Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất tritecpenoit từ loài nấm linh chi Ganoderma pfeifferi Bres. ở Nghệ An

Cho đến nay, đã có một số nghiên cứu về nấm ở Việt Nam, và các công trình, đề tài này đều đi đến kết luận về sự đa dạng của các hợp chất thiên nhiên và giá trị to lớn chúng trong sản xuất thực phẩm, dược liệu. Tuy nhiên, các nghiên cứu về loài Ganoderma pfeiferi vẫn còn rất ít, một phần vì loài này chỉ mới được phát hiện ở Việt Nam, trong khi tiềm năng của nó là rất lớn. Do vậy, việc nghiên cứu về Ganoderma pfeiferi là rất cần thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu tiềm năng dược liệu và giá trị kinh tế của loài nấm này. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất tritecpenoit từ loài nấm linh chi Ganoderma pfeifferi Bres. ở Nghệ An”.

1 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hiện nay, nấm công nhận giới riêng biệt, khác biệt hẳn với thực vật hay động vật, chúng tách xuất xấp xỉ tỷ năm trước [18], tạo thành giới riêng biệt hành tinh Nấm phân bố toàn giới phát triển nhiều dạng môi trường sống khác nhau, đa phần nấm sống cạn, số loài lại tìm thấy môi trường nước Dựa theo theo tỉ lệ số loài nấm với số loài thực vật môi trường, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài [21] Tuy nhiên có khoảng 80000 loài nấm nhà phân loại học phát định danh Giới nấm ngày có ý nghĩa to lớn kinh tế quốc dân, khoa học vòng tuần hoàn vật chất Nấm sử dụng dân gian từ hàng ngàn năm có ý nghĩa quan trọng đời sống người Chúng nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, chứa nhiều protein, chất khoáng vitamin (A, B, C, D, E ) [1,2,3] Nhiều loài nấm ứng dụng công nghiệp dược phẩm, nguồn nguyên liệu để điều chế hoạt chất điều trị bệnh Những loại nấm nấm hương, nấm linh chi tập trung nghiên cứu khả chống ung thư, chống virus tăng cường hệ miễn dịch chúng Từ 2000 năm trước, Linh chi sử dụng dân gian loại thuốc quý vua chúa sử dụng Hiện nhà khoa học phát thêm nhiều loài linh chi có đặc tính quý, tốt cho phòng chữa bệnh Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh bệnh gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư, AIDS Trong dịch chiết methanol, hexane, ethyl acetate từ thể Ganoderma lucidum có hoạt chất có hoạt tính kháng virus Chúng có tác dụng kìm hãm sinh trưởng phát triển virus HIV Các hoạt chất từ Ganoderma applanatum có hiệu lực chống khối u cao, chúng sử dụng điều trị ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dày Các dẫn xuất adenosine có G.capense G amboinense có tác dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính tiền tiểu cầu [1, 2, 4, 7, 30, 31, 33] Loài Ganoderma pfeiferi loài nấm quý nằm chi Ganoderma, tương đối phổ biến châu Âu, nơi có khí hậu ôn đới, thường mọc có khả cố định đạm Tuy Việt Nam, loài nấm phát gần đây, với thể lớn, hàm lượng hoạt chất sterol, flavonoit, ancaloit tritecpenoit cao, loài hứa hẹn nguồn dược liệu đáng kể Nghệ An tỉnh có vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt Đây vùng đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, có chứa đựng nguồn lợi lớn đa dạng sinh học, có nguồn lợi lớn nấm sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm Tại phát loài nấm Ganoderma pfeiferi Cho đến nay, có số nghiên cứu nấm Việt Nam, công trình, đề tài đến kết luận đa dạng hợp chất