QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC VÀ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN ĐỀ TÀI Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin Bình vôi trồng qui mô sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình QUY TRÌNHHỒ SƠ SẢN PHẨM KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔKỸ THUẬT NHÂNG GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ THÔNG TIN CHUNG CỦA QUY TRÌNH .4 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ CÂY BÌNH VÔI VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC NHÂN GIỐNG BẰNG CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY 13 BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Đỗ Thị Đào (2008 ), “Ảnh hưởng số nhân tố tới kết giâm củ cắt Tai chua ” Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh 21 Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội .21 Dương Mộng Hùng “ Nhân giống Phi lao Củ cành” ĐH Lâm Nghiệp số 11/1992 21 Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003) Giáo trình giống rừng Nhà xuất Nông Nghiệp 21 Đoàn Thị Mai cộng (2000) Kết bước đầu vê nhân giống Bạch đàn lai phương pháp nuôi cấy mô phân sinh Tạp chí Lâm nghiệp, 10 : 46 – 47 21 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ Sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp 21 Lê Văn Chi (1992) Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng vi lượng hiệu cao Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội .21 Lê Đình Khả (1993), “ Nhân giống Keo tràm Keo tai tượng” Tạp chí lâm nghiệp số 5/1993 .21 Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng, giáo trình giống rừng, 2003 21 Lê Đình Khả, Đoàn Thị Bích, Trần Cự, “ Nghiên cứu tạo chồi, môi trường giá thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng”, tạp chí Lâm nghiệp dố 10/1996 21 Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ bắng Củ”, tạp chí Lâm nghiệp số 9/1996 21 Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống Sao đen thuốc bột TTG”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số 8/1998 .21 Ngô Kim Khôi (1998), Thống kê toán học Lâm nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà Nội .22 Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vô tính chàm (Melaleula caujuputy Powell ) phương pháp giâm củ cắt” Luận văn tốt nghiệp trường ĐH Lâm Nghiệp .22 Nguyễn Hữu Thước cộng sự: “Ảnh hưởng chế đọ che sáng đến Xà Cừ” Tập san SVĐH III 1964 Tr.35-38 22 Nguyễn Hữu Thước, Lê Văn Khôi: “Nghiên cứu yêu cầu ánh sáng Mỡ giai đoạn tuổi non” Tập san SVĐH III 22 Thái Văn Trừng (2000): “Những hệ sinh thái rừng mưa nhiệt đới Việt Nam”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 22 Phạm Văn Tuấn (1997) “ Nhân giống rừng Củ, thành tựu khả áp dụng Việt Nam” Tổng luận chuyên khảo kỹ thuật Lâm nghiệp Việt Nam NXB Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 22 Đỗ Tất Lợi, 1991 Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB BNN 22 ĐẶT VẤN ĐỀ Nằm vùng giàu tài nguyên dược liệu giới, Việt Nam đánh giá nước có tài nguyên thuốc phong phú Theo Trung tâm Tài nguyên Môi trường - Đại học Quốc gia Hà Nội (2000) thống kê nước ta có 3.800 loài thực vật có giá trị dược liệu Việc sử dụng thảo dược làm thuốc chữa bệnh có từ xa