khảo sát sự hình thành protease và mk7 của bacillus subtilis natto trong môi trường nuôi cấy chứa đậu tương

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY DUNG MÃ SINH VIÊN: 1101085 KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH PROTEASE VÀ MK-7 CỦA Bacillus subtilis natto TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỨA ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY DUNG MÃ SINH VIÊN: 1101085 KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH PROTEASE VÀ MK-7 CỦA Bacillus subtilis natto TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỨA ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ds Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo Ds Lê Ngọc Khánh - Giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn thực khóa luận Đồng thời, xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ts Đàm Thanh Xuân, Ths Nguyễn Khắc Tiệp, cho nhiều ý kiến đóng góp quý báu giúp đỡ suốt trình thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện giúp đỡ thực khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dìu dắt, dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình tất người thân, bạn bè động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2016 Sinh viên Lê Thị Thùy Dung MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto chế phẩm Natto 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 1.1.2 Chế phẩm natto tác dụng 1.2 Protease Nattokinase 1.2.1 Protease 1.2.2 Nattokinase .6 1.2.3 Các nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh enzym protease B subtilis natto 1.3 Vitamin K2 MK-7 1.3.1 Nguồn gốc .8 1.3.2 Sơ lược Vitamin K .8 1.3.3 Vitamin K2 MK-7 1.3.4 Cấu trúc MK-7 1.3.5 Tính chất vật lý, hóa học 1.3.6 Tác dụng chế tác dụng 10 1.3.7 Các nghiên cứu định tính, định lượng sản xuất MK-7 .12 1.3.8 Các chế phẩm chứa MK-7 thị trường 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu thiết bị sử dụng 15 2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 15 2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 15 2.1.3 Môi trường 15 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu .17 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung đậu tương tới khả sinh protease Bacillus subtilis natto……………………………………………….…… 17 2.2.2 Sơ định tính MK-7 dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi trường canh thang chứa đậu tương ……………… ……………… … 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu .17 2.3.1 Phương pháp giữ giống nuôi cấy Bacillus subtilis natto .17 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính enzym protease .18 2.3.3 Phương pháp chiết MK-7 từ dịch lên men .18 2.3.4 Phương pháp chiết MK-7 từ chế phẩm Natto 18 2.3.5 Phương pháp sắc kí lớp mỏng định tính MK-7 19 2.4 Một số công thức sử dụng kết thực nghiệm 19 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ .21 3.1 Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung đậu tương tới khả sinh protease Bacillus subtilis natto .21 3.1.1 Khảo sát nguồn nguyên liệu đậu tương dạng hạt dạng bột tới hoạt tính enzym protease 21 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ đậu tương tới khả sinh enzym Proteae Bacillus subtilis natto 23 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian thu sản phẩm tới nồng độ enzym protease 25 3.2 Sơ định tính MK-7 dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi trường canh thang chứa đậu tương 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AND Acid deoxyribo nucleic Atm Atmosphe B subtilis natto Bacillus subtilis natto Da, kDa Dalton, kilo Dalton FU Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả phân giải fibrin chất nghiên cứu) Gla Axit γ-carboxyglutamic HPLC High-performance liquid chromatography mmHg Milimet thủy ngân MK-7 Menaquinone NCBI National center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học) pI Điểm đẳng điện TLC Thin layer