thiên nhiên giá trị to lớn chúng sản xuất thực phẩm, dược liệu Tuy nhiên, nghiên cứu loài Ganoderma pfeiferi ít, phần loài phát Việt Nam, tiềm lớn Do vậy, việc nghiên cứu Ganoderma pfeiferi cần thiết, có ý nghĩa lý luận thực tiễn, góp phần quan trọng việc tìm hiểu tiềm dược liệu giá trị kinh tế loài nấm Vì lý chọn đề tài: “Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất tritecpenoit từ loài nấm linh chi Ganoderma pfeifferi Bres Nghệ An” Nhiệm vụ nghiên cứu Trong đề tài này, có nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với dung môi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất từ nấm linh chi Ganoderma pfeiferi - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất tritecpenoit từ nấm linh chi Ganoderma pfeiferi Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu khóa luận thể loài nấm linh chi Ganoderma pfeifferi Bres thuộc chi Nấm Linh chi (Ganoderma) Nghệ An Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm lớn 1.1.1 Tổng quát nấm lớn Nấm (tên tiếng Anh Fungi) nhóm sinh vật nằm giới Myceteae [25] Giới nấm, bao gồm nấm lớn tất nấm khác (như nấm men, nấm mốc, … vi nấm), tách riêng có đặc điểm không giống thực vật lẫn động vật Vào năm 1977, C Woese phân chia sinh giới thành lãnh giới Bacteria, Archaea Eukarya Nấm, thực vật động vật giới riêng lãnh giới Eukarya Giới nấm gồm sinh vật nhân thực, thể đơn bào đa bào, cấu trúc dạng sợi, phần lớn thành tế bào chứa kitin, lục lạp, lông roi Nấm có hình thức sinh sản hữu tính vô tính nhờ bào tử Nấm sinh vật dị dưỡng, chúng nhận chất dinh dưỡng hấp thụ qua bề mặt tế bào, khác với thực vật tự dưỡng động vật nội tiêu hoá qua ống tiêu hoá Nấm lớn (macrofungi) định nghĩa với thể (fruiting body) phân biệt rõ, mà mọc mặt đất hay mặt đất đủ to để thấy mắt thường thu hái tay” [25] Số lượng loài nấm định danh 80060 loài Trong đó, số lượng loài nấm lớn có khoảng 14 nghìn loài lên tới 22 nghìn loài [21] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Nấm lớn có cấu tạo gồm hai phần: hệ sợi tơ nấm thể Quả thể nấm lớn đa dạng: hình dù với mũ nấm cuống nấm, có bao ngoài, giống vỏ sò nấm sò, hình cúp uốn nhăn, dạng cầu, dùi cui nhỏ, dạng giống lỗ tai nấm tai mèo Màu sắc nấm lớn khác nhau: trắng, xám, vàng, nâu đỏ, đen, tím,… Hình 1.1 Nấm hương Hình 1.2 Nấm rơm Cấu trúc mà người bình thường gọi nấm, thực chất thể hay tai nấm loài nấm Phần sinh dưỡng (vegetative part) loài nấm, gọi hệ sợi tơ nấm (mycelium), bao gồm hệ sợi mãnh nhỏ dài sợi mọc lan đất, compost, khúc gỗ hay chất trồng nấm Sau thời gian tăng trưởng điều kiện thuận lợi, hệ sợi tơ nấm trưởng thành sản sinh thể Nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho nấm lớn chất xơ lignocellulose thực vật Các nấm lớn tiết enzyme mạnh (như cellulase, ligninase, ) phân rã vật liệu lignocellulosic thành chất dinh dưỡng dễ hấp thu 1.1.3 Phân bố Các loài nấm lớn phân bố nhiều nơi trái đất, đặc biệt nơi ẩm ướt, lớp mục vùng rừng mưa Ở vùng đất khô nấm lớn xuất sau mưa [25] 1.1.4 Phân loại nấm lớn 1.1.4.1 Phân loại nấm lớn theo giá trị sử dụng Có thể chia nấm lớn thành loại: Nấm ăn (như nấm hương L edodes, nấm rơm V volvacea); Nấm y dược (như nấm linh chi G lucidum); Nấm độc (như nấm A phalloides); Nhóm nấm hỗn hợp hay “các nấm khác” số lượng lớn nấm lại chưa xác định rõ giá trị sử dụng Dĩ nhiên, kiểu phân loại