xưa, song chủ yếu dựa theo kinh nghiệm dân gian Trong năm gần đây, nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm tăng mạnh, việc khai thác nguồn tài nguyên thuốc cách bừa bãi làm cho loài có giá trị dược liệu bị suy giảm nghiêm trọng, số loài đứng trước nguy bị tuyệt chủng, phải đưa vào danh mục thực vật rừng nguy cấp, quý, hiếm, nghiêm cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng năm 2006 Chính phủ) Trước thực trạng đó, Thủ tướng Chính phủ ban hành Quyết định số 81/2009/QĐ-TTg việc phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành công nghiệp hóa dược đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 Trong đó, ưu tiên đầu tư sản xuất nguyên liệu hóa dược để phục vụ sản xuất thuốc thiết yếu, thuốc mạnh xuất khẩu, thuốc từ dược liệu để thay thuốc nhập Ưu tiên việc tạo dựng nguồn nguyên liệu ổn định số lượng chất lượng để cung cấp cho nhà máy chiết xuất Theo quy hoạch, có 22 vùng nguyên liệu sản xuất thuốc củng cố, mở rộng nhằm phát triển giống thuốc quý Việt Nam giới Chi Bình vôi (Stephania) gồm nhiều loài thuốc quý có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dày, chữa ngủ, chúng sử dụng để chữa bệnh ung thư bệnh kỷ Hiện tài liệu mô tả đặc điểm sinh vật học, sinh thái học loài Bình vôi hạn chế Trong loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) bị suy giảm nghiêm trọng tự nhiên Do việc hiểu biết số đặc điểm sinh vật học loài có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen phát triển loài thuốc quý Bên cạnh đó, hiểu biết tầm quan trọng, lợi ích công tác nhân giống, đặc biệt nhân giống sinh dưỡng loài không giúp cho công tác bảo tồn mà tạo nguồn nguyên liệu đảm bảo số lượng chất lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mô lớn Chính lý đây, đề tài tiến hành thực nội dung nghiên cứu “Nhân giống bBình vôi từ củ nuôi cấy mô” nhằm cung cấp thêm thông tin loài nói riêng công tác bảo tồn phát triển thuốc nước ta THÔNG TIN CHUNG CỦA QUY TRÌNH Mụ c đí ch xây dự ng quy trì nh Nhằ m mụ c đí ch xây đượ c trì nh tự thự c hiệ n đượ c hoạ t độ ng nhân giố ng Bì nh vôi bằ ng phương phá p nhân giố ng bằ ng củ và nuôi cấ y mô Xuấ t xứ quy trì nh Quy trì nh đượ c hì nh thà nh dự a cá c nghiên cứ u và thự c nghiệ m ở mô hì nh thuộ c đề tà i “ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin Bình vôi trồng qui mô sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình ” tạ i đị a điể m Hò a Bì nh, Thá i Bì nh, Đắ c Nông, và Đà Lạ t Phạ m vi á p dụ ng quy trì nh Quy trì nh á p dụ ng vớ i cá c loà i thuộ c chi Bì nh vôi có củ Mộ t số thuậ t ngữ , khá i niệ m - Nuôi cấ y mô tế bà o thự c vậ t : Nuôi cấy mô tế bào thực vật tổng hợp kỹ thuật sử dụng để trì nuôi cấy tế bào, mô quan thực vật điều kiện vô trùng môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với thành phần xác định CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ CÂY BÌNH VÔI VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC NHÂN GIỐNG BẰNG CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO 1.1 1.2 Giới thiệu chung loài Bình vôi Như đề cập, Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) thuộc chi Bình vôi (Stephania) Ở Việt Nam biết gần 15 loài, có khoảng 10 loài có rễ phình thành củ, nhìn