chromatography TLPT Trọng lượng phân tử t – PA Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen mô) v/v Thể tích/Thể tích VSV Vi sinh vật w/v Khối lượng/Thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 15 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng .16 Bảng 3.1: Đường kính vòng phân giải casein dịch lên men B subtilis natto với đậu tương dạng hạt dạng bột 22 Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein dịch lên men bổ sung hạt đậu tương nồng độ 24 Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải casein dịch lên men thời điểm 26 Bảng 3.4: Kết định tính MK-7 dịch lên men chế phẩm Natto .29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis natto Hình 1.2: Công thức cấu tạo menaquinone – Hình 1.3: Cơ chế tác động MK-7 .11 Hình 1.4: Vipteen – Công ty CPDP Vinh Gia 14 Hình 1.5: Vững cốt Vinh Gia – Công ty CPDP Vinh Gia 14 Hình 2.1: Bản mỏng sắc kí 19 Hình 3.1: Đường kính vòng phân giải casein dịch lên men B subtilis natto với đậu tương dạng hạt dạng bột 22 Hình 3.2: Đường kính vòng phân giải casein dịch lên men nuôi cấy B subtilis natto môi trường canh thang có hạt đậu tương 24 Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải casein sau khoảng thời gian nuôi cấy B subtilis natto môi trường có đậu tương 26 Hình 3.4: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 3) 29 Hình 3.5: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 3) .29 Hình 3.6: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 2) 30 Hình 3.7: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 2) .30 ĐẶT VẤN ĐỀ Bacillus subtilis natto phân loại loài thuộc loài Bacillus subtilis, tìm thấy năm 1905 Kể từ đó, ứng dụng sản xuất thuốc thú y, thực phẩm chức năng, thức ăn tốt cho sức khỏe B subtilis natto giúp lên men sản phẩm từ đậu tương, Natto Nhật, Kinema Nepal Thuanao Thái Lan Natto ăn truyền thống Nhật, mang nhiều lợi ích cho sức khỏe, quan tâm nghiên cứu Người ta tìm thấy Natto có chứa lượng lớn Nattokinase, protease có khả tiêu fibrin mạnh, dùng đường uống để phòng bệnh huyết khối Một chất khác có giá trị phát muộn MK-7 MK-7 thuộc nhóm Vitamin K, có tác dụng phòng ngừa loãng xương, giúp xương khỏe, đồng thời phòng ngừa số bệnh tim mạch Nattokinase MK-7 khẳng định tác dụng sử dụng ngày rộng rãi giới Hiện Nattokinase sản xuất phương pháp tái tổ hợp lên men mẻ, khai thác từ Natto MK-7 sản xuất chủ yếu trình lên men lỏng sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis Các sản phẩm Nattokinase MK-7 nhiều công ty dược phẩm nghiên cứu sản xuất Tuy nhiên Việt Nam, có công ty sản xuất sản phẩm Nattokiase, protease hay MK-7, chủ yếu sử dụng sản phẩm ngoại nhập với giá thành cao Dạng thực phẩm truyền thống Nhật Bản nhập không dùng phổ biến nặng mùi, nhớt, khó ăn, không phù hợp với vị người Việt Nam Bởi vậy, vấn đề cần thiết đặt là, cần phải nghiên cứu phương pháp sản xuất để chủ động cung cấp sản phẩm protease MK-7 B subtilis natto có khả phát triển tốt đậu tương nấu chín, nhiều công ty sử dụng đậu tương làm nguồn dinh dưỡng lên men sản xuất protease, Nattokinase MK-7 Với lợi nguồn đậu tương sẵn có nước, việc lựa chọn nghiên cứu môi trường lên men B subtilis natto chứa đậu tương hướng đầy tiềm Do khóa luận “Khảo sát hình thành protease MK-7 Bacillus subtilis natto môi trường nuôi cấy chứa đậu tương” thực với hai mục tiêu:  Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung đậu tương tới khả sinh protease Bacillus subtilis natto  Sơ định tính MK-7 dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi trường canh thang chứa đậu tương 26 - Nuôi cấy giống B subtilis natto theo phương pháp nêu mục 2.3.1.b.; - Lên men B subtilis natto theo phương pháp nêu mục 2.3.1.c Môi trường lên men MT3 với nồng độ đậu tương %; - Thu dịch lên men sau khoảng thời gian ngày, ngày, ngày; - Thử so sánh hoạt tính protease theo phương pháp nêu mục 2.3.2.; - Thí nghiệm lặp lại