Sinh học đại cương trần thị lê trang

BÀI TẾ BÀO HỌC NỘI DUNG ĐẠI CƯƠNG VỀ TẾ BÀO 1.1 Lược sử nghiên cứu tế bào 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tế bào 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tế bào 1.2.1 Sử dụng kính hiển vi 1.2.1.1 Nguyên lý chung kính hiển vi 1.2.1.2 Một số loại kính hiển vi a, Kính hiển vi sử dụng ánh sáng thấy (light microscope) b, Kính hiển vi phân cực (polarization microscope) c, Kính hiển vi đối pha (phase – cotrast microscope) d, Kính hiển vi huỳnh quang (fluorescence microscope) e, Kính hiển vi điện tử (electron microscope) 1.2.2 Phương pháp làm tiêu hiển vi cố định 1.2.3 Phương pháp nguyên tử đánh dấu 1.2.4 Phương pháp phóng xạ tự ghi 1.2.5 Phương pháp li tâm 1.2.6 Phương pháp nghiên cứu tế bào sống 1.3 Cơ sở phân tử tế bào 1.3.1 Các nguyên tố hóa học tế bào 1.3.2 Nước vai trò nước tế bào 1.3.3 Saccarit (Cacbohydrat) 1.3.4 Lipid 1.3.5 Protein 1.3.6 Axit Nucleic 1.4 Hình thái đại cương tế bào TẾ BÀO TIỀN NHÂN (PROKARYOTE) 2.1 Đại cương tế bào tiền nhân 2.2 Cấu tạo tế bào tiền nhân 2.3 Vai trò thể tiền nhân đời sống người TẾ BÀO NHÂN CHUẨN (EUKARYOTE) 3.1 Đại cương tế bào nhân chuẩn 3.2 Cấu tạo chức tế bào nhân chuẩn 3.2.1 Vách tế bào 3.2.2 Màng sinh chất 3.2.3 Nhân 3.2.4 Tế bào chất 3.2.5 Lục lạp 3.2.6 Ty thể 3.2.7 Mạng lưới nội chất 3.2.8 Phức hệ golgi 3.2.9 Lizoxom 3.2.10 Trung thể 3.2.11 Các bào quan khác 3.2.12 Bộ khung sườn tế bào ĐẠI CƯƠNG VỀ TẾ BÀO 1.1 Lược sử nghiên cứu tế bào Hầu hết tế bào có kích thước hiển vi khơng thể nhìn thấy mắt thường, lịch sử nghiên cứu tế bào gắn liền với đời tiến kính hiển vi Robert Hooke (1635 - 1703) người đưa khái niệm Tế bào cách 300 năm, ơng sử dụng kính hiển vi với độ phóng đại 30 lần để quan sát “hộp” nhỏ cấu tạo nên nút bấc Ông cho hộp tế bào, cịn ngày biết vách Cellulose có tẩm suberin tế bào thực vật chết Với nghiên cứu tiếp theo, ơng cho đời “Hình hiển vi” vào năm 1665 Trong thời gian hiểu biết tế bào cịn hạn chế, cịn có nhiều giả thuyết sai lầm tế bào “Thuyết tự sinh” LeeuwenHoek (1632 - 1723) lắp đặt kính hiển vi với độ phóng đại 270 lần, với độ phóng đại sử dụng để nghiên cứu tế bào Ông quan sát tế bào hạt phấn nằm tự lần mô tả số thể đơn bào Delf (Hà Lan), nhà bn bán, ngồi ơng cịn nghiên cứu Vi khuẩn, Động vật nguyên sinh, Hồng cầu,… qua khám phá ơng góp phần chống lại “Thuyết phát sinh” Mãi đến năm 1894 Louis Paster, phương pháp thực nghiệm bác bỏ hoàn toàn “thuyết tự sinh” Tiếp theo nghiên cứu M Manpigi, Grew mô quan động vật thực vật tảng cấu trúc chung tế bào Vào đầu kỉ XIX, hai nhà bác học người Đức M Sleiden Theodor Schwann với nghiên cứu với thành tựu tế bào từ kỉ XVII – XVIII khái quát thành "Học thuyết tế bào" Đây cơng trình vĩ đại kỉ XIX, khẳng định tế bào đơn vị cấu tạo thể sống Đến nửa sau kỉ XIX, kính hiển vi quang học hồn thiện với độ phóng đại khoảng 3000 lần bào quan hiển vi (Nhân, lục lạp, ty thể,…) phát nghiên cứu Với đời kính hiển vi điện tử vào năm 50 kỉ XX, có độ phóng đại từ 30 ngàn đến 1triệu lần Sử dụng kính hiển vi điện tử kết hợp với phương pháp sắc kí, ly tâm, điện tử đánh dấu nhà khoa học nghiên cứu cấu tạo siêu hiển vi bào quan tế bào, biết cấu trúc phân tử nguyên tử thành phần cấu tạo tế bào Cùng với tiến khoa học kĩ thuật, hiểu biết tế bào ngày hồn thiện, đầy đủ có sở khoa học, tế bào ngày khẳng định đơn vị cấu trúc chức thể sống 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tế bào 1.2.1 Sử dụng kính hiển vi Tế bào đối tượng khoa học tế bào, chúng có kích thước bé, để nghiên cứu trước hết phải sử dụng kính hiển vi 1.2.1.1 Nguyên lý chung kính hiển vi Các dụng cụ phóng đại xây dựng dựa sở sử dụng xạ điện từ: Bức xạ tia Ronghen, sóng cực ngắn, tia tử ngoại (l = 10 – 380 nm), tia sáng thấy (l = 380 – 780nm), tia hồng ngoại (l > 780nm) Các xạ có tính chất truyền theo dạng sóng hạt có độ dài bước sóng khác Mức độ quan sát kính hiển vi phụ thuộc vào độ phân giải, tức khả quan sát khoảng cách hai điểm gần Độ phân giải tính bằng: Vì sina a £ độ khúc xạ phần lớn nguyên liệu sử dụng dụng cụ quang học không 1,6 nên độ phân giải thấu kính lúc chìm dầu khoảng 1,4 Dựa vào ngta tính giá trị cụ thể cơng thức Ví dụ: + Ánh sáng đơn sắc (l= 400nm): Quan sát vật nhỏ khoảng 0,17mm + Ánh sáng trắng (l = 580nm): Quan sát vật nhỏ khoảng 0,25mm + Tia hồng ngoại (l = 800nm): Quan sát vật nhỏ khoảng 0,4mm Như vậy, khả nhìn rõ vật tỷ lệ nghịch với độ dài bước sóng, hồn thiện kính hiển vi gắn liền với việc dụng xạ điện từ ngày có bước sóng ngắn 1.2.1.2 Một số loại kính hiển vi a, Kính hiển vi sử dụng ánh sáng thấy (light microscope) Bao gồm hai phận học quang học Bộ phận học gồm hệ thống thấu kính vật kính mắt kính Thấu kính làm nhiệm vụ hội tụ tia sáng, cịn mắt kính sử dụng để quan sát ảnh Cấu tạo hệ thống thấu kính người ta hồn thiện tối đa, độ phóng đại kính hiển vi quang học thông thường phụ thuộc vào chất tia sáng thấy Độ phân giải kính hiển vi quang học khoảng 0,2mm (d = 1/3.0,6mm) Hệ thống thấu kính vật kính hồn thiện có độ phóng đại tối đa 120 lần, độ phóng đại tối đa mắt kính 30 lần Do độ phóng đại tối đa kính hiển vi quang học khoảng 3600 lần Từ mắt kính kính hiển vi quang học gắn thêm thiết bị chụp ảnh hiển vi máy quay phim, nhằm chụp ảnh ghi lại chuyển động tế bào chất hay phân chia tế bào Hình 1.1 Cấu tạo kính hiển vi sử dụng ánh sáng thấy b, Kính hiển vi phân cực (polarization microscope) Về nguyên tắc cấu tạo giống kính hiển vi quang học thơng thường, kính hiển vi phân cực có thêm nicol màu xám chế tạo từ CaCO3 Một nằm trước tụ quang (nicol phân cực), cịn đặt ống thị kính vật kính gắn thị kính (nicol phân tích) Hai gạt sang bên tháo sử dụng kính hiển vi thơng thường Nếu ta để hai nicol thẳng góc với ánh sáng khơng lọt vào nên nhìn vào kính ta thấy tối đen, xoay từ từ nicol đặt trước tụ quang tìm vị trí làm cho ánh sáng gần tắt hẳn Khi ta để lên mâm kính tiêu đá kết tinh thể lên nhiều hạt tinh thể có màu sắc đẹp, tượng phân cực sắc Phương pháp dựa bất đẳng hướng (không hướng) thành phần tế bào, mô xuất quan sát ánh sáng phân cực phân bố với tốc độ hướng nên số khúc xạ chất cấu trúc tinh thể không đổi, phụ thuộc vào hướng phân bố ánh sáng Trong bất đẳng hướng tốc độ ánh sáng phân cực phụ thuộc vào định hướng mặt phẳng phân cực phương chùm tia tới Chất có tính gọi khúc xạ kép Nó đặc trưng với giá trị khúc xạ tương ứng với tốc độ phân bố ánh sáng phân cực từ nicol phân cực (Nhận nguồn sáng tạo ánh sáng phân cực) nicol phân tích (Nhận ánh sáng phân cực xoay để tia sáng lọt vào kính) Nhờ kính hiển vi phân cực người ta đo chuyển dịch pha xuất đường tia phân cực mặt phẳng vng góc Nếu tiêu đường glucose nhìn qua kính hiển vi phân cực ánh sáng lên chất glucose chứa nguyên tử Cacbone bất đối làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, glucose gọi đồng phân quang học đồng phân lập thể Nếu tiêu tinh bột quan sát qua kính hiển vi phân cực thấy dạng chữ thập màu đen Phần chữ thập đen amilopectin chứa photpho, phần xung quanh chủ yếu amilose chứa nhiều photpho c, Kính hiển vi đối pha (phase – cotrast microscope) Kính hiển vi đối pha người Hà Lan – Zernike phát minh, cho phép nghiên cứu đối tượng sống hiển vi mà không cần nhuộm, quan sát sinh vật đơn bào sống, tế bào sống quay phim, chụp ảnh hoạt động sống chúng Nguyên tắc phương pháp cấu tạo tế bào sống suốt, song ánh sáng nhìn thấy làm thay đổi pha tia sáng qua tế bào d, Kính hiển vi huỳnh quang (fluorescence microscope) Hiện tượng huỳnh quang tượng phát sáng nguyên tử, phân tử vật bị kích động lượng vật kích thích Tia sáng phát vật bị kích thích có bước sóng dài bước sóng tia sáng vật kích thích Căn vào nguồn lượng tia sáng kích thích khác mà người ta phân biệt nhiều dạng huỳnh quang: Huỳnh quang quang học (sự phát sáng kích thích ánh sáng mặt trời), huỳnh quang Ronghen (sự phát sáng kích thích tia X), huỳnh quang phóng xạ (sự phát sáng kích thích tia phóng xạ), huỳnh quang tử ngoại (sự phát sáng kích thích tia cực tím - UV) Đối tượng nghiên cứu kính hiển vi huỳnh quang có