hình thái bên chúng tương đối giống nhau, có tên chung gọi “Bình vôi”, gồm loài S brachyandra Diels; S cambodia Gagnep; S cepharantha Hayta; S dielsiana Y.C.Wu; S kwangsiensis H S Lo; S pierrei Dield; S rotunda Lour; S venosa (Blume) Spreng v.v… tất dùng làm thuốc 1.2.1 1.1.1 Đặc điểm hình thái Bình vôi dây leo, sống hàng năm Thân non nhẵn, già có nhiều bì khổng, hóa gỗ có xoắn vặn Rễ củ to, vỏ xù xì, màu nâu xám Lá mọc so le, có cuống dài, đính khoảng 1/3 vào phiến lá; phiến mỏng, gân hình tròn tam giác, gốc bằng, đầu tù, mép lượn sóng, hai mép nhẵn, gân xuất phát từ chỗ đính cuống lá, tỏa hình chân vịt rõ mặt Cụm hoa mọc kẽ cành già rụng thành sim tán Hoa đực hoa khác gốc, hoa đực có 5-6 đài, 3-4 cánh hoa màu vàng cam, 3-6 nhị, thường 4; hoa có đài, cánh hoa; bầu hình trứng Quả hạch, hình cầu, dẹt, màu đỏ chín; hạt cứng, hình móng ngựa với hàng vân ngang dạng gai, hai mặt bên lõm, lỗ thủng 1.2.2 1.1.2 Đặc điểm sinh học Bình vôi loại ưa sáng chịu bóng chịu bóng Cây thường mọc kẽ đá, leo trùm lên loại khác phủ lên đá, loại hình rừng ẩm núi đá vôi Độ cao phân bố loài S sinia Diels thường từ vài chục đến vài trăm mét chưa phát thấy khoảng 100m so với mặt biển Bình vôi có tượng rụng vào mùa đông, mọc lại vào mùa xuân hoa xuất sau non Mùa hoa vào tháng 4-8, cá biệt thấy chín vào tháng 10 Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt từ phần khác lại sau cắt Ngoài ra, từ củ Bình vôi đem vùi 1/3 xuống đất cần đặt phần gốc tiếp xúc với đất ẩm mọc thành Nhìn chung, loài Binh vôi ưa ẩm Lúc nhỏ, mọc tán rừng Sau 2, năm, leo lên giá thể, ưa sáng Những loài sống núi đá vôi trảng cát ven biển có mọc thường có hệ rễ phát triển, len lõi khe đá đâu sâu xuống cát để hút nước chất dinh dưỡng Có thể rễ củ to, chứa nhiều nước nên loái sống núi đá vôi có khả chống chịu cao với điện kiện thời tiết khắc nghiệt khô hạn nắng nóng mùa hè Đặc điệm tượng học Binh vôi thể rõ nét qua tập tính sinh trưởng phát triển chồi Nhìn chung, loài Binh vôi có Việt Nam có hai vụ chồi năm Vụ chồi Đông Xuân, bao gồm chồi sớm xuất thân đầu củ từ tháng 11 – 12 Những chồi trạng thái chồi ngủ mùa Xuân tháng 1-2 bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ vòng 1-2 tháng, chồi dài tới 1m Chồi Đông Xuân lứa chồi quan trọng Binh vôi, Xuân Hè (chồ cấp II) Số chồi cấp II nhiều gấp bội so với chồi Đông Xuân tính đơn vị chiều dài chồi Lá trưởng thành gnay mùa Hè rụng hết vào mùa khô hanh (tháng 10) Sự rụng hàng năm tập tính quan trọng Binh vôi Sự tái sinh chồi mạnh mẽ Bình vôi thể khả mọc mầm mảnh bổ tf củ đem vùi xuống đất Những mảnh đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt mảnh khác Có thể áp dụng khả để nhân giống Binh vôi 1.2.3 1.1.3 Đặc điểm phân bố Thế giới: Trung Quốc, Lào Việt Nam: Trong loài Bình vôi kể trên, có số loài S sinica Diels, S kwangsiensis H S Lo, S rotunda Lour thường mọc lẫn với rừng núi đá vôi tỉnh Ninh Bình, Hà Nam, Thanh Hóa, Quảng Bình, Hải Phòng(Cát Bà), Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tây (cũ) 1.2.4 1.1.4 Bộ phận dùng công dụng Bộ phận dùng: Củ thái lát phơi hay sấy khô, dùng làm thuốc theo y học cổ truyền Để chiết xuất hoạt tính làm thuốc dùng củ tươi Thành phần hóa học: Trong củ loài Bình vôi nói chung thường có