lần;  Kết quả: Kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải casein dịch lên men thời điểm Thời gian (ngày) Dcasein 1,863 1,956 1,843 ∆p 0% 4,99% -1,07% Trong đó: Dcasein (cm) đường kính vòng phân giải casein ∆p độ chênh lệch đường kính vòng phân giải (%) thời điểm so Đường kính vòng phân giải (cm) với thời điểm ngày 2,5 1,863 1,956 1,844 1,5 0,5 Ngày Ngày Ngày Thời gian (ngày) Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải casein sau khoảng thời gian nuôi cấy B subtilis natto môi trường có đậu tương 27 Từ đồ thị thấy hoạt độ enzym protease ngày thứ ba cao nhất, so với ngày thứ tăng 4,99%, ngày thứ sáu thấp nhất, so với ngày thứ giảm 1,07%  Bàn luận: Ngày thứ cho kết hoạt độ protease cao Điều thấy rõ biểu đồ qua kết phân tích Kết khác với kết số nghiên cứu trước Năm 2007, Peddapalli Siva Rasagnyal cộng khảo sát thời gian thu sản phẩm lên men B subtilis natto NCIM 2724 thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 kết luận rằng, thời điểm 24 cho hoạt tính nattokinase cao Trong nghiên cứu Lê Thị Bích Phượng, thời gian ghi nhận thu sản phẩm có hoạt tính protease cao 40 với phương pháp lên men bề mặt bán rắn, nguồn nguyên liệu đậu tương Nguyễn Thùy Dương năm 2013 khảo sát thời gian thu protease lên men B subtilis natto môi trường canh thang, thấy thời điểm hoạt tính protease cao 48 (so với 24 72 giờ), nhiên, chênh lệch thời điểm không đáng kể Lê Thị Hồng Liên năm 2014 so sánh thời điểm 24 giờ, 48 72 giờ, với môi trường canh thang bổ sung sữa đậu tương bột đậu, kết thu 48 hoạt tính protease thu lớn Sự khác kết nghiên cứu nhiều yếu tố Những yếu tố vi sinh vật, môi trường lên men khác Các yếu tố khác nguồn nguyên liệu, tiêu chuẩn thao tác, điều kiện môi trường thí nghiệm, thiết bị thí nghiệm, người thực thí nghiệm… ảnh hưởng tới kết Nghiên cứu Lê Thị Hồng Liên, thực trường Đại học Dược Hà Nội, sử dụng môi trường lên men môi trường canh thang bổ sung đậu tương, nhiên, Lê Thị Hồng Liên sử dụng nồng độ đậu bổ sung 3%, thấp nồng độ nghiên cứu – 5%, giống vi sinh vật sử dụng hai nghiên cứu không nguồn gốc Quy mô hai nghiên cứu nhỏ, kết đưa sử dụng để tham khảo, định hướng, chưa thể từ khẳng định Các thời điểm thu sản phẩm nghiên cứu xa chưa cách đều, chưa thể lập đồ thị chi tiết thể mối quan hệ thời gian lên men hoạt độ protease Như vậy, yếu tố thời gian lên men cần nghiên cứu kĩ lưỡng 28 Một thí nghiệm với thời điểm lấy mẫu gần giúp xác định rõ ràng khoảng thời gian hợp lí để thu protease Qua nghiên cứu kết luận sơ thời điểm thu sản phẩm để có hoạt độ protease cao ba ngày Kết luận sử dụng để định hướng cho nghiên cứu Sơ định tính MK-7 dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi 3.2 trường canh thang chứa đậu tương Sản phẩm Natto chứng minh có chứa hàm lượng MK-7 cao so với nguồn thực phẩm khác Môi trường lên men nghiên cứu sử dụng đậu tương, nguyên liệu sản phẩm Natto, dự đoán môi trường phù hợp cho B subtilis natto sinh tổng hợp MK-7 Tuy nhiên, để khẳng định lên men B subtilis natto phương pháp lên men lỏng bổ sung đậu tương có sinh MK-7 hay không, phép định tính thực dịch lên men B subtilis natto môi trường canh thang có hạt đậu  Mục tiêu: Định tính MK-7 dịch lên men nuôi cấy Bacillus subtilis natto với môi trường canh thang bổ sung đậu tươngvà sản phẩm Natto So sánh kết định tính  Tiến hành: Chiết MK-7 từ môi trường lên men chế phẩm Natto  Đối với môi trường lên men bổ sung đậu tương: - Nuôi cấy giống B subtilis natto theo phương pháp nêu mục 2.3.1.b.; - Lên men theo phương pháp nêu mục 2.3.1.c Nguồn nguyên liệu đậu tương lựa chọn dạng hạt, nồng độ đậu tương bổ sung 10%; - Sau lên men, thu dịch chiết theo phương pháp nêu mục 2.3.3.;  Đối với chế phẩm natto thị trường: - Chiết MK-7 từ chế phẩm Natto theo phương pháp nêu mục 2.3.4 Một hộp Natto 40g khuấy với 50 ml nước ấm; Tiến hành định tính sắc kí lớp mỏng - Tiến hành định tính theo phương pháp nêu mục 