Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHƠI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHƠI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Văn Khoa PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Trần Văn Khoa PGS.TS Đinh Đoàn Long Các số liệu, kết luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học Di truyền y học – Học viện Qn y, Trƣởng phịng Cơng nghệ Gen Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y dƣợc – Học viện Quân y PGS.TS Đinh Đồn Long – Chủ nhiệm Bộ mơn Y dƣợc học sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dƣợc - Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hƣớng dẫn tơi q trình nghiên cứu để hồn thành luận án tiến sĩ Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Văn Lƣơng – Phó giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dƣợc – HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phịng Cơng nghệ Gen Di truyền tế bào đồng chí, đồng nghiệp Bộ môn Sinh học Di truyền y học; đồng chí Phịng Cơng nghệ gen Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dƣợc học – Học viện Quân y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen protein – Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dƣợc – Học viện Quân y cung cấp mẫu phục vụ cho nghiên cứu luận án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình tất ngƣời thân, bạn bè giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa Tiếng Việt Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh A Adenine Adenine ADN Deoxyribonucleic Acid Acid Deoxyribonucleic AF Amniotic Fluid Dịch ối AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein AIHW Australian Institute of Health and Viện sức khỏe phúc lợi Úc Welfare ATP Adenosine Triphosphate Adenosine Triphosphate Bp Base pairs Cặp bazơ C Cytosine Cytosine CAH Congenital Adrenal Hyperplasia Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh CVS Chorionic villous sampling Lấy mẫu gai rau dNTPs Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotide Triphosphate Triphosphate Dị tật bẩm sinh DTBS Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid Fluorescence-activated cell Phân loại tế bào hoạt hóa sorting FACS Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid EDTA huỳnh quang FISH Fluorescence in-situ hybridization Lai chỗ huỳnh quang fNRBCs Fetal nucleated red blood cells Tế bào hồng cầu có nhân phơi thai G Guanine Guanine HCĐ Down syndrome Hội chứng Down Kb Kilo base Kilo base Khoảng sáng sau gáy KSSG MACS Magnetic activated cell sorting Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính Nhiễm sắc thể NST PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymerase PUBS Percutaneous umbilical cord Lấy mẫu máu cuống rốn qua da blood sampling Quantitative fluorescence - Phản ứng chuỗi định lƣợng Polymerase Chain Reaction huỳnh quang STR Short Tandem Repeat Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn T Thymine Thymine Taq – Thermus aquaticus polymerase QF-PCR polymerase TBE Tris - Boric – EDTA Tris - Boric – EDTA TOP Termination of pregnancy Đình thai UV Ultra Violet Tia cực tím β hCG Beta_human chronic Beta_human chronic gonadotropin gonadotropin DANH MỤC BẢNG TRANG STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Bảng 1.1 Thống kê so sánh sản phẩm thƣơng mại kỹ thuật NIPT Bảng 1.2 Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng Mỹ Bảng 2.1 Thành phần hóa chất QIAamp ADN blood Mini Kit Bảng 2.2 Trình tự kích thƣớc sản phẩm khuếch đại gen SRY GAPDH Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR vòng vòng Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen mồi ngồi mồi gen SRY chu trình nhiệt nhân gen GAPDH Bảng 2.5 Trình tự mồi đầu dò phản ứng định lƣợng huỳnh quang gen DYS14 GAPDH Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime-PCR