5.3 Virut rubella thải ra như thế nào?
Người ta phát hiện được virut rubclla từ dịch mũi, họng ở những người tiêm văcxin từ 6 đến 29 ngày sau tiêm cũng như trong sữa của phụ nữ cho con bú; nhưng nồng độ virut rất thấp và không có khả năng lây truyền hoặc gây bệnh thể lâm sàng vì chủng virut văcxin đã giảm độc lực
5.4 Phản ứng do tiêm vặc xin
Mặc dù văcxin từ chủng giảm độc lực rất an toàn, nhưng có thể sưng hạch Lympho, phát ban và có đau khớp xương xảy ra trong vòng từ 10 đến 30 ngày sau khi
tiêm vac xin Nhìn chung, các phản ứng này xảy ra nhẹ nhàng và chỉ kéo dài trong
vòng một tuần
5.5 Chống chỉ định
Trang 26Giéng nhu cdc vac xin virut s6ng khác, bệnh nhân thoả hiệp miễn dịch như các
bệnh hiểm nghèo, những người đang dùng thuốc gây độc cho tế bào, điều trị bằng tia, các chất corticoid, bệnh nhân giảm tiểu cầu và HIV dương tính
Các văcxin sống có thể tiêm đồng thời nhưng ở các phía khác nhau của chi, loại trừ văcxin hỗn hợp MMR Hai văcxim sống cùng tiêm phải tách ra,cách nhau khoảng 3 tuần Nếu có sốt thì đó là phản ứng và sẽ qua nhanh chóng Văcxin rubella có chứa kháng sinh như Neomycin, Kanamycin hoặc Polymycin vì vậy nếu cơ địa dị ứng với các kháng sinh này cũng không nên tiêm văcxin Tiêm vãcxin rubella, phải để sau 3 tháng mới được truyền máu hoặc dùng globulin miễn dịch Tuy nhiên, sử dụng
globulin miễn dịch kháng D không lấn át được đáp ứng miễn dịch 5.6 Tiêm văcxin trong thời kỳ có thai
Mặc dù các chủng virut rubella hoang dại đã tạo ra quái thai Các số liệu tích lũy
từ những nghiên cứu đã thông báo ở nhiều nước, trong đó có hơn 500 phu nit man cam với rubella được tiêm văcxin trong thời kỳ thai nghén, đặc biệt trong 3 tháng đầu mang
thai Chủng virut vãcxin có thể gây nhiễm virut cho thai nhi, vì virut rubella vẫn phân
lập được từ rau thai, thận và tuy xương đến 94 ngày sau khi tiêm vãcxin Hơn thế nữa, kháng thể IgM có mặt hoặc tồn lưu ở 3% số trẻ em có mẹ mang thai tiêm văcxin ở thời
kỳ 3 tháng đầu :
Về lý thuyết thì nguy cơ tối đa của tiêm văcxin gây ra các dị tật bẩm sinh cho thai nhi là 95% Vì vậy, khuyến cáo ở Anh quốc phụ nữ có thai không nên tiêm văcxin
3.7 Miễn dịch thụ động
Người ta đã sử dụng glubulin miễn địch kháng rubella với hiệu giá cao để thử nghiệm xem có thể giảm nhiễm rubella Điều này có ÿ nghĩa với các phụ nữ mang thai có nguy cơ nhiễm rubella và có tiếp xúc với người mắc rubella tạo ra miễn dịch thụ
động để phòng rubella
Trang 27I DOI TUONG VA PHUGNG PHAP NGHIEN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
-_ 728 mẫu huyết thanh của trẻ em 9 tháng đến 14 tuổi của Tiên Lãng-Hải Phòng
-_ 308 mẫu huyết thanh của trẻ em L đến 10 tuổi của Thanh Hoá - _ 100 mẫu huyết thanh của phụ nữ mang thai 3 tháng đầu của Hà Nội - 452 mau huyết thanh bệnh nhi sốt phát ban nghị Sởi
- _ 52 mẫu huyết thanh của bệnh nhi 1 ngày đến 3 tuổi
* Sinh phẩm
Bộ sinh phẩm Enzygnost® Anti Rubella-virus/[gM (Behring-CHLB Ditc) Bộ sinh phẩm Platelia® Rubella-IgG (BioRad-Pháp)
* Phiếu điều tra một số thông tin của các bà mẹ mang thai
2 Phương pháp
Từ khi phát hiện được virut rubella năm 1962, nhiều tác giả nghiên cứu các