2.3.5.; 29 - Bản mỏng TLC silica gel 60 F254; - Hệ dung môi n-hexan: CH2Cl2 (1:1, v/v); - Pha động: n-hexan: dicloromethan (1:1, v/v); - Với mẫu thử, tiến hành định tính lần lấy kết trung bình  Kết Kết định tính MK-7 phương pháp sắc kí lớp mỏng cho bảng sau: Bảng 3.4: Kết định tính MK-7 dịch lên men chế phẩm Natto Lần TN MT hạt đậu 10% Natto Lần Rf1 = 0,49, Rf2 = 0,59 Rf1 = 0,50; Rf2 = 0,59 Lần Rf1 = 0,46, Rf2 = 0,81 Rf1 = 0,49, Rf2 = 0,69 Lần Rf = 0,57 (chỉ thu vết) Rf = 0,56 (chỉ thu vết) Hình 3.4: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 3) Hình 3.5: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 3) 30 Hình 3.6: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 2) Hình 3.7: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 2)  Phân tích kết quả: Kết lần đo chưa ổn định Do đó, số liệu không tính kết trung bình mà báo cáo cụ thể, nhằm đưa số liệu khách quan Nhưng thấy liên quan định lần thí nghiệm hai mẫu thử, natto Nhật Bản môi trường lên men bổ sung đậu tương Theo nghiên cứu công bố, sử dụng pha động n- hexan: dicloromethan (1:1, v/v), MK-7 cho vết sắc kí có Rf = 0,4 Tham khảo giá trị phân tích kết quả, ta thấy: xếp giá trị Rf = 0,46; Rf = 0,49; Rf = 0,50 xếp thành nhóm, Rf = 0,56; Rf = 0,57; Rf = 0,59 xếp thành nhóm, đưa giả thiết rằng, giá trị Rf hai chất, tồn sản phẩm natto Nhật Bản môi trường lên men bổ sung đậu tương  Bàn luận Mục đích thí nghiệm nhằm khảo sát hình thành MK-7 nuôi cấy B subtillis môi trường bổ sung đậu tương Bước tiến hành 31 định tính MK-7 dịch lên men phương pháp sắc kí lớp mỏng Việc chiết định tính MK-7 từ sản phẩm Natto Nhật Bản tiến hành song song để so sánh Tuy nhiên chưa có MK-7 chuẩn, chưa thể kết luận vi khuẩn B subtillis điều kiện nuôi cấy đưa ra, chế phẩm Natto có sinh MK-7 hay không Phân tích kết đưa vài giả thiết:  Có thể điều kiện nuôi cấy nghiên cứu đưa không phù hợp để B subtillis sinh tổng hợp MK-7, sinh với nồng độ nhỏ, lượng dịch chiết dùng để cô cạn chấm sắc kí ít, chưa thể thu vết MK-7 mỏng  Sự khác kết lần thí nghiệm sai khác lần thực thí nghiệm, ví dụ: nồng độ chất dinh dưỡng, tốc độ lắc, cường độ lắc chiết, mức độ cô cạn… Việc thực hoàn toàn giống trình thí nghiệm thực khó khăn  Các đơn vị đóng gói Natto khác cho kết định tính khác nhau, lô mẻ sản phẩm không đồng chất lượng, thời hạn bảo quản, điều kiện bảo quản sản phẩm khác  Đối với hai chất giả định tồn Natto môi trường lên men (có Rf = 0,49 Rf = 0,57), chưa đủ để xác định chất gì, khẳng định MK-7 Tuy nhiên, sơ thấy rằng, việc lên men B subtillis môi trường bổ sung đậu tương sản sinh số chất tương tự Natto Như vậy, bước đầu với mục tiêu định tính MK-7 gặp nhiều vấn đề, khó khăn Một điều trở ngại lớn không tìm MK-7 để làm mẫu chuẩn phép định tính, dẫn tới chưa thể kết luận chắn Trên giới, nay, để định tính MK-7, người ta dùng phương pháp sắc kí lớp mỏng, phương pháp sử dụng phổ biến sắc kí lỏng hiệu cao Phương pháp dùng để định tính lẫn định lượng MK-7, nghiên cứu khảo sát hàm lượng MK-7 thực phẩm, nghiên cứu phương pháp lên men sản xuất MK-7, hay đo nồng độ MK-7 huyết tương 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: Qua trình thực nghiệm, khóa luận thu kết sau đây: Khảo sát hình thành protease môi trường lên men bổ sung đậu tương:  Không có khác biệt hai nguồn nguyên liệu đậu tương dạng hạt đậu tương dạng bột tới hình thành protease  Nồng độ cho hoạt độ protease cao 5% có xu hướng giảm dần tăng nồng độ đậu Các nồng độ đậu 10%, 15%, 20% cho hoạt độ protease thấp nồng đô 5% với tỉ lệ 5,43%, 5,43%, 7,92%  Thời gian lên men cho hoạt độ protease cao ba ngày, thấp ngày Hoạt độ protease ngày thứ ba so với ngày thứ cao 4,99% Khảo sát hình thành MK-7 môi trường lên men bổ sung đậu tương:  Định tính MK-7 dịch lên men từ môi trường bổ sung đậu tương chế phẩm Natto cho kết chưa ổn định Chưa thể kết luận dịch lên men chế phẩm Natto thị trường có MK-7 hay không  