Bảng 2.7 Công thức ứng dụng chất gắn bề mặt hạt từ tính Bảng 2.8 Các locus STR NST 13, 18, 21 NST X, Y Bảng 2.9 Thành phần thể tích phản ứng QF-PCR Bảng 2.10 Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR Bảng 2.11 Các thành phần cho mẫu điện di Bảng 2.12 Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di mao quản Bảng 2.13 Phân tích tỷ lệ peak huỳnh quang STR Bảng 2.14 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime PCR Bảng 3.1 Nồng độ ADN (ng/µl) phƣơng pháp tách nhiệt phƣơng pháp tách Kít Qiagen Bảng 3.2 Kết số copy gen DYS14 (A: copy/ml) nồng độ gen DYS14/GAPDH (B: %) tuần đến 12 thai kỳ trƣờng hợp thai nam Bảng 3.3 Kết số copy gen GAPDH (A: copy/ml) tuần đến 12 thai kỳ trƣờng hợp thai nữ Bảng 3.4 So sánh kết kỹ thuật Nested PCR, Realtime PCR với siêu âm tuần thứ 16/ sau sinh (A) Bảng 3.5 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR 33 34 49 50 51 51 52 53 54 57 58 58 59 59 61 62 63 71 72 75 76 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Realtime-PCR tuần tuổi thai Bảng 3.6 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime-PCR tuần tuổi thai Bảng 3.7 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime-PCR tuổi thai >8 tuần Bảng 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR Nested PCR tuần tuổi thai Bảng 3.9 Kết nhân gen SRY (trƣớc sinh: A) kiểm chứng sau sinh (B) 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2 Bảng 3.10 Kết nồng độ ADN biến thiên sau sinh Bàng 3.11 Nồng độ ADN phôi thai tự huyết tƣơng mẹ mang thai nam bình thƣờng Bảng 3.12 Nồng độ ADN phôi thai tự huyết tƣơng mẹ mang thai nam bất thƣờng Bảng 3.13 Kết sàng lọc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh Bảng 3.14 Kết sàng lọc bệnh loạn dƣỡng Duchenne Bảng 3.15 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen RhD Bảng 3.16 Kết chẩn đốn nhóm máu Rh thai nhi tuần thứ Bảng 3.17 Kết thử nghiệm tế bào phôi thai tự 76 77 77 85 87 98 99 107 110 111 112 116 DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG STT Hình1.1: Các bƣớc chình kỹ thuật FISH 24 Hình 1.2: Nguyên tắc phản ứng Nested PCR (PCR lồng) 25 Hình 1.3 Phƣơng pháp Real-time PCR với mẫu dị TaqMan 26 Hình 1.4 Tóm tắt chế hoạt động Taqman probe Realtime- 27 PCR Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 48 Hình 2.2 Trình tự đoạn gen DYS14 53 Hình 2.3 Trình tự đoạn gen GAPDH 53 Hình 2.4 Các chất gắn bề mặt ̣t tƣ̀ tính 54 Hình 2.5 Phân tích kết QF-PCR bình thƣờng 59 10 Hình 2.6 Phân tích tính kết tỷ lệ alen 60 11 Hình 2.7 Ảnh phân tích kết QF-PCR locus bị Trisomy 61 12 Hình 3.1 Ảnh điện di gen SRY GAPDH mẫu nghiên cứu 65 13 Hình 3.2 Ảnh điện di gen SRY GAPDH mẫu nghiên cứu 66 từ 811 - 825 14 Hình 3.3 Ảnh kết điện di gen SRY GAPDH mẫu 67 nghiên cứu từ 826 - 840 15 Hình 3.4 Phân tích đƣờng chuẩn gen DYS14 gen GAPDH 70 16 Hình 3.5 Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến mẫu 301 78 17 Hình 3.6 Ảnh nhân gen GAPDH tuổi thiai tuần tuổi từ mẫu 269 đến 297 78 18 Hình 3.7 Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến 79 mẫu 321 19 Hình 3.8 Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến mẫu 321 80 24 Hình 3.9 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 269 81 25 Hình 3.10 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 277 82 26 Hình 3.11 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 296 83 27 Hình 3.12 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 551 84 28 Hình 3.13 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự sau sinh 88 29 Hình 3.14 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu QF64 90 (tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thƣờng 30 Hình 3.15 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu QF 61 92 (tƣơng ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down 31 Hình 