thu tinh trong ong nghiem phan 2

Dần dần kỹ thuật thụ tinh trong Ống nghiệm IVF càng trờ nên tiến bộ, sử dụng kỹ thuật trong phòng thí nghiệm điểu chỉnh một số giai đoạn trong quá trình thụ tinh để rồi có thể gây thụ ti

vô sinh hoặc ờ những ngưòi đàn ông thiếu tinh dịch Dần dần kỹ thuật thụ tinh trong Ống nghiệm IVF càng trờ nên tiến bộ, sử dụng kỹ thuật trong phòng thí nghiệm điểu chỉnh một số giai đoạn trong quá trình thụ tinh để rồi có thể gây thụ tinh cho nhóm bệnh nhân không thể có thai tự nhiên được, cụ thể là kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI-intracytoplasmic sperm injection).

Sau khi gây thụ tinh 12 đến 20 giờ xuất hiộn ít nhất 2 tiền nhân chúng tỏ hiện tượng thụ tinh đã xẩy ra vể mặt hình thái và vi thể Tuy nhiên, có hay không có tiền nhân không phải là một bằng chúng chắc chắn Đôi khi có thể nhẩm không bào của noãn với tiền nhăn, đặc biệt là đối với nhũng người nhìn không có kinh nghiệm Đây chỉ là nhầm lẫn tạm thời Nếu không nhìn thấy tiền nhân sự thụ tinh vản có thể xảy ra; tiền nhân được hình thành sau nên không nhìn thấy trong lần kiểm tra noãn hoặc sau khi đã xảy ra hiện tượng phân chia Cũng không có thể nói sự phân chia là bằng chúng của sự thụ tinh Nguời ta đã mô tả phôi ở giai đoạn 8 tế bào như là một sự sinh sàn đơn tính không có thụ tinh Sự hiện diện 2 cục cáu là một bằng chúng quan trọng thứ hai chứng tỏ hiện tượng thụ tinh Tuy nhiẽn cục cầu thứ nhất chỉ là một mảnh, vì vậy muốn xác đinh hiện tượng thụ tinh một cách chắc chín cần phải quan sát kết hợp nhiều mặt vào,các thời điếm khác nhau.

Trước khi dưa tinh trùng và noãn vào đĩa hoặc ống để thụ tinh trong ống nghiệm cẩn phải xử lý tinh trùng Tinh trùng phải được tách ra khỏi tinh dịch

và xứ lý theo thủ tục thường lệ để đám báo lây được một sô lượng tinh trùng

di động tót thu tinh cho noãn Ó chương 3 " Tinh trùng/ thưc hành " đã nêu lên tấm quan trọng của quá trình xử lý tinh trùng trước khi thụ tinh Trong chưcnig 3 này dã mỏ tả hai phương pháp xử lý đó là phương pháp "treo" và phương pháp Percoll

Trơng phần này chỉ nêu những điểm liên quan đến ván để chuẩn bị tinh trùng trước khi ủ tinh trùng và noãn, sô lượng tinh trùng cần thiết để đạt được cơ hội thụ tinh cao Trong trường hợp tinh dịch quá tồi, chúng ta cần dùng đến phương pháp thụ tinh nhân tạo như: tiêm tinh trùng vào dưới lớp trong suốt(SUZI/Subzonal spermatozoon injection) hoặc tiêm tinh trùng vào trong bào tương của noãn (ICSI/ intracytoplasmic sperm injection) Trong những truờng hợp đặc biệt chọc hút lấy tinh trùng từ thừng tinh, sau đó sử dụng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiộm(IVF) Kỹ thuật này gọi là phưong pháp vi phẫu thuật hút tinh trùng từ thừng tinh (MESA/ Microsurgical epididymal sperm aspiration)

Xử lý tỉnh trùng

Trước khi bàn về các kỹ thuật xử lý tinh trùng ,chúng ta cần xem xét đến việc xử lý tinh dịch, những điểm cần đề phòng trong thực hành thụ tinh nhân tạo ( các chất liệu không độc được sử dụng đễ chứa ) Hai điểm cần phải nghiên cứu: đầu tiên là cần quan tâm đến thời gian kể từ khi lấy tinh dịch đến khi bắt đầu quá trình xử lý Các nghiên cứu sử dụng thử nghiệm thâm nhập của tinh trùng đã chỉ ra rằng có sự liên hệ giữa khả năng thụ tinh của tinh trùng và thời gian chưa được xử lý này Nếu tinh dịch không được xử lý trên một giờ thì kết quả của thử nghiệm thâm nhập của tinh trùng thấp hơn nhiều Mặc dù nghiên cứu này không được tiến hành trong thực nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm IVF ở người, nhưng những kết quả này vẫn có phần quan trọng

Thứ 2 là quan sát về hiện tượng hoá lỏng: các chất tiết của túi tinh góp phần

Phuơng pháp chỉ sử dụng khả năng di chuyên của chính tỉnh trùng

Chúng ta có thể lấy được tinh trùng tự do từ tinh dich mà không cần ly tâm bằng cách sử dụng phương pháp "bơi lên" hoặc "bơi xuống" Phương pháp bơi lên hoặc bơi xuống có lợi là tinh trùng không bị tổn thương do ly tâm Bằng cách sử dụng khả nâng di chuyển của chính tinh trùng, chúng ta có thể tạo được điểu kiện giống tư nhiên Tinh trùng chưa xừ lý được chia ra và đổ vào một số lọ, sau dó đổ lên trên tinh dịch một lớp mỏi trường nuôi cấy một cách cẩn thận Sau một thời gian, người ta hút lớp phía trên chứa nhiếu tinh trùng có khả năng hoạt động nhất Không hút lớp chứa hỗn hợp với tính dịch Một cách khác là sử dụng ống TEA (hình 8.1 xem phụ bàn 4) Tinh trùng chưa xử lý được đặt ở phần bên trong (A) và môi trường nuỏi cấy ờ bén ngoài (B), lớp môi trường nuôi cấy đủ đầv để thông nối giữa hai phán A và B

ở phía trên Tinh trùng có khả năng di chuyên có thể đi qua lớp trên để tới phần (B) (bơi lên), Bằng cách này, ta thu được nhiều tinh trùng có khả năng

di chuyển hơn Người ta đã mô tả các dạng "bơi lên" hoặc "bơi xuống'' khác nhau Điều bất lợi nhất cùa tất cả các phương pháp này là chi có thể lấy được hoàn toàn sạch sẽ một lượng nhỏ tinh trùng trong tổng số tinh trùng có khả năng hoạt động Tất nhiên với các mẫu tinh trùng chất lượng kém thì thu được rất ít tinh trùng để sử dụng cho thử nghiệm thụ tinh trong ống nghiộm (IVF thành công

Các phương pháp ly tâm

Trong những năm đầu tiên áp dụng thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), người

ta pha tinh dịch với môi trường nuôi cấy rồi ly tâm Sau khi loại bỏ phần nổi trên mặt bằng cách ly tâm và để ngưng tụ lại sau đó rửa khối tinh trùng còn lại nhiều lần Một diéu bất lợi là cả tinh trùng khoẻ và yếu, các tế bào sinh tinh và bạch cầu đọng lại trong khối này dược pha loãng để cho vào noãn Sau lần rửa cuối cùng nếu khối này không được để ngưng tụ lại mà dược phù một lóp môi truờng nuôi cấy, thì các tinh trùng khoẻ nhất có Ihể bơi lừ các khối này lên dung dịch ở phía trên Bằng cách này, các linh tràng yếu và bạch cầu cũng có thể bị loại ra nhiều hay ít Vào nẫm 1981 trong một bài

báo Aiken và Clarkson đã mô tả tác dụng bảo vệ của Percoll Tác giả dã

công bố là các tinh trùng có hình thái và chuyển dộng bình thường thì khả năng taọ ra gốc oxy kém hơn so với các tinh trùng bất thường, các bạch cẩu

và các loại tế bào khác Ưong tinh dịch chua xử lý Thông thường khi ly lAm

106

thì tất cả các loại tế bào này được kết lại thành một khôi làm cho khoảng cách tế bào gẩn lại nên các gốc oxy có thể tác động đến màng của các tinh trùng sống Tỷ lệ giữa tinh trùng sống với tế bào bất thường càng nhỏ thì khả nãng phá huỷ tinh trùng lớn hơn Nếu sử dụng phương pháp Percoll sẽ không hình thành khối hỗn hợp này và các tinh trùng sống được phân tách một cách nhanh chóng với các tế bào bất thường Các tinh trùng sống có mặt trội hơn trong khối Percoll, trong khi các tế bào không bình thường đọng lại ở phần dưới thấp hơn Phương pháp này tạo ra hiện tượng phân tách tốt chọn được nhiều tinh trùng.

Người ta tiến hành một số các thử nghiệm có kiểm tra so sánh tác dụng của các kỹ thuật xử lý lên kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiộm (IVF) Berger đã mô tả khả năng thâm nhập của tinh trùng sau khi đã xử lý bằng phương pháp Percoll tốt hơn so với các tinh trùng được xử lý bằng ly tâm hoặc phương pháp "bơi lên" Tuy nhiên trong thực nghiệm này, sau khi thực hiện phương pháp bơi lên lại ly tâm tinh trùng vì vậy người ta không so sánh được chức năng của tinh trùng có ly tâm hay không ly tâm

Gần đây Alvarez và cộng sự đã mô tả một số tổn thương của tinh trùng do ly tâm Người ta đã chứng minh các tinh trùng không bị ly tầm duy trì khả năng chuyển động khoẻ trong một thời gian dài, trong khi khả năng chuyển động của các tinh trùng được ly tâm giảm hẩn xuống sau 48 giờ Bằng phương pháp "bơi lên" những tinh trùng thu nhận được ở giai đoạn đầu có khả năng khác biệt rõ ràng sau 24 giờ Người ta chưa biết đến ảnh hưởng của

sự ly tâm lên chức năng của tinh trùng trong thực nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm ( IVF) Trong các thực hành hàng ngày thường cần sự ly tâm Nói cách khác việc sử dụng các mẫu tinh trùng có ít tinh trùng hoặc các tinh trùng có khả năng di chuyển kém thì không có lợi

xử lỷ hỗn hợp gò mỉm

GÒ mầm xung quanh noãn là một hàng rào đối với tinh trùng Chất nhầy của

tử cung có đặc tính giống với chất nhầy cổ tử cung Trong một số truờng hợp, xuất hiện các tế bào hạt trong tử cung và có thể thực bào tinh trùng Đối với tinh trùng cổ khả năng thụ tinh yếu thì nên loại bỏ gò mầm trước khi thụ

tinh Các nghiên cứu của Mahadevan và Trounson đã chỉ ra rằng sử dụng hyaluronidase để loại bỏ gò mầm không có hại cho noãn hoặc phôi