phương pháp phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng rubella
Trước đây một số phương pháp đã được ứng dụng như kỹ thuật trung hòa (NT) kết hợp bổ thể (CF) miễn dịch huỳnh quang (IF) Nhưng cũng có một số khó khăn ở các phòng thí nghiệm thông thường và các kết quả xét nghiệm cũng có lúc không
chính xác Dùng kỹ thuật ƯCNKHC (HỊ) có thể chẩn đoán giai đoạn cấp và tình trạng miễn dịch của bệnh nhân Engvall và Perlman 1971 đã miêu tả về kỹ thuật miễn dịch
Enzyme Sự phát triển của kỹ thuật này đã góp phần cải thiện sự phát hiện kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và có độ nhạy cao Phụ nữ trước thời kỳ mang thai nếu xết nghiệm có IgG kháng vi rút rubclla là đủ bảo vệ thai nhi không nhiễm bệnh hoặc đánh giá tình trạng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin Hoặc xét nghiệm huyết thanh cho thấy IgG tăng lên 2 lần chứng tỏ mới nhiễm Rubella mà có thể không có triệu chứng lâm sàng điển hình
2.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện IgŒ
Sử dụng bộ sinh phẩm Platelia rubella IgG (Bio-Rad) Bộ sinh phẩm này để định
tính và định lượng IgG người kháng vi rút Rubella trong huyết thanh hoặc huyết tương bệnh nhân
2.1.1 Nguyên lý
Là thử nghiệm miễn dịch Enzyme trên phiến cứng (Solid phase enzyme 1mmunoassay) như phương pháp ELISA gián tiếp
Phủ bản kháng nguyên virut rubella đã bất hoạt Kháng thể kháng virut Rubella
trong mẫu huyết thanh sẽ kết hợp với kháng nguyên Sau đó rửa bản để loại bỏ các lgG và protein không đặc hiệu của huyết thanh Thêm vào cộng hợp (kháng thể đơn dòng đặc hiệu chuỗi gamma người gắn Enzyme peroxidase) tạo thành phức hợp kháng
nguyên + kháng thể + cộng hợp Các kháng thể không gắn vào phức hợp được loại bỏ trong quá trình rửa bản Tiếp đến dung dịch cơ chất OPD Phản ứng tạo màu ở mức đậm, nhạt cho phép định lượng IgG trog mẫu thử Dừng phản ứng bằng axit sulfuric Sử
dụng máy đọc ELISA để đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 492 nm
Trang 28Bước | © KN Rubella
Bước 2 A A Khang thé IgG ket hop voi KN Rubella
Rửa bản loại bỏ Globulin miễn dịch không đặc hiệu và protein trong huyết thanh
Bước 3 A È Cộng hợp: kháng IgG người gắn Peroxydase
Bước 4 bàn Cơ chất OPD
2.1.2 Giới thiệu và hướng dẫn sử dụng sinh phẩm trong bộ kH: Platelia Rubella IgG (Biorad) , - Tat cd sinh phdm dude bao quan ở 2 - 8°C - Tat ca sinh phẩm gồm có: R1 Bản nhựa Microplate: 1 96 giếng phẳng (F) đã phủ kháng nguyên rubella bất hoạt được bọc kín trong túi giấy bạc
Bản phủ kháng nguyễn được để ở nhiệt độ phòng 10-15 phút trước khi sử dụng
Cát bỏ túi giấy bạc và dùng ngay Các dãy (strips) chưa dùng có thể để 2-8°C trong túi giấy bạc và dán kín bằng băng dính
R2 Dung dịch rửa đặc 10 lần (10x) 100ml
Dung dịch đệm Tris-NaCl (pH 7,4 + 0,15) ; 1% Tween 20 và 0,01% Thiomerosal
Pha 100ml dung dịch rửa 10x với 900ml nước cất để có 1000ml vừa đủ để rửa I bản Nước cất hoặc nước trao đổi lon để ở nhiệt độ phòng Dung dịch R2 có thể giữ 4 tuần ở
2-8°C Trước khi dùng phải để ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút
R3 Huyết thanh mẫu chuẩn âm: 0,50 ml
Huyết thanh người không có kháng thể IgG khang Rubella, khong cé HBsAg,