hai loại: Các đối tượng tự phát huỳnh quang mà nhuộm màu gọi huỳnh quang nguyên sinh, ví dụ: Vitamin A, B, sắc thể, lạp thể, lipid, sụn, Các đối tượng không tự phát huỳnh quang mà phải nhuộm màu chất đặc biệt (fluorochrome) phát ánh sáng gọi huỳnh quang thứ sinh Phương pháp hiển vi huỳnh quang cho phép nghiên cứu vật chất sống, quan sát xâm nhập di chuyển chất thể, trình trao đổi chất bình thường bệnh lí Dùng huỳnh quang nghiên cứu cấu trúc thành phần hóa học phân tử sinh học như: ADN, ARN, Protein, Hình1.2 Kính hiển vi huỳnh quang Hình 1.3 Sơ đồ hoạt động e, Kính hiển vi điện tử (electron microscope) - Kính hiển vi điện tử xuyên qua (Transport electron microscope) Kính hiển vi điện tử nhà bác học người Đức Ruska phát minh vào năm 1932, đến năm 1939 sử dụng nghiên cứu lĩnh vực sinh học Kính hiển vi điện tử xuyên qua sử dụng tia điện tử xuyên qua để nghiên cứu cấu tạo siêu hiển vi tế bào sinh vật Các tia điện tử có bước sóng ngắn (l = 0,005nm) nhỏ bước sóng ánh sáng mặt trời nhiều (l = 555nm), nên khả phân giải kính hiển vi điện tử lớn nhiều Về nguyên tắc, nguyên lí cấu tạo kính hiển vi điện tử giống kính hiển vi thường, khác nguồn lượng chùm tia điện tử ánh sáng Để tạo chùm tia điện tử người ta để sợi dây Vonfram hạt tungsten cực âm (Catot) ống kính chân khơng (1/10000mmHg) dài khoảng 1,5m Khi sợi dây bị nung nóng phát điện tử với tốc độ khoảng 100.000km/s, với điện cực mạnh 50.000 – 100.000volt Điện tử cịn tăng tốc độ nhờ điện trường truyền theo đường thẳng có tính chất sóng hạt nhưu ánh sáng Chùm điện tử phát từ Vonfram cực âm nhờ có cuộn từ tính có vai trị tụ quang làm cho chúng hội tụ mặt phẳng mẫu vật sau bị lệch đi, tỏa cuộn từ tính khác làm tăng độ phóng đại mẫu vật Tiếp theo chùm điện tử hội tụ cuộn từ tính thứ – có vai trị thị kính làm tăng độ phóng đại vật từ vật kính Cuối tia điện tử đập lên màng huỳnh quang để tạo ảnh, cố định kính ảnh, nhìn thấy rõ vật nghiên cứu Hình 1.4 Sơ đồ hoạt động kính hiển vi điện tử - Kính hiển vi điện tử quét (Scaning electron microscope) Về nguyên tắc cấu tạo giống kính hiển vi điện tử xuyên qua, khác chùm điện tử quét bề mặt mẫu vật Kình dùng để nghiên cứu tiêu siêu hiển vi hình thái Hình 1.5 Sơ đồ hoạt động kính hiển vi điện tử quét - Kính hiển vi hiệu ứng đường hầm ( electron microscope) Kính hiển vi điện tử cải tiến nâng độ phóng đại lên triệu lần cho phép nghiên cứu đại phân tử, chưa thể nghiên cứu nguyên tử, ion,… Giải vấn đề đời kính hiển vi hiệu ứng đường hầm, chúng cho phép nghiên cứu cấu tạo nguyên tử virus, phản ứng hóa sinh quang hợp, hơ hấp,… Kính hiển vi phát minh hai nhà bác học Binning Rohrer, họ nhận giải thưởng Noben thập kỉ 80 kỉ XX Hiệu ứng đường hầm tượng mà người ta mô tả môn học lượng tử từ năm 20 kỉ XX Theo tượng này, mẫu vật chất điện tử quay chung quanh hạt nhân nguyên tử có xác xuất khỏi nguyên tử mẫu vật chất để vào nguyên tử mẫu vật chất khác cạnh Vậy theo mơn học lượng tử, cho hai mẫu vật kim loại gần khoảng 1A0 chân không cho vào điện áp điện tử vịng ngồi nguyên tử khỏi nguyên tử vào khe hở hai nguyên tử, từ đo theo hiệu ứng đường hầm băng qua hàng rào điện nhảy từ nguyên tử sang nguyên tử khác Xác suất di chuyển điện tử phụ thuộc vào khoảng cách hai nguyên tử mẫu vật chất Ví dụ: Cho hai nguyên tử xích lại gần khoảng 5A0 cho áp vào điện vài chục milivolt có luồng đường hầm vài monoampe Trong thực tế người ta cho vận động mũi kim nhọn bề mặt tạo đường hầm ổn định, nghĩa giữ khoảng cách mũi nhọn bề mặt khơng đổi Vị trí mũi nhọn thay đổi tùy vào địa hình bề mặt nguyên tử mẫu kim loại Nếu nguyên tử nhô lên đường đồng mức hay lõm xuống đường đồng mức, mũi nhọn di chuyển nhơ lên hay lõm xuống để giữ khoảng cách định hai nguyên tử Những thay đổi vị trí vận động mũi nhọn bề mặt kim loại đem lại đồ hình nổi, hình thành đường biên giới nguyên tử, tức hình thành luồng đường hầm hai dãy nguyên tử Đây nguyên tắc kính hiển vi hiệu ứng đường hầm Năm 1981 Bining Rohrer tạo hình kính hiển vi hiệu ứng đường hầm Sở dĩ hai ông thành