Báo cáo thí nghiệm hóa sinh

Báo cáo thí nghiệm hóa sinh

Trường ĐHKH-HuếKhoa Sinh Học

Báo cáo

Thí nghiệm hóa sinh

Huế, 11/2010

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ

I Theo phương pháp Bertrand

Tất cả các nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự do trong những điều kiện xác định có khả nămg khử Cu2+ thành kết tủa Cu2O

Vì vậy, phương pháp này dùng để định lượng các loại aldose,

THời gian đun 3 phút kể từ khi có bọt khí đầu tiên xuất hiện

Hàm lượng đường trọng dịch nghiên cứu lấy ước tính khoảng

không quá 160mg tốt nhất 10-90mg pha loãng mẫu nếu quá đặc.Phải bảo vệ kết tủa Cu2O không bị oxyl hóa bởi lớp không khí bề mặt

10 FeSO4 + 2KMnO4 + H2SO4 5Fe2(SO4)3

2 Đối tượng, hóa chất, thiết bị

II Tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị mẫu

Cân 2gram cho vào cối sứ, thêm ít nước cất ngiền thành dạng chấtđồn thể

Cho 20ml nước cất vào, tiếp tục ngiền rồi để lắng, lấy phần nước

và rửa sạch cối khoảng 3 lần

Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng Sau đó định mức lên 100ml

Tiến hành rửa trên phễu lọc Bunce

Dồn tủa về một phia Chiết từ từ dịch Fehling qua phễu lọc Quá trình rửa cần cho nước cất ấm vào dần dần, để ngẵn tủa tiếp xúc với không khí Mở máy cho dịch Fehling hút nhanh xuống bình, thử pH của tủa trong bình tam giác khi không còn tính kiềm là kết thúc quá trình rửa

4 Hòa tan kết tủa Cu 2 O:

Đặt phễu lọc lên bình nón, cho vào bình kết tủa 15ml Fe2(SO4)3 chảy từ từ rồi lắc đều để tủa tan hoàn toàn nếu kết tủa vẫn chưa tan hết thì cho thêm Dùng nước cất nóng rửa bình chứa tủa và phễu lọc cho đến khi không còn phản ứng acid là kết thúc gian đoạn này

5 Chuẩn độ bằng dd KMnO 4 0.1N

Cho dd KMnO4 0.1N lên buret rồi chuẩn độ dịch đã hoàn thành xong, đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây, kết thúc quá trình chuẩn độ

Ghi lại số ml dd KMnO4 0.1N đã dùng

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET 1.1 Mục đích yêu cầu

- Mục đích: giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hàm

lượng lipid thô bằng phương pháp dùng máy so màu

- Yêu cầu: phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác

định hàm lượng lipid thô, các thao tác tiến hành thí nghiệm phải hết sức cẩn thận

1.2 Nguyên tắc

Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật) Chính vì vậy để xác định hàm lượng lipid, ta chiết rút lipid rakhỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ Ở đây ta dùng petrol ether để trích lipid ra khỏi một lượng mẫu biết trước (mẫu đã được sấy khô) trênmáy soxhlet

Khi đã trích li hết lipid ra khỏi mẫu, ta tiến hành sấy mẫu khô lại đến khôi lượng không đổi Từ đó xác định hàm lượng lipid thô có trong 100g mẫu theo công thức:

Trong đó: X là hàm lượng lipid tính theo %

m: là trọng lượng mẫu đem chiết rút lipid

m1: trọng lượng gói mẫu trước khi chiết rút lipid (kể cả khối lượng giấy lọc)

m2: trọng lượng gói mẫu đã được sấy khô tuyết đối sau khi chiết rút lipid

- Bước 1: chuẩn bị mẫu

Đối tượng thí nghiệm: đậu lạc

+ Đem mẫu cho vào cối chầy sứ nghiền mịn Sau

đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 1050C đến khi khối

lượng không đổi

+ Mẫu sau khi được sấy khô ta cân 5g cho vào giấy

lọc (đã được sấy khô tuyệt đối) gói lại ba gói, đây chính

là trọng lượng m1

- Bước 2: chiết rút lipid

+ Rửa sạch và làm khô bộ soxlet sau đó cho mẫu

vào ống hình trụ sao cho mẫu chiếm khoảng 1/3 thể tích

của ống

+ Đổ ethylic vào ngập mẫu ở phía trên ống hình trụ còn ở dưới bình cầu ta đổ ethylic khoảng 2/3 bình Lắp kính bình cầu với ống hình trụ.

