Viện Công nghệ sinh học_ ĐHCTPHÚC TRÌNH THỰC TẬP NUÔI CẤY MÔBÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤYBÀI 2: VI NHÂN GIỐNG CÂY CẢNHBÀI 3:TẠO SẸO TỪ PHÔI LÚABÀI 4: CẤY CHUYỂNBÀI 5: THUẦN DƯỠNG VÀ CHUYỂN CÂY CON RA VƯỜN ƯƠM
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÚC TRÌNH THỰC TẬP
NHÓM:
SINH VIÊN THỰC HIỆN
THỰC TẬP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT
CS328 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Trang 2BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Giới thiệu một số dụng cụ thiết bị cơ bản, và cách sử dụng chúng
Giúp làm quen với các thao tác trong nuôi cấy mô
II. VẬT LIỆU – MÔI TRƯỜNG
- Dụng cụ: Đĩa petri, chai thủy tinh, giấy thấm mẫu, nước cất
- Hóa chất: Agar, đường sucrose, NAA, BAP, than hoạt tính
III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
- Chuẩn bị dụng cụ khử trùng
- Đĩa petri: mỗi người một đĩa
- Chai, lọthủytinh: mỗi người 2 chai (đựng môi trường)
- Mỗi nhóm: 2 chai nước khử trùng, 2 xấp giấy, 2 chai thủy tinh
- Pha chế môi trường
- Môi trường MS1 (dùng để nhân chồi): BA 2mg/l, NAA 0,5mg/l, 8g agar, 20g sucrose PH =5,7- 5,8
- Môi trường MS2 (môi trường tạo sẹo): 2,4D 3mg/l, VTM 0,5mg/l, 8g agar
- Môi trường MS3 (môi trường tạo rễ): 0,5mg/l NAA, VTN 0,5mg/l, 2g than hoạt tính, 30g sucrose
Trang 3BÀI 2: VI NHÂN GIỐNG CÂY CẢNH
Giúp sinh viên học các thao tác khử trùng mẫu cấy, cách chọn mẫu cấy các thao tác vô mẫu trong điều kiện vô trùng
II. VẬT LIỆU – MÔI TRƯỜNG
- Mẫu cấy: Chồi cây hoa cúc kiểng
- Dụng cụ: chai thủy tinh vô trùng, giấy vô trùng, đèn cồn, dao cắt, kẹp gắp inox,
- Hóa chất: cồn, javen, xà phòng, nước rửa chén,…
- Môi trường MS1: BA 2mg/l, NAA 0,5mg/l, 8g agar, 20g sucrose PH =5,7- 5,8 III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1. Chọn chồi từ cây trong nhà lưới
2. Cắt bỏ lá và cắt thành đoạn ngắn khoảng 5-7 cm, mỗi đoạn có thể có 1 hoặc vài chồi bên
3. Rửa sạch dưới vòi nước
4. Ngâm trong dung dịch xà phòng khoảng 10 phút
5. Rửa lại bằng nước sạch
6. Cho vào chai và thêm vào chai cồn 70% lắc trong 30 giây, sau đó bỏ cồn
7. Cho javel và vài giọt nước rửa chén vào chai và lắc trong 15-20 phút
8. Thực hiện trong tủ cấy vô trùng, đổ bỏ javel và rửa với nước cất (khoảng 3 lần)
9. Lấy mẫu để lên giấy đã khử trùng
10. Dung dao sắc nhọn cắt mẫu thành những đoạn ngằn chứa chồi
11. Cấy vào môi trường MS1 đã chuẩn bị sẵn
12. Để ở điều kiện thích hợp, theo dõi và ghi nhận kết quả
IV. KẾT QUẢ
Bảng 1: Kết quả tạo chồi từ vi nhân giống cây cảnh
D Mẫu không đạt: mẫu không phát triển thành cây, nhưng không bị nhiễm
H Mẫu đạt: Chồi cây phát triển tốt, mẫu không bị nhiễm
Q Mẫu không đạt: cây chết, môi trường không nhiễm
T Mẫu không đạt: Mẫu không phát triển thành cây, nhưng không bị nhiễm
T Mẫu đạt: Chồi cây phát triển tốt, không bị nhiễm
Thảo luận: Kết quả của nhóm chưa tốt, chỉ có 2/5 mẫu còn sống tuy nhiên không có
mẫu nào bị nhiễm
Do quá trình khử trùng của nhóm dài hơn yêu cầu nên mẫu bị giảm sức sống, đồng thời do thao tác cấy chưa đúng có thể đã làm hỏng chồi
Cần thực hiện thao tác thí nghiệm cẩn thận hơn để đạt kết quả tối ưu
Trang 4BÀI 3:TẠO SẸO TỪ PHÔI LÚA
Sinh viên nắm các thao tác cấy tạo sẹo và quan sát các cấu trúc sẹo hình thành
II. VẬT LIỆU – MÔI TRƯỜNG
- Nguyên liệu: Hạt lúa chưa nảy mầm
- Dụng cụ: Đĩa petri vô trùng, bình tam giác, giấy vô trùng, kẹp inox, đèn cồn,
tủ vô trùng
- Hóa chất: Cồn, Javel, nước rửa chén,…
- Môi trường: MS2 (2,4D 3mg/l, VTM 0,5mg/l, 8g agar)
III. Các bước thực hiện
1. Chọn hạt lúa no, sáng
2. Bóc bỏ vỏ trấu (cẩn thận tránh tổn thương phôi)
3. Cho hạt lúa đã bóc vỏ trấu vào bình tam giác đã khử trùng