có giá trị tương đối [25] 1.1.4.2 Phân loại nấm lớn theo môi sinh Nấm sinh vật thiếu cho sống trái đất, chúng phân huỷ chất bã hữu cơ, mắt xích quan trọng lưới thức ăn tự nhiên, tham gia vào chu trình tuần hoàn vật chất Có thể chia nấm lớn thành loại: Hoại sinh: thu nhận dinh dưỡng từ vật liệu hữu chết; Ký sinh: sinh vật ký sinh lấy chất dinh dưỡng từ thực vật động vật sống, gây bất lợi cho vật chủ; Nấm cộng sinh thường gọi rễ - nấm hay khuẩn căn: rễ - nấm có quan hệ sinh lý chặt chẽ hai bên có lợi với rễ thực vật sống chủ: nấm thu nhận dinh dưỡng từ thực vật đồng thời làm tăng trưởng tốt Nấm Cep Bordeaux Boletus, thường cộng sinh với rễ sồi Quercus; nấm matsutake lúc đầu xuất nấm cộng sinh với rễ non, sau thành ký sinh cuối hoại sinh [25] 1.2 Chi Ganoderma (Linh chi) 1.2.1 Đặc điểm hình thái phân loại nấm Linh chi Linh chi sử dụng từ lâu, theo cách hiểu dân gian Linh chi loại nấm có lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, lông, phủ suốt lên mặt tán nấm, mũ nấm có màu đỏ đỏ hồng Nhưng loài nấm họ nấm Linh chi - Ganodermataceae Điểm đặc biệt có nhóm nấm màng bào tử đảm lớp - dấu hiệu di truyền bật, nhiều nhà khoa học đề nghị xếp chúng thành họ độc lập họ Linh chi (Ganodermataceae Donk) Theo Donk (1993) họ Ganodermataceae thuộc nấm lỗ (Alphyllophorales), ngành nấm đảm (Basimydiomycetes), Giới nấm (Mycetalia) Năm 1971, Ainsworth G.C dựa vào đặc điểm hình thái thể, cấu trúc bào tử đảm, đưa hệ thống phân loại cách hoàn chỉnh Cho đến hệ thống phân loại nhiều nhà khoa học giới sử dụng [12] Họ có đặc điểm chung ngành là: cấu tạo tế bào có nhân thật, diệp lục, nhận thức ăn từ môi trường bên cách hấp thu từ giá thể (sống dị dưỡng) Ngoài có đặc điểm riêng [12, 15]: - Sợi nấm gồm nhiều đoạn ngăn cách với vách ngang Mỗi đoạn coi tế bào có hay nhiều nhân Trên vách ngang có lỗ nhỏ, từ chất nguyên sinh nhân qua - Cuống thể biến dị lớn: Các loại đa niên thường không cuống loài có cuống phong phú: Từ loài có cuống ngắn (0,5cm), mảnh (0,2cm) loài dài cỡ hàng 5–10cm dài (20– 25cm), to mập (đường kính tới 3,3cm) Cuống nấm phân nhánh không, màu sắc thay đổi khác tuỳ loài Cuống thường đính bên, đính gần tâm trình liên tán mà thành - Mũ nấm: Dạng thận, gần tròn xoè thành hình quạt nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm có tia rãnh phóng xạ Màu sắc từ vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, đỏ tím, nâu đen, nhẵn, bóng, láng vecni, sẫm màu dần già Lớp vỏ láng phủ suốt mặt mũ chạy dài theo cuống nấm Kích thước tán biến động từ 2–30cm, dày 0,8 – 2,5cm tuỳ loại Phần đính với cuống gồ lên lõm xuống - Thịt nấm dày từ 0,4–1,8 cm màu vàng kem, nâu nhạt, trắng Nấm mềm dai tươi, khô chắc, cứng nhẹ Hệ sợi có đầu tận phình hình chuỳ, màng dày, đan kết vào tạo thành lớp vỏ láng phủ mặt mũ - Bào tầng lớp ống dày từ 0,2–1,7cm, gồm ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng, vàng ánh xanh - Đảm đơn bào mang bào tử đảm hình trứng, trứng cụt - Bào tử đảm có cấu trúc vỏ kép, màu vàng mật ong sáng, tụ dạng giọt dầu, kích thước (5 –6) x (8,8 – 12)µm Vỏ bào tử dày cỡ 0,7 – 12µm, có cấu trúc phức tạp: Màng suốt, màng sần sùi mụn cóc, gai nhọn, gò trống Đặc biệt, dù hình thái bên nấm biến đổi đa dạng, song cấu tạo bào tử đảm có độ ổn định cao Các bào tử đảm đơn bào điều kiện thuận lợi nảy mầm tạo hệ sợi sơ cấp