So sánh kết định tính từ dịch lên men chế phẩm natto tìm số vết tương đồng Tuy nhiên chưa thể khẳng định chất Đề xuất:  Đối với protease:  Khảo sát việc bổ sung đậu tương với khoảng chênh lệch nồng độ bé hơn, xung quanh khoảng 5% để tìm nồng độ thích hợp cho việc sinh tổng hợp protease  Tại nồng độ thích hợp, khảo sát thời điểm thu sản phẩm với khoảng cách thời gian ngắn hơn, nhằm tìm thời điểm thu lượng enzym lớn  Thử nghiệm lên men phương pháp lên men bề mặt bán rắn, nguồn nguyên liệu đậu tương so với lên men lỏng 33  Đối với MK-7:  Tìm kiếm nguồn cung cấp MK-7 để làm mẫu chuẩn phép định tính  Định tính MK-7 số phương pháp khác sắc kí lòng hiệu cao HPLC, phổ hồng ngoại IR, phương pháp khối phổ  Định tính định lượng MK-7 chế phẩm bán thị trường  Nghiên cứu thành phần môi trường lên men phù hợp, khảo sát điều kiện lên men để tăng sinh tổng hợp MK-7 Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu thức MK-7 công bố, kể từ nhà khoa học, hay từ công ty sản xuất sản phẩm chứa MK-7 Công ty cổ phần Vinh Gia Bởi vậy, việc nghiên cứu môi trường lên men, phương pháp chiết, tinh MK-7 thực cần thiết Với lợi ích mà MK-7 mang lại, mong có thêm nhiều đơn vị quan tâm, phát triển sản phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đinh Thu Hương (2013), "Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chiết enzym protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto ", Luận văn Thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội Lê Thị Bích Phượng (2012), "Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase", Tạp chí sinh học, 34(SE3), trang 99 – 104 Nguyễn Văn Rư (2002), "Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng", Luận án tiến sĩ dược học, trang 3-5, 33-36 Tài liệu Tiếng Anh Allergy Research Group (2008), "Nattokinase: Clinical updates from doctors support its safety and efficacy", Allergy Research Group Focus Newsletter, pp 1-7 Asakura H, Myou S, Ontachi Y (2001), "Vitamin K administration to elderly patients with osteoporosis induces no hemostatic activation, even in those with suspected vitamin K deficiency", Osteoporos Int 12, pp 996-1000 Aydin Berenjian et al (2011), "Efficient media for high menaquinone-7 production: response surface methodology approach", New Biotechnology, 28(6), pp 665-672 Berenjian A., Mahanama R (2011), "Extraction of Menaquinone-7 for supplementation of food", Barton, A.C.T.: Engineers Australia, 2011, pp 1616-1625 Bhat et al (2013), "Bacillus subtilis natto: a non-toxic source of poly-γ-glutamic acid that could be used as a cryoprotectant for probiotic bacteria", AMB Express, 3, pp 36-36 Deepak V (2008), "Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology", Bioresource Technology 99, pp 8170 – 8174 10 Dehghani et al (2014), "Fermentation and in situ extraction of menaquinones during microbial culture", WO2014131084 A1 11 Delmas PD (1993), "Biochemical markers of bone turnover Theoretical considerations and clinical use in osteoporosis", Am J Med 95(5A), pp 11-16 12 Dos Santos, Leandro Freire et al (2013), "Characterization and optimization of levan production by Bacillus subtilis Natto", Romanian Biotechnological Letters, 18(4), pp 8413-8422 13 Dubey R (2011), "Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources", African Journal of Biotechnology, 10(8), pp 1408 – 1420 14 Fleming (2004), Evaluating bacterial cell immobilization matrice for use in a biosensor, Master of science thesis (Virginia Polytechnic Institute and State University), pp – 10 15 Fujita M et al (1995), "Transport of nattokinase across the rat intestinal tract", Biol Pharm Bull., 18(9), pp 1194-1196 16 Gast G.C.M., De Roos N.M., Sluijs I et al (2009), "A high menaquinone intake reduces the incidence of coronary heart disease", Nutr Metab Cardiovas, 19, pp 504510 17 Geleijnse J.M., Vermeer C., Grobbee D.E., et al (2004), "Dietary intake