HCV va HIV, bao quan trong Thiomerosal 0,01%
R4a Huyét thanh mau chudn duong (1): 0,5 ml; 15UI/ml
Huyết thanh người có chứa kháng thể IgG kháng Rubella va khong cé HBsAg,
HCV và HIV, bảo quản trong Thiomerosal 0,01%
R4b Huyết thanh mẫu chuẩn dương (II): 0,5 ml; 60 U1/ml (như R4a)
Rác Huyết thanh mẫu chuẩn dương (II): 0,5 ml; 120 UI/ml (như R4a)
R4d Huyết thanh mẫu chuẩn dương (IV): 0,5 ml; 500 UI/ml (như Ráa)
RS Khong có R5
Trang 29R6 Cong hop dac 50 lần (50 x) 0,6 ml
Kháng thể đơn dòng chuột kháng chuỗi gamma người (kháng IgG người) gắn Peroxidase Pha ding cho 1 ban: 0,5ml cộng hợp (50 x) pha với 25 ml dung dịch R7 Nếu chỉ dùng 1 kênh có 8 giếng thì pha 50 yl cong hợp đặc 50 x pha với 2,5 ml R7 R6 pha xong phải dùng ngay
R7 Dung dịch pha: 2 lo x80ml
Thành phần gồm dung dich Tris-NaCl pH 7.6
BSA-đỏ phenol 0,1% Tween va 0,01% Thiomerosal
R8 Dung dich pha co chat: 120 ml
0,05M (pH 5,6) axit citric va Natri citrate 0,03% hydrogen -Peroxidase 0,01%
Thiomerosal M6i ban can 30 ml
R9 Co chat (OPD) dang vién: 12 vién x 30 mg
Gồm Otho-phenylenediamine-2HCI (OPD) Khi sử dụng hết sức cẩn thận vì rất độc Nhớ đi găng khi pha OPD Tránh tiếp xúc với da và niêm mạc
Cách pha cơ chat Chromogen (OPD) (R8 + R9)
Kênh 8 giếng (số Viên OPD (R9: số Dung dịch pha cơ chất
kênh) viên) R8 (mi) 1-5 1 10 6-10 2 20 11-12 3 30
Hòa tan viên OPD trong dung dịch cơ chất (R8+R9) Từ không màu chuyển thành vàng nhạt rồi sau đó chuyển thành cam vàng Dung dịch cơ chất một khi đã pha
là dùng ngay, không được để lại
R10 Dung dịch dừng phản ứng:12 ml
Axit sulfuric 4N: chú ý độc hại (ăn mòn)
Để ở nhiệt độ phòng trước khi dùng
Film day bản: 4 tấm
2.1.3 Chuẩn bị dụng cụ, nguyên vội liệu phòng thí nghiệm (không kèm theo bộ ki!)
-_ Nước cất hoặc nước trao đổi ion
- Pipet tự động hoặc bán tự động, cố định thể tích 10-1000 pul; 1, 2 va 10 ml - Ong dong 25, 50, 100, 1000 ml
-_ Máy rửa bản hoặc bừa rửa thủ công
Trang 30- May nhua pha dung dich rtra
- Sodium hypochlorite va Sodium bicarbonate - Gang tay ding 1 lan
- May tr6n vortex mixer -_ Thùng rác an toàn sinh học
2.1.4 Một số điều lưu ý khi sử dụng bộ ki Platelia rubella IgG cua Biorad -_ Cặp huyết thanh phải được thử nghiệm trên cùng một hãng
- Khong ding lẫn lộn các thành phần khác loạt của Biorad và các thành phần của các
hãng khác
-_ Đưa các sinh phẩm vào phòng trước khi dùng (nhiệt độ 23 +30°C)
~_ Pha các dung dịch, sinh phẩm phải cẩn thận tránh nhiễm bẩn
-_ Các dụng cụ thủy tỉnh sau khi rửa sạch phải ngâm trong nước cất hoặc nước trao đổi ion để loại bỏ chất sát trùng (detergents)và làm trung tính thuỷ tỉnh
-_ Sử dụng đầu côn riêng biệt cho mỗi mẫu huyết thanh
- Khong được tiến hành thử nghiệm trong điều kiện bụi bẩn hoặc các chất có bốc hơi
(axit, bazơ, aldehyd), nó có thể làm thay đổi hoạt tính enzyme của cộng hợp
- Phản ứng enzyme rất nhậy đối với tất cả các đồ kim loại, do vậy không được tiếp xúc với các chất cộng hợp, cơ chất hoặc dung dịch dừng phản ứng với bất cứ kim loại nào hoặc chất oxy hóa nào
- Không được dùng chung máy hoặc dụng cụ đựng các sinh phẩm Mỗi dụng cụ chỉ dùng cho 1 thứ duy nhất