công nhờ hủy bỏ chứng động khí, kim loại hồn tồn ngun chất tuyệt đối phẳng, kiểm tra vận động mũi nhọn điều chỉnh khoảng cách mũi nhọn kim loại 0,1A0 Độ phân giải kính 0,1A0 nghĩa 1/10 đường kính trung bình ngun tử, độ phóng đại đạt tới 100 triệu lần 1.2.2 Phương pháp làm tiêu hiển vi cố định a Định hình Giết chết tế bào, mơ để cố định hình thái cấu tạo giai đoạn định để nghiên cứu, không làm biến đổi chất hay thay đổi biến dạng tế bào * Định hình riêng rẽ: Sử dụng đơn chất như: Formol, cồn ethylic, axid acetic, axit osmium,… * Định hình hỗn hợp chất: Sử dụng hỗn hợp như: - Axit acetic - cồn theo tỷ lệ 3/1 dùng để định hình tế bào + Dung dịch Cacnoa I: Cồn tuyệt đối 60ml + axit acetic kết tinh 10ml + Dung dịch Cacnoa II: Cồn tuyệt đối 60ml + axit acetic kết tinh 10ml + Clorofooc 30ml - Cồn – formol: Formol 6ml + cồn 70% 100ml Dùng để định hình ống phấn, đầu nhụy, vịi nhụy Thời gian định hình khoảng 20phút - Bouin (Buen): Dung dịch axit picric 75ml + formol 50ml + axit acetic kết tinh 10ml Hợp chất thường dùng để cố định mẫu vật phân chia tế bào, đặc biệt để cố định chất khác tế bào thực vật glucose thuộc loại cấu trúc tế bào tăng trưởng tối đa với nguồn glucose Khi nguồn glucose cạn, tế bào phản ứng lại cách tạo c-AMP Việc tăng nồng độ c-AMP tế bào gây nên hàng loạt kiện, diện lactose, dẫn đến phiên mã gen cấu trúc operon lactose 3.1 Cấu trúc operon lactose Hệ thống lactose (lactose system) bình thường (Hình 8.4) gồm có gen điều hịa (i R) operon mang trình tự promoter (P) locus operator (O) ba gen cấu trúc cho -galactosidase (Z), permease (Y) transacetylase (A) Nhiều đột biến locus phát 3.2 Hoạt động hệ thống - Điều kiện cảm ứng (có lactose) Lactose chuyển vào tế bào yếu có vài phân tử permease làm việc Khi vào tế bào, số lactose (liên kết -1,4) chuyển thành allolactose (liên kết -1,6) nhờ galactosidase Allolactose chất cảm ứng, gắn vào protein kìm hãm gây biến đổi cấu hình tạo phức hợp allolactose-repressor Phức hợp khả gắn operator Lúc operon mở, RNA polymerase bắt đầu phiên mã gen cấu trúc Toàn kiện diễn hình 8.4b - Điều kiện khơng cảm ứng (khơng có lactose) Gen điều hịa operon thường xuyên tổng hợp protein kìm hãm (repressor protein) mức độ thấp, có promoter hiệu Sự tổng hợp protein bị tác động nồng độ lactose tế bào Ngược lại, promoter bình thường operon lac gắn với RNA polymerase có hiệu Khi khơng có đường lactose, protein điều hòa hoạt động (active regulator protein) gọi protein kìm hãm gắn vào promoter hay “đọc” trình tự operator protein kìm hãm chiếm đoạn Như vậy, phiên mã tất gen cấu trúc operon lac bị dừng (Hình 8.4a) Do số lượng permease tăng, nên lactose vào tế bào với số lượng lớn phân hủy -galactosidase Khi lactose sử dụng hết, protein kìm hãm gắn trở lại vào operator làm operon bị đóng; phiên mã gen cấu trúc bị dừng Bản thân gen điều hòa lacI có promoter (Pi) gen cấu trúc protein kìm hãm Promoter yếu, protein kìm hãm có số lượng lớn, bị protein gắn vào làm dừng phiên mã Operon (a) Không có lactose Gen điều hịa lacI Operator lacO RNA polymerase Gen cấu trúc X Không thể liên kết pI lacZ lacY lacA lacP Phiên mã dịch mã Không phiên mã Protein điều hịa hoạt động (protein kìm hãm) Operator lacO RNA polymerase (b) Có lactose X X Phiên mã dịch mã Phiên mã dịch mã Protein điều hòa hoạt động Enzymes Β-Galactosidase Protein điều hòa bất hoạt Permease Transacetylase Glucose Allolactose Β-Galactosidase Lactose Galactose Hình 8.4 Operon lactose hoạt động Điều hịa biến dưỡng: Kiểm soát âm-ức chế Biến dưỡng (anabolism) trình tổng hợp nên chất cần thiết cho tế bào Ví dụ tổng hợp amino acid Quá trình tổng hợp tryptophan tiền chất tryptophan chorismic acid, trải qua giai đoạn enzyme xúc tác Hệ thống tổng hợp amino acid tryptophan E coli ví dụ điển hình operon bị kìm hãm kiểm sốt âm 4.1 Cấu trúc hoạt động Hệ thống tryptophan có cấu trúc tương tự hệ thống lactose gồm gen điều hòa trpR operon tryptophan (promoter, operator gen cấu trúc) Các gen cấu trúc xác định enzyme xếp theo thứ tự