+ Cho nước chảy vào ở vòi dưới và chảy ra ở vòi trên của ống sinh hàn đồng thời bật bếp điện đun bình cầu chứa ethylic, khi đó hơi

ethylic bốc lên gặp lạnh ở ống sinh hàn sẽ ngưng tụ lại và rơi vào ống hình trụ để hòa tan lipid tự do có trong mẫu Ta điều chỉnh nhiệt độ củabếp điện khoảng 40 – 500C sao cho cứ sao khoảng 10 phút thì dung môi ethylic chảy qua eo của ống hình trụ và tràn xuống bình hình cầu

Ta đun trong vòng 10 -12 giờ cho đến khi tách chiết hết lipid ra khỏi mẫu Cần chú ý trong quá trình đun nếu nghĩ giữa chừng thì phải cho dung môi ngập mẫu mới tắt bếp

+ Để thử lipid đã được chiết hết hay chưa, ta lấy vài giọt dung môi

từ ống hình trụ nhỏ vào miếng giấy lọc, để khô mà nếu thấy vết loang của dung môi không phân biệt được với nền giấy trắng thì xem như đã chiết hết lipid và ta kết thúc quá trình chiết rút

+ Sau khi chiết rút xong ta lấy các gói mẫu ra và cho bay hết dungmôi, đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 1050C trong vòng 1 – 1,5h, sau đó tiếp tục sấy khô ở nhiệt độ thấp hơn cho đến khối lượng không đổi Đem mẫu đã được sấy khô đến khối lượng không đổi ra cân ta thu đượctrong lượng m2

Nhận xét: Qua bảng kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid trong

đậu lạc khá cao Hàm lượng lipid chiếm gần một nữa lượng chất có trong củ

Qua bài thí nghiệm này giúp cho sinh viên nắm được các bước cơ bản của phương pháp chiết rút lipid bằng máy soxlet, và rèn luyện được kỹ năng làm thí nghiệm

BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY

4.1.Mục đích yêu cầu

- Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp xây dưng đồ thị

chuẩn protein và phương pháp xác định hàm lượng potein trong mẫu

- Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, trong quá trình tiến hành

thí nghiệm phải cẩn thận

4.2 Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng màu giữa protein với thuốc thử Folin Do trong môi trường kiềm với sự có mặt của một lượng nhỏ Cu2+ protein sẽ tạo thành phức chất màu xanh Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu (có nghĩa là hàm lượng protein trong mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm) Sau đó dùng máy so màu

để xây dựng đồ thị chuẩn, và thông qua đồ thị chuẩn ta tính được hàm lượng protein có trong mẫu

4.3 Dụng cụ hóa chất

- Dụng cụ:

Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức

- Hóa chất: Albumin

+ Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = 7

+ Dung dịch Na2CO3 2% tan trong NaOH 0.1N (dung dịch A)

+ Dung dịch CuSO4 1% (dung dịch B1)

+ Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B2)

+ Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B1, 0.5ml dung dịch B2 và50ml dung dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước khi dùng 30 phút)

+ Thuốc thử Folin 0.5N Chú ý thuốc thử Folin được đựng trong chai màu và bảo quản lạnh, thuốc thử này có màu vàng, khi dùng nếu thấy có màu xanh thì cho vài giọt brom đun trong 15 phút thì sẽ có màu vàng trở lại và dùng được

4.4 Tiến hành thí nghiệm

4.4.1 Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein

- Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân chính xác 1g albumin hòa tan trong nước cất và định mức đến 100ml

- Chuẩn bị dãy gồm 6 ống nghiệm khô sạch, sau đó cho vào các ống nghiệm những chất như bảng sau:

TT

Nước cất (ml) 1 0.995 0.99 0.98 0.97 0.96Albumin (ml) 0 0.005 0.01 0.02 0.03 0.04

Hàm lượng

albumin (µg/ml) 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4Khi cho dung dịch C vào các ống nghiệm ta lắc đều và để trong 10 phút, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên trong 30 phút Sau đó đem so màu ở bước sóng 620nm ta thu được kếtquả như sau:

4.4.2 Tiến hành xác định hàm protein trong mẫu

Trước hết ta phải chiết mẫu bằng cách cân 3g mẫu đậu xanh rồi nghiền trong các cối sứ được làm lạnh với dung dịch đệm phosphat 0.1N Sau đó dùng đệm phosphat định mức đến 200ml, như vậy mẫu

đã được pha loãng 200 lần Sau đó chia mẫu vào các ống ly tâm và đem ly tâm trên máy li tâm ở 10000 vòng trong thời gian 15 phút Sau khi ly tâm ta thu phần dịch trong cho vào lọ và bảo quản lạnh để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo Còn với mẫu sữa đậu nành thì ta lấy 2ml+ 6ml nước cất (fa loãng 4 lần) để thí nghiệm