3.16 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu DT02 với cặp mồi extra Marker 21 93 32 Hình 3.17 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu QF56 94 (tƣơng ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter 33 Hình 3.18 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu DT03 (QF56) với mồi extra marker locus X, Y 95 34 Hình 3.19 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu DT08 96 mang hội chứng Edward 35 Hình 3.20 Ảnh nhuộm FISH tế bào phơi thai mẫu số 831 101 36 Hình 3.21 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai mẫu số 837 102 37 Hình 3.22 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu nghiên cứu 964 với locus NST giới tính X, Y 104 38 Hình 3.23 Ảnh điện di gen SRY mẫu sàng lọc bệnh CAH tuần thai thứ 106 39 Hình 3.24 Ảnh nhân gen GAPDH mẫu sàng lọc bệnh CAH tuần thai thứ 106 40 Hình 3.25 Ảnh điện di nhân gen SRY mẫu sàng lọc DMD tuần thứ 109 41 Hình 3.26 Ảnh điện điện di nhân gen GAPDH mẫu sàng lọc 109 10 Reprod., 6(9), pp 855-860 [90] Mann K., Petek E., Pertl B., (2009), “Prenatal detection of chromosome aneuploidy by quantitative fluorescence PCR”, Methods Mol Biol., 444, pp 7194 [91] Marden P., Smith D., Donald M (1964), “Congential anomalist in the newborn infant, including minor variations a study of 4412 babies by suface examination for anomalies and buccal smear for sex chromatin”, J Pediatr., 64, pp 357-371 [92] Mary R., Narelle G., Elizabeth A., A review of the National Congenital Malformations and Birth Defects Data Collection, AIHW National Perinatal Statistics Unit Sydney, AIHW Cat, No PER 23 [93] Meagan S., Kimberly M., Alexandrea H., Jeannie V (2014), “A case of false negative NIPT for Down syndrome – lesson learned”, Hidawi Publishing Corporation Case Reports in Genetics, 2014, pp.1-3 [94] Mergenthaler S., Babochkina T., Kiefer V., (2005), “FISH analysis of all fetal nucleated cells in maternal whole blood: improved specificity by the use of two Y-chromosome probes”, J Histochem Cytochem., 53, pp 319-322 [95] Morain S., Michael F., Michelle M (2013), “A New Era in Noninvasive Prenatal Testing” N Engl J Med., 369(6), pp 499-501 [96] Mueller U., Hawes C., Wright A (1990), “Isolation of fetal trophoblast cells from peripheral blood of pregnant women”, Lancet, 336, pp 197-200 [97] Nakonieczny M., Jezierski G., Woźniak I (2008), “Prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidies using quantitative fluorescent PCR (QF-PCR)”, Przegl Lek., 65(3), pp 119-21 [98] Oepkes D., Yaron Y., Kozlowski P., Rego M , Bartha J., Akker E., Dornan S., Krampl-Bettelheim E., Schmid M., Wielgos M., Cirigliano V., Renzo G., Cameron A., Calda P., Tabor A (2014), “Counseling for non-invasive prenatal testing (NIPT): what pregnant women may want to know”, Ultrasound Obstet 142 Gynecol., 44, pp 1–5 [99] Padilla C., Cutiongco E., Sia J (2003), “Birth defects ascertainment in the Philippines”, Southeast Asian J Trop Med Public Health., 34(3), pp 239-243 [100] Palomaki G., Deciu C., Kloza E., Lambert G, Haddow J., Neveux L (2012), “DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study”, Genet Med., 14, pp.296–305 [101] Pangkanon S., Sawasdivorn S., Kuptanon C., Chotigeat U., Vandepitte W (2014), “Establishing of National Birth Defects Registry in Thailand”, J Med Assoc Thai., 97(6), pp 182-188 [102] Papp C., Ban Z., Szigeti Z., Csaba A., Beke A., Papp Z (2007), “Role of second trimester sonography in detecting trisomy 18: a review of 70 cases”, J Clin Ultrasound, 35 (2), pp 68–72 [103] Pertl B (1997), “Quantitative fluorescence polymerase chain reaction for rapid prenatal detection of common aneuploidies and fetal sex”, Am J Obstet Gyneco.l, 177(4), pp 899-906 [104] Peter A., Benn, James F (2007), “Second trimester prenatal ultrasound