số nhóm hoạt chất, thành phần chủ yếu alkaloid như: L-tetrahydropamatin, stepharin, cycleanin, tuduranin, palmatin, dihydropalmatin, dicentrin… Công dụng: Trong y học cổ truyền dùng củ Bình vôi thái lát phơi khô sắc uống có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dày… Liều dùng 3-6 g/ngày Tuy nhiên, cách dùng áp dụng, dễ bị ngộ độc (gây nôn) có alkaloid Bình vôi nguyên liệu chiết alcalid làm thuốc an thần, chữa ngủ Thuốc làm dạng viên có tên Rotunda, viên chứa 0,05g L-tetrahydropalmatin clohydrat Liều dùng viên 1-2 viên trước ngủ 1.2.5 1.1.5 Giá trị kinh tế, khoa học, bảo tồn Bình vôi thuốc quý Do nguồn nguyên liệu tương đối dồi nên giá thu mua rẻ Tại nơi khai thác, giá mua khoảng 4.000 – 4.500 đ/kg tươi Bởi giá thành thuốc rẻ (3.000- 3.500 đồng vỉ 10 viên) Tuy nhiên, phát động khai thác ạt (từ năm 1992 đến nay) nhằm cung cấp cho thị trường nước xuất nên nguồn Bình vôi tỉnh miền núi phía Bắc mau cạn kiệt Bên cạnh đó, Việt Nam có số loài Bình vôi coi quý hiếm, như: Stephania brachyandra Diels có hàm lượng L-tetrahydropalmatin cao số loài biết (khoảng 2,3-3,5%), phân bố số vùng núi cao 1.000m Hoặc loài Stephania cepharantha Hayta chứa hợp chất Cepharantin, có tác dụng làm thuốc chữa ung thư, phát điểm Quảng Ninh Hòa Bình … Những loài đưa vào danh mục Sách đỏ Danh lục đỏ thuốc Việt Nam để bảo vệ, mức đe dọa tuyệt chủng cao Để khai thác lâu dài nguồn Bình vôi Việt Nam, trước mắt nên khai thác hạn chế, với khối lượng vừa đủ cho nhu cầu sử dụng nước (ước tính 50-100 tấn/năm) Bên cạnh đó, cần hoàn tất việc nghiên cứu, phát triển số loài có hàm lượng cao Stephania brachyandra Diels Stephania kwangsienssis H S Lo tỉnh phía Bắc 1.3 Cơ sở việc nhân giống Củ Thực vật có hai hình thức sinh sản chủ yếu, sinh sản hữu tính sinh sản vô tính Sinh sản hữu tính hình thức sinh sản có sở dựa phân bào giảm nhiễm Hợp tử hình thành kết hợp hai giao tử đực giao tử hai thể bố mẹ Do sinh sản hữu tính có phân ly tái tổ hợp gen, nên thể thường không giữ đặc tính di truyền thể bố mẹ cách nguyên vẹn Sinh sản sinh dưỡng hình thức sinh sản có sở dựa vào phân bào nguyên nhiễm Tế bào mẹ sinh tế bào có nhiễm sắc thể giống hệt Do mà thực vật sinh sản sinh dưỡng trì đặc điểm di truyền thể mẹ ổn định qua nhiều hệ Nhân giống sinh dưỡng (vegatative propagation) kĩ thuật tạo từ phận sinh dưỡng lá, cành, củ, thân, mô phân sinh tiếp hợp phận dinh dưỡng (ghép) để tạo thành Theo nghĩa rộng nhân giống sinh dưỡng bao gồm nhân giống củ (mảnh cắt củ), chiết cành, ghép nuôi cấy mô – tế bào + Phương pháp chiết việc tạo rễ cho đoạn cành (thân) mẹ tách cành (thân) khỏi thân mẹ để nhân giống Phương pháp có ưu điểm chiết sớm Tuy nhiên, hệ số nhân giống thấp, chiết nhanh bị cỗi + Phương pháp ghép dùng phân sinh dưỡng mẹ định thân giống ghép lên khác (gốc ghép) để tạo nên hoàn chỉnh Phương pháp cho hệ số nhân giống cao, ghép sinh trưởng tốt, tuổi thọ cao Nhưng phương pháp yêu cầu ghép phức tạp, phương pháp đòi hỏi người có kinh nghiệm để lựa chon cành mắt chiết đạt yêu cầu để đảm bảo chất lượng tốt + Phương pháp nhân giống nuôi cấy mô – tế bào phương pháp tạo từ phân nhỏ (các quan, mô, tế bào) cách nuôi chúng bình nuôi điều kiện vô trùng có môi trường thích hợp kiểm sóat nghiêm ngặt Đây