- Sau khi chuẩn bị xong dịch chiết ta chuẩn bị dãy nhiều ống

nghiệm khô sạch Một ống nghiệm chứa mẫu trắng đối chứng, còn ba ống chứa mẫu

- Ta cho vào ống mẫu trắng 1ml nước cất và 5ml dung dịch C, tương tự các ống khác ta cho vào mỗi ống 1ml mẫu và 5ml dung dịch

C, để yên trong 10 phút sau đó cho vào mỗi ống 0.5ml dung dịch Folin lắc đều để yên trong 30 phút Sau đó đem so màu ở bước sóng 650nm,mẫu trắng dùng để chuẩn máy so màu

Kết quả:

Đối tượng: Độ fa

loãng Không phaloãng 2 lần 3 lần 4 lần 8 lần

0.047 0.019 0.020.047 0.021 0.018

Đặc biệt thông qua bài học này giúp cho sinh viên nắm được

phương pháp xây dựng đồ thị chuẩn proetin và biết cách xác định hàm lượng protein trong mẫu, qua đó giúp sinh viên rèn luyện được kỷ nănglàm thí nghiệm

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ TRÊN GIẤY 6.1 Mục đích yêu cầu

- Mục đích: nhằm giúp sinh viên nắm vững nguyên tắc và làm quen với phương pháp định lượng acid amin bằng sắc ký trên giấy

- Yêu cầu: phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ thí nghiệm, các thao tác thí nghiệm phải cẩn thận chính xác để không làm ảnh hưởng đền kết quả thí nghiệm

6.2 Nguyên tắc

Trong quá trình chạy trên giấy sắc ký, do giấy sắc ký được cấu tạo

từ các sợi cellulose, do đó các acid amin tan trong dung môi sắc ký sẽ chạy theo các mạch với lực mao dẫn khác nhau tùy vào trọng lượng phân tử của các acid amin Vì vậy kết thúc quá trình chạy sắc ký thì mỗi loại acid amin sẽ nằm ở những vị trí khác nhau cách nhau khoảng nhất định trên giấy sắc ký Bằng việc sử dụng các thuốc thử hiện màu, thôi màu ta có thể định lượng được các acid amin trong mẫu thông quaviệc so màu của dung dịch thôi màu khi ngâm các vết sắc ký trong dung dịch sắc ký, ta so màu ở bước sóng 530nm

6.3 Hóa chất dụng cụ

- Hóa chất:

+ Các acid amin chuẩn: Prolin, Valin, Lysin, Isoleusin

+ Butanol, acid acetic, nước cất

+ Ninhydrin, aceton, CuSO4.5H2O

+ Cồn methylic hoặc ethylic

- Thuốc thử hiện màu: Ninhydrin 0,5g + aceton vừa đủ 100ml

- Thuốc thử thôi màu: CuSO4.5H2O 5mg + 22ml nước cất + cồn metylic hoặc cồn etylic vừa đủ 100ml

- Tiến hành định lượng acid amin: ta dùng bút chì kẻ một đường cách mép giấy sắc ký khoảng 9-12cm, chia đường thẳng đó thành những đoạn bằng nhau cách nhau 3-4 cm, cách hai đầu mép giấy sắc

+ Kết quả: ta thu được các vết acid amin khác nhau: bao gồm các vết riêng lẽ và các vết hỗn hợp Ta đối chiếu các vết acid amin hỗn hợpvới các vết acid amin riêng lẽ ta có thể thấy rằng vết trên của hỗn hợp

là hỗn hợp của Lysin và Prolin còn vết dưới là Isoeusin và Valin chập vào nhau Kết quả này có thể chỉ mang tính tương đối do trong quá trình làm thí nghiệm có thể có nhiều sai sót

6.5 Nhận xét kết luận

Qua kết quả trên ta thấy hàm lượng acid amin trung bình của mỗi loại trong các hỗn hợp khác nhau là khác nhau Trong quá trình chạy sắc ký ta thấy các acid amin chạy tương đối đều Tuy nhiên kết quả này chỉ mang tính chất tương đối do các vệt acid amin không nằm rời nhau trên giấy sắc ký Qua bài thí nghiệm này giúp sinh viên nắm đượcnhững kiến thức cơ bản cách định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký trên giấy

Bài 5 Định lượng Cellulose

1 Nguyên tắc.

Phương pháp định lượng Cellulose dựa vào tính chất của nó trong một hợp chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh,

không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác

thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin ít bền với tác dụng của acid và base nên bị oxyl hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch base hoặc hỗn hợp acid nitric với acid acetic