and screening for Down syndrome”, Prenat Diagn., 27, pp 884 [105] Phillips O., Elias S., Shulman L., Andersen R., Morgan C., Simpson J (1992), “Maternal serum screening for fetal Down syndrome in women less than 35 years of age using alpha-fetoprotein, hCG, and unconjugated estriol: a prospective 2year study”, Obstet Gynecol., 80, pp.353-358 [106] Quezada M., Gil M., Francisco C., Orosz G., Nicolaides K (2014), “Screening for trisomies 21, 18 and 13 by cell-free DNA analysis of maternal blood at 10–11 weeks’ gestation and the combined test at 11–13 weeks”, Ultrasound Obstet Gynecol, 45, pp 36–41 [107] Richard P., Thomas J., Maurel K (2014), “Noninvasive prenatal screening for 143 fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA”, Am J Obstet Gynecol., 211(365), pp 1-12 [108] Rossa W., Chiu K., Allen C., Yuan G (2008), “Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma”, Proc Natl Acad Sci USA., 105(51), pp 20458– 20463 [109] Samura O., Pertl B., Sohda S., Johnson K., Sekizawa A., Falco V., Elmes R., Bianchi D (2000), “Female fetal cells in maternal blood: use of DNA polymorphisms to prove origin”, Hum Genet., 107, pp 28-32 [109] Schmorl G (1893), “Pathologisch-anatomische Untersuchungen über Publereklampsie”, Leipzig: Vogel [110] Sekizawa A., Kimura T., Sasaki M., Nakamura S., Kobayashi R., and Sato T., (1996), “Prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy using a single fetal nucleated erythrocyte in maternal blood”, Neurology., 46, pp 1350-1353 [111] Sekizawa A., Purwosunu Y., Matsuoka R (2007), “Recent advances in noninvasive prenatal DNA diagnosis through analysis of maternal blood”, J of Obste Gynecol Res., 33,pp 747-764 [112] Sekizawa A., Samura O., Zhen D., Falco V., Farina A., and Bianchi D (2000), “Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood, Prenat Diagn., 20, pp 886-889 [113] Shengnan J., Xueqin Michelle L., Haiyang L., Kenneth Y., George S., Chunming D (2012), “Further Improvement in Quantifying Male Fetal DNA in Maternal Plasma”, Clin Chem., 58(2), pp 465–468 [114] Shi L (2002), “Prevalence of birth defects and parental work in Singapore live births form 1994 to 1998: A population-based study”, Occup Med., 52(6), pp 325-331 144 [115] Shirly I (1992), “Rontine radiographer screening for fetal abnor malities by ultrasound in an unselected lanrisk population”, Br J Radiol., 65, pp 564-567 [116] Simpson J (2013), “Cell-free fetal DNA and maternal serum analytes for monitoring embryonic and fetal status”, Fertility and Sterilitym, 99(4), pp 11241134 [117] Sípek A., Gregor V., Horáček J., Langhammer P (2012), “Course of congenital malformation incidences and their changes over time in children born in the Czech Republic”, Ceska Gynekol., 77(5), pp 424-436 [118] Sparks A., Wang E., Struble C., Barrett W., Stokowski R., McBride C., (2012), “Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy” Prenat Diagn., 32, pp.3–9 [119] Stephensen S., Sigfússon G., Eiríksson H., Sverrisson J., Torfason B., Haraldsson A., Helgason H (2002), “Congenital heart defects in Iceland 1990-1999”, Laeknabladid, 88(4), pp 281-287 [120] Tabor A., Philip J., Madsen M., Bang J., Obel E., and Norgaard-Pedersen B (1986), “Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 lowrisk women”, Lancet, 1, pp 1287-1293 [121] Tan K., Tan T., Tan J., Tan I., Chew S., Yeo G (2005), “Birth defects in Singapore: 1994-2000”, Singapore Med J., 46(10), pp 545-552 [122] Thomas, Tutschek, Fros (1995), “The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation”, Prenat Diagn., vol 15, pp 641-646 [123] Thompson and Thompson Genetics in Medicine – 6th edition - chapter [124] Thompson and Thompson Genetics in Medicine – 6th edition – Chapter [125] Troeger C., Zhong X., Burgemeister