107

Sự thụ tỉnh

• ■

Môi trường nuôi cấy

Vé mặt lâm sàng, người ta sử dung cùng một loai môi trường nuôi cây trong giai đoạn thu tinh và cả ờ giai đoạn hình thành và phát triển phôi vẻ sau Trước đây nồng độ huyết thanh dùng trong Ihụ tinh thường bằng một nửa so với nồng độ huyết thanh dùng cho phôi phát triển nhưng hiệu quả tác dụng cũng không chắc chắn Trong các môi truờng nuôi cấy khác nhau sử dụng cho thụ tinh trong ông nghiệm bao gồm các chất quan trọng đôi với tinh trùng: ion Ca++, gluco, lactat, bicarbonat, tỉ lệ Na+/ K* gần giống với dịch

trong ống dẫn trúng và chất protein phụ thêm Ion Ca** cần thiết cho phản

ứng cực đầu, đổng thòi thúc đẩv cơ chế tiến triển Glucose và lactat là nguổn nàng lượng dự phòng cho tinh trùng Lượng ATP cùa tinh trùng nguời tàng nếu cho thêm gluco hoặc lactat; Khi cho thêm các chất kích thích sự chuyển động của tinh trùng thì lượng gluco sử dụng phải tăng lên

Protein, đặc biệt là albumin thúc đẩy khả năng di chuyển và cần thiết cho sự hoạt hoá tinh trùng của hầu hết các sinh vật Nhiều trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng huyết thanh của người phụ nữ nhận phôi làm nguồn protein Điều thuận lợi nhất là huyết thanh của họ rất an toàn vé măt vi sinh học Điều không thuận lợi là một sô phụ nữ tạo ra kháng thể độc đối với tế bào (VD: kháng thể kháng tinh trùng) Tuy nhiên có thể xét nghiêm trước tát

cả các mẫu huyết thanh để tìm kháng thể nhưng mất rất nhiều thời gian Cán

lựa chọn phương pháp chuẩn bị protein ví dụ: sử dụng phương pháp tiệt Ịiùng phương pháp Pasteur hoặc Albuminar Các nghiên cứu khác nhau đã nêu lên

rằng sự chuẩn bị các protein này cũng kích thích sự thụ tinh như huyết

thanh Tuy nhiên ở chuột, người ta đã thấy rằng albumin hấp thụ một lượng lớn acid béo có tác dụng ức chế sự thụ tinh Do đó không nên lấv huyết thanh làm môi trường nuôi cấy ngay sau khi ãn 1 u l

Độ tập trung và dung tích lò ấp tinh trùng

Như đã nói trong cuôn sách này, ưong tự nhiên chỉ có một sổ tinh trùng có mặt trong bóng vòi trứng ờ thời điểm thụ tinh Tuy nhiên ưong quá trình thụ tinh thực nghiệm cố hàng chục nghìn tinh trùng có mặt xung quanh trúng phụ thuộc vào thể tích lò ấp dược sử dụng Độ tập trung dưới 50 000 tinb trùng/mỉ không phải là tốt nhất Độ tập trung tinh trùng quá cao có thể là

108

một điêu kiên không thuận lợi vì tăng khả năng đa bội Hơn nữa trong quá trình th u tinh với độ tập trung của tinh trùng cao có thể ảnh hưởng tới khá năng sông của phổi Cuối cùng các men trong cực đầu tinh trùng là các men phân huỷ có thế có hại cho trứng và phôi Trong các mẫu tinh trùng đã chuẩn

bị cũng thường có những tinh trùng khỏ hoặc chết có thế gáy tổn thương cho noãn do các gốc oxy Người ta cũng cho rằng tỷ lệ thụ tinh có thê giảm nếu

sử dụng nhiéu tinh trùng

Mặc dù vấn đề này vẫn đang được bàn cãi nhưng cũng có những ý kiến cho rằng việc sử dụng nhiều tinh trùng cũng thu được kết quả thụ tinh trong ống nghiệm tốt Hammitt đã ủ tinh trùng có khả nãng chuyển động trong một thê tích nhỏ với nồng độ tinh trùng cao ( một lượng nhỏ chất bảo quản đông lạnh) và đã nhận thấy rằng các phôi tạo ra có cơ hội làm tổ tốt hơn Tất nhiên chúng ta nên điều chỉnh nồng độ tinh trùng đúng theo yêu cầu cần thiết để kết quả không tăng nguy cơ đa bội ( lớn hơn hoặc bằng 3 tiền nhân) và cũng không tăng sô thụ tinh thất bại

Bổng 8.1: Tóm tắt kết quả của Hammitt, 1993

Độ tập trung của tinh

<JÌ ặi-.vt $ r r :

i-.y-Thời gian thụ tinh

*1 ỉ •ị .* 1

i có khả năng thụ tinh ữong

vật như chuột người ta đã

nhận thấy rằng sau khi thụ tinh muộn thì noãn thường có cực cáu to và phổi phát triển không tốt trong ông nghiệm, ở lợn người ta dã tháy các phổi không bình thường, đôi với người cũng vậy, khi cho tinh trùng vào thụ tinh muộn quá thì khả năng phôi bất thường tăng lên.

Tái thụ tinh

Việc thụ tinh lại giữa noãn có, tiền nhân và tinh trùng không phải là không

có khả năng sinh sản Câu hỏi đặt ra là liệu đây có phải là phương pháp thận trọng không Tuy nhiên người ta đã mô tả trong 150 noãn chín, 41 (27%) noãn được thụ tinh sau khi tái thụ tinh Tuy nhiên người ta đã xác định cẩn mức độ nhiều tinh trùng hơn (29%) Tuy nhiên không có hiệu quả mang

thai Trounson và Webb cũng đưa kết luận tương tự như vậy Ờ những bệnh nhân có tinh trùng yếu, các tiền nhân được tạo ra muộn thì thường là thụ tinh

được sau tái thụ tinh.Tái thụ tinh với tinh trùng của người cho sẽ tạo ra nhiẻu phôi Người ta chỉ quan sát thấy một truờng hợp mang thai từ các phôi được

tạo ra sau khi tái thụ tinh và sau đó bị sảy thai tự nhiên Vì vậy sự tái thụ tinh không được coi là một phương pháp có hiệu quả thành cồng.

Sự thụ tinh bẳng phương pháp vl thụ tinh

Mặc dù tất cả các cố gắng để tạo điều kiện càng thích hợp càng tốt ưong quá

trình ủ trứng cùng với tinh trùng nhưng thường là không đạt được thụ tinh

hoàn toàn Điều này xảy ra đặc biệt thường xuyên ở những bệnh nhân bị thiếu tinh dịch nạng Trên thực tế mặc dù cho thêm một số lượng tinh trùng

bình thường có khả năng chuyển động hoặc thậm chí thêm số lượng nhiéu tinh trùng thì vẫn xảy ra tình trạng không một tinh trừng nào có thể thâm nhập vào lớp trong suốt và hoà vào màng noãn hoàng Các xél nghiệm duới kính hiển vi thấy rằng rất ít hoặc không có tinh trùng gắn vào vùng trong suốt.Mặc dù các thử nghiệm đều nhằm mục đích giúp cho tinh trừng vuạ qua hàng rào vùng này.

Tạo lỗ ở vùng trong suốt Phẫu tích từng phẩn ràng trong suốt

Kỹ thuật này nhằm cố gắng tạo ra một lỗ mở ở vùng trong suốt, qua đó tinh

trùng có thể bơi vào Sử dụng ống hút cầm giữ để cố định trứng và tạo ra mội

lỗ mở ở vừng trong suốt bằng dung dịch đệm acid Dùng một ống hút nhò di

110

bơm chát đệm acid vào vung trong suốt Chất đệm acid này hoà tan glycoprotein cứa vùng trong suốt Ngay sau khi nhìn thấy lỗ mở trên vùng trong suốt thì rứa trứng vài lán trong môi trường nuôi cấy mới để đạt được pH như bình thường Sau đó tiến hành thụ tinh như cách thõng thường Bằng cách này có thế đạt dược tỷ lệ thụ tinh cao ớ chuột với độ tập trung tinh trùng thấp Điều này chứng tó việc tạo ra một lỗ mở ở vùng trong suốt làm tăng cơ hội thụ tinh Tuy nhiên khi sứ dụng kv thuât nàv ớ người kết quả không được khá quan Sự thụ tinh thực sự có xảy ra nhung phôi có chất lượng kém nên không phát triển thành thai Lớp trong cùng cúa vùng trong suốt ớ người kháng lại hệ đệm acid vì vậy tình trạng pH thấp vẫn duy trì trong một thời gian lâu hơn ở chuột Tinh trạng pH thấp cũng gây hại nhanh chóng cho noãn.

Malter và Cohen đã tạo ra phương pháp phẫu tích từng phần vùng trong suốt (PZD/ partial zona dissection) đê tránh sử dụng hệ đệm acid Dùng một ống hút nhỏ đầu nhọn đâm qua vùng trong suốt, đầu đâm vào ở vị trí 1 giờ và đầu đâm ra ở vị trí 11 giờ (hình 8.2 xem phụ bản 4) Dùng ống hút cầm giữ để lấy đi các phần của vùng trong suốt nằm ở phía trên của ông hút đầu nhọn Dùng Sucrose cho vào noãn sẽ co lại một ít vì vậy trứng không có nguy cơ khi tạo lỗ Các noãn được xử lý theo cách này có thê phát triển bình thường sau khi thụ tinh, và phôi cũng phát triển thành thai bình thường Tất nhiên câu hỏi đặt ra là trên thực tê liệu phương pháp phẫu tích này có được sử dụng nhiều hơn kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm thông thường được tiến hành với độ tập trung tinh trùng cao Cohen đã nêu lên điều không thuận lợi khi tạo ra các lỗ tương đối lớn ở vùng trong suốt là: phôi được tạo ra sau phương pháp phẫu tích và sự thụ tinh với tinh trùng có chất lượng kém sẽ không làm

tổ được tốt Có thể là quá trình này làm giảm khả năng bảo vệ của vùng trong suốt đối với các chất thải và gốc oxy do các tinh trùng yếu không có khả năng di chuyển và tinh trùng bA't thường luôn có mặt trong các mẫu tinh dịch đã tạo ra Phương pháp ph iu tích này luôn luôn đòi hỏi một số lượng tinh trùng tương đối nhiều, vì vậy phưong pháp này không được coi

là phương pháp tiến bộ hơn so với kỹ thuật vi thụ tinh

ubzonal sperm injection)

