Báo cáo thí nghiệm hóa sinh

Báo cáo thí nghiệm hóa sinh

Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Trường ĐHKH-Huế Khoa Sinh Học Báo cáo Thí nghiệm hóa sinh Huế, 11/2010 Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bài ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ I Theo phương pháp Bertrand Tất nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự điều kiện xác định có khả nămg khử Cu2+ thành kết tủa Cu2O Vì vậy, phương pháp dùng để định lượng loại aldose, cetose, disaccharide có tính khử Khi dùng phương pháp này, muốn có kết tốt, cần phải đảm bảo điều kiện sau: Loại Protein chất khác khỏi dung dịch cần nghiên cứu cách dùng dung môi thủy ngân, base acetate, hỗn hợp CuSO NaOH (1VCuSO4 8% 1V NaOH 1.25% ) THời gian đun phút kể từ có bọt khí xuất Hàm lượng đường trọng dịch nghiên cứu lấy ước tính khoảng không 160mg tốt 10-90mg pha loãng mẫu đặc Phải bảo vệ kết tủa Cu2O không bị oxyl hóa lớp không khí bề mặt - Nguyên tắc: Khi đun sôi dịch kiềm Cu2+ với dung dịch đường tạo thành kết tủa Cu2O, sau rửa nước, hòa tan kết tủa Cu2O Fe2(SO4)3, Cu2+ chuyển thành Cu+ Fe3+ chuyển thành Fe2+ Chuẩn độ Fe2+ dd KMnO4 0.1N biết lượng KMnO4 dùng để tích lượng đồng Tử lượng đồng ấy, đối chiếu bảng cho sẵn tính lượng đường mẫu Các phản ứng sau: Cu2+ Cu+ Phản ứng Fehling Phản ứng kết tủa Cu2O: Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Phản ứng chuẩn độ dd KMnO4 0.1N 10 FeSO4 + 2KMnO4 + H2SO4 5Fe2(SO4)3 Đối tượng, hóa chất, thiết bị 2.1 Đối tượng Quả Hồng 2.2 Hóa chất Dung dịch Fehling Fe2(SO4)3: 5g Fe2(SO4)3 + 20ml H2SO4 đậm đặc cho nước cất đến 90ml kiểm tra dd KMnO4 0.1N có màu hòng nhạt bền 30 giây Thêm nước cất đủ 100ml 2.3 Thiết bị Hệ thống hút lọc chân không Bình tam giác, phễu, chày cối sứ Giấy lọc, cân (chính xác 0.001g) Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế II Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mẫu Cân 2gram cho vào cối sứ, thêm nước cất ngiền thành dạng chất đồn thể Cho 20ml nước cất vào, tiếp tục ngiền để lắng, lấy phần nước rửa cối khoảng lần Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng Sau định mức lên 100ml Phản ứng Fehling: Cho vào bình tam giác 5ml dịch lọc 20ml fehling, đậy bình phễu nhỏ đun sôi Khi thấy bọt khí xuất có kết tủa đỏ gạch tính thời gian phút, để nguội cho kết tủa lắng Rửa kết tủa Cu2O Tiến hành rửa phễu lọc Bunce Dồn tủa phia Chiết từ từ dịch Fehling qua phễu lọc Quá trình rửa cần cho nước cất ấm vào dần dần, để ngẵn tủa tiếp xúc với không khí Mở máy cho dịch Fehling hút nhanh xuống bình, thử pH tủa bình tam giác không tính kiềm kết thúc trình rửa Hòa tan kết tủa Cu2O: Đặt phễu lọc lên bình nón, cho vào bình kết tủa 15ml Fe 2(SO4)3 chảy từ từ lắc để tủa tan hoàn toàn kết tủa chưa tan hết cho thêm Dùng nước cất nóng rửa bình chứa tủa phễu lọc không phản ứng acid kết thúc gian đoạn Chuẩn độ dd KMnO4 0.1N Cho dd KMnO4 0.1N lên buret chuẩn độ dịch hoàn thành xong, đến xuất màu hồng nhạt bền 20-30 giây, kết thúc trình chuẩn độ Ghi lại số ml dd KMnO4 0.1N dùng Tính kết 1ml KMnO4 0.1N tương đương 1mg Cu mCu có dịch là: g1 = Vc x6.36 Vc số ml KMnO4 0.1N dùng chuẩn độ Tra bảng ta có kết quả: Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET 1.1 Mục đích yêu cầu - Mục đích: giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hàm lượng lipid thô phương pháp dùng máy so màu - Yêu cầu: phải nắm vững kiến thức lý thuyết phương pháp xác định hàm lượng lipid thô, thao tác tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận 1.2 Nguyên tắc Trong tế bào, lipid dạng tự liên kết Lipid tự tập trung chủ yếu quan dự trữ hạt, (ở thực vật) mô mỡ (ở động vật) Chính để xác định hàm lượng lipid, ta chiết rút lipid khỏi nguyên liệu dung môi hữu Ở ta dùng petrol ether để trích lipid khỏi lượng mẫu biết trước (mẫu sấy khô) máy soxhlet Khi trích li hết lipid khỏi mẫu, ta tiến hành sấy mẫu khô lại đến khôi lượng không đổi Từ xác định hàm lượng lipid thô có 100g mẫu theo công thức: m − m2 X% = x100 m Trong đó: X hàm lượng lipid tính theo % m: trọng lượng mẫu đem chiết rút lipid m1: trọng lượng gói mẫu trước chiết rút lipid (kể khối lượng giấy lọc) m2: trọng lượng gói mẫu sấy khô tuyết đối sau chiết rút lipid 1.3 