of menaquinone is associated with a reduced risk of coronary heart disease: the Rotterdam Study", J Nutr, 134, pp 3100–3105 18 Gupta R., Beg Q.K (2002), "Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications", Applied Microbiology and Biotechnology, 59, pp 15 – 32 19 Hamidi M.S., Cheung A M (2014), "Vitamin K and musculoskeletal health in postmenopausal women", Mol Nutr Food Res, 58(8), pp 1647-1657 20 Henrik Dam (1935), "The Antihæmorrhagic Vitamin of the Chick.: Occurrence And Chemical Nature", Nature, 135 (3417), pp 652–653 21 Hiroyuki Sumi, Misako Yoshkawa (1999), "Elastase activity in Natto, and its relation to nattokinase", Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), pp 1187 – 1190 22 Ikeda Y, Iki M, Morita A, et al (2006), "Intake of fermented soybeans, natto, is associated with reduced bone loss in postmenopausal women: Japanese PopulationBased Osteoporosis (JPOS) Study", J Nutr, 136, pp 1323 – 1328 23 Iwamoto I, Kosha S, Noguchi S-i (1999), "A longitudinal study of the effect of vitamin K2 on bone mineral density in postmenopausal women a comparative study with vitamin D3 and estrogen-progestin therapy", Maturitas, 31, pp 161-164 24 Johanna M Geleijnse (2004), "Dietary Intake of Menaquinone Is Associated with a Reduced Risk of Coronary Heart Disease: The Rotterdam Study", The journal of nutrition, pp 3100 – 3105 25 Junguo Liua et al (2005), "Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods", Process Biochemistry 40(8), pp 2757–2762 26 Kaneki M., Hosoi T., Ouchi Y., et al (2006), "Pleiotropic actions of vitamin K: protector of bone health and beyond?", Nutr, 22, pp 845-852 27 Kato, Keitaro et al (2003), "Barley and yam Natto", United States Patent(US 6669971B1) 28 Katsuyama H, Ideguchi S, Fukunaga M, et al (2002), "Usual dietary intake of fermented soybeans (Natto) is associated with bone mineral density in premenopausal women", J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 48, pp 207 –215 29 Lide D.R (2008), CRC handbook of chemistry and physics : a ready-reference book of chemical and physical data, 88, Boca Raton, FL : Chemical Rubber Publishing, pp 323-324 30 Luo G et al (1997), "Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein", Nature, 386, pp 78 – 81 31 M Fujita (1993), "Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan", Biochemical and Biophysical research communication, pp 1340 – 1347 32 Maryadele J O'Neil (2006), The Merck Index - An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals Whitehouse Station, 14, Whitehouse Station, N.J : Merck., pp 1008 33 Meruvu Haritha (2011), "Nattokinase: “A Review on Fibronilytic Enzyme", International Journal of Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1), pp 61 – 66 34 Miki T et al (2003), "Vitamin K2 (menaquinone 4) reduces serum undercarboxylated osteocalcin level as early as weeks in elderly women with established osteoporosis", J Bone Miner Metab 21, pp 161- 165 35 Milner M (2002), "Natto and its active ingredient nattokinase: a potent and safe thrombolytic agent", Alternative & complementary therapies, 8(3), pp 157 – 164 36 Muramatsu K., Yamawake K (2000), "Purification and crystallization of a new Bacillus subtilis elastase", Journal of Home Economics of Japan, 51(12), pp 1127 – 1135 37 Novotny JA, Kurilich AC, Britz SJ, et al (2010), "Vitamin K absorption and kinetics in human subjects after consumption of 13 C-labelled phylloquinone from kale", Br J Nutr, 104, pp 858 –862 38 Nowicka B., Kruk J (2010), "Occurrence, biosynthesis and function of isoprenoid quinones", Biochim Biophys Acta, 1797, pp 1587-1605 39 Osol A , Hoover J.E (1975), Remington's Pharmaceutical Science, 15, Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Co, pp 942 40 Pieczenik S., Neustadt J (2008), "Osteoporosis: Beyond Bone Mineral Density", Integrative Medicine, 7(6), pp 44-47 41 