Trong phương pháp này không mở th >ng vùng trong suốt mà dùng một ống hút nhỏ đưa thẳng tinh trùng qua ví >ig trong suốt vào khoang quanh noãn

hoàng (hình 8.2) Trong loạt thư nghiệm sư dụng phương phap nay đảu tiẻn thường đãt một tinh trùng giữa vùne trong suòt và noãn LX> két quà thu tinh không được khà Ijuan, người ta đã thav đổi tiêm lừ 2 thậm chí tiêm lư 2 dẽn

10 tinh trùng giũa vùng trong suốt và noãn, những nguy cơ da thu tinh tăng

Từ đó lai nẩy ra kỹ thuãt loại bỏ tiển nhân thừa Tuy nhiên phương pháp này nói chung không được châp nhận.Cáu hòi được dát ra là liẻu đày có ihực su

là một phương pháp thuận lợi khóng ? phương pháp thu tinh trong òng nghiệm truyền thống không mang lại kêt quả tốt hoặc hoàn toàn tốt? Gán đày người ta đã nêu lèn vi thụ tinh không dem lại tiến bộ nào hoặc háu nhu khòng tiến bộ hơn so với thu tinh trong òng nghiệm bình thường trẽn những bệnh nhân trước đây điéu trị thụ tinh trong ông nghiệm không thành còng, (không xảy ra sự thụ tinh) Việc lựa chọn bệnh nhân cũng đóng vai ưò quan trọng Tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt có một vài ưu điềm dậc biệt đôi với bệnh nhân có tinh trùng rất yếu: nếu dùng phương pháp thụ tinh ưong ỏng nghiệm thông thường chắc chấn sẽ không thành cổng Tuy nhiên kết quà phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI )cũng khỏng đáp lại lòng mong đợi

Nhóm nghiên cứu cùa Fishel đã mô tả 225 bệnh nhân sử dụng phương pháp này và đã nhận xét là 16% noãn được thụ tinh, có 82 truờng hợp được

chuyển cho bệnh nhân (39% bệnh nhân) và 12 trường hợp có thai lảm sàng,

kết quả không khả quan 5% Cohen mô tả 103 chu kỳ với phương pháp vi

thụ tinh (thường là sự kết hợp giữa phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới

vùng trong suốt, phương pháp phẫu tích và có một sô theo phương pháp thụ

tinh trong ông nghiệm thông thường với noãn khác nhau lấy từ mội bènh nhân,cho kết quả 26 trường hợp mang thai (21%) nhưng không thế kiểm tra được hiệu quả khác nhau giữa các kỹ thuật vi thụ tinh khác nhau.

Tiêm tinh trùng vào trong bào tương: ỈICSI/ ỉntracytoplasmic sperm ioiecdM)

Vào đầu nãm 1976, Ưehara và Yanagimachi đã tiêm tinh trừng thẳng vio

trong bào tương Họ tiêm tinh trùng người và chuột túi vào thẳng trong bèo

tương noãn của chuột túi Trong một số trường hợp đã dẫn đến sự hỉnh thinh

tiền nhân nhưng noãn cũng thường bị thoái hóa Áp dụng phương phỊp này trên thỏ người ta cố thể tạo được phôi phát triển đến lúc dẻ Gần đ&y nguòi ta

dã báo cáo các con bê được sinh ra sau sử dụng phương pháp t i ín tinh trÌMg

r Mị*,ỆHỂỊ& ĩtíitỉ gi.»34 *>'■<- u&pjf

vào trong hào iưc/ng (ICS1) và cấy phôi bò ngay sau khi làm tan (làm ấm) tinh trung bò đã đỏng lạnh.

Nãm 1988 Lanzendorf và cộng sự đã thấy tinh trùng người thiếu cực đầu có khá năng chống lại hiện tượng đông đặc trong bào tương cùa noãn Một sô cuốn sách gần đây ở Brussels đã nêu lên việc sử dụng phưcmg pháp tiêm tinh trùng vào trong hào tương (ICSI) trên lâm sàng Đối với phương pháp tiêm tháng tinh trùng vào trong bào tương bằng ông hút có đường kính < 6fj.m với đầu nhọn ngắn Tinh trùng được nằm lơ lửng trong dung dịchpolyvinylpyrrolidon (PVP) Dung dịch keo này có chất nhày và làm giảm khả năng chuyển động của tinh trùng Người ta cố gắng hút tinh trùng có hình thái bình thường vào trong kim, đầu tiên kéo phần đuôi sau đó hút phần đầu tinh trùng vào trong kim Nếu cần thiết dùng kim tiêm châm dính vào đuôi tinh trùng để làm bất động tinh trùng Người ta dùng kim chọc qua vùng trong suốt và màng noãn hoàng vào sâu trong bào tương chất ở vị trí đã được loại bỏ hoàn toàn cực cầu thứ nhất Người ta đưa tinh trùng vào trong bào tương với một ít dịch càng ít càng tốt, rồi rút từ từ ông hút ra để lại tinh trùng ớ vị trí đó Vansteirteghem đã công bô áp dụng phương pháp này có so sánh với 11 bệnh nhân được áp dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI) Người ta chia noãn của mỗi bệnh nhân thành hai nhóm, một nhóm sử dụng phương pháp ICSI và một nhóm sử dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI) Trong 71 noãn sử dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI) chỉ 4% được thụ tinh, trong 73 trường hợp thụ tinh sử dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương (ICSI), 48 trường hợp (73%) có 2 nhân Phôi được tạo ra sau tiêm tinh trùng vào bào tương, có ít nhất 3 trường hợp mang thai và trường hợp mang thai thứ 4 trong nhóm này được tạo ra sau khi chuyên phôi

của cả hai phương pt^áp tiêm trùng vào bào tương và phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt Vansteirteghem đã công bố trong bài báo của ông là ở Brussels hiện nay phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương

đã thay thế phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt Kết qủa công bố trên 150 cặp vợ chổng áp dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương thành công , 150 cặp vợ chồng này đều đã được thụ tinh không thành

nhận dê tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm binh thương Trong tổng số

1409 noãn 'ầiíồt 'tiftnC cM B V ầoãn bị tổn thương và 830 noãn (64%) cổ 2

V •

-* « #

tiền nhàn Chi có 15 bệnh nhân không được chuyến phôi 53 trường hơpcó

thai trẽn lám sàng, ti lệ thành công 35(7(I trên tổng sò chu kỳ kinh đâu và gẩn

40% trên tổng sô phôi đươc chuyến Người ta tìm ra mòt diếxi quan trọng là đặc tính cùa tinh trùng không ảnh hường tới cơ hội thụ tinh: người đàn ông

có tinh dịch rất nghèo nàn (tất nhiên có vài tinh trùng) có cơ hội thụ tinh nhu nguời đàn ỏng có rất nhiều tinh trùng chuyên dộng

So sánh các kỹ thuật vỉ thụ tỉnh

Với kỹ thuật phẫu tích từng vùng trong suốt (PZD) tinh trùng phải bơi qua lỗ

mở tự tạo sẽ xẩy ra sự tác động qua lại với vùng trong suốt vì tinh trùng ờ rất gần noãn Sự tương tác này dẫn đến phản ứng cực đầu, để hoà nhâp giữa tinh trùng và noãn Vì vậy sẽ xảy ra sự lựa chọn tinh trùng vì không phải tất cà các tinh trùng có khả năng di động hoàn toàn và có thể trải qua phản ứng cực đáu Với kỹ thuật tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI) thì một số tinh trùng được lựa chọn hút vào trong ống hút do các nhà nghiên cứu Một khi

đã tiêm vào trong khoang quanh noãn hoàng, các tinh trùng này sẽ phải trải qua phản ứng cực đầu, bằng sự tác động của mặt trong của vùng trong suốt (để có được phản ứng cực đầu phải có mặt các thụ cảm thích hợp) hoặc bằng cách khác Tinh trùng mà không trải qua phản ứng cực đầu sẽ không có khả nâng hoà nhập với noãn Đánh giá phương pháp này cần chú ý hai mặt: một mặt là phải sự lựa chọn được tinh trùng, có khả năng trải qua phản ứng cực đầu và một mặt là chú ý đến sự hạn chế của phương pháp Trên thực tế là muốn cơ hội thụ tinh tâng phải tiêm từ hai tinh trùng trở lên Đồng thời có một hạn chế nữa là: các tinh trùng có khả năng dễ thụ tinh sẽ gây ra tình trạng đa thụ tinh

Kị thuật vl phẫu thuật ỉhùmg tinh đỂ hút tinh trùng (MESA/ Microsurgical epỉdỉdymal sperm aspiration)

Tình ưạng không có tinh trùng chiếm khoảng từ 10-20% trường hợp vô sinh nam Tình trạng sinh tinh bị tổn thương hay có sự trở ngại ưong dường sinh

Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) cũng tạo nên sự thay đổi trong từng trường hợp Với kỹ thuật vi phẫu thuật thừng tinh đê lấy tinh trùng (MESA) được tiến hành dưới kính hiển vi Mớ một hay nhiều điểm trên thừng tinh đê cố gắng hút dịch cùng với tinh trùng Tiến hành cẩn thận thì sau 2 đến 3 lần ta có thể hút được tinh trùng Lượng tinh trùng thu đuợc có thể thay đổi, đôi khi có thể tiến hành kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm thông thường (IVF), nhưng tất nhiên có thể áp dụng kỹ thuật vi thụ tinh, v ề mặt lý thuyết tinh trùng không có đủ thời gian trong thừng tinh thì chưa truớng thành đầy đủ nhưng trên thực tế ngưòi ta nhận thấy chúng có thể thụ tinh được Sô lượng tinh trùng chuyển cho một nang chọc hút cũng thấp Tuy nhiên kết quả của phương pháp vi phẫu thuật thừng tinh để lấy tinh trùng (MESA) kết hợp với phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương (ICSI) cũng rất hứa hẹn (bảng 2 Toumaye 1993)

sỏ nang choc hút•

% Thu tinh•

Số lượng vận chuyển Tỷ lệ có thai

Tàỉ liệu tham khảom

Aitken J, Clarkson JS.

S ignificance o f reactive oxygen species and antioxydants in

d e fin in g the efficacy o f sperm separation techniques.

Journal o f Androlflgy 1988; 9: 367 - 376.

Alvarez JG, lasso JL, Blasco L, Nunez RC Heyner s Caballero pp Storey BT.