tương ứng với chức xúc tác theo trình tự phản ứng chuỗi biến dưỡng tryptophan (Hình 8.5) (a) Nồng độ tryptophan thấp Gen điều hòa (trpR) PR RNA polymerase Operator Cấu gen cấu trúc 5’ UTR trpE trpD trpC trpB trpA Promoter X Phiên mã dịch mã Phiên mã dịch mã mRNA Protein điều hòa bất hoạt Enzymes Chorismate (trp repressor) Tryptophan Operator (b) Nồng độ tryptophan cao PR Phiên mã dịch mã Khơng phiên mã Protein điều hịa bất hoạt Hình 8.5 Operon tryptophan Sự khác với hệ thống lactose gen điều hòa Gen điều hòa hệ thống tryptophan tổng hợp thường xun aporepressor protein, chất kìm hãm mà riêng khơng có hoạt tính Khi tryptophan dư thừa trở thành chất corepressor (đồng kìm hãm) kết hợp với aporepressor thành phức hợp kìm hãm (holorepressor) có hoạt tính Phức hợp gắn vào operator operon tryptophan (trp) làm dừng phiên mã gen cấu trúc Khi nồng độ tryptophan thấp, tách khỏi phức hợp kìm hãm aporepressor hoạt tính Lúc operator lại mở RNA polymerase dịch mã gen cấu trúc để tổng hợp enzyme tạo tryptophan (Hình 8.5) Sự điều hòa kiểu gọi điều hòa ức chế ngược (retroinhibition) sản phẩm cuối có mối liên hệ ngược (feed-back) Như vậy, hoạt động hệ thống ngược lại với hệ thống lactose: có tryptophan operon bị đóng, thiếu tryptophan gen mở 4.2 Sự suy yếu (attenuation) Kiểu điều hòa thứ hai phát operon tryptophan gọi suy yếu Ở đầu 5’ mRNA đa gen (polycistronic) operon có enzyme Đoạn gọi trình tự leader (trình tự huy) Một phần trình tự phiên mã tạo leader peptide gồm 14 amino acid, mà chức đến chưa rõ Cơ chế kiểm tra mà tổng hợp mRNA bắt đầu kết thúc sớm với chiều dài mRNA ngắn gọi suy yếu Ví dụ: tế bào E coli tăng trưởng môi trường thiếu amino acid đó, chưa đủ enzyme cần có cho tổng hợp tất 20 amino acid cần thiết để tạo protein Khi thêm amino acid (tryptophan) vào môi trường làm giảm đáng kể tổng hợp enzyme cần cho tạo amino acid Phản ứng có tính thích ứng trì nguồn enzyme khơng cịn cần sản phẩm cuối chuỗi sinh tổng hợp (tryptophan) có tế bào (ức chế ngược) Operon tryptophan có phương thức điều hịa hoạt động gen thứ hai, hồn tồn độc lập với hệ thống repressor-operator (chất kìm hãm đoạn điều hành) Ở operon tryptophan, tổng hợp mRNA 161 base trước codon khởi trpE, enzyme cấu trúc phiên mã Đột biến đoạn DNA phía trước trpE, giải phóng trpE khỏi kìm hãm phức hợp represser-operator Các đột biến làm tăng mức độ biểu operon lên gấp sáu lần Tinh DNA phiên mã in vitro cho thấy phần lớn mRNA kết thúc base 139 không đạt tới trpE Ở đây, có kìm hãm phiên mã trước gen cấu trúc biểu gen có hiệu Đoạn dài mRNA nằm trước trpE gọi leader (trpL) đoạn kìm hãm phiên mã gọi attenuator (trpa, trpA) Cuối cùng, quan sát cho thấy suy yếu dao động theo nồng độ tryptophan thấp, nhiều phân tử mRNA tạo qua attenuator toàn operon phiên mã Sự suy yếu phương thức khác để kiểm soát biểu gen Ribosome phiên dịch nhanh mRNA tryptophan phong phú dẫn tới tạo thành cấu trúc stem-and-loop ức chế RNA polymerase kết thúc phiên mã Hình 8.6 Sự suy yếu xảy cấu trúc thứ cấp đặc biệt tạo thành mRNA mRNA trình bày từ trình tự leader operon trp Nếu tryptophan tế bào phong phú trình tự leader phiên dịch nhanh, mRNA tạo thành cấu trúc thân quai (stem-and-loop) hoạt động tín hiệu kết thúc phiên mã Cơ chế suy yếu thực kết hợp phiên mã dịch mã RNA polymerase bắt đầu phiên mã gen mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp cần thiết để tạo tryptophan Ví dụ: diện tryptophan nhanh chóng đạt tới điểm (trên RNA tổng hợp) gọi attenuator dừng phiên mã Attenuator có chức điểm kết thúc tryptophan diện Sự phiên mã dừng trình tự leader đạt attenuator Nếu có đủ trytophan tế bào, dịch mã codon thực hiện, phiên mã dịch mã thực hoàn chỉnh lúc RNA polymerase đạt tới điểm attenuator, nơi kết thúc phiên mã Khi khơng có trytophan, dịch mã dừng phần leader mRNA cuộn lại cho attenuator không thực chức năng, trường hợp tổng hợp mRNA toàn vẹn cho operon tryptophan tạo Với diện enzyme đó, trytophan tích lũy với số lượng lớn tế bào Attenuator dạng tinh tế ức chế, điều