Plaza SM, Lamson DW (2005), "Vitamin K2 in bone metabolism and osteoporosis", Altern Med Rev, 10(1), pp 24-35 42 Putra S.R et al (2001), "Zeaxanthin and menaquinone-7 biosynthesis in Sphingobacterium multivorum via the methylerythritol phosphate pathway", FEMS Microbiol Lett, 204(2), pp 347-353 43 Raja Mahanama, et al (2011), "Effects of Inoculation Loading and Substrate Bed Thickness on the Production of Menaquinone via Solid State Fermentation ", Proceedings of the World Congress on Engineering and Computer Science, II, pp 694-697 44 Rishavy MA, Berkner KL (2012), "Vitamin K oxygenation, glutamate carboxylation, and processivity: defining the three critical facets of catalysis by the vitamin K-dependent carboxylase", Adv Nutr, 3, pp 135–148 45 Rong L.H (2011), "The optimization, extraction and purification of Nattokinase and genetic cloning", Master’s thesis, Hebei Union University (China) 46 Sato T, Schurgers LJ, Uenishi K (2012), "Comparison of menaquinone-4 and menaquinone-7 bioavailability in healthy women", Nutr J, 11, pp 93 47 Schoepp-Cothenet B et al (2009), "Menaquinone as pool quinone in a purple bacterium", Proc Natl Acad Sci U S A, 106(21), pp 8549-8554 48 Schurgers, Cees Vermeer (2000), "Determination of phylloquinone and menaquinones in food Effect of food matrix on circulating vitamin K concentrations", Haemostasis, 30(6), pp 298-307 49 Schurgers LJ, Teunissen KJ, Hamulyak K, et al (2007), "Vitamin K-containing dietary supplements: comparison of synthetic vitamin K1 and natto-derived menaquinone-7", Blood, 109, pp 3279 –3283 50 Schurgers LJ, Vermeer C (2000), "Determination of phylloquinone and menaquinones in food: effect of food matrix on circulating vitamin K concentrations", Haemostasis, 30, pp 298–307 51 Shearer M J (1995), "Vitamin K", Lance, 345, pp 229 –234 52 Shearer MJ, Bach A, Kohlmeier M (1996), "Chemistry, nutritional sources, tissue distribution and metabolism of vitamin K with special reference to bone health", J Nutr, 126 (4), pp 1181S–1186S 53 Steinlraus K (2004), Industrialization of indigenous fermented foods, Marcel Dekker Inc publicsher, pp 227-230 54 Sugimoto S., Fujii T., Morimiya T (2007), Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, pp 2184 55 Sumi H., Hamada H (1987), Experientia, 43, pp 1110 56 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K (1990), Acta Haematologica, 84, pp 139 57 Sumi H , Nakajima N , YatagaiC (1995), Biochemistry & Molecular Biology, 1, pp 543 58 Taku K et al (2011), "Soy isoflavones for osteoporosis: an evidence-based approach", Maturitas, 70(4), pp 333-338 59 Đỗ Thị Bích Thủy, Salil Kumar Bose (2011), "Characterization of multiple extracellular protease produced by a Bacillus subtilis strain and identification of the strain", International Journal of Biology, 3(1), pp 101 – 110 60 Tokudome S., Omura K (2005), "A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects", Journal of Pharmacological Siences, 99, pp 247 – 251 61 Ushiroyama T, Ikeda A, Ueki M (2002), "Effect of continuous combined therapy with vitamin K(2) and vitamin D(3) on bone mineral density and coagulofibrinolysis function in postmenopausal women", Maturitas, 41, pp 211-221 62 Vermeer C., Braam L (2001), " Role of K vitamins in the regulation of tissue calcification", J Bone Miner Metab, 19, pp 201–206 63 Wang C., Du Ming (2009), "Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B -12", Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, pp 9722 – 9729 64 William Shurtleff, Akiko Aoyagi (2012), History of natto and Its Relatives, Soyinfo Center Trang web 65 http://vietsciences.free.fr/ 66 https://merops.sanger.ac.uk/ 67 http://www.webmd.com/vitamins-supplements/ingredientmono-1084NATTOKINASE.aspx?activeIngredientId=1084&activeIngredientName=NATTO KINASE&source=2 68 http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Menaquinone_7#section=Top 69 http://www.vedan.com/english/products/pro01_012.html 70 http://www.moh.gov.vn/news/pages/tincanbiet.aspx?ItemID=38 [...]