C e n trifu g a tio n o f hum an sperm atozoa induces sublethal damage.

Human Reproduction 1993: 8: 1087-1092.

Berger T M ans RP, Moyer DL.

Comparison of techniques for selection of motile spermatozoa.

Fertility and Sterility 1985; 43: 2Ó8-273.

Cohen J

A review of clinical microsurgical fertilization.

In: Micromanipulation o f human gametesand embryos Roven Press, New York 1992: 163 - 190.

Gorus FK, Pipelleers DG.

A rapid method of the fractionation o f human spermatozoa according to their progressive motility.

Fertility and Sterility 1981; 35: 662-665.

Hammitt DG, Walker DL, Graig HS, Miller TM, Bennet M

Treatment of severe male factor with high concentrations of motile sperm by microinsemination in em bryo

cryopreservation straws

Journal o f In Vitro Fertilization and Embryo Transfer 1991; 8:

101 -109.

Malter HE, Cohen J

Partial Zona Dissection o f the human oocyte: a nontraumatic

method using micromanipulation to assist zona pelludda

penetration.

Fertility and Sterility 1989; 51:139-148.

Toumaye H, Van Steirteghem, Horis H, Liu J, Nagy z , Liebaars I, Devroey p

Microchirurgische epidid vmaire sperma aspiratie en geassisteerde fertilisatie.

Tijdschrift voor Fertiliteisonerzoek 1993; 2:29-33.

Van Steirthegem A, Liu J, Jons H, Nagy z , Janssenswillen c , Toumaye H, Dade

MP, Van Assche E, Devroey p

Higher success rate by intracytoplasmic sperm inJcctkM Una

by subzonal insemination.

Human Reproduction 1993; 8:1055 —1060.

116

KHOANG NOÀN HOANG

MANG TƯƠNG

NHẢN

-MÀNG

Tinh trùng đầu tiên xâm nhập và hoà đổng (hoà nhập với màng tương (plasma membrane) của noãn phản ứng vỏ (cortical reaction) tạo nên một vùng trong suổt

mà tinh trùng không chỉ xâm nhập đưọc (vùng màu vàng) Phía dưới:

Phản ứng cực đẩu

Sơ đồ đưa theo Wassaman (1988)

B B A

B

Cumulus cell B

Cumulus cell

B

B

Cumulus cell 1

Hình 7.2 Hiệu quả của 3 thành phần khi có phản ứng cực đẩu

- Tế bào gò mầm tổng hơp glycoprotein (A)

- Protein kết hợp với progesteron (B)

- Noán bào tổng hợp loại peptid hoạt tính (C) (như là thành phần của vùng trong

suốt)

- A B C hỉnh thành một phức hơp trong lớp ngoài của vùng trong suót - Phức hợp

này có khả năng đặc hiệu gây nèn phản ứng cực đấu

Hình 7.5 Não bào người đã dược thụ tinh (sau thụ tinh khoảng 16 giò Thấy rỗ 2

-30 giờ sau khi thu tinh

Hình 7.6 Biểu đồ biểu thị quá trình thụ tinh.

- Thời điểm thụ tinh ỏ mốc o

- Tinh trùng tiếp cận vùng trong suốt và xẩy ra phản ứng cực đầu (A)Tinh trùng

xâm nhập vào vùng trong suốt (B)

- Chẳng bao lâu 1 tinh trùng hoà nhập với noãn tương, lớp vỏ hạt bị đẩy ra (C)

- Hiện tượng trên tạo cho noãn tương không tiếp nhận một tinh trùng nào khác và

tinh trùng được trứng tiếp nhận (D)

- Đầu của tinh trùng phân ly ra Quá trình nói trên được hoàn thiện khoảng chừng

8 giờ sau khi thụ tinh

- Cực cầu 2 bị đẩy ra Tiền nhân bắt đầu hình thành và hoàn thiện sau 12 giờ kể

từ khi thụ tinh

- Tổng hợp DNA sau giờ thứ 9, và tối đa vào giờ thứ 9 đến giờ thứ 13, sau đó lại

giảm nhanh

- Các tiền nhân di chuyển dần vào vùng trung tâm và tiến sát gần nhau vào thời

diểm 20 giờ sau thụ tinh và sau 22 giờ thì hoà nhập hoàn toàn Sau 23 giờ bắt đầu sự hợp giao (sinh sản hữu tính), sau đó các nhiễm sắc thể phân ly để chuẩn

bị phân bào

Hình 8.1 Òng Tea

Phản tích 1 phần vùng trong suót

(PZD/partial Zona dissetion)

Tiêm tinh trùng vào dưới vung Ưong suốt (SUZI/subzonal sperm injection

Tiêm tinh trùng vào trong vùng trong suốt (ICSI/intracytoplasmic sperm injection)

Hình 8.2 Sd đổ kỹ thuật PZD, SUZI, ICSI

0

Sự phát triển của phôi trước khỉ làm tô

Sự phân chia đầu tiên của phôi là sự phân chia kiểu phân tách Trong giai

đoạn này phôi không phát triển, nên thể tích tê bào phôi (nguyên bào phôi) còn như tế bào cơ thể Chu kỳ tế bào đầu tiên đã được bàn tới trong quá trình thụ tinh, kéo dài khoảng 24 giờ, dài hơn các chu kỳ sau (dài 18 giờ) Mặc dù

chủ yếu dựa vào các số liệu thu dược trong thực nghiệm, người ta nhận thấy rằng 3 chu kỳ phân chia kiểu phân tách đầu tiên của tế bào trên động vật có

vú tạo nên tế bào m ới^ó kích thước khác nhau nhưng đều mất một khoảng thời gian giống nhau là 60 giờ (bảng 9.1) Các nguyên bào phôi đếu hình

tròn, đầu tiên có tính đồng nhất về mặt hình thái, sinh hoá và tiềm năng phát

117

triển giống nhau Tất cả các tế bào đều có thể tham gia hình thành tổ chúc cùa phôi Các nguvên bào phôi đểu có đặc tính toàn năng.

Các nghiên cứu về thực nghiệm trên chuột chứng tò nguyên bào phôi ờ giai đoạn 8 tế bào mang tính toàn năng nhưng đến giai đoạn sau thi khả nảng phát triển lại bị hạn chế Trên gia súc như: lợn, bò cừu tiềm năng phát triển của nguyên bào nuôi không bị giới hạn ờ thời diêm tối thiểu nhât là giai đoan 4 tế bào tất nhiên chưa biết số liệu thực nghiệm trẽn người

Tiếp theo là giai đoạn thể dâu biểu hiện sự phân chia kiểu phân tách hình thành đặc điểm của giai đoạn là sự kết đặc tế bào Dưới kính hiển vi thấy rõ các tế bào tiếp xúc khãng khít với nhau, làm giảm khoang gian bào và đường viển quanh tế bào cũng mờ đi Hiện tượng kết đạc tế bào này phụ thuộc theo từng loại động vật và điều kiện hoàn cảnh Hiện tượng này trên chuột rát rõ rệt đến nỗi phôi trong giai đoạn thể dâu đôi khi rất khó phân biệt với phôi ờ giai đoạn 1 tê bào Nói chung, hiện tượng kết đặc tế bào ờ phôi gia cầm khi nuôi cấy thì không rõ ràng Quá trình kết đặc tê bào này phụ thuộc vào calci

và đòi hỏi sự tham gia của khung tế bào và phân tử uvomorulin kết dính tế bào (còn gọi là yếu tố kết dính cadherin) Kháng thể đơn dòng kháng uvomorulin hạn chế quá trình kết đặc tế bào này

Bảng 9.1: Thời gian (các ngày sau khi thụ tinh) và sô' tế bào trong quá trình phát triển trước khi làm tổ của một số chủng động vật.

Sự phản tách

Thời gian cúa quá trình này thay đối theo từng chủng động vật nhưng thường xáy ra giữa giai đoạn 8 tế bào và giai đoạn 16 tê bào (bảng 9.1).Trong quá trình phân chia tế bào tiếp tục, lớp ngoài cùng của tế bào thu được các đặc tính cùa biểu mô và hình thành các cầu nôi gian bào tao nên môi liên kết rất khó phân chia.

Do cấu trúc này nên các tế bào ở phía trong sẽ không tiếp xúc trực tiếp với môi

trường bén ngoài, Tại một thời điểm nào đó lớp ngoài của tế bào bắt đầu tiết mạnh chất muối và nước vào khoang gian bào thành khoang gọi là túi mầm Trên phôi người khoang này thường được tạo thành giữa giai đoạn phân chia thứ tư và năm (16 tới 32 tế bào), giỏng như trên phôi cùa chuột Ngay thời điểm quan sát thấy khoang này là bắt đầu giai đoạn túi mầm Các tế bào phía bên trong tiếp tục phân chia tạo thành một khối ở vị trí lệch tâm, gọi là khối tế bào bên trong (ICM/ inner cell mass) Cuối cùng khối tế bào này sẽ tạo nên toàn bộ phôi cùng với 1 phần của tổ chức ngoài phôi (màng đệm) Lớp tế bào phía ngoài dạng biểu bì gọi là lá nuôi phôi (TE/trophotodemn) có nhiệm vụ đối với sự làm tổ của phôi

Hiện tượng kết đặc tế bào là cần thiết cho sự biệt hoá khối tế bào trong (ICM) và tế bào lá nuôi phôi (TE) Nếu có các kháng thể chống uvomorulin thì sẽ hạn chế hiện tượng kết đạc tế bào, túi mầm cũng được hình thành nhưng chỉ bao gồm một túi tế bào lá nuôi mà không có khối tế bào trong, vì vậy không bao giờ hình thành phôi sống Phân biệt các tế bào của khối trong

và lá nuôi không chỉ bằng cách quan sát các đặc điểm phát triển sinh học mà còn được thấy rõ bằng sự hiện diện các kháng nguyên bể mặt tế bào đặc trưng và các men đặc trưng

Sự phân chia tế bào

Không giống với các tế bào cơ thể khoẻ mạnh bình thường,nguyên bào phôi

không cần các phân tử tín hiệu đặc trưng để khởi động quá trình phân chia

Đối với viộc điều hoà phân chia tế bào, phôi tự điều hoà quá trình phân chia

tế bào theo "đồng hồ" nội bào

Điều hoà chu kỳ tế bào dinh dưỡng (Somatic) và tế bào phôi đều giống nhau: qua các thời kỳ như sau đây: (xem hình 9.1 phụ bản)

Thời kỳ G,: Thời kỳ này bao gồm quá trình tổng hợp RNA (sao chép mã) và tổng hợp protein Trong suốt quá trình này các tế bào không phân chia, ở

trang thái vén tĩnh Thời eian cua eiai đoan này kéo dài khác nhau nhiéu,C T T ^ c ^theo tưng loai tế bào Sư khác nhau về thời gian này bièu thi cho sư khác nhau vé tóc độ phân chia cùa tùng loai tế hào.