hòa hoạt động gen, tạo đặc hiệu cho tổng hợp amino acid tế bào Cơ chế repressor điều hịa thơ hệ thống tryptophan, hệ thống chế attenuation kiểm soát nồng độ tryptophan cách tinh tế Sự suy yếu operon Trp nhạy cảm với nồng độ số amino acid histidine leucine Kiểm soát dương cảm ứng Cơ chế điều hịa dương, cảm ứng tìm thấy operon arabinose E coli Arabinose chất đường, cần ba enzyme (được mã hóa gen araB, araA araD) cho biến dưỡng Hai gen khác nằm xa operon góp phần đưa arabinose vào tế bào Gen điều hòa araC nằm gần gen B, A D Sản phẩm gen araC protein kìm hãm operon khơng có đường arabinose Tuy nhiên, có đường arabinose tế bào, gắn với repressor (protein araC) hình thành nên phức hợp activator (hoạt tố) tạo thuận tiện cho phiên mã RNA polymerase Trên thực tế, nghiên cứu cho thấy chế điều hịa phức tạp Ví dụ: cAMP protein hoạt hóa thối dưỡng (catabolite gene activator protein) gọi CRP (cyclic AMP receptor protein-protein thể nhận cAMP) tham gia vào điều hòa hệ thống arabinose Hoạt tố L-Arabinose Gen ức chế (bên ngồi) araC mRNA Các vị trí điều chỉnh Các gen cấu trúc araC araO1 araO2 CAP araI araB araA araD Gen điều hòa araBAD mRNA L-arabinose isomerase Pemease system L-Arabinose L-Arabinose (bên ngoài) (bên trong) L-arabinose isomerase L-Ribulose L-arabinose isomerase L-Ribulose-5-P ATP D-Xylulose-5-P ADP Hình 8.7 Operon arabinose E coli IV Điều hịa hoạt tính eukaryote Các chế điều hịa eukaryote xảy 5-6 mức độ khác (xem mục II) Trong phần nhấn mạnh thêm số đặc điểm điều hòa hoạt động gen eukaryote: - Ở operon prokaryote, gen điều hòa promoter thường nằm gần nhau, eukaryote gen điều hịa nằm gần promoter chúng kiểm sốt - Các enhancer trình tự nằm phân tử với promoter có hàng trăm cặp base phía trước phía sau promoter mà chúng kích thích - Trình tự điều hịa 5’ phía trước có promoter eukaryote thường dài, có hàng chục kilobase (kb) - Có nhiều kiểu điều hịa dạng nhân tố có tác động từ xa (trans) protein Sự phiên mã kích thích tín hiệu khác Sự điều hòa hoạt động gen prokaryote phần lớn đáp ứng lại tín hiệu bên Các promoter Tương tự vi khuẩn, promoter eukaryote nằm phía trước điểm xuất phát mRNA có trình tự bảo tồn tiến hóa Hộp TATA, định hướng cho RNA polymerase bắt đầu phiên mã, nằm khoảng 30 basepair (bp) động vật có vú, 60-120 nấm men Hộp TATA hoạt động có hiệu với hai trình tự tương ứng phía trước khoảng 40 bp CCAAT 110 bp trình tự giàu GC Sự thay đổi hộp TATA làm giảm tốc độ phiên mã Hiệu tốc độ phiên mã đo thay đổi base promoter, thay đổi base ngồi hộp TATA trình tự phía trước khơng gây hiệu tốc độ phiên mã, thay đổi yếu tố nêu làm giảm đáng kể tốc độ phiên mã Khác với promoter prokaryote, promoter eukaryote khó đảm bảo nhận biết tín hiêu cách đầy đủ để RNA polymerase khởi phiên mã in vitro Hộp TATA trình tự phía trước phải nhận biết protein điều hòa, protein gắn với điểm định chúng hoạt hóa phiên mã Các enhancer Enhancer trình tự có tác động cis (liền kề), chúng tăng tốc độ phiên mã đáng kể từ promoter nằm phân tử DNA Tính độc đáo enhancer chỗ chúng có khả thực cách hiệu khoảng cách xa, có đến vài nghìn cặp base Ngồi ra, chúng có hoạt động chức hướng nào, dù phía trước hay phía sau promoter Xét góc độ đó, enhancer tương tự promoter Cụ thể, chúng tổ chức gồm dãy trình tự có tác động cis để nhận biết nhân tố tác động từ xa (trans) (Hình 8.8) Các protein nhân tố có tác động trans Một vài protein, nhận biết hộp CCAAT, xác định tế bào động vật có vú Các nhân tố phân biệt đơn vị phân tử CCAAT Các hộp GC nhận biết nhân tố phụ Các ví dụ tác động trans (trans-acting factor) tìm thấy nấm men động vật có vú Các nhân tố trans có đặc điểm chung gồm hai vùng cấu trúc chức chính: - Vùng gắn nhân tố trans vào DNA - Vùng tác động lên phiên mã Đồng thời nhân tố trans có bốn kiểu tác động như: - “ngón tay kẽm” (zinc-finger) - “xoắn-vịng-xoắn” (helix-turn-helix) - “xoắn-nút-xoắn” (helix-loop-helix) - “dây kéo leucine” (leucine-zipper) (Hình 8.9) Promoter Activators Gen DNA Enhancers Hộp TATA Các nhân tố