-_ Cần thận khi rửa bản vi lượng, không để dung dịch rửa tràn ra ngoài gây sai lệnh kết quả Không được chạm vào bề mặt của mỗi giếng trên bản vi lượng
- Mẫu chứng đương và chứng âm phải cùng thực hiện trên một hàng của thử nghiệm hoặc một bản của thử nghiệm 2.1.5 Thực hiện thứ nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 R3 S4 S5 S6 S7 S8 Sl S9 S2 S10 33 S11 rõ TH” Œ@O yp
-_ Thực hiện theo sơ đồ trên cho các mẫu chuẩn (R) và mẫu thử (S) Chú ý: Tất cả các mẫu thử được xét nghiệm riêng
+ Giếng 1A 200 nl huyết thanh (-) R3 pha 1/101
+ Giếng 1B 200 yl huyét thanh (+) I-R4a pha 1/101 + Giếng 1C 200 kl huyết thanh (+) II-R4b pha 1/101
Trang 31+ Giếng 1D 200 yl huyét thanh (+) III-R4c pha 1/101 + Giéng LE 200 yl huyét thanh (+) IV-R4d pha 1/101
+ Giéng 1F 200 yl huyét thanh bệnh nhân(S1-S1 1) pha 1/101
-_ Pha dung dịch rửa (R2) 100 ml dung dịch đặc R2 với 900ml nước cất Pha 1000ml đủ cho | ban
-_ Pha HT bệnh nhân 1/101 trong R7: 10 pl HT trong 1000 pl R7 HT (-)R3 va HIT(+)
R4a, R4b, Rác, R4d cũng pha như trên để có 1/1001 trộn đều trên máy Vortex ~_ Rửa bản I lần với dung dịch rửa R2 Võ nhẹ bản trên giấy thấm để loại bỏ nước dính
Ở các giếng
- Thêm 200ui1/giếng mẫu đã pha: mẫu HT (-) R3, HT (+) R4a, Rác, R4d vào các
giếng đúng theo sơ đồ
- Day bản
- U ban & th dm 37-40°C trong 60 + 5 phút
- Pha cộng hợp; R6 chỉ pha trước khi lấy bản ủ ấm ra 15 phút Lấy 0,5ml cộng hợp đặc 50 lần (R6) trong 25 ml dung dịch pha R7 (cho 1 bản) Nếu pha cho 1 kênh 8
giếng thì 50 ul dung dịch cộng hợp đặc50 lần với 2,5 ml R7 Trộn đều và phải dùng ngay
-_ Sau lần ủ thứ nhất, vầy bản cho hết dịch ủ Rửa bản 3 lần trong R2 Võ nhẹ bản trên giấy thấm cho hết nước
- Thém 200pl/giéng cộng hợp đã pha (R6) Đậy ban
- 0 37-40°C trong 60+5 phút
-_ Pha dung dịch cơ chất: (R8+R9) chỉ pha trước lần ủ thứ 2 là 10 phút Mội viên OPD (R9) với 10 ml dung dịch cơ chất (R8) Để trong tối cho đến khi sử dụng
-_ Rửa bản 4 lần bằng dung dịch rửa R2 Võ nhẹ bản lên giấy thấm để hết nước -_ Thêm 200Hl/giếng dung dich co chat (R8+R9) Day ban
- U ban é nhiét do 23 + 3°C trong tối (Ví dụ trong túi nilon màu đen) trong 30 + 5 phút
-_ Thêm 100u1/giếng dung dịch dừng phản ứng R10
-_ Lau khơ bên ngồi ban (mat dưới của bản) trước khi đưa lên may doc OD
-_ Đọc bản trong vòng 30 phút khi dừng phản ứng để cho kết quả đúng
~ Kiểm tra lại mẫu và sơ đồ có đúng như mẫu đã chuẩn bị để tính kết quả
2.1.6 Đánh giá về các mâu chuẩn
Các mẫu chuẩn HT I, H, II, IV đã được WHO chuẩn thức bằng so sánh giới hạn OD, định lượng IgG tính bằng đơn vị quốc tế U1/ml để xây dựng đồ thị chuẩn
2.1.7 Kiểm tra chất lượng
Bao gồm các mẫu chuẩn(+) và (-) trên mỗi bản Để thẩm định kết quả thử nghiệm
Trang 322.1.8 Két qud
Hàm lượng IgG được xác định bằng so sánh OD của mẫu thử trong giới hạn chuẩn Các số liệu đọc được (OD) sẽ dựng lên 1 đồ thị gồm HT đương I, II, HH, IV và HT âm, tạo thành 5 điểm ví dụ như hình dưới đây
Định lượng IgG bằng don vi quéc té (U/ml)
- Tat ca cdc mau thit pha 1/101 thé hiện hiệu gi4<10 [U/ml duge coi 1a rubella IgG 4m
tính Bệnh nhân không có miễn dịch
- Tat ca mẫu pha-1/101 có hiệu giá IgG > 10TU/ml và < 15 IU/ml được cơi là nghỉ ngờ (+) cũng có thể mới nhiễm nên IgG chưa tăng Kết quả phải được xác định lại