Sự lòns hơp DMA xẩy ra ờ giai đoạn s (Sphase)

Thời kỳ G: : (G phase) Giai đoan nàv nói chung là nhanh, là thời kỳ chuyén tiếp từ giai đoan s (S phase) sang giai đoạn M (M phase) giai đoan M là giaidoạn phân chia nguyên nhiẻm (mitose) và cùng là giai đoạn bãi đáu kẽt hợp nhiẻm sắc thế và kết thúc hiện tượng phân ly nhiễm sắc thể

Kết hợp nhiễm sắc thê là giai đoạn hình thành các cáu trúc nhiẻm sac thè dặc hiêu của DNA

Sau khi phán ly nhiẻm sắc thế tế bào lại trờ lại thời kỳ Gị

Chu kỳ tế bào được diều hoà ở 3 điểm Ba điểm này khòng phụ thuộc vào hiện tượng phân chia nguyên nhiẻm hoặc phân chia giảm nhiẻm dó là ba quá trình tiến triển cùa chu kỳ

1 Quá trinh khởi đầu ỡ giai đoạn G 1

2 Quá trình trước khi bắt đầu giai đoạn M

3 Quá trình phân chia trung kỳ (metaphase)

Chất phosphoprotein pp34 đóng vai trò quan trọng trong 3 quá ưinh tién triển cùa chu kỳ tế bào cơ thể hoặc tê bào phôi

Trước khi bắt đầu phân chia nguyên nhiẻm pp 34 phóng thích ra thành nhóm phospho gọi là quá trình giải phóng phospho để kết hợp với cyclin, ià yếu tố protein điều hoà chu kỳ của tê bào

Tất cả phức hợp pp 34 - cyclin gọi là yếu tố kích thích sự truờng thành (MPF/mataration- promoting factor) tham gia vào quá ưình phán chia và trường thành của noãn

Cyclin trong phức hợp được phospho hoá, các enzym trong phức hợp được hoạt hoá, sẽ đảm bảo sự kết hợp cằc nhiễm sắc thể và khởi đầu giai đoạn M

Hoạt động của men Kinase trong phức hợp các yếu tố kích thích tnfcng thành (MPF) có tác động dặc hiệu trên hiện tượng kết hợp nhiẻm sắc thì Điều này chúng tỏ rằng những protein trong nhiễm sắc thể được phospbo hoá dưới sự tác động của phúc hợp các yếu tố hoạt hoá pro tease Ptofiease lại

có tác dộng làm tan rã cảc đơn vị cyclin trong phúc hợp kúih thích nuông thành (MPF) và gây bất hoạt phức hợp này, từ đó tế bào sẽ thoát khỏi gift đoạn trung kỳ của thời kỳ phân chia nguyên nhiẻm và các nhiẻm sếc tbé dược phân ỉy ra.

120

ầ

Trong thời kỳ G l, các cyclin đặc hiệu GI kết hợp với pp 34 tạo thành một phức hợp đặc hiệu Phức hợp này tạo ra giai đoạn s (S phase) Sau khi phức hợp Cỵclin đặc hiệu G I p h â n ly thì chu kỳ tê bào lại bắt đáu.

Bình thường thì sự phân chia bào tương và sự phân chia nhân tế bào, tiên triển đổng bộ, các đôi nhiễm sắc thể được sự phân chia đều ra cho tế bào con mới được hình thành.♦

Quá trình phán chia bào tương và phân chia nhân đôi khi bất đồng bộ sẽ tạo thành các nguyên bào có số lượng nhiễm sắc thế bất thường, thậm chí hình thành những nguyên bào có nhiễm nhiều nhân, hoặc không có nhân

Phân chia bào tương cũng có thể tiến triển trên các tế bào không nhân cho đến khi chỉ còn lại một mảnh bào tương không nhân

Các phôi gồm các nguyên bào có sô lượng nhiễm sắc thể bất thường này thường là không sống được

Sự giáng hoá cyclin

Hỉnh 9.1 Sơ đổ vệ sự điểu hoà trong chu kỳ tế bào

• MPF = yếu tố klch thích trưởng thành/maturation promoting factor

Pp34 = phospho protein 34

• Kpo** = pnospno protein

• p = phospho dư thừa (còn lại)

V ; M-cyd = cyclin ô giai đoạn M

• G1-cycl = clyclin ỏ giai đoạn G1.

• I

Sự biêu lộ gen và sự tống hợp protein ở phôi

Trước khi thu tinh, noãn vừa rung đã có cấu tạo sinh hoá hoàn chinh cho sụ tổng hợp protein Trong quá trình phát triển và trường thành trứng chứa đấy ribosome còn gọi là cơ quan nội bào tổng hựp protein ARN ribosom(r ARN), ARN thóng tin (m ARN) và ARN vận chuyển (t ARN) Trong chu kỳ

tế bào đáu tiên sau thụ tinh protein được tổng hợp, biến đổi và gảy tan ra tại các thời điểm thứ ỉự theo mẫu riêng biệt Quá trình này vản tiếp tục xẩy ra trong thực nghiệm kê cà khi lấy nhàn ra khỏi phôi và có mặt các chất ức chẻ đặc trưng của sự tổng hợp ARN Quá trình phân chia tế bào đầu tiên cũng không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN ở phôi Các số liệu này đã nẻu lên rằng trong các chu kỳ tế phát triển tế bào ớ giai đoạn sớm, sự chuyển hoá và tổng hợp protein hoàn toàn dưới sự kiểm soát của các thông tin mà trứng nhận được từ mẹ trong quá trình phát triển và trướng thành Các thóng tin di truyền của phôi bao gồm cả phần lấy từ bô chỉ được tạo ra ờ giai đoạn sau Điều này xảv ra sau sự hoạt hoá bộ gen cùa phôi, gọi là sự chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử (MZT/material to zygote transition) Động lực chuyên tiếp thông tin này thay đổi rất nhiều giữa các loài động vật (bảng 9.2)

Mặc dù người ta không tiến hành các kỹ thuật sinh hoá và sinh phân tử để phát hiện sự chuyển tiếp thông tin ờ phôi người, nhưng các thay đổi hình thái ớ nhân của phôi người chứng tỏ các thông tin chuyển từ mẹ thành các thông tin của con ở khoảng giai đoạn 8 tế bào

Bảng 9.2: Giai đoạn chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử trong quá trình phát triển của phôi một số chủng động vật được nghiên cứu kỹ

Phát hiện các protein mang đặc diêm của bỏ vào cuối giai đoạn 2 tế bào Sự tổng hơp m ARN của phôi được tiến hành tốt vào giai đoạn có 8 tế bào phân chia theo luật số mũ Cũng có thê phát hiện r ARN mới đầu tiên ở giai đoạn

2 tê bào Mác dù đã phát hiện dấu vết của m ARN của mẹ tồn tại đến giai đoạn 8 tế bào, nhưng hầu hết nó bị phá huỷ từ trước giai đoạn 2 tế bào Sự tổng hợp protein còn phụ thuộc hoàn toàn vào ARNs ghi nhận được từ ADN của phôi ở tất cả các giai đoạn sau khi đã chuyển thông tin từ mẹ sang phôi (MZT) Nghiên cứu mẫu protein của phôi khi thông tin của mẹ đã chuyển sang phôi thấy rằng một nhóm protein có trọng lượng phân từ giống nhau từ 6.5.000 - 70.000 được sản xuất ra đầu tiên Nhóm protein này gọi là protein đòi hỏi sao mã (TRPs/ Transcription requiring protéin) và sẽ biến mất sau giai đoạn 8 tế bào.Trên phôi, khi mà quá trình tổng hợp ADN và quá trình phân chia tế bào bị hạn chế hoàn toàn, thì đúng lúc đó protein đòi hỏi sao mã vẫn còn xuất hiện Điều này chứng tỏ rằng: sự sao mã được khới đầu bằng một đổng hồ sinh học, và chạy liên tục không phụ thuộc vào sự tổng hợp ADN và phân chia tế bào Trên thực tế, các protein đòi hỏi sao mã xuất hiện trên phôi được nuôi cấy ở giai đoạn muộn Điểu này chứng tỏ rõ ràng là vị trí của đồng hổ nằm trong bào tương Sự truyền đạt thông tin từ mẹ sang phôi

có ý nghĩa quan trọng về mặt sinh học và thực hành trong việc nuôi cấy phôi Trên thực tế giai đoạn truyền đạt này (MZT) xuất hiện đồng thời với giai đoạn phôi ngừng phân chia trong điều kiện nuôi cấy còn thiếu một yếu tố nào đó Phôi của một số loài chuột bị ức chế ở giai đoạn 2 tế bào, và trong một thời gian dài áp dụng hệ thống môi trường nuôi cấy cho phôi bò thấy rằng phôi bò bị ức chế ở giai đoạn 8 tế bào,và áp dụng môi trường nuôi cấy phôi cần thấy rằng phôi cừu bị ức chế ở giai đoạn 16 tế bào, giai đoạn ức chế này trùng hợp với giai đoạn truyền thông tin từ mẹ sang phôi (MZT) Một giả thuyết nêu lên là sự sao mã không được hoạt hoá ở phôi ngừng phân chia

ở giai đoạn truyền thông tin từ mẹ sang phôi (MZT) Vì vậy trên gia cầm (bò) người ta đã tìm thấy protein đòi hỏi sao mà ở vào khoảng giai đoạn 8 tế bào không kể đến phôi đó có bị ức chế phát triển hay không Các thay đổi

điều kiện nuôi cấy nói chung ngăn ngừa được sự ức chế đặc trưng cho từng chủng loại Hiện íiay người ta chưa biết được điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng tới sự truyển đạt thỡng tin từ mẹ sang phôi (MZT) như thế nào và iiộu các phân tử tín hiệu thông tin đặc trang có tham gia vào không.