qua loạt phát triển tạo tán nấm Tán nấm hình thành bào tầng lại phát tán bào tử đảm tạo thành chu trình sống nấm Linh chi Chu trình sống tương tự chu trình sống nấm đảm khác Hình 1.3 Chu trình phát triển nhóm Nấm họ Linh chi Nấm Linh chi sinh sản chủ yếu bào tử nằm mặt thể Phần có chức sinh dưỡng hệ sợi nấm mọc ẩn gỗ mục đất Nấm Linh chi mọc gỗ (thường thuộc Fabales) sống hay chết Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng đến tháng 11), mọc thân cây, quanh gốc từ rễ cây, thích hợp với bóng rợp, ánh sáng khuyếch tán nhẹ với nhiệt độ ôn hoà Nên vùng núi đồi cao 1000m so với mực nước biển, thường có chủng thích hợp nhiệt độ thấp từ 21 - 260 vùng Tam Đảo, Pù Mát, Thừa Thiên Huế, Trường Sơn nước ta 10 Các loài Nấm Linh chi phát Việt Nam sớm Dựa theo màu sắc mũ nấm, y học phương Đông phân biệt sáu loại Linh chi với tên gọi tương ứng: Linh chi trắng (Bạch chi hay Ngọc chi), Linh chi vàng (Hoàng chi hay Kim chi), Linh chi xanh (Thanh chi hay Long chi), Linh chi đỏ (Xích chi hay hồng chi), Linh chi tím (Tử chi), Linh chi đen (Hắc chi hay huyền chi) Năm 1881, Karsten xác lập chi Ganoderma Karst Chi Ganoderma thuộc ngành nấm đảm (Basidiomycota), lớp nấm tán (Agaricomycetes), nấm lỗ (Polyporales), họ nấm lim (Ganodermataceae) Trên giới, chi Ganoderma có 250 loài phân loại, ví dụ : G adspersum, G applanatum, G australe, G boninense, G cupreum, G incrassatum, G lipsiense, G lobatum, G lucidum, G oerstedii, G oregonense, G pfeifferi, G planse, G resinaceum, G sessile, G sinense, G tornatum, G tsugae số loài khác Riêng Việt Nam có khoảng 30 loài Chúng phân bố khắp nơi giới, thường mọc rộng rãi nơi có khí hậu nhiệt đới, môi trường sống nấm thường rừng kín xanh ẩm, độ cao từ vài chục mét đến 1500 m [5, 12, 18] Ganoderma lucidum Ganoderma sinesis – Huyền chi 32 1.3 Nấm linh chi Ganoderma pfeifferi 1.3.1 Phân loại Nấm Linh chi có vị trí phân loại thừa nhận rộng rãi nay: - Giới: Nấm (Fungi) - Ngành: Nấm đảm (Basidiomycotina) - Lớp: Agaricomycotina - Bộ: Aphyllophorales - Họ: Ganodermataceae Donk ( Polyporales) - Chi: Ganoderma (Fr.) Pat - Loài: Ganoderma pfeifferi - Tên tương tự: Fomes pfeifferi, Scindalma pfeifferi, Ganoderma laccatum - Tên thường gọi : Nấm linh chi châu Âu 1.3.2 Đặc điểm hình thái 1.3.2.1 Đặc điểm bên Thể có dạng hình bán nguyệt, cuống, thường gắn trực tiếp vào Kích thước chiều ngang từ 10-50cm, rộng 10-30cm, dày 10-15 cm Khi non, bề mặt phía phẳng, bóng, màu trắng màu kem Vào cuối mùa thu mùa đông, bề mặt có tiết sáp nên có màu vàng có mùi thơm đặc trưng 33 Hình 1.8 G.pfeifferi non Hình 1.9 G pfeifferi lâu năm Quả thể lâu năm trở nên cứng, thường có nhiều tầng, màu nâu sẫm, xuất nhiều vết nứt nếp nhăn bề mặt Bề mặt bên có lỗ mịn hình tròn đường kính 0,2 mm, ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, với mật độ 5-6 lỗ/ mm Hình 1.10 Bề mặt thể G pfeifferi Nấm thường mọc đơn, sống lâu năm, không ăn Chúng ban đầu thường ký sinh gỗ, chủ yếu loài thuộc chi sồi (Fagus) 34 số loài rụng lá, kim Aesculus, Acer, Fraxinus, Prunus Quercus, gây bệnh thối trắng, giết chết chủ, sau hoại sinh gốc chết [29] 1.3.2.2 Đặc điểm bên Bào tử thường có dạng hình elip (hình trứng), màu nâu, kích thước 9-12 x 6-8 µm Hình 1.11 Bào tử loài G pfeifferi Người ta thường nhầm lẫn Ganoderma pfeifferi với loài Ganoderma resinaceum