OD 3
100 200 300 400 500 600 Rubella IgG [U/ml
-_ Tất cả mẫu pha 1/101 có hiệu giá IgG > 15 IU/ml là đương tính
+ Những mẫu có kết quả IgG > 200 TU/ml được coi là đã có miễn dịch từ lâu hoặc mới nhiễm và trong giai đoạn IgG dang tang
+ Những mẫu có lgG > 200 [U/ml va < 500 [U/ml cé thé 1a bệnh nhân mới nhiễm và trong giai đoạn IgG tăng cao hoặc tồn lưu kháng thể miễn dịch cao
+ Những mẫu có IgG > 500 [U/ml cé mién dich rat cao
- D6i véi bénh nhan nghi ngờ mới nhiễm thì mẫu HT thứ 2 phải được lấy 3 tuần sau lần lấy mẫu lần thứ nhất và hiệu giá IgG tăng lên ít nhất 2 lần so với mẫu HT 1 thì
kết luận là mới nhiễm gần đây Nhưng để xác định chính xác phải thực hiện ELISA - IgM Khi khang thé IgM (+) co thé khang dinh kết quả mới nhiễm Rubella
Trang 332.1.9 Thẩm dịnh mẫu chuẩn ODR3=0,035 chuẩn < 0,080 CÓ giá trị ODR4a=0,250 chuẩn > 0,150 ni ODR4b=0,950 chuẩn > 0,400 - nt ODR4c=1,550 chuẩn > 0,600 nt ODR4d=2,000 chuẩn > 0,800 nt ODR 4a 0,250 —————=_—“—-= ODR3 0.035 Tylé Tyke > 2: có giá trị 6 gid tri ODR4b -_ 0950 „ ¬ te aes ODR 4a = 0250 = Tylé > 2: có giá trị ODR 4c 1550, „ „ ; ¬ “ODR4a ` 02507 DIỆ > 2: cógiát ODR 4d _ _2,000 Ti > „„ op ODR 4c ~ 1,00 — 2: 06 gid tr 2.1.10 Những hạn chế của ELISA - IgG
Chẩn đoán bệnh phải kết hợp cả lâm sàng và xét nghiệm huyết thanh
Chỉ 1 huyết thanh không kết luận được
Nếu kết quả 1 cặp huyết thanh không kết luận được thì phải xét nghiệm lại và có thể lấy tiếp 1 huyết thanh thứ 3 để cùng xét nghiệm với cặp huyết thanh trước thì có thể
cho kết quả đúng
Để xác định mới nhiễm lần đầu thì cần phải xét nghiệm kháng thể IgM
Khang thé IgM khang virut Rubellacần được xác định ở phụ nữ mang thai khi IgG
dương tính nhẹ Việc này rất cần vì trong 3 tháng đầu nhiễm rubella, nguy cơ bị dị tật bẩm sinh rất cao
Mặc dù các mẫu chuẩn dựa vào qui định của TCYTTG nhưng ở mỗi phòng thí nghiệm thực hiện kỹ thuật khác nhau cũng có thể cho kết quả không thống nhất 2.2.1.11 Nhận định kết quả: dựa vào mật độ quang học trung bình (OD)
Thử nghiệm được tiến hành cho 20 mẫu riêng biệt cho mỗi loại 20 mẫu HT âm
20 mẫu HT dương tính yếu
Trang 342.2.1.12 Đánh giá độ nhậy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Platelia Rubella IgG - So sanh Platelia Rubella IgG va HI:
Dựa trên kết quả nghiên cứu 435 mẫu huyết thanh Platelia IgG (kết quả lân 1) IgG + + - HI + - + - Số mẫu 311 41 9 74 Platelia IgG (kết quả lần 2) IgG + + - - HI + - + _ Số mẫu 346 6 5 78 Độ nhậy: 98;6% (346/351); Độ đặc hiệu:92,9% (78/84)
-_ So sánh Platela Rubella IgG với kỹ thuật ngưng kết hạt Latex Agglutination (LA)
Bộ sinh phẩm LA đang sử dụng ở thị trường Châu Âu và Mỹ Thử nghiệm 213
mẫu huyết thanh của phụ nữ mang thai Platelia IgG (lần 1) IgG + + - - LA + - + - Số mẫu 172 5 6 30 Platelia IgG (lần 2) IgG + + - - LA + - + - Số mẫu 175 2 0 36 Độ nhậy: 100% (175/175), Độ đặc hiệu:94,7% (36/38) - _ So sánh Platela Rubella IgG với 1 thử nghiệm EIA khác:
Bộ sinh phẩm EIA đang sử dụng ở Mỹ Thử nghiệm 181mẫu huyết thanh của phụ nữ mang thai ° Platelia IgG (kết quả lần 1) IgG + + - - HI + - + - Số mẫu 71 25 7 78 Platelia IgG (kết quả lần 2) IgG + + - - HI + - + - S6 mau 81 15 8 78 D6 nhay: 92,0% (81/89); Độ đặc hiệu:83,9% (78/03)