phiên mã RNA polymerase RNA polymerase Phức hợp khởi đầu phiên mã Tổng hợp RNA Hình 8.8 Enhancer DNA eukaryote Đặc tính chung cấu trúc vừa kể chúng ln ln gắn lên trình tự cis dạng dimer (gồm hai dimer) Trình tự cis nhân tố trans thường có tương tác đặc hiệu liên kết yếu hình thành phân tử nhân tố trans với base trình tự cis Ví dụ, trường hợp tương tác hormone steroid với enhancer Nhiều protein có tác động trans tham gia vào tiến trình phát triển thể ruồi giấm, chúng có vai trị đặc biệt xác định xếp đoạn thân ruồi Như vậy, gen eukaryote hoạt hóa hai trình tự DNA có tác động cis promoter enhancer, chúng nhận biết nhân tố protein có tác động trans, nhân tố trans cho phép RNA polymerase khởi phiên mã đạt tốc độ phiên mã tối đa A Xoắn-nút-xoắn B Xoắn-vòng-xoắn Khung Cặp base đường-phosphate DNA COOH NH2 C Ngón tay kẽm D Dây kéo leucine Hình 8.9 Các kiểu tác động nhân tố trans Hormone Ví dụ rõ chất điều hòa nội hoạt tính gen hormone Đó chất tạo loạt tế bào có hiệu đến tế bào khác Các hormone thường vận chuyển đến phần thể tác động đến tế bào có receptor tương ứng Sự tương tác hormone với receptor gây tín hiệu tác động đến vùng đặc trưng DNA, gây hoạt hóa gen nhóm gen tương ứng Các hormone kích thích phiên mã chế sau: - Hormone làm cho DNA tách khỏi histone tạo điều kiện cho RNA polymerase bắt đầu phiên mã - Có thể làm chất cảm ứng (inducer) gây bất hoạt phân tử receptor - Có thể gắn trực tiếp với đoạn DNA đặc hiệu tạo thuận lợi cho việc gắn RNA polymerase protein nhân tố phiên mã (protein transcription factor) - Có thể hoạt hóa effector protein làm thành phức hợp gắn DNA kích thích gắn RNA polymerase - Có thể gắn với protein tạo phức hợp hoạt hóa kích thích gắn RNA polymerase Kiểm soát chất thường gặp nhân Một số nhóm phân tử diện nhiều tế bào eukaryote, histone, chất máy dịch mã, cấu phần màng… Vài chương trình khác thực để trì số lượng đủ lớn chúng tế bào Các chương trình gồm: - Sự phiên mã liên tục lặp lại tế bào - Sự lặp lại gen - Sự khuếch đại nhiễm sắc thể trình tự gen đặc hiệu 5.1 Sự phong phú Các gen mã hóa cho rRNA tRNA nghiên cứu kỹ Phản ứng lai đơn giản DNA-RNA cho thấy nhiễm sắc thể Xenopus có vùng tổ chức hạch nhân (nucleolus organizer) chứa 450 DNA mã hóa cho 18S 28S rRNA Ngược lại, nhân có 20.000 gen mã hóa cho 5S rRNA gen khơng nằm vùng tổ chức hạch nhân Các gen mã hóa cho histone có với nhiều lặp lại hàng trăm lần Sự phong phú gen nêu đảm bảo đủ số lượng cần thiết cho dịch mã phải tổng hợp hàng triệu phân tử protein vào lúc cần thiết 5.2 Sự khuếch đại gen Một ví dụ khuếch đại gen nhân chỗ phình (puff) nhiễm sắc thể khổng lồ hay đa sợi (polytene chromosome) tuyến nước bọt ruồi giấm Ở chỗ phình này, DNA nguyên nhiễm sắc (euchromatic) khuếch đại khoảng vài nghìn lần Trong nhân tế bào trứng Xenopus, có hàng trăm nhân nhiễm sắc thể (extrachromosome nucleoli) với kích thước khác nhau, nhân chứa vịng trịn rDNA kích thước khác nhau, mà vai trị đến chưa rõ Các DNA vòng tròn sản sinh nhiều rRNA mức hợp lý V Sự biệt hóa tế bào Các tế bào biệt hóa mang thơng tin giống Ở sinh vật bậc cao người, thể trưởng thành gồm nhiều loại tế bào khác Các tế bào bắt nguồn từ hợp tử ban đầu, qua q trình biệt hóa trở thành tế bào có chức khác Tuy nhiên, thực nghiệm xác định số lượng nhiễm sắc thể, số lượng DNA tỷ lệ (A+T)/(G+C) tế bào thuộc mô khác thể giống Sử dụng kỹ thuật lai DNA cho thấy DNA từ tế bào mô khác thể không bị biến đổi q trình biệt hóa, chúng tự hồi tính (renaturation) với Thí nghiệm ghép nhân tế bào ruột ếch vào tế bào trứng bị hỏng nhân (do chiếu tia tử ngoại) cho thấy 1% tế bào ghép nhân phát triển thành ếch trưởng thành Điều chứng tỏ tế bào ruột biệt hóa giữ nguyên vẹn thông tin di truyền để tạo ếch trưởng thành Tóm lại, số lượng DNA tế bào biệt hóa giống với hợp tử ban đầu chứa nguyên vẹn thông tin di truyền đủ để phát triển thành cá thể nguyên vẹn Các tế bào biệt hóa tổng hợp nhóm protein khác Để hiểu khác tế bào biệt hóa, cần xét nhiều vấn đề sau: - Thứ nhất, nhiều trình chung