phương pháp nhân giống vô tính mang lại hiệu cao nhất, chất lượng tốt, đồng Tuy nhiên, việc nuôi cấy mô thực với quy trình thật nghiêm túc tỉ mỉ, điều kiện trang thiết bị đầy đủ mô phát triển môi trường hoàn toàn vô trùng, việc nhân giống thực với quy mô nhỏ phục vụ cho nghiên cứu + Phương pháp nhân giống hom củ (mảnh cắt củ) phương pháp dùng phần lá, đoạn thân, đoạn cành đoạn rễ để tạo gọi Củ phương pháp nhân giống giữ nguyên tính trạng mẹ (do có kiểu gen hoàn toàn giống mẹ ban đầu), đơn giản có hệ số nhân lớn, tương đối rẻ tiền nên ngày sử dụng rộng rãi nhân giống rừng, ăn quả, cảnh… Tuỳ thuộc vào loại mảnh cắt củ sử dụng mà phận thiếu có khác nhìn chung phận thiếu rễ (phần mặt đất) phận mặt đất thân, cành, lá… Khả rễ có ỹ nghĩa định thành bại giâm củ cắt, nhiên hình thành rễ lại phụ thuộc vào đặc điểm di truyền loài cây, phận lấy làm giống dòng mẹ, chất điều hoà sinh trưởng, điều kiện giâm, giá thể… Do người ta phải tạo điều kiện thuận lợi cho củ giâm rễ 1.4 Cơ sở khoa học nhân giống phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.4.1 Cơ sở việc nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Chồi ngủ: Cây thường tạo chồi "ngủ" để chắn sống còn, chồi chết bị sâu bọ ăn Trong thời dài, lớn lên sản xuất chất điều hoà sinh trưởng (hormone – kích thích tố) để ngăn cản phát triển chồi khác thân Nếu chết đi, chất điều hoà sinh trưởng bị thiếu hụt chồi "ngủ" bắt đầu phát triển Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào: Cơ sở phân hóa phản phân hóa tế bào tính toàn tế bào Mỗi tế bào chuyên hóa chứa lượng thông tin di truyền (bộ nhiễm sắc thể) giống với toàn tế bào khác thể trưởng thành giống tế bào hợp tử Nếu tế bào chuyên hóa để điều kiện định tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính toàn tế bào Như tế bào phát triển thành hoàn chỉnh sở phương pháp nuôi cấy in vitro Về mặt di truyền phân tử nói toàn trình phát triển cá thể từ hợp tử chết tuổi tối đa mã hóa cấu trúc phân tử ADN đặc trưng cho loài Đời sống trình thực chương trình di truyền Sơ đồ thể biệt hóa phản biệt hóa tế bào 10 Quá trình biệt hóa TB TB phôi sinh TB giãn TB phân hóa chức Quá trình phản biệt hóa TB Cơ sở thứ hai phương pháp nuôi cấy mô - tế bào biệt hóa phản biệt hóa tế bào Sự biệt hóa tế bào trình tế bào chuyển từ giai đoạn sinh trưởng tế bào sang giai đoạn chuyên hóa chức Các tế bào giai đoạn có đặc trưng khác cấu trúc chức Sự phản phân hóa tế bào trình diễn ngược lại, tế bào biệt hóa mô chức không khả phân chia mà điều kiện định chúng quay trở lại đóng vai trò mô phân sinh có khả phân chia tế bào [3], [1] Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ: Trong giai đoạn người ta thường sử dụng loại hóa chất như: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn nấm, vi khuẩn tạo chủ động nguồn mẫu cấy Nguồn mẫu ban đầu chồi, hạt phận khác Mục đích giai đoạn tạo nguồn vật liệu để đưa vào nuôi cấy giai đoạn 1.4.2 Cơ sở việc nghiên cứu khả tạo chồi từ chồi ngủ nuôi cấy mô Nhóm chất điều hoà sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, Gibberellin,… chất phụ gia khác nước dừa, chuối, khoai tây,… có vai trò quan trọng, chúng thúc đẩy phân hoá quan, đặc biệt 11 chồi Mục tiêu giai đoạn tạo số lượng chồi, chồi sinh trưởng