- Phan ting chéo:
Thử nghiệm 54 mẫu huyết thanh của bệnh nhân mắc bệnh tự miễn (yếu tố khớp, kháng thể kháng nhân) Tất cả số này đều không có phản ứng chéo với Platelia Rubella
IgG
2.2 KY thudt ELISA phdat hién IgM
Bộ sinh phẩm Enzygnost Anti Rubella virut / IgM cia Behring - BRD
La sinh phẩm để phát hiện IgM dac hiéu khi nhiém rubella va chan đoán phân biệt với các bệnh phát ban ở da giống Rubella
Trang 352.2.1 Nguyên lý
Hình vẽ
——_—_ © KN virut Rubella
a _1_ Kháng thể IgM người (HT bệnh nhân)
ầ _E Cộng hợp: Kháng IgM người gắn Peroxydase
£ Oo 2 Cơchấ TMB
2.2.2 Gidi thich nguyén ly
Bề mặt bản nhựa đã được gắn kháng nguyên rubella, huyét thanh bénh nhan đã xử lý bằng RF (Rheumatic Factor) Cac yếu tố RF sẽ bám vào IgG và IgG được loại bỏ trong quá trình rửa Nếu trong huyết thanh có IgM dac hiệu sẽ kết hợp với kháng nguyên rubella (KN rubella + IgM khang nguyén rubella) C4c protein khong tao thanh trong phức hợp trên được loại bỏ trong quá trình rửa Sau đó cho cộng hợp khang IgM người gắn Peroxidase lại kết hợp luôn với phức hợp trên Cơ chất TMB phản ứng với cộng hợp và tạo thành màu xanh Phản ứng màu cuối cùng khi cho dung dịch dừng
phản ứng POD va chuyển thành màu vàng Độ hấp phụ mầu được do OD ở bước sóng
450 nm :
2.2.3 Bộ sinh phẩm gồm
- Enzygnost anti Rubella virut/IgM: 2 ban
-_ Huyết thanh chứng dương P/P: 0,65 ml
-_ Huyết thanh chứng âm P/N : 0,4 ml
- Dung dich pha (Sample Buffer OPD): 2 lo x 50 ml -_ Cộng hợp (anti Human IgM/OPD): 1 ml
- Dung dich pha cong hgp (Conjugate Buffer Microbiol): 4 lo x 12,5 ml -_ Hấp phụ RE: 4 lọ (1 lọ + 5 mi H;O)
-_ Túi polyethylen để bảo quản các kênh chưa dùng 2.2.4 Thành phần các sinh phẩm
-_ Bản nhựa đã gắn kháng IgM người đặc hiệu chuỗi u, mỗi kênh có 2 hàng Khi dùng có thể nhấc ra từng kênh Hàng bên trái gắn KN dương Hàng bên phải gắn KN âm KN dương là tế bào BHK 21 nhiễm Rubella đã bất hoạt KN âm là tế bào BHK 21 không gây nhiễm
- Anti Rubella Referrence P/P: Là kháng thể IgM người kháng virut rubella trong dung dich Tris Buffer — (20 nmol/1) “P” biểu hiện dương tính mạnh trong kỹ thuật Enzygnost anti rubella virut /IgM “N” biểu hiện âm trong chứng âm
- Dung dịch pha loãng mẫu OPD (Tris bufer 0,3 mol/l) chỉ dùng để pha mẫu thử và mẫu chứng
Trang 36- Cong hop: Khang thé khang IgM người gắn enzyme (đặc hiệu chuỗi 1) là kháng thể
dé kháng IgM nguwoi gin Peroxydase (POD) trong Tris buffer (0,05 mol/l) Pha khi ding la 1 +50
- Dung dich pha cong hop: Conjugate buffer microbiol (EDTA 37 mg/l) trong dung
dich Phosphate buffer (PBS) 0,01 mol/l Chi ding dé pha cong hgp
- Chat hấp phụ RE (RF absorbent) dạng đông khô, bao gồm kháng thể cừu kháng trực tiép IgG ngudi trong PBS 10mM (8,2 g/l)
Chú ý:
-_ Sinh phẩm chỉ dùng để chẩn đoán phòng thí nghiệm
-_ Tránh tiếp xúc với đa và niêm mạc
-_ Huyết thanh P/P và P/N của người cho máu đều phải xét nghiệm để loại trừ HbsAg, anti HCV, anti HIV1, anti HIV2 Chi str dung các mẫu huyết thanh âm tính với các
tác nhân trên
-_ Không được dùng các thành phần lẫn lộn giữa các loạt Chú ý xem kỹ loạt và ngày