Két luân

Một sô quá trình tham gia vào sự phát tricn cua phôi ilươc ban dén ờ đây có tính chất độc lập với nhau Tuy nhiên một sỏ nhận xét nhan manh răng fl­irtin g phôi các hệ thống diéu hoà phức tạp ánh hướng clẽii nhau rát nhiều Vì vậv các thay đổi về nguồn năng lượng trong một mỏi trường nuôi cày nào đó

có thế tạo nên hoặc làm mát khả năng ức chê phát triến đặc trưng của lừng loài Úc chế việc sao mã cùa phôi sẽ làm hạn chẽ chu kv tê bào phôi sau thời diêm tru vén đạt thòng tin từ mẹ sang phôi (MZT) vì vậy các hệ thống điều hoà đều liên kết với nhau và hoạt động tốt nếu phôi được nuôi cấv tiếp tục sống, phát triển và khoẻ mạnh Mặt khác có các thí nghiệm đầy thuyết phục nêu lên tính linh hoạt cúa các hệ thông diều hoà này Diggers và cộng sự cổ gắng tạo ra một mói trường tốt nhất để nuôi cáy phôi chuột dựa trên 10 thành phần cơ bản Tác giả đã đưa ra các kết quả thí nghiệm nuói cấy với các thành phần được đưa vào mỏi trường và được nhập theo một mẫu máy tính, làm cơ sờ kiếm tra trớ lại mẫu môi trường mới mà máy tính phác thào ra Quá trình thử nghiệm này được lặp lại cho đến khi có thể nuôi cầy phôi đạt hiệu quả cao từ giai đoạn một tế bào đến giai đoạn túi mầm Điều gì đã tạo

ra ấn tượng trong thực nghiệm này Đó là máy tính đã phác thao đưa ba môi trường hoàn toàn khác nhau, nhưng có tác dụng giông nhau trong việc nuôi cây phôi Thành phần cuối cùng của môi trường được quyết đinh bầng thành phần đã tạo được chu kỳ thực nghiệm bắt đầu tốt nhất Các nhà nghiên cứu

đã tìm ra một điều quan trọng nữa là trong việc tạo ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho phôi, một điều quan trọng là cần tránh các yếu tố có thể hạn chế sự phát triển của phôi, hơn nữa cần thúc đẩy nghiên cứu nhũng yếu lố kích thích sự phát triển cùa phôi

1 J ' » '

J

124

ràỉ liệu tham khảo

Ế

H a r d y K H a n d y s i d c A H W i n s t o n R M L

Iv ,

í

The human blastocyst: cell num ber, death and allocation during

late preim plantaion development in vitro.

Developm ent I9H 9; 107: 597- 604.

;Howlett SK.

A set o f proteins showing cell cycle dependent m o d ific a lio n in

: Cell 1986; 45: 387 - 396.

Lawitts JA, Biggers JD.

Optimization of embryo culture media using simplex methods

Journal o f Reproduction and Fertility 1991; 91: 543-556.

Murray AW, Kirschner NW

What controls the cell cycle.

Scientific American 991; 264 (Volume3): 34 -41.

Papaioannau VE, Ebert KM

Comparative aspects of embryo manipulation in mammals

In: Experimental approaches to mammalian embryonic

(Editors: Schatten H and Schatten G) Academic Press Inc

vf, Krysiak E, Karasiewicz J, Czolowska J, Czolowska R,

sử dụng tăng kích thích buồng trứng, lượng estradiol trong máu người phụ

nữ, sô lượng các nang phát triển và sô lượng noãn và tinh trùng thu lấy được Yếu tô liên quan đến sự thành công của phương pháp điều trị đã dược nèu lên nhưng người ta nhận thấy rằng các yếu tô chú yếu nhất là sô lượng và chất lượng phôi đạt được trong phòng thí nghiệm Vì vậy số lượng và chất lượng của phôi được chuyển quyết định một phần quan trọng đến kết quả

thành công điều trị có nghĩa sau khi chuyên phôi sẽ có một thai và chắc chắn không mang 3 thai Tử cung (tính thụ cảm của tử cung) cũng góp phần quan trọng Người ta vản còn biết rất ít về điều này tuy nhiên trên thực tế, tảng kích thích bằng hormon và chọc chút nang noãn, có thể làm rối loạn sự phát triển của nội mạc tử cung Chất lượng của nội mạc tử cung đậc biệt giảm ở các chu kỳ kinh có sử dụng hormon tăng kích thích, để thu dược >12 noãn

Chương này chủ yếu nói về sự đánh giá chất lượng của phôi được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và thời điểm chuyển phôi Người ta đánh giá chát lượng phôi giữa dặc điểm hình thái và tỷ lệ phân chia của tế bào phôi (sự phát triển) Dùng kính hiển vi để tiến hành các xét nghiệm đánh giá dược nhanh chóng và không xâm phạm vào phôi, không ảnh hưởng nhiểu dến mồi trường nuôi cấy và khả năng sống của phôi, Kính hiển vi thường dược sử dụng là loại kính hiển vi có kính điều chỉnh tầm xa nổi (độ phóng đại tối da

là 70x) và loại kính hiển vi có pha tương phản (đảo ngược) có bàn vật kính được làm nóng bằng điện Gắn camera vào kính hiển vi để cho nhũng người khác cũng theo dõi quá trình đánh giá Cũng có thế thỴtbảng hình noãn vi

phôi để xác định xét nghiệm sau Như vậy sự nhẠn định theo chỉ số hình thái

và sử dụng sẽ được thống nhất cao hơn 'p V

126

Các đặc điểm hình tháỉ định tính của phốỉ

Đánh giá quá trình phát triển thụ tinh trong phòng thí nghiệm vào khoảng 18 giờ sau khi thụ tinh Noãn được thụ tinh chứa 2 tiền nhân, và đôi khi cũng có thê nhìn thấy cực cầu thứ 2 hình 10.2 xem phụ bán 5) Vị trí của hạch nhân trong 2 tiền nhân nằm cạnh nhau Cũng có thê thấy noãn có > 3 tiền nhân hoặc một tiền nhân (hình 10.2,3 xem phụ bản 5) Rối loạn chức năng cơ chế phản ứng vùng vỏ hoặc có rất nhiều tinh trùng hoạt động khoẻ làm cho một

sô tinh trùng có thế thâm nhập vào trứng sẽ hình thành > 2 tiền nhân Đôi khi không xuất hiện cực cầu thứ 2 Noãn có > 2 nhân được giữ riêng và không được chuyển phôi Noãn có không bào thường khó phân biệt với noãn

đa thụ tinh (hình 10.5 xem phụ bản 5) Plachot nghiên cúu thấy 6,4% trứng được thụ tinh trong thực nghiệm có n 3 tiền nhân Hai ngày sau khi chọc hút trứng và khoảng 40-44 giờ sau khi thụ tinh cần đánh giá xem trứng thụ tinh sắp phân chia chưa? (hình 10.5 xem phụ bản 5) Phôi đang ở giữa giai đoạn 2

tế bào hoặc giai đoạn 4 tế bào? Việc đánh giá hình thái là phương pháp bán định tính có thang điểm từ 1 tới 4 phụ thuộc vào hình dạng của nguyên bào nuôi và số lượng các mảnh không nhân tách ra Hình 10.la đến 10.ld xem phụ bản là sơ đổ của từng mức độ khác nhau Trong Y văn đều thống nhất hình ảnh về chất lượng của phôi loại 1 là các nguyên bào nuôi có hình dạng giống nhau và không có các mảnh nhỏ của nguyên bào nuôi (Hình 10.la; hình 10.7, 10.1, 10.12, 10.14, 10.15, và 10.18 xem phụ bản 5) Nếu số lượng nguyên bào nuôi thất thường không đều nhau do một số nguyên bào nuôi còn phân chia nên có kích thước to gấp đôi các nguyên bào nuôi khác (hình 10.11) cũng vẫn đạt được loại 1

Tiêu chuẩn loại 2 là: nguyên bào nuôi có hình dạng và số lượng không cố định, đổng thời có những mảnh vỡ chiếm < 10% thể tích phôi (Hình lO.lb hình 10.8, 10.13 và 10.16 phụ bản 5) Nếu sô' lượng mảnh vỡ tăng tới 10-

50% chúng tỏ là phôi loại 3 (Hình 10.lc hình 10.9 phụ bản 5) Phôi loại 4 có

> 50% mảnh vỡ (Hình lO.ld hình 10.10 và 10.19 xem phụ bản 5) Ở các phòng thí nghiệm khác nhau sử dụng các tiêu chuẩn về thang điểm khác nhau vì vậy trôn thục tế cẩn phải tiến hành đếm Vì các thang điểm khác nhau nên việc so sánh kết quả vẻ mối liận quan giữa chất lượng của phôi và

cơ hội có thai khó khôn Khoảng 20% phôi loại , 1 và 2 sẽ có thể làm

tổ ưong buồng tử cung đuợc T ỳ lẹ này 0 thể giảm *uống 1,5% đối với các phôi có nhiểu mảnh vỡ Cơ hội tiếp tục có thai đối với phôi chuyển có chất

lương tòt là khoang 10-15% Nổi bật là kết qua ớ bênh khoa Boum Hall

(Anh; 90cf bệnh nhân có thai có tối thiểu 1 phôi chuyen loai mỏl Châi

lượng hình thái của phôi chuyển không liên quan đên sẩy thai muộn

Hình 10.1a Phôi đô 1,

điểm số 4 tương ứng với

SƯ thinh thanh nguyên

số lương thay đổi,

nguyên bào phân chia

Các giai đoạn phân tách và phát UiỂn cùa phôi

Dùng kính hiển vị thường cố thể dễ dàng nghiên cứu đặc điểm hình thái và

tỷ lộ phân chia để chọn lựa phôi chuyển cho thích hợp Trong ngày thứ 2 nuối cấy phôi, phôi ở giai đoạn 2 tế bào đến giai đoạn 4 tế bào (hình 10.7 đến 10.14) 2% phổi cổ thể được tạo ra do các trứng không được thụ tình Quá trình này gọi là sự sinh sản đơn tửứi.k Thâm chí các trứng này có thể

128

bâng dung dịch acid Tyrode và calci ionophore có thể tạo ra sự sinh sản đơn tính ứ người Sử dụng Hyaluromdase dể điều trị loại bò gò mầm không có hiệu quả Người ta sử dụng cách này trong quá trình vi thụ tinh và kỹ thuật

vi sinh thiết và thật là thiển cận nếu cho rằng sự sinh sản đơn tính có thể xảy

ra thường xuyên hơn sau các thao tác tinh xảo băng tav Vào ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, phôi được phân chia theo một nhịp điệu chính xác đến giai đoạn tối thiểu là 8 tế bào (hình 10.15 đến 10.19 xem phụ bàn 5) Sau đó phôi có chất lượng tốt có thể phát triển đến giai đoạn phổi dâu (khoảng 4 ngày) và túi mầm (từ 5 đến 6 ngày, hình 10.20 phụ bản 5) Tiếp theo phôi trườn ra khỏi vùng trong suốt Quá trình này gọi là hiện tượng nở trứng (hình 10.21,

22, 23, 24 xem phụ bản 5)

Các hình ảnh dưới kính hiển vi thường

Các hình ảnh ở trang sau là các hình ảnh của trứng thụ tinh và phôi ờ vài ngày sau khi thụ tinh dưới kính hiển vi thường Các bức ảnh này được chụp

từ k ín h h iể n vi v ò m (thị k ín h X 10 vật k ín h X 20) và các ả n h được lấy từ kính hiển vi c ó k ín h đ iề u c h ỉn h tầ m xa nổi (phó ng đại bằn g m ắ t X 10; đ iể u c h ỉn h

tầm xa vật quan sát tối đa là 7x) Dùng đầu quay video gắn trên kính hiển vi

để quay các bức ảnh và dùng máy in video để in ảnh.