phát triển tốt để chủ động sản xuất lượng lớn giống cung cấp cho thị trường 1.4.3 Cơ sở việc nghiên cứu khả phát triển từ chồi nuôi cấy mô Tạo nuôi cấy mô hoàn chỉnh: Khi chồi đạt kích thước định từ môi trường nhân nhanh cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Thông thường, môi trường tạo rễ hàm lượng Cytokinin giảm xuống, ngược lại tăng hàm lượng Auxin Các chất ĐHST như: α - NAA, IBA, IAA nồng độ 0,1 - 5,0 mg/l thường sử dụng để tạo rễ cho hầu hết loài trồng Ở giai đoạn này, mô nhạy cảm với độ ẩm, ánh sáng dễ nhiễm bệnh hoạt động rễ sinh phải lưu ý đến yếu tố môi trường nuôi cấy Đưa nuôi cấy mô vườn ươm: Ở giai đoạn này, huấn luyện cho thích nghi với môi trường bên Chú ý đảm bảo độ ẩm, chế độ ánh sáng (tránh ánh sáng trực xạ cho - tuần đầu), ngày sau chế độ chăm sóc hom ươm từ hạt vườn ươm 12 CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ 1.5 2.1 QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TỪ CỦ Từ kết thực nghiệm thực tế quan sát, bước đầu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống vô tính bình vôi tử củ sau: 1.5.1 2.1.1 Thời vụ nhân giống Có thể giâm củ cắthom từ tháng đến tháng dương lịch 1.5.2 2.1.2 Chuẩn bị vật liệu nhân giống + Giá thể giâm củ cắt Giá thể giâm củ cắt cát sông (loạ i cá t đen) tầng đất B Trước cấy Ccủ vào luống giâm, tiến hành xử lý thể (phun dung dịch Benlat nồng độ 6g/11 lít nước cho 50m 2, thuốc tím 0,1%) để giảm thiểu nguy nấm bệnh hại + Vật liệu giâm củ cắt: Phần đầu củ Bình vôi 1.5.3 2.1.3 Cắt củ giâm củ Củ lấy từ mẹ sinh trưởng tốt, không sâu bệnh Chọn củ nguyên phần đầu (phần đỉnh củ phát sinh chồi ngọn) Dùng dao rửa qua nước xà phòng cắt phần đỉnh củ nơi có chồi phát sinh , miếng cắt dầy??? Cm CủPhần củ cắt ngâm vào dung dịch thuốc Benlate nồng độ 0,3% thời gian 15 phút, sau vớt vật liệu Ccủ khay cho nước Khi giâm củ cắt, chấm gốc Ccủ vào dung dịch thuốc kích thích cho phủ kín mặt gốc Củ cấy vào luống + Nhằm giảm tối thiểu việc nước hom Do cắt hom xong nhúng hom vào xô nước cho tươi Sau vớt để nước chấm vào thuốc kích thích sinh rễ khoảng – giây trước giâm 13 + Cách cắm homphân củ cắ t : Cắm hom giâm cách nhẹ nhàng vào giâm đa tưới ẩm, ấn nhẹ sâu khoảng – cm, cắm hom thẳng vào tâm bầu (nếu giâm trực tiếp bầu) Sau đó, dùng ngón tay ấn nhẹ lấp đất giữ cho hom giâm ổn định + Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng chất kích thích chồi BAP Kinetin nồng độ 10ppm, 20ppm 30 ppm dạng nước Củ sau xử lý cắm vào thể sau: 70% cát + 30% đất tầng B + Môi trường giâm yêu cầu: Độ ẩm từ 75% - 80%, nhiệt độ trung bình từ 22 – 250C, giâm thích hợp không chứa mầm bệnh 1.5.4 2.1.4 Chăm sóc sau giâm - Tưới nước: Điều tiết nước để vườn giâm đủ ẩm: + Trong ngày đầu tưới ngày lần + Từ 20 ngày sau giâm tưới ngày lần + Tùy điều kiện thời tiết khí hậu tăng hay giảm số lần tưới để đảm bảo đủ ẩm cho vườn giâm - Làm cỏ: Do giâm vào đầu mùa mưa, mưa nhiều với chế độ tưới thường xuyên nên ẩm độ cao, cỏ dại phát triển nhanh cần ý làm cỏ thường xuyên - Bón phân: sau giâm khoảng 40 ngày cành giâm mạnh, dinh dưỡng bầu không đủ cung cấp cho hom giâm nên cần tưới bổ sung phân bón qua 1.5.5 2.1.5 Tiêu chuẩn xuất vườn: Cây giống đủ tiêu chuẩn xuất vườn có mầm trở lên, có từ trở lên Chiều