sản xuất Các sinh phẩm cùng loạt mới dùng đồng thời cho thí nghiệm 2.2.5 Chuẩn bị sinh phẩm để xét nghiệm
Sơ đồ pha mẫu cho cả thử nghiém IgG va IgM 0,4 ml sample buffer POD 0,02 ml 0,2 ml Sample buffer OPD | ——I-G |—0.2ml » KN Chứng KN Mẫu thử hoặc mẫu chứng + Nông độ pha 1:231 - lỗ phút nhiệt độ phòng 15- Ig | 02ml=———— 2C Pha trong tube 0,2 ml —0,15 ml hoặc giếng hấp phụ RF | KN KN(-)
- Dé tat cd sinh phẩm và mẫu thử ở nhiệt độ 18 — 25°C trước khi bắt đầu thử nghiệm Có thể hơi có tủa xuất hiện trong Sample Buffer POD nhưng không ảnh hưởng đến thử nghiệm -_ Cho mỗi bản thử pha 20 ml dung dịch rửa POD trong 400 ml nước cấ hoặc nước trao đổi ion
-_ Pha các mẫu chứng và mẫu thử : tính toán pha thể tích vừa đủ, không pha thừa để sẽ
chuyển màu không ảnh hưởng đến kết quả
- Pha mau thir va mau chitng : 1 + 20 véi mau xanh (Sample buffer POD) tron kỹ
Trang 37- 1+ 20 pha trên có thể sử dụng cả cho kỹ thuật tìm IgG và IgM Mộu này bảo quản ở
2 — 8°C qua đêm, chia ra các lọ con và có nút chặt
-_ Cộng hợp pha l1 :50, trộn đều nhẹ nhàng :
+ Cho 2 kênh ( là ló thử nghiệm).: 5 ml dung dịch đệm + 0,1 ml cộng hợp
+ Cho I bản pha 0,25 mÍ cộng hợp với 12,5 ml († lọ nguyên) dung dich pha cộng
hợp Trộn đều nhàng
- Co chat: Pha cho 1 ban 14 1 mi Chromogen TMB véi 10 ml dung dich pha co chat
TMB trong lo plastic kém theo bộ kit Ngâm lọ trong nước cất sau khi dùng (Không
bao giờ được pha đầy lọ)
Nếu dung dịch cơ chất chuyển màu xanh trướckhi cho vào bản chứng tỏ đã bị nhiễm trùng, trong trường hợp này phải pha lại trong 1 lọ sạch khác Tránh tiếp xúc với đa, niêm mạc Không được đựng trong các dụng cụ kim loại nặng sẽ bị oxy hoá nhanh chóng
-_ Hồi chỉnh 5 mÌ nước cất trong lọ hấp phụ RE
-_ Hấp phụ yếu tố RF:
Thêm 0,2 ml mau pha 1+20 vào lọ RF đã hồi chỉnh 0,2 ml (các mẫu chứng không phải xử lý chất hấp phụ RF) để nhiệt độ phòng 15-25 °C trong 5 phút hoặc 2 - 8°C qua đêm (nồng độ pha1/42)
- Bao quan: Không được mở các lọ sinh phẩm nếu không dùng đến Các thành phần đều có hạn sử dụng ở nhãn, nên bảo quản 2 — 80C
-_ Nguyên liệu cần thiết nhưng không có trong bộ sinh phẩm: (Như cho ELISA - IgM Platelia Rubella IgG — muc 3)
2.2.6 Bệnh phẩm
- Bệnh phẩm thích hợp là huyết thanh hoặc huyết tương người đã xử lý đúng tiêu chuẩn phòng thí nghiệm
-_ Bờt hoạt 56°C/30 phút để giảm các nguy cơ lây nhiễm
Trang 38*Thực hiện:
P/P là huyết thanh chứng dương (HT+) P/N là huyết thanh chứng âm (HT-) Ag là kháng nguyên dương-(KN+) Co Ag là kháng nguyên âm (KN -)
* Như vậy trên bản có:
-_ Đã phủ sẵn anti Human IgM
- Trên mỗi kênh có 2 hàng Ví dụ hàng AI và A2
- Tat cd hang A1 1a KN (+), hàng A2 là KN (-) (Đã phủ sắn)
- Chứng HT (+) cho vào hàng A1 và A2, nếu chỉ làm 1 kênh thì chứng HT (-) cho vào
HI và H2 Nếu làm cả bản thì chứng HT (-) cho vào H11 và H12
- Mộu bệnh phẩm 1, 2, 3, 4, cho vào từng cặp hàng trừ các giếng chứng HT (+) và
HT(-) :
- Nhu vay néu chi tach lam 1 kénh thi duge 6 bénh phdm Néu lam ca ban thi duge 45
bệnh phẩm
* Tóm tắt các bước thực hiện: Trên bản đã phủ sẵn anti human IgM và Ag, CoAg Bước 1: Xử lý huyết thanh bệnh nhân 56°C / 30 phút
Bước 2:
Pha huyết thanh 1/21 (1+20)
Bước 3:
Pha 200 gì (HT/21) +200ul dung dich RF —> cho tỷ lệ 1/42
Cho 150ul / giếng x 2 giếng (BI và B2) Ở 372C / 1 giờ (trong hộp ẩm) Rửa bản 4 lần bằng dung dịch rửa POD, mỗi lần 1 — 2 phút Bước 4: Cộng hợp: pha 1/50 (1 + 50) Cho 100ul / giếng (đủ 96 giếng) Ủ 372C / 1 giờ (trong hộp ẩm) Rửa bản 4 lần bằng dung dịch rửa POD (như trên) Bước 5 : Cơ chất : pha 1/10 (1+10)
Cho 100 pl / giếng (tất cả 96 giếng)
U trong tối (bọc bản bằng giấy màu đen) trong 30 phút
Bước 6: l
Ding phan ting: (Stop Solution) 100 ul / giéng (tat cả 96 giếng)
Trang 39*Thuc hién:
P/P là huyết thanh chứng dương (HT+)
P/N là huyết thanh chứng âm (HT-)
Ag là kháng nguyên dương (KN+) Co Ag là kháng nguyên âm (KN -)
* Như vậy trên bản có:
- Da phi san anti Human IgM
- Trên mỗi kênh có 2 hàng Ví dụ hàng A1 và A2
- Tat cd hang Al la KN (+), hàng A2 là KN (-) (Đã phủ sắn)
- Chứng HT (+) cho vào hàng A1 và À2, nếu chỉ làm 1 kênh thì chứng HT (-) cho vào
HI và H2 Nếu làm cả bản thì chứng HT (-) cho vào H11 và H12
- Mộu bệnh phẩm 1, 2, 3, 4, cho vào từng cặp hàng trừ các giếng chứng HT (+) và
HTC) ,
-_ Như vậy nếu chỉ tách làm 1 kênh thì được 6 bệnh phẩm Nếu làm cả bản thì được 45 bệnh phẩm
* Tóm tắt các bước thực hiện: Trên bản đã phủ sẵn anti human IgM va Ag, CoAg Bước 1: Xử lý huyết thanh bệnh nhân 56°C / 30 phút
Bước 2:
Pha huyết thanh 1/21 (1+20)
Bước 3:
Pha 200 pl (HT/21) +200pl dung dịch RF —> cho tỷ lệ 1/42
Cho 150ul / giếng x 2 giếng (BI và B2) Ủ 372C / 1 giờ (trong hộp ẩm) Rửa bản 4 lần bằng dung dịch rửa POD, mỗi lần 1 — 2 phút Bước 4: Cộng hợp: pha 1/50 (1 + 50) Cho 1001 / giếng (đủ 96 giếng) - Ủ 372C / 1 giờ (trong hộp ẩm) Rửa bản 4 lần bằng dung dịch rửa POD (như trên) Bước 5 : Cơ chất : pha 1/10 (1+10)
Cho 100 il / giếng (tất cả 96 giếng)
Ủ trong tối (bọc bản bằng giấy màu đen) trong 30 phút
Bước 6:
Dừng phản ứng: (Stop Solution) 100 ul / giéng (tất cả 96 giếng)
Trang 40IV KET QUA VA BAN LUAN
1 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ nhiễm rubella 6 trẻ 1-14 tuổi
Để đánh giá chung về tỷ lệ nhiễm rubclla ở Hải Phòng và Thanh Hố,
chúng tơi thực hiện nghiên cứu dịch tễ huyết thanh học ở trẻ em khoẻ mạnh từ 1-
10 tuổi bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể IgG với nồng độ pha loãng của
huyết thanh là 1/100 Kết quả, tổng số mẫu huyết thanh dương tính theo nhóm
tuổi ở Hải Phòng và Thanh Hoá được thể hiện trên bảng 4
Bảng 4: Kết quả giám sát huyết thanh học ở trể em 1-10 tuổi
tại Hải Phòng và Thanh Hoá Nhóm tuổi Số mẫu huyết thanh lgG + (%) <1tmổi 49 2 (4,08) 2-4 tuổi 347 8 (2,30) 5-9 tuổi 405 63 (15,55) Tổng 801 73 (6,98)
Tổng hợp mẫu huyết thanh tại Hải Phòng và Thanh Hóa của trẻ em 1-10
tuổi cho thấy: Tỷ lệ ở trẻ < 1 tuổi là 4,08%; 2-4 tuổi là 2,30% và 5-9 tuổi là 15,55% Bảng 5: Kháng thể IgG kháng virut rubella ở trẻ em 1-14 tuổi tại Tiên Lãng- Hải Phòng, năm 2002 Nhóm Số mẫu IgG (+) % <1tuổi 33 0 0.0 2-4 tuổi 216 1 0,46 5-9 tuổi 244 13 5,33 10-14 tuổi 235 47 20,00 Tổng 728 61 8,4
Phân tích riêng về tỷ lệ nhiễm của Hải Phòng, kết quả thể hiện ở bảng 5, 6,
_7 và hình”10 cho thấy: nhóm trẻ < 1 tuổi IgỚ (-) chưa hề có miễn dịch Nhóm 2-