4. Cho vào cồn 70 lắc trong 30 giây
5. Đổ bỏ cồn cho vào Javel nguyên chất và vài giọt nước rửa chén, lắc đều nhẹ trong 15 phút
6. Mang bình vào tủ cấy, đỏ bỏ Javel rửa mẫu với nước cất tiệt trùng 3 lần cấy vào môi trường MS2 mỗi đĩa cấy 10-15 hạt
7. Ủ tối theo dõi nhiễm và sự xuất hiện của sẹo trong 2 – 3 tuần
IV. KẾT QUẢ
Bảng 2 : Kết quả tạo sẹo từ phôi lúa
STT HỌ VÀ TÊN KẾT QUẢ
1 Có tạo sẹo nhưng bị nhiễm
2 Có tạo sẹo nhưng bị nhiễm
3 Có tạo sẹo nhưng bị nhiễm
4 Có tạo sẹo nhưng bị nhiễm
5 Có tạo sẹo nhưng bị nhiễm
Thảo luận:
Tất cả các mẫu của nhóm đều bị nhiễm, có thể là do qua trình khử trùng mẫu của nhóm không tốt và thao tác cấy mẫu không đảm bảo nguyên tắc vô trùng, hoặc do trình bịch keo đĩa petri còn khe hở tạo điều kiện cho vi sinh vật, côn trùng nhỏ xâm nhập vào
Trang 5BÀI 4: CẤY CHUYỀN
Biết cách cấy chuyền lần 1 cho mẫu cấy sang môi trường dinh dưỡng mới phù hợp với mục đích nuôi cấy (tạo chồi, tạo rễ,…)
II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
- Mẫu cấy: Mẫu cấy còn sống ở bài 2
- Dụng cụ: Đèn cồn, dao cắt, lọ (hoặc ống nghiệm) đựng môi trường vô trùng, giấy vô trùng, kẹp gắp inox,…
- Hóa chất: cồn khử trùng
- Môi trường: MS3(0,5mg/l NAA, VTN 0,5mg/l, 2g than hoạt tính, 30g sucrose) III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1. Cho các mẫu cấy và dụng cụ cần thiết vào tủ vô trùng
2. Mở nắp lọ chứa mẫu cần cấy chuyền, khử trùng miệng lọ và dùng kẹp gắp cây trong lọ ra
3. Để mẫu cấy lên giấy vô trùng, cắt bớt lá úa, rễ già
4. Gắp mẫu cấy cắm vào môi trường MS3 trong lọ đã chuẩn bị trước
5. Hơ miệng và nắp đậy lọ mới trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng và đậy nắp lại
6. Theo dõi sự phát triển của mẫu cấy trong 3 tuần liên tiếp
V. KẾT QUẢ
Bảng 3: Kết quả sức sống của cây sau 3 tuần cấy chuyền
TÊN SV BAN ĐẦU TUẦN 1 TUẦN 2 TUẦN 3
D Cây tốt Cây sống và phát
triển tốt, cây có nảy sinh thêm 2 chồi mới
Cây vẫn phát triển tốt, và chồi lớn dần lên
Cây vẫn sống, chồi phát triển, nhưng một số lá ở cuối cây
bị héo
H Cây tốt Cây sống và phát
triển tốt Cây vẫn sống, cao thêm Cây vẫn phát triển xanh tốt
Q Cây tốt Mẫu cấy phát triển
bình thường
1 cây phát triển bình thường
1 cây bị nhiễm, úa vàng
1 cây phát triển bình thường
1 cây bị nhiễm nhưng vẫn còn sống
T Cây tốt Cây sống và xanh
tốt
Cây vẫn phát triển tốt, có nảy thêm chồi mới
Cây vẫn sống, chồi phát triễn
T Cây tốt Cây sống phát triển
yếu
Cây bị nhiễm nấm
và chết
Cây đã chết do nhiễm nấm
Thảo luận: Kết quả cấy chuyền của nhóm khá tốt, có 2 mẫu bị nhiễm nấm, còn lại
phát triển rất tốt
Do thao tác cấy chuyển không đảm bảo nguyên tắc vô trùng, làm câây mới chuyển có sức sống kém Chất dinh dưỡng trong môi trường giảm dần làm cây khó phát triển Cần cần thận trong thao tác hơn để có kết quả tốt nhất
Trang 6BÀI 5: THUẦN DƯỠNG VÀ CHUYỂN CÂY CON RA VƯỜN ƯƠM
I. MỤC ĐÍCH:
Làm quen với các kỹ thuật đưa cây con ra vườn ươm
Học các thao tác chuyển cấy cây con ra vườn ươm
Học cách chăm sóc để cây cấy mô thích nghi có tỉ lệ sống cao và phát triển tốt trong điều kiện tự nhiên
II. VẬT LIỆU – MÔI TRƯỜNG
- Cây con có đầy đủ rể thân lá
- Ly nhựa trồng cây
- Thau nhựa
- Bọc nilon
- Giá thể trồng (đất, xơ dừa, trấu, than,…)
III. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1. Lấy nhẹ nhàng cây con từ bình nuôi
2. Tách riêng từng cây rửa sạch agar bám xung quanh rễ
3. Ngâm nhanh rễ trong nước trong khi chuẩn bị đất.hoặc rửa dưới vòi nước chảy nhẹ
4. Đặt cây vào giá thể trồng sau khi đo cây
5. Trùm kín cây bằng bọc nilon
6. Để trong mát
7. Khoảng 7 ngày mở bọc nilon (một cách từ từ)
8. Khoảng 15 ngày cây có thể sống ở điều kiện bình thường