cho tất tế bào nên có nhiều protein giống Những protein gồm số lượng nhiều, dễ phân tích phần lớn protein cấu trúc thành tế bào nhiễm sắc thể; số protein bào quan (lưới nội sinh chất, máy Golgi, ribosome…) Nhiều protein có số lượng khơng nhiều enzyme khác nhau, tham gia vào phản ứng trung tâm trình trao đổi chất, diện tất kiểu tế bào - Thứ hai, số protein có số lượng phong phú số tế bào chuyên hóa mà việc phát chúng cần có thử nghiệm riêng Ví dụ, hemoglobin phát tế bào máu - Thứ ba, 2.000 loại protein có số lượng dồi so sánh kiểu tế bào biệt hóa vi sinh vật với điện di hai chiều polyacrylamide, số khác biệt đáng kể tìm thấy Dù so sánh hai dòng tế bào ni cấy (như dịng tế bào thần kinh) hay tế bào mô chuột (như gan phổi), đại đa số protein phát tổng hợp hai loại tế bào với tốc độ tổng hợp khác đến 10 5; có vài trăm protein diện với số lượng khác đáng kể hai kiểu tế bào Các nghiên cứu cho thấy tế bào eukaryote bậc cao tổng hợp từ 10.000-20.000 protein khác Phần lớn chúng có số lượng khó phát Nếu protein (minor protein) khác tế bào với mức độ tương tự protein dồi dào, số lượng nhỏ chúng đủ tạo nên nhiều khác biệt chun hóa lớn hình thái sinh lý tế bào Tế bào thay đổi biểu gen chúng đáp lại tín hiệu bên Phần lớn tế bào chuyên hóa sinh vật đa bào có khả thay đổi phương thức biểu gen để đáp lại tác động bên ngồi Ví dụ: tế bào bị tác động glucocorticoid hormone, tổng hợp số protein chuyên biệt tăng vọt (Hình 8.10) Glucocorticoid phóng thích bị đói bụng hay hoạt động mạnh báo hiệu cho gan tăng cường tạo glucose từ amino acid hay phân tử nhỏ khác Các protein, tạo enzyme cảm ứng tyrosine aminotransferase hỗ trợ biến tyrosine thành glucose Khi hormone khơng cịn nữa, tổng hợp protein giảm xuống mức bình thường Các loại tế bào khác phản ứng với glucocorticoid nhiều cách khác Ví dụ tế bào mỡ, tổng hợp tyrosine transferase giảm, số loại tế bào khác hồn tồn khơng có phản ứng với glucocorticoid Các ví dụ minh họa cho tính chất chung biệt hóa kiểu tế bào biệt hóa khác thường phản ứng lại tín hiệu bên nhiều cách khác Trên sở đó, kiểu tế bào biệt hóa có đặc tính ổn định thường xun Các tính chất phản ánh biểu lâu bền nhóm gen khác Glucocorticoid receptor diện glucocorticoid hormone Gen biểu mức độ thấp Glucocorticoid hormone gen gen gen gen gen gen Gen biểu mức độ cao Hình 8.10 Tác dụng glucocortcoid làm tăng mức độ biểu gen Như vậy, tế bào biệt hóa sử dụng phần thông tin Nhiều loại tế bào chuyên hóa tổng hợp chủ yếu số protein, protein cấu trúc protein sử dụng cho q trình sinh lý bình thường Ví dụ: tế bào tổng hợp nhiều myosin, protein quan trọng co cơ, hay tế bào biểu bì (epithelial) tổng hợp nhiều keratine Như vậy, chứa thông tin di truyền giống nhau, loại tế bào biệt hóa sử dụng phần thơng tin: tổng hợp chủ yếu số loại protein Sự điều hòa mức phiên mã nguồn gốc sai khác tế bào biệt hóa Nếu biệt hóa kiểu tế bào khác phụ thuộc vào gen chuyên biệt mà tế bào biểu hiện, kiểm sốt biểu gen thực mức độ nào? Giả thuyết chấp nhận tế bào biệt hóa số gen phiên mã, cịn có gen khác khơng Khơng có kiện mâu thuẫn với giả thuyết giải thích hợp lý tình trạng biệt hóa tế bào Đối với phần lớn gen, kiểm sốt phiên mã có tầm quan trọng hàng đầu, đảm bảo cho tổng hợp khơng dư thừa chất trung gian Việc phát gen điều hịa gen đóng hay mở giúp hiểu điều hịa q trình phát triển cá thể biệt hóa tế bào Genome đơn bội tế bào người có số lượng DNA nhiều gấp 1.000 lần so với genome vi khuẩn Tuy nhiên, số lượng gen cấu trúc người lớn 10 lần số gen cấu trúc vi khuẩn Điều cho thấy nhiều gen người tham gia vào chế điều hịa Tóm lại, genome tế bào chứa trình tự nucleotide DNA thơng tin để tạo hàng nghìn protein phân tử RNA khác Tế bào biểu điển hình nhóm gen kiểu tế bào biệt hóa khác sinh vật đa bào sản sinh nhóm gen khác có biểu không giống Hơn nữa, tế bào thay đổi phương thức biểu gen chúng để đáp lại thay đổi mơi trường, tín hiệu từ tế bào khác Mặc dù tất bước biểu gen điều hòa, phần lớn gen việc khởi phiên mã điểm kiểm soát quan trọng