... 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto - So sánh ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đậu tương dạng nguyên hạt và dạng bột tới khả năng sinh enzym protease - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đậu tương tới khả năng sinh enzym Proteae của Bacillus subtilis natto - Khảo sát thời gian thu enzym protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong các môi trường. .. được dự đoán là môi trường phù hợp cho B subtilis natto sinh tổng hợp MK-7 Tuy nhiên, để khẳng định lên men B subtilis natto bằng phương pháp lên men lỏng bổ sung đậu tương có sinh ra MK-7 hay không, phép định tính được thực hiện trên dịch lên men B subtilis natto trong môi trường canh thang có hạt đậu  Mục tiêu: Định tính MK-7 trong dịch lên men nuôi cấy Bacillus subtilis natto với môi trường canh thang... trường canh thang có bổ sung đậu tương 2.2.2 Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi trường canh thang chứa đậu tương - Định tính MK-7 bằng phương pháp sắc kí mỏng trong dịch lên men từ các môi trường có sử dụng nguyên liệu đậu tương dạng hạt - Định tính MK-7 trong chế phẩm Natto - So sánh kết quả định tính MK-7 trong dịch lên men và chế phẩm Natto 2.3 Phương pháp nghiên... pepton đậu tương 8,28 %, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300U/ml [25] Năm 2008, Deepak và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Hoạt tính Nattokinase đạt 3.194 U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [9] LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất Nattokinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto. .. trường canh thang bổ sung đậu tươngvà trong sản phẩm Natto So sánh kết quả định tính  Tiến hành: 1 Chiết MK-7 từ môi trường lên men và chế phẩm Natto  Đối với môi trường lên men bổ sung đậu tương: - Nuôi cấy giống B subtilis natto theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1.b.; - Lên men theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1.c Nguồn nguyên liệu đậu tương được lựa chọn là dạng hạt, nồng độ đậu tương bổ sung là 10%; -... khuẩn B subtilis natto Như vậy đậu tương sẽ là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho B subtilis natto để sinh tổng hợp protease Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease của B subtilis natto theo một số thông số: dạng nguyên liệu, nồng độ nguyên liệu bổ sung, thời gian thu sản phẩm, cuối cùng, so sánh nồng độ enzym protease thu được từ môi trường. .. 1.697 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 % Đậu tương 5% 10% 15% 20% Hình 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men nuôi cấy B subtilis natto trong môi trường canh thang có hạt đậu tương 25 Quan sát đồ thị ta thấy, hoạt tính protease tại nồng độ 5% là cao nhất, và có xu hướng giảm dần theo chiều tăng của nồng độ Hoạt tính enzym protease tại 10% và 15% gần như tương đương, thấp hơn nồng độ 5% khoảng... pepton từ đậu tương 3% [45] Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzym Nattokinase 470FU/g trên môi trường thạch đậu tương hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện sinh học nhiêt đới và phân lập từ thực phẩm Natto [2] 1.3 Vitamin K2 và MK-7... tâm của vết thử,tính bằng cm b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto Chế phẩm Natto được khẳng định chứa một lượng lớn Nattokinase Nguyên liệu sản xuất Natto gồm đậu tương và. .. hoạt độ protease cao nhất là ba ngày Kết luận này có thể sử dụng để định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi 3.2 trường canh thang chứa đậu tương Sản phẩm Natto được chứng minh có chứa hàm lượng MK-7 cao nhất so với các nguồn thực phẩm khác Môi trường lên men trong nghiên cứu sử dụng đậu tương, chính là nguyên liệu của sản phẩm Natto,