Hóa chất dụng cụ - Hóa chất: ethylic - Dụng cụ: cối chày sứ, giấy lọc, bếp điện, tủ sấy, soxlet 1.4 Tiến hành thí nghiệm - Bước 1: chuẩn bị mẫu Đối tượng thí nghiệm: đậu lạc + Đem mẫu cho vào cối chầy sứ nghiền mịn Sau đem sấy khô nhiệt độ 100 – 1050C đến khối lượng không đổi + Mẫu sau sấy khô ta cân 5g cho vào giấy lọc (đã sấy khô tuyệt đối) gói lại ba gói, trọng lượng m1 - Bước 2: chiết rút lipid + Rửa làm khô soxlet sau cho mẫu vào ống hình trụ cho mẫu chiếm khoảng 1/3 thể tích ống Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế + Đổ ethylic vào ngập mẫu phía ống hình trụ bình cầu ta đổ ethylic khoảng 2/3 bình Lắp kính bình cầu với ống hình trụ + Cho nước chảy vào vòi chảy vòi ống sinh hàn đồng thời bật bếp điện đun bình cầu chứa ethylic, ethylic bốc lên gặp lạnh ống sinh hàn ngưng tụ lại rơi vào ống hình trụ để hòa tan lipid tự có mẫu Ta điều chỉnh nhiệt độ bếp điện khoảng 40 – 500C cho khoảng 10 phút dung môi ethylic chảy qua eo ống hình trụ tràn xuống bình hình cầu Ta đun vòng 10 -12 tách chiết hết lipid khỏi mẫu Cần ý trình đun nghĩ chừng phải cho dung môi ngập mẫu tắt bếp + Để thử lipid chiết hết hay chưa, ta lấy vài giọt dung môi từ ống hình trụ nhỏ vào miếng giấy lọc, để khô mà thấy vết loang dung môi không phân biệt với giấy trắng xem chiết hết lipid ta kết thúc trình chiết rút + Sau chiết rút xong ta lấy gói mẫu cho bay hết dung môi, đem sấy khô nhiệt độ 100 – 105 0C vòng – 1,5h, sau tiếp tục sấy khô nhiệt độ thấp khối lượng không đổi Đem mẫu sấy khô đến khối lượng không đổi cân ta thu lượng m2 1.5 Kết nhận xét: - Kết quả: Qua trình chiết rút lipid từ mẫu ta thu kết sau: Mẫu (m=5g) m1 (g) 6.185 m2 (g) 3.960 m1 − m2 x100 m 44.5% X% = Đậu lạc Nhận xét: Qua bảng kết cho ta thấy hàm lượng lipid đậu lạc cao Hàm lượng lipid chiếm gần lượng chất có củ Qua thí nghiệm giúp cho sinh viên nắm bước phương pháp chiết rút lipid máy soxlet, rèn luyện kỹ làm thí nghiệm Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 4.1.Mục đích yêu cầu - Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp xây dưng đồ thị chuẩn protein và phương pháp xác định hàm lượng potein mẫu - Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, quá trình tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận 4.2 Nguyên tắc Dựa vào phản ứng màu giữa protein với thuốc thử Folin Do môi trường kiềm với sự có mặt của một lượng nhỏ Cu 2+ protein sẽ tạo thành phức chất màu xanh Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có mẫu (có nghĩa là hàm lượng protein mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm) Sau đó dùng máy so màu để xây dựng đồ thị chuẩn, và thông qua đồ thị chuẩn ta tính được hàm lượng protein có mẫu 4.3 Dụng cụ hóa chất - Dụng cụ: Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức - Hóa chất: Albumin + Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = + Dung dịch Na2CO3 2% tan NaOH 0.1N (dung dịch A) + Dung dịch CuSO4 1% (dung dịch B1) + Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B2) + Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B1, 0.5ml dung dịch B2 và 50ml dung dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước dùng 30 phút) + Thuốc thử Folin 0.5N Chú ý thuốc thử Folin được đựng chai màu và bảo quản lạnh, thuốc thử này có màu vàng, dùng nếu thấy có màu xanh thì cho vài giọt brom đun 15 phút thì sẽ có màu vàng trở lại và dùng được 4.4 Tiến hành thí nghiệm 4.4.1 Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein - Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân chính xác 1g albumin hòa tan nước cất và định mức đến 100ml - Chuẩn bị dãy gồm ống nghiệm khô sạch, sau đó cho vào các ống nghiệm những chất bảng sau: Page Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế TT Hóa chất Nước cất (ml) Albumin (ml) Dung dịch C (ml) Folin (ml) Hàm lượng albumin (µg/ml) MT 0.995 0.005 0.99 0.01 0.98 0.02 0.97 0.03 0.96 0.04 0.5 0.5 0.05 0.5 0.1 0.5 0.2 0.5 0.3 0.5 0.4 Khi cho dung dịch C vào các ống nghiệm ta lắc đều và để 10 phút, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên 30 phút Sau đó đem so màu ở bước sóng 620nm ta thu được kết quả sau: Hàm lượng 0.05 Albumin(µg/ml) OD 0.175 0.1 0.2 0.3 0.4 0.29 0.40 0.515 0.623 Sử dụng phần mềm oringin 7.5 xây dựng đồ thị chuẩn protein: Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X Parameter Value Error -A 0.0643 0.00219 B 1.121 0.00661 -RSD N P -0.99995 0.00209 [...]... Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính % A: khối lượng cellulose gram W: Khối lượng mẫu thí nghiệm 0.007 x100 X = = 0.7% 1 5 Nhận xét, kết luận Nhận xét: hàm lượng phần trăm cellulose trong quả hồng rất thấp (0.7%) Bởi vì, đối tượng thí nghiệm đã chín và lượng cellulose cũn không còn nhiều Page 13 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Kết luận: Qua bài này, em đã biết cách xác định hàm lượng cellulose... và đi làm Em chân thành cảm ơn Thầy Page 14 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bài 6 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS 1.Yêu cầu ,mục đích : 1.1 Mục đích : - Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết - Biết được phương pháp xác định protein bằng phương pháp điện di SDS 1.2 Yêu cầu : - Chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ trước khi tiến hành thí nghiệm Đọc kỹ lý thuyết -Thao tác nhanh nhẹn,... dương.Do đó, bằng phương pháp điện di có thể tách biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau 3 Hóa chất và dụng cụ 3.1 Hóa chất: 1 Acrylamide 30% Acrylamide 29 g Bisacrylamide 1g Định mức 100 mL bằng nước cất 2 lần Bảo quản 4oC 2 Tris 2 M (pH 8,8) Page 15 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Tris base 121 g Nước cất 2 lần 300 mL Chỉnh pH = 8,8 bằng HCl đậm đặc Định mức 500 ml... chỉ mang tính chất tương đối do các vệt acid amin không nằm rời nhau trên giấy sắc ký Qua bài thí nghiệm này giúp sinh viên nắm được những kiến thức cơ bản cách định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký trên giấy Page 12 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bài 5 Định lượng Cellulose 1 Nguyên tắc Phương pháp định lượng Cellulose dựa vào tính chất của nó trong.. .Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRÊN GIẤY 6.1 Mục đích yêu cầu - Mục đích: nhằm giúp sinh viên nắm vững nguyên tắc và làm quen với phương pháp định lượng acid amin bằng sắc ký trên giấy - Yêu... Nước cất 14.(NH4)2SO4 3.2 Dụng cụ : -Micro pipet,máy chạy điện di, máy ly tâm,giấy thấm,hộp nhựa 3.3 Đối tượng : -Thơm 4 Các bước tiến hành: 4.1 Đổ gel Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất đầy đủ Page 17 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất Gắn các tấm kính vào giá đỡ Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nước... 6.Kết luận: -Hàm lượng protein tương đối thấp -Biết được nguyên tắc của việc xác định protein bằng phương pháp điện di SDS Page 19 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bài 7 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.Mục đích,yêu cầu : 1.1.Mục đích: -Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết - Biết được phương pháp xác định protein tổng số 1.2.Yêu cầu: - Phải nắm vững kiến thức lý thuyết... đã vạch sẵn, chú ý chấm những chầm nhỏ để khô rồi mới chấm tiếp + Cho giấy sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn dung môi ở trên và bắt đầu cho chạy sắc ký Page 11 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế + Kết quả: ta thu được các vết acid amin khác nhau: bao gồm các vết riêng lẽ và các vết hỗn hợp Ta đối chiếu các vết acid amin hỗn hợp với các... pipette thêm stacking gel vào phía trên lược để bổ sung lương gel bị chảy ra ngoài (nếu có) 4.2 Chuẩn bị mẫu: -Mẫu được chuẩn bị như ở bài định lượng prôtein bằng phương pháp Bradford Page 18 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bước 5: Tính toán lấy 5 mẫu chứa khoảng 30 µg protein và 5 µL sample buffer, 5 mẫu chứa 20 µg protein và 5 µL sample buffer.5 mẫu chứa 10 µg protein và 5 µL sample buffer.1... mL Định mức 100ml với nước cất 2 lần 8 2X SDS sample buffer Tris 2M pH 8,8 6,25 mL Nước cất 2 lần 30 mL Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc SDS 4g Glycerol 20 mL β- mercaptoethanol 10 mL Page 16 Báo cáo thí nghiệm hóa sinh - Trường ĐHKH-Huế Bromophenol blue 0,2 g Định mức với nước cất 2 lần tới 100 mL Bảo quản ở -20oC 9 10X Electrophresis buffer pH 8,3 Tris base 30 g Glycine 144 g SDS 10 g Nước cất 2 lần