dài chồi mầm đạt khoảng - 15 cm Mầm khỏe, không sâu bệnh Hom giống 60 ngày tuổi xuất vườn 14 MỘT SỐ HÌNH ẢNH QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG TỪ CỦ 15 1.6 2.2 Qquy trình nhân giống bình vôi phương pháp nuôi cấy mô 1.6.1 - 2.2.1 Vật liệu nhân giống Đối tượng nghiên cứu đề tài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) - Vật liệu nghiên cứu: Chồi ngủ Bình vôi năm tuổi trở lên 2.2.2 Khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Sử dụng chồi ngủ làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng cấy vào môi trường MS Các môi trường thí nghiệm chỉnh pH đến 5,8 sau khử trùng 120 0oC thời gian 20 phút Các mẫu cấy nuôi điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 o0C Có nhiều hóa chất sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn bệnh tạo lượng lớn mẫu in vitro, hai loại hóa chất sử dụng nhiều có hiệu cao HgCl NaClO - Phương pháp khử trùng: Khử trùng box cấy: Phần thân mang chồi đựng ống phancol, lắc rửa mạnh nước dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt Sau rửa mẫu vòi nước chảy cho hết xà phòng, tráng lại mẫu nước cất Khử trùng box cấy: Phần thân rửa nước cất vô trùng, lắc mạnh 1-2 phút để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt, lặp lại lần Sau tiến hành rửa cồn 70 % phút rửa nước cất vô trùng (rửa lần) Sử dụng hóa chất HgCl 0,1% NaClO 60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau rửa lại 4-5 lần nước cất vô trùng để loại bỏ hóa chất bám bề mặt tránh gây độc cho chồi 16 Công thức khử trùng vật liệu nuôi cấy tốt sử dụng dung dịch Javen 60% (NaClO) 12 phút Cấy mẫu vào môi trường: Phần thân sau xử lý đưa đĩa vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước bề mặt phần thân, sau cấy lên môi trường công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh chồi Bình vôi in vitro môi trường: MS + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + g/l Agar + 30g/l sucrose 2.2.3 Nhân nhanh chồi từ chồi nuôi cấy mô Khi mẫu tái sinh bật chồi, sau 2-3 tuần cắt chồi cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu khả nhân nhanh chồi Tiến hành cắt chồi mầm in vitro cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi (môi trường dinh dưỡng tốt thí nghiệm có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau) Qua trình nghiên cứu thử nghiệm thấy công thức môi trường (MS + 8g/l Agar + 30g/l Sucrose + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin) công thức môi trường tốt để nhân nhanh chồi Bình vôi 2.2.4 Tạo hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy mô Khi chồi dài khoảng 3-5 cm tiến hành cắt cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo rễ, chồi không đủ kích thước tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh Công thức môi trường rễ môi trường: 1/2MS + 8g/l Agar + 14 g/l Sucrose + 0,4 mg/l IBA cho tỷ lệ chồi rễ đạt 100%, số rễ trung bình 5,27 rễ/chồi, chiều dài trung bình rễ đạt 2,57cm, sau ngày nuôi chồi bắt đầu rễ 17 1.6.2 2.2.5 Đưa nuôi cấy mô vườn ươm chăm sóc * Đưa nuôi cấy mô giá thể Giai đoạn chuyển in vitro từ bình nuôi trồng vườn ươm giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, định khả ứng dụng toàn quy trình nhân giống in vitro vào thực tiễn sản xuất Giai đoạn