Chỉ sô' của từng phôi và chỉ số' phỗí tích luỹ cho sự vận chuyển

Kết qủa của điều trị thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) có thể là không có thai,

có một thai hoặc đa thai Số lượng phôi chuyển cũng góp phần quan trọng vào kết quả này Tỉ lộ có thai đối với phôi chuyển có chất lượng trung bình là khoảng 10% (tỷ lộ này tảng khoảng 15% đối với phôi có chất lượng rất tốt) Nếu chuyển 2 phôi thì tỷ lệ có thai tăng 15% chuyển 3 phôi tỷ lộ lăng 25%

và chuyển 4 phôi tỷ lệ tăng 35% Tuy nhiên chửa đa thai cũng tăng tương ứng với tỷ lệ tăng nói trên Tỷ lệ sinh ba khoảng 3,5% trên bệnh nhân có thai sau khi chuyển 3 phôi Một số bệnh viện nêu tỷ lệ này là 9%. Tỷ lệ sinh tư khoảng 1% trên bệnh nhân có thai sau khi chuyển 4 phôi Sinh 3 gây nên các vấn đề lớn về y tế xã hội và tài chính Vì vậỵ hiện nay sự vận chuyển 4 phôi không $>n thích bợp nữa, Cần hạn $ $ việc $»ụyển 3 phôi đặc biệt chuyển 3 phôi có chất lượng tốt Stacsen Gông bố là khi chuyển 2 hoặc 3 phôi ở phụ nữ có tuổi trung bình khoảng 30 thì cq hội có thai vẫn không thay

đổi nhưng có thai sinh ba tăne đáng kể Kêt quả này càng nêu lên tầm quan trọng về việc hạn chế sỏ lượng phôi chuyển.

Một số phòng thí nghiệm đã đưa ra mẩu phối điển hình băng cách kết hợp sô lượng và hình thái tế bào (chỉ sô của từng phôi) Theo còng thức này thì phôi loại 1 có chỉ số bằne 4 và phôi loại 4 có chỉ sô bằng 1 Chi số loai 1 cùa phổi

2 ngày tuổi có 4 tế bào là 16 (4x4) Nghiên cứu trong khi nuòi cấy nhiểu phôi thấv rằng 23% sỏ phỏi có chỉ sô phôi >16 trong ngày thứ 2 phát triển tới giai đoạn nguyên bào mầm (bias to cyst), trong khi đôi với phôi có chỉ sô

thấp thì tỷ lệ nàv chỉ chiếm 5%

35 30

tích số của số lượng nguyên

bào và chỉ số phôi Ví dụ phôi 4

ỉế bào loại 1 có chỉ số 4 điểm

Nguồn tư liệu “A text book of in-vitro fertiizsation and assisted reprodution”.

Nhà xuấỉ ban Parthenon, chương 11 CL Mitto (1992)

Chúng ta có thể tính được hiệu quả tác dụng của số lượng phôi đuọc chuyển lên kết quả thụ tinh trong ống nghiêm (TVF) bằng cách tính tổng chỉ số của tùng phôi chuyển trong ngày thứ 2 (chỉ số tích luỹ của phôi chuyến ngày thứ 2) Hình 10.25 biểu thị chỉ số tích luỹ của phôi trong ngày thứ 2 iita quan đẾtằ

tỉ lệ có thai Chuyển phôi có chỉ số tích luỹ từ 3 - 10 dẫn đỂh tỷ 16 có thai là

0

130

8,8%, và chỉ sô tích luỹ 35-42 dản đến tỉ lộ có thai là 33 % Chỉ sỏ tích luỹ trèn

50 không làm cho việc điều trị thành công mà còn làm tăng sổ lượng chửa đa thai (43% trên tổng số phôi chuyển điểu này không được nêu trên sơ đồ), ơ trung tâm y tế Hallman (Luân Đôn) tổng kết chỉ số phôi trên 326 trường hợp mang thai sau chuyển phôi đã khuyên rằng: giới hạn chỉ sô tích luỹ tới 40 đối với phôi chuyển để đạt được cơ hội có thai bình thường cao nhát và cơ hội đẻ đa thai thấp nhất Số lượng nguyên bào mầm, chất lượng của phôi, số lượng phôi đều có tầm quan trọng như nhau khi sử dụng tính chỉ số phôi Gần đây, sử dụng phương pháp thống kê đa chiều để phân tích các thông sô

có giá trị d ự đ o án , người ta c h o rằng số lượng phôi được c h u y ể n có giá trị dự

đoán tốt hơn so với các chỉ số về hình thái phôi Trong nghiên cứu này, chỉ

số hình thái phôi (trung bình) dựa trên chất lượng của tế bào phôi và tỉ lệ mảnh vỡ Kết quả của việc phân tích đa biến số gợi ý rằng số lượng phôi được chuyển và hình thái phôi không có giá trị ngang tầm với nhau Chỉ số tích luỹ và hình thái trung bình đối với chuyển phôi (ET) chỉ là một công

thức đơn giản để chỉ định một cách nhanh chóng về sô' lượng phôi chuyển Tuy nhiên có nhiều nhân tô' ảnh hưởng tới khả năng thụ tinh Các phân tích thống kê đa biến về các thông số khác nhau đã chỉ ra rằng tuổi của bệnh nhân và nguyên nhân vô sinh cũng có giá trị dự báo và thông tin này cũng cần phải nghiên cứu khi quyết định cần bao nhiêu phôi chuyển.

Thời đỉểm vận chuyển

ở điều kiện tự nhiên phôi ở giai đoạn thể dâu túi mầm sẽ đi đến buồng tử cung khoảng 4 - 5 ngày sau khi rụng trứng Lúc đó phôi có khoảng 60 tế bào (bảng 10.1) Vì vậy trong thụ tinh ống nghiệm cần chọn giai đoạn phù hợp

để chuyển phôi vào buồng tử cung Tuy thế, trong những ngày đầu thụ tinh trong ống nghiệm Edwards chọn phôi ở giai đoạn 8 tế bào 16 tế bào để chuyển vào buồng tử cung có ý nghĩa là vào khoảng 3-4 ngày sau khi hút nang Vào thời điểm đó, họ không thể gây có thai được đối vói phôi được nuôi cấy 5 ngày Hiện nay người ta đã cải tiến điểu kiện nuôi cấy phôi nên

cố thể nuôi cấy phôi trong một thời gian dài thậm chí cho đến giai đoạn túi mầm blastocyst (hình 10.21, 22, 23, 24)' Qua nhiểu năm, có rất nhiều các

phương phắp nhằíri cố gắng nghién cứa Khoảng thòi gian tốt nhất từ khỉ thụ tinh đến khi chuyển phối Thti i ỉ ẳ r t i ỳ M ỹ Ỉ M ĩ đến 5 ngày (ngày thụ

> i Ị-.tt í! aãv tạt- >JUt K>dq ftefirf Ạirti T/ ob ỳ{ - f t * '■

131

tinh là ngày 0) Giai đoạn phát triển cúa phôi thay đổi từ hơp từ thành tế bào

mầm (túi mầm, blastocyst)

Tế bào mầm Sô lượng tế bào trong

khối tế bào phôi (embryoblast)

Sỏ lượng tế bào trong khối té bào nuôi (hophoblast)

Tone só tế bào

Bảng 10.1: Sô lượng tế bào (trung bình ± SD ) trong khối tẻ bào phôi bén ưong) và tê bào

nuỏi cùa phôi nuôi cấy trong ống nghiêm vào ngày 5,6 và 7.Số liộu lấy từ: "Development

107: 597-604 (1989) Hardy, K, Handyside, A.H và Winston, R.M.L

Chuyển hạp tử vào ngày thứ 1

( 2 0 - 2 4 giờ sau khi thụ tinh )

Trong chu kỳ tự nhiên, hợp tử ở trong vòi trứng Phương pháp chuyển hợp tử

vào trong vòi trứng (ZIFT/ zygote intra-fallopian transfer) tạo ra điều kiộn Ị gần giống tự nhiên nhất Dùng một catête dài để đưa hợp tử được tạo ra trong

ống nghiêm vào đoạn cuối cùa vòi trứng Đây là một phương pháp đòi hỏi sự

cần cù Người ta thường tiến hành phương pháp này dưới sự chỉ dản của siêu

âm Tuy nhiên bắt buộc vòi trứng phải thông Một điều thuận lợi của việc

c h u y ể n phôi trong n g ày th ứ n h ất là trứng được th ụ tin h chỉ ờ bên ngoài cơ

thể một thời gian ngắn và nhanh chóng quay trở lại điểu kiện môi trường tự

nhiên Một điểm không thuận lợi là người ta không chắc chắn là hợp tử có

phát triển thành phôi có chất lượng tốt không, kết quả đầu tiên của phương pháp này dường như rất đáng khích lệ, nhưng sau đó lại không thành công vì vậy phương pháp này hầu như không được sử dụng nữa.