2 Hóa chất

Dung dịch acid nitric đặc(d=1.4)

Dung dịch acid acetic đặc

Rượu ethylic 96%

3 Tiến hành

3.1 Đối tượng là quả hồng

Cân 1g mẫu đã nghiền nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ không đổi, cho vào bình tam giác 250ml

Thêm vào bình 16.5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 1.5ml acid acetic đặc Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình, đun sôi trong 30 phút

Để nguội pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng Lọc qua giấy lọc đã sấy khô tuyệt đối và biết trước khối lượng

Rửa kết tử cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng

Rửa bằng rượu ethylic 96% một đến hai lần

Rửa bằng ete ethylic

Sấy giấy lọc chứa mẫu ở nhiệt độ 100-105oC đến khối lượng không đổi

Vì có thể dư lại một lượng nhỏ hemicellulose, lignin nên cellulose gọi

là cellulose thô

4 Tính kết quả

Hàm lượng cellulose được tính như sau:

Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính %

A: khối lượng cellulose gramW: Khối lượng mẫu thí nghiệm

5 Nhận xét, kết luận

Nhận xét:

hàm lượng phần trăm cellulose trong quả hồng rất thấp (0.7%) Bởi vì, đối tượng thí nghiệm đã chín và lượng cellulose cũn không còn nhiều

Kết luận:

Qua bài này, em đã biết cách xác định hàm lượng cellulose thô,

nó sẽ giúp ích cho em sau này khi ra trường và đi làm Em chân thành cảm ơn Thầy

Bài 6 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS 1.Yêu cầu ,mục đích :

1.1 Mục đích :

- Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết

- Biết được phương pháp xác định protein bằng phương pháp điện

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất đầy đủ.

Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thậtsạch bằng nước cất Gắn các tấm kính vào giá đỡ Thử độ thấm lắpghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làmlại

Bước 3: Pha dung dịch separating gel 12%.

Bước 4: Pha dung dịch stacking gel 5%

4.2 Chuẩn bị mẫu:

-Mẫu được chuẩn bị như ở bài định lượng prôtein bằng phươngpháp Bradford

Bước 6: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1XElectrophoresis buffer) Chú ý không để bọt khí ở phía dưới tấm kính,dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng Chạy prerun khoảng 5phút ở 80 - 100 V.

Bước 7: Dùng Hamilton syringe load mẫu vào các giếng, cẩn thận

để mẫu không bị tràn ra ngoài

Bước 8: Chạy điện di ở điện thế 60 V trong khoảng từ 3 giờ cho đếnkhi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu)

4.4 Nhuộm và rửa gel

Bước 9: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm(thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹkhoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút

Bước 10: Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ,khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành

5.Kết quả :

- Hàm lượng protein của thơm tương đối thấp

6.Kết luận:

-Hàm lượng protein tương đối thấp

-Biết được nguyên tắc của việc xác định protein bằng phương pháp điện di SDS

Bài 7 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.Mục đích,yêu cầu :

1.1.Mục đích:

-Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết

- Biết được phương pháp xác định protein tổng số

1.2.Yêu cầu:

- Phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác định protein tổng số, phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất dung cụ thí nghiệm Trong quá trình tiến hành thí nghiệm phải hết sức cẩn thận để tránh những sự cố đáng tiếc và ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

2 Nguyên tắc :

-Xác định hàm lượng protein tổng số trên 1g dựa vào phương pháp Bradford bằng cách đo hấp thụ quang của dịch chiết protein ở λ=595 nm và tính toán hàm lượng protein theo đường chuẩn albumin huyết thanh bò

4.2 Cách chuẩn bị mẩu chiết:

-Lấy 5g thịt quả thơm nghiền nát sau đó hòa tan 20ml với nước cất rồi lọc chân không.Tiếp tục dùng nước cất tráng bã sau khi lọc cho đến lúc hết protein trong bã bằng cách thử thuốc thử nihidrin

-Kết tủa thuận nghịch dung dịch thu được bằng (NH4)2SO4

5 Tiến hành :

-Mẫu sau khi lọc thì ly tâm với độ 15000 vòng/phút ở 4oc dùng

micro pipet hút 4 L dung dịch mẫu và 200 L dung dịch bardford 1X

vorter 30 giây sau đó đo OD ở bước sóng 595 nm và tiến hành do lặp lại 3 lẫn

-Mẫu blank thay mẫu bằng nước cất

6.Kết quả :