thường gặp nhiều khó khăn in vitro điều kiện ổn định mặt dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng,… tiến hành chuyển làm dễ bị “sốc” điều kiện sống dẫn tới bị chết Giá thể thích hợp cho trồng Bình Vôi in vitro là: 50% đất: 30% cát: 20% trấu hun, tỷ lệ sống cao đạt 95,5% , sau tuần trồng Cây khỏe mạnh, sinh trưởng phát triển bình thường * Chăm sóc nuôi cấy mô Phương pháp tưới nước: Trong thời gian tuần sau chuyển In-vitro vườn ươm không nên sử dụng phân bón tưới nước lần/ngày (chủ động điều chỉnh liều lượng nước tưới tùy theo mùa nắng hay mùa mưa) * Lưu ý: Chỉ phun sương cho ướt giá thể, không nên phun sau chiều - Làm cỏ: Với chế độ tưới thường xuyên nên ẩm độ cao, cỏ dại phát triển nhanh cần ý làm cỏ thường xuyên - Bón phân: Sau giâm khoảng 60 ngày dinh dưỡng bầu không đủ cung cấp cho hom giâm nên cần tưới bổ sung phân bón qua Cây giống đủ tiêu chuẩn xuất vườn có mầm trở lên, có từ trở lên Chiều dài chồi mầm đạt khoảng - 10 cm Mầm khỏe, không sâu bệnh Cây giống 60 ngày tuổi xuất vườn MỘT SỐ HÌNH ẢNH QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ 18 19 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Thị Đào (2008 ), “ Ảnh hưởng số nhân tố tới kết giâm củ cắt Tai chua ” Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội Dương Mộng Hùng “ Nhân giống Phi lao Củ cành ” ĐH Lâm Nghiệp số 11/1992 Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003) Giáo trình giống rừng Nhà xuất Nông Nghiệp Đoàn Thị Mai cộng (2000) Kết bước đầu vê nhân giống Bạch đàn lai phương pháp nuôi cấy mô phân sinh Tạp chí Lâm nghiệp, 10 : 46 – 47 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ Sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp Lê Văn Chi (1992) Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng vi lượng hiệu cao Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội Lê Đình Khả (1993), “ Nhân giống Keo tràm Keo tai tượng ” Tạp chí lâm nghiệp số 5/1993 Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng , giáo trình giống rừng, 2003 Lê Đình Khả, Đoàn Thị Bích, Trần Cự , “ Nghiên cứu tạo chồi, môi trường giá thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng ”, tạp chí Lâm nghiệp dố 10/1996 Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ bắng Củ”, tạp chí Lâm nghiệp số 9/1996 Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống Sao đen thuốc bột TTG ”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số 8/1998 21 Ngô Kim Khôi (1998), Thống kê toán học Lâm nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vô tính chàm (Melaleula caujuputy Powell ) phương pháp giâm củ cắt ” Luận văn tốt nghiệp trường ĐH Lâm Nghiệp Nguyễn Hữu Thước cộng : “Ảnh hưởng chế đọ che sáng đến Xà Cừ ” Tập san SVĐH III 1964 Tr.35-38 Nguyễn Hữu Thước, Lê Văn Khôi : “Nghiên cứu yêu cầu ánh sáng Mỡ giai đoạn tuổi non” Tập san SVĐH III Thái Văn Trừng (2000): “Những hệ sinh thái rừng mưa nhiệt đới Việt Nam”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Phạm Văn Tuấn (1997) “ Nhân giống rừng Củ, thành tựu khả áp dụng Việt Nam ” Tổng luận chuyên khảo kỹ thuật Lâm nghiệp Việt Nam NXB Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đỗ Tất Lợi, 1991 Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB BNN 22