Chuyển hạp tử vào ngày thứ 2

(khoảng 36 - 48 giờ sau khi thụ tinh)

ở thời điểm này phôi đang ờ giai đoạn 2-4 tế bào nhưng chỉ quan sát dược phôi ở giai đoạn 6-8 tế bào Trong điều kiện tự nhiên phôi vản ở trong vòi trứng Tuy nhiên, vì những lý do về thực hành phôi được dật vào trong buổng

132

tử cu n g Thời điểm thuận lợi nhất để chuyển phôi (ET) (cũng như chuyển

hợp tứ) là khi phôi chỉ ở bên ngoài cơ thể trong một thời gian ngắn (2 ngày) Nêu phôi ớ bcn ngoài cơ thể lâu hơn dưới các điêu kiện nhân tạo phôi sẽ chịu

nhiều ánh hưởng của điều kiện bên ngoài hơn như sự dao động của nhiệt độ,

C 0 2, độ ẩm không khí, cũng như nguv cơ nhiễm trùng Khi chọn phôi để chuyến người ta thường chọn phôi có nhiều tế bào hơn vì họ nghĩ rằng các phôi phát triển nhanh sẽ dễ làm tổ trong buồng tử cung hơn Trên thực tế Staessen và cộng sự đã nhận thấy rằng sự khác nhau về tỉ lệ làm tổ giữa phôi

có chất lượng tốt ở giai đoạn 4 tế bào là 21% và giai đoạn 2 tế bào là 14%

Chuyển phối vào ngày thứ 3

Vào ngày thứ 3 phôi phát triển đến giai đoạn 6-8 tế bào thậm chí có thể đến giai đoạn 10-12 tế bào Trên thực tế phôi phát triển trong nuôi cấy đến giai đoạn 8 tế bào hoặc nhiều hơn chứng tỏ chất lượng, khả năng làm tổ của phôi tốt và thuận lợi Chọn phôi để chuyên trong ngày thứ 3 đơn giản hơn nhưng mặt khác lại khó khăn hơn là chọn phôi trong ngày thứ 2 Theo nguyên tắc lựa chọn những phôi phát triển tốt nhất trong điểu kiện nhân tạo, biểu hiện bằng số lượng tế bào của phôi Dự đoán số lượng các tế bào ở giai đoạn này đôi khi khó khăn do có các mảnh tế bào không nhân có kích thước giống tế bào phôi (hình 10.19) Vì vậy rất dễ nhận định lản lộn, phôi có chất lượng kém (có nhiều mảnh không nhân) với phôi phân chia có chất lượng tốt

Nói chung, hầu hết các trung tâm thụ tinh ống nghiệm (IVI) sẽ lựa chọn phôi

chuyển (ET) vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 Thực tế trong điều kiện tự nhiên ở thời điểm này là phôi còn ở trong vòi trứng nhưng khi thụ tinh trong ống

nghiệm phôi được chuyển vào buồng tử cung Tuy vậy phôi vẫn không bị tác động bất lợi cho sự phát triển thành thai Phôi vần tồn tại trong buồng tử cung cho đến khi làm tổ Không có sự khác nhau thực sự về tỉ lệ có thai, tỉ lệ sảy thai giữa chuyển phôi ưong 3 ngày với chuyển phôi trong 2 ngày Đôi khi chuyển phôi ngày thứ 3 thích hợp hơn, vì không thể lựa chọn được phôi thích hợp trong ngày thứ'2 Các phôi ở thời điểm ngày thứ 2 này có chất lượng giống nhaunfin phải chờ những ngày sau mới cố thể ỉựa chọn dễ hơn.

‘V i t <-h i ’ i i t i > , ' t i ỉ i u - ■ :■

Chuyển phôi vào ngày thủ 4 và thứ 5

C h u v ển phôi ờ giai đoan phôi dâu hoặc giai đ o ạn túi m ầ m thì gần giỏng với

điều kiện tự nhiên Vào thời điểm đó người ta sẽ biết được phôi nào có thể thay đổi thông tin từ mẹ sang phôi (sự vận chuyển thông tin từ mẹ sang hợp

tử) T u v nhiên, ờ hầu hết các phòng thí n g h iệ m , c h u y ể n phôi vào giai đoan nàv k h ô n g được ưu tiên sử d ụ n g vì thời gian phôi phản c h ia tích đảc tế bào

này xảy ra trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo dài hơn, sẽ làm cho sự phát triển chậm lại so với phôi được đưa vào cơ thể Từ các sô liệu có sẩn có thể so

sánh giữa tỉ lệ có thai sau khi vận ch u y ển phôi ở giai đoạn phối dâu và túi

m ầm với tỷ lệ có thai sau khi chuyển phôi vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 ưong

điều kiện nuôi cấy chuẩn mực

Mặt khác, theo một sô tài liệu nghiên cứu nếu điểu kiện nuôi cấy tốt nhất ví

dụ nuôi cấy phổi trên một lớp đơn tế bào ( co-culture) thì kết quả thụ tinh trong Ống nghiệm sẽ tốt hơn Menezo đã nêu lên tỉ lệ có thai là 25% trên bệnh nhân đã được chuyển phôi theo phương pháp nuôi cấy trèn, thậm chí phôi nuôi cấy chưa tới giai đoạn chuyển phôi (ET) Sử dụng phương pháp nuôi cấy một lớp tế bào đơn Vero (tế bào thận khí) tác giả thấy tăng lượng tế bào trong khối tế bào bén trong của túi mầm

Mặc dù đây là một kết quả đáng thuyết phục, nhưng người ta khuyên không nên dùng các dòng tế bào có nguổn gốc động vật để điều trị nuôi cấy trong ống nghiệm (IVF) vì dễ có nguy cơ nhiễm virus

Các phương pháp khác nghiên cửu chít lượng của phối

Một điều hiển nhiên là bản thân các nghiên cứu trên phôi không ảnh hưởng đến sự sống của phôi Bên cạnh các xét nghiệm về hình thái học, có thể kiểm tra chất lượng của phôi qua các phân tích sinh hoá các sản phẩm chuyển hoá

và các chất giải phóng của noãn và phôi trong môi trường nuôi cấy Trong 5 ngày đầu, phôi phát triển, hấp thụ chất pyiuvat cùa môi trường Nổng độ pyruvat lý tường nhất ưong môi trường là 0,47 mM/1 Sau khi phát triển tới giai đoạn túi mầm, việc tiêu thụ pyruvat giảm, và glucose tăng Pyruvat và glucose tiêu thụ ở giai đoạn túi phôi có thể đo dược chính xác Pyruvaỉ liêu

thụ trên phôi không phán chia thấp hơn 20% so với phôi phát triển tới giai đoạn túi mám Một phương pháp hoàn toàn khác đê đánh giá chất lượng cùa phói (đặc biệt phương pháp có tính di truyền) càng được sừ dụng ngày càng nhiều hưn, đó là kỹ thuật chẩn đoán trước khi làm tổ Một điểm khác nhau quan trọng so với các phương pháp đã nêu ở trên là kỹ thuật chẩn đoán này

có tính xâm phạm đến phôi Người ta lấy nguyên bào phôi từ phôi có 6 đến 8

tế bào rồi nghiên cứu cụ thể các ADN của các tế bào này trong phòng thí nghiệm Ở chương sau sẽ nói nhiểu vể kỹ thuật này hơn

Kết luậnm

Ớ hầu hết các phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), người ta chuyên phôi vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 sau khi thụ tinh Ở thời điểm đó, sử dụng kính hiển vi thường có thể đánh giá tốt và nhanh chóng chất lượng phôi Để phôi lâu trong môi trường nuôi cấy có thể dẫn đến những điểm không tốt về mặt kỹ thuật và thực hành như phôi sẽ phát triển chậm so với khi chuyển phôi vào tử cung (ET), vì trong ống nghiệm phôi phát triển chậm hơn trong cơ thể Như là một nguyên tắc: không chuyển nhiều phôi (nhiều hơn 2 hoặc 3 phôi) người ta thường chọn phôi được tạo ra từ các trứng được thụ tinh đúng lúc: (có thể thấy 2 tiền nhân khoảng 18 giờ sau thụ tinh), được phân chia đầy đủ (4 tế bào đến 8 tế bào) và có rất ít hoặc không có mảnh vỡ

Có nhiểu phôi để chọn lựa phôi tốt để chuyển phôi là thuận lợi nhất Chỉ số phôi tích luỹ cũng giúp cho việc đánh giá sự thành công trong điều trị thụ tinh trong ống nghiệm: tãng tỷ lệ có thai và giảm thấp nhất tỷ lệ thai sinh ba Gần đây nhiều các trung tâm có xu hướng chuyển tối đa là hai phôi đặc biệt trong trường hợp vô sinh thứ phát hoặc khi người phụ nữ tương đối trẻ (dưới

30 tuổi) Khả nàng làm đông các phôi thừa ỉà một tiến bộ sau này của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm Một mặt bảo quản phôi đông lạnh sẽ làm

giảm nguy cơ đa thai, vì sẽ có ít phôi được chuyển hơn Mặt khác, khả năng

cố thai thêm là khoảng 10% vì người ta có thể làm tan dông để chuyển tiếp phôi một thời gian sau (khi lẩn dầu thất bại).

I

' n!ỉ 10 3 H o ằ n đ i àUỢữ M ct’ V:

Tàl liệu tham khảo

Brinsden R Rainsbury A.

In vitro fertilization and assisted reproduction.

The Parthenon Publishing Group, Caniforth 1992.

Edwards RG, Steptoe PC, Purdy JM

Establishing fullterm human pregnancies using cleaving embryos grown in vitro.

British Journal o f Obstertrics and Gynaecology 1980; 87:737

Hardy K, Handyside AH, Winston RML

The human blastocyst; cell number Death and allocation during late preimplantation development in vitro.

Development 1989; 107; 597-604.

Hardy K, Hooper MA, Handyside AH et al

Non-invasive measurement of glucose and pyruvate uptake

by individual human oocytes and preimplantation embryos.

Human Reprodution 1989; 4: 188 - 191.

Hill GA, Freeman M, Basttias MC et al

The influence of oocyte maturity and embryo transfer.

Fertility and Sterility 1989; 52: 801-805.

Menezo YJ, Guerin JF, Czyba JC

Improvement of human early embryo develovemant in vitro

by coculture on monolayers of Vero cells.

Biology of Reprodution 1990; 42: 301-306.

f

The influence of the interval between in vitro fertilization

and embryo transfer and some other variables on treatment

outcome.

Fertility and Sterility 1989; 51: 360.

Plachot M, MandelbaumJ, Junca AM et al

Cytogenetic analysis and developmental capacity of normal

and abnormal embryo after IVF.

Human Reprodution 1989; 4: 8

Hình 10.4 Noãn với 1 nhân

(khoảng 18 giờ sau khi thụ tinh

t.p a riafl Ị ệ A t 99Mb t b nỀoM C O’ < U n r <

Mỗi lần phân chia tế bào tách làm đỏi cho đến khi kích thước tế bào giảm đi phần nửa bằng

tế bào cơ thể bình thường

Hình 10.6 Giai đoạn đẩu của phân chia lẩn thứ nhất (khoảng 24 giờ sau khi thụ tinh)

í

<

Hinh 10.7 Hai phôi bào độ 1, chỉ số phôi = 8

(sau thụ tinh khoảng 36 - 48 giờ)