Fomitopsis pinicola 1.3.3 Phân bố Ganoderma pfeifferi phân bố phổ biến châu Âu, số nước CH Séc, Đan Mạch, Đức, Hà Lan, Tây Ban Nha, Thủy Điển, Anh,… thời gian dài tìm thấy Ở Việt Nam, G pfeifferi phát vào tháng 9/2011, Lâm Đồng PGS TS Lê Xuân Thám, phó giám đốc Sở Khoa học - công nghệ Lâm Đồng, cho biết phát loài nấm linh chi đỏ chưa có danh mục nấm Việt Nam thân phi lao sống 35 cổng khách sạn Dalat Palace, nên tạm đặt tên “Linh chi Dalat Palace” [8] Loài nấm phát Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An 1.3.4 Thành phần hóa học Hiện nay, không phổ biến Việt Nam nên số lượng nghiên cứu thành phần hóa học loài Ganoderma pfeifferi Năm 2000, A Mothana cộng phân lập phương pháp phổ xác định farnesyl hidroquinon từ loài Ganoderma pfeifferi, axit 2-[2-(2,5-dihidroxyphenyl)-etyliden]-11-hidroxy-6,10-dimetyl-undeca5,9-dien (ganomycin A) (64) axit 2-[2-(2,5- dihidroxyphenyl)-etyliden]-6,10dimetyl-undeca-5,9- dien (ganomycin B) (65) [29] (64) Ganomycin A (65) Ganomycin B Năm 2003, A Mothana cộng phân lập tritecpen từ Ganoderma pfeifferi applanoxidic (68) [28] ganodermadiol (66), lucidadiol (67), axit 36 (66) ganodermadiol (67) lucidadiol (68) axit applanoxidic Từ nghiên cứu Timo H J Niedermeyer cộng (2005), có sterol 10 tritecpen phân lập từ thể Ganoderma pfeifferi Trong đó, có hợp chất phân lập biết đến ergosta-7,22-dien-3-on (69), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (70), 5α,8α-epidioxiergosta-6,22-dien-3βol (71), ergosta-7,22-dien-3β-ol (72), luciandehit B (73), ganoderol A (74), ganoderol B (75), ganoderal A (76) axit applanoxidic A (77), C (78) G (79) [34] 37 (69) (70) (71) (72) 38 (73) Luciandehit B (74) Ganoderol A (75) Ganoderol B (76) Ganoderal A (77) Axit applanoxidic A (78) Axit applanoxidic C 39 (79) Axit applanoxidic G Nhiều steroid tritecpen đươc phân lập biết đến loài chi Ganoderma trước Tuy nhiên, lượng luciandehit B ganoderal A Ganoderma pfeifferi lớn nhiều so với loài khác chi Ví dụ, hàm lượng luciandehit B G pfeifferi cao gấp 100 lần so với G lucidum [17] Hơn thế, có tritecpen phân lập, 3,7,11-trioxo-5α-lanosta8,24-dien-26-al (luciandehit D) (80), 5α-lanosta-8,24-dien-26-hidroxy-3,7-dion (ganoderon A) (81), 5α- lanosta-8-en-24,25-epoxy-26-hidroxy-3,7-dion (ganoderon C) (82) Các cấu trúc xác định dựa kết phổ Từ hợp chất thu được, nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut Ganoderon A, luciandehit B ergosta-7,22-dien-3β-ol cho thấy khả ức chế mạnh chống lại virut Herpes HSV [34] 40 (80) Luciandehit D (81) Ganoderon A (82) Ganoderon C 1.3.5 Hoạt tính sinh học Ganoderma pfeifferi loài nấm quý, phổ biến chưa nghiên cứu sâu Việt Nam với thể lớn, hoạt chất cao, loài có tiềm nuôi trồng khai thác dược liệu Hai hoạt chất ganomycin A ganomycin B cho thấy khả ức chế tăng trưởng số chủng vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gram dương Bacillus subtilis, S aureus Micrococcus flavus [29] 41 Các hợp chất ganoderon A, ganodermadiol, luciandehit B, lucidadiol, ergosta-7,22-dien-3β-ol axit applanoxidic A, C, G có hoạt tính kháng virut virut cúm A HSV-1 [28] 42 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu nấm thu hái vào thời điểm thích hợp năm Mẫu lấy rửa sạch, để nơi thoáng mát sấy khô 40 0C Mẫu xử lý tiếp phương pháp chiết chọn lọc với dung