R., Minderer S., Tercanli S., Holzgreve W., Hahn S (1999), “Approximately half of the erythroblasts in maternal blood are of fetal origin”, Mol Hum Reprod, 5, pp 1162-1165 145 [126] Umberto N., Faustina L., Federica N., Cristina C., Hung B (2008), “The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration” Hum Reprod Update, 10(6), pp 541–548 [127] Van L., Arends J., Leffers P., Fuente A., Looij H., Geraedts J (1993) “The value of histomorphological features of chorionic villi in early spontaneous abortion for the prediction of karyotype”, Histopathology, 22, pp 557-563 [128] Vankayalapati P., Hollis B (2004), “Role of ultrasound in obstetrics”, Current Obstet Gynecol., 14, pp 92-98 [129] Wald N., (2000), “Advances in antenatal screening for Down’s syndrome”, Bailliere’s Clin Obstet Gynaecol., 14, pp 563-580 [130] Walknowska J., Conte F., Grumbach M (1969), “Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer”, Lancet, 1, pp 1119-1122 [131] Wang J., Zhen D., Falco V., Farina A., Zheng Y., Delli-Bovi L., Bianchi D (2000), “Fetal nucleated erythrocyte recovery: fluorescence activated cell sortingbased positive selection using anti-gamma globin versus magnetic activated cell sorting using anti-CD45 depletion and anti-gamma globin positive selection”, Cytometry, 39, pp 224-230 [132] Willems P., Dierickx H., Vandenakker E., Bekedam D., Segers N., Deboulle K., Vereecken A (2014), “The first 3,000 Non-Invasive Prenatal Tests (NIPT) with the Harmony test in Belgium and the Netherlands”, Facts Views Vis Obgyn., 6(1), pp 7–12 [133] Zeinab K., Leili M., Reza R., Farzaneh A., Abbas B., Masooma A., Sedigheh S (2015), “Evaluation of a Modified DNA Extraction Method for Isolation of CellFree Fetal DNA from Maternal Serum”, A J O Medic Biotech., 7(2), pp.85-88 [134] Zolotukhina T.V (2005), “Analysis of Cell-free Fetal DNA in Plasma and Serum of Pregnant Women”, J Histochem Cytochem, 53, pp 297-299 146 PHỤ LỤC HÌNH 147 Hình 3.5a Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi Hình 3.5b Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi Hình 3.5c Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi 148 Hình 3.5d Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi Hình 3.6a Ảnh nhân gen GAPDH mẫu tuần tuổi Hình 3.6b Ảnh nhân gen GAPDH mẫu tuần tuổi 149 Hình 3.6c Ảnh nhân gen GAPDH mẫu tuần tuổi Hình 3.6d Ảnh nhân gen GAPDH mẫu tuần tuổi Hình 3.7a Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến mẫu 301 150 Hình 3.7b Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 321 đến mẫu 540 Hình 3.7c Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 541 đến mẫu 555 Hình 3.7d Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 567 đến mẫu 623 151 Hình 3.8a Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến mẫu 301 Hình 3.8b Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 321 đến mẫu 540 Hình 3.8c Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 541 đến mẫu 555 152 Hình 3.8d Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 567 đến mẫu 623 Hình 3.9a Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 297 Hình 3.9b Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 298 153 Hình 3.9c Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 301 Hình 3.9d Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 303 Hình 3.9e Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 308 154 Hình 3.9f Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 314 Hình 3.9g Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 317 Hình 3.9h Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 322 155 Hình 3.9i Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 331 Hình 3.9k Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 542 Hình 3.9l Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 545 156