môi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất dùng cho nghiên cứu nêu phần thực nghiệm 2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất Để phân tích phân tách phân lập hợp chất, sử dụng phương pháp sắc ký : - Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230 - 400/mesh - Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích tiến hành mỏng kính silicagel - Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm - Hiện màu: iot đèn UV 254 nm - Các phương pháp kết tinh phân đoạn 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất Cấu trúc hợp chất khảo sát nhờ kết hợp phương pháp phổ: 43 - Phổ tử ngoại (UV) - Phổ hồng ngoại (IR) - Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR - Phổ DEPT - Phổ HSQC - Phổ HMBC - Phổ COSY 2.2 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 2.2.1 Hoá chất Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật dùng loại tinh khiết (pure), dùng cho loại sắc ký lớp mỏng sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) Dung môi sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton, nước cất 2.2.2 Dụng cụ thiết bị - Nhiệt độ nóng chảy đo máy Yanaco MP-S3 - Phổ tử ngoại UV ghi máy Agilent UV-VIS - Phổ hồng ngoại đo máy Bruker 270-30, viên nén KBr - Phổ khối lượng EI-MS ghi máy HP 5989 B-MS với lượng bắn phá 70 eV phổ ESI-MS đo máy LC-MS-Trap-00127 44 - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR đo máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC COSY đo máy Bruker 125 MHz 2.3 Nghiên cứu hợp chất 2.3.1 Thu mẫu Nấm Linh chi đỏ Ganoderma pfeifferi thu hái vườn quốc gia Pù Huống – Nghệ An Mẫu định danh TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học khoa học Huế Tiêu lưu giữ khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh 2.3.2 Phân lập hợp chất Mẫu nấm thu thập sấy khô nhiệt độ từ 40 0-500C 48 giờ, sau sấy khô vật liệu nghiền qua (5,4kg), ngâm chiết lần dung môi metanol (3 × 10l) thời gian ngày, sau lọc dịch lọc cất giảm áp suất thiết bị quay cất chân không thu cao metanol thô màu nâu (162,0g) Sau hòa tan nước chiết với dung môi etyl axetat butanol, chưng cất chân không thu cao etyl axetat cao butanol Cao etyl axetat tiến hành sắc ký cột silica gel (1kg, 80 × 8cm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan : axeton (100:0, 25:1: 15:1, 10: 1, 7:1, 5: 1) hệ dung môi giải hấp clorofom : metanol (10:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu 10 phân đoạn Phân đoạn (2,7g) sắc ký lại cột silica gel (200g, 60 × 3,2cm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan : axeton (100%, 6:1, 4:1, 1:1) thu mẫu chất rắn A (22 mg) 45 Phân đoạn (4,8g) sắc ký lại cột silica gel (200g, 60 × 5cm) với hệ dung môi rửa giải clorofom : metanol (20:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1) thu phân đoạn nhỏ Phân đoạn 4.2 sắc ký cột silica gel (200g, 60 × 3cm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan : axeton (9:1, 4:1) thu mẫu chất rắn B (17 mg) 46 Quả thể G pfeifferi 5,4kg - Ngâm chiết với metanol - Cất thu hồi dung môi Cao metanol 162,0g - Phân bố nước - Chiết hexan, etyl axetat, butanol Cao n – hexan Cao etyl axetat Cao butanol CC, SiO2, N/A, C/M F1 F3 2,7g CC, SiO2, N/A F4 4,8g F10 CC, SiO2, C/M A (22mg) F4.1 F4.2 F4.3 F4.4 CC, SiO2, N/A B (17mg) Sơ đồ 2.1: Phân lập hợp chất nấm linh chi Ganoderma pffeiferi