Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh alpha và bêta thalassemia

Tỉ lệ các loại alen đột biến và kiểu gen thalassemia ở các đối tượng nghiên cứu .... Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen đột biến thalassemia được phát hiện... Tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ dương

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT

VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA VÀ BÊTA THALASSEMIA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2013

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT

VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA VÀ BÊTA THALASSEMIA

Chuyên ngành: MÔ PHÔI THAI HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu

và kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng có ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Khắc Hân Hoan

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục i

Danh mục các chữ viết tắt iii

Ký hiệu các đột biến gen globin v

Danh mục các bảng vii

Danh mục biểu đồ x

Danh mục các sơ đồ x

Danh mục các hình xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các gen globin và sinh tổng hợp hemoglobin 3

1.2 Phân loại bệnh thalassemia 5

1.3 Tầm soát và chẩn đoán trước sinh 14

1.4 Các quy trình tầm soát và chẩn đoán trước sinh 24

1.5 Tình hình nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh thalassemia tại Việt Nam 28

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn vào mẫu nghiên cứu 31

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 31

2.1.3 Cỡ mẫu 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Biến số sử dụng trong nghiên cứu 33

2.2.2 Phương pháp tiến hành 35

2.2.3 Thu thập và phân tích số liệu 50

2.2.4 Y đức 51

2.2.5 Lợi ích mong đợi từ nghiên cứu 51

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52

3.1 Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu 52

3.2 Tỉ lệ các loại alen đột biến và kiểu gen thalassemia ở các đối tượng nghiên cứu 55

3.3 Khả năng tầm soát phát hiện đột biến thalassemia của chỉ số MCV và MCH 70

3.4 Kiểu hình huyết học của các kiểu gen thalassemia ở các đối tượng nghiên cứu 75

3.4.1 Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia 76

3.4.2 Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia 81

3.4.3 Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia kèm -thalassemia 86

Chương 4: BÀN LUẬN 89

4.1 Đánh giá về phương pháp nghiên cứu 89

4.2 Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu 92

4.3 Tỉ lệ các loại alen đột biến -thalassemia và -thalassemia 94

4.4 Tỉ lệ phát hiện đột biến -thalassemia và -thalassemia của chỉ số MCV và MCH 101

4.5 Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia, -thalassemia, -thalassemia kèm -thalassemia 105

KẾT LUẬN 119

KIẾN NGHỊ 121

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- 3.7 đột biến xóa đoạn 3,7 kb α + -thalassemia

-4.2 đột biến xóa đoạn 4,2 kb α + -thalassemia

MED đột biến xóa đoạn Mediterranean α0-thalassemia

SEA đột biến xóa đoạn South East Asia α0-thalassemia

 alen gen globin 1 và 2 bình thường

 19 đột biến điểm gen globin α1 tại codon 19, CGC>GGC

31 đột biến điểm gen globin α2 tại codon 31 AGG>TGG

 (832)  đột biến điểm gen globin α2 tại vị trí +832 G>A

 CS  đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Constant Spring

 QS  đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Quong Sze

α T α đột biến điểm gen globin α2

ααT đột biến điểm gen globin α1

 WS  đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Westmead

 gen globin beta, alen gen globin  bình thường

 0 đột biến  0 -thalassemia không tổng hợp chuỗi globin β

 + đột biến  + -thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin β

-28 đột biến điểm gen globin  tại vị trí -28 A>G

 cd17 đột biến điểm gen globin  tại codon 17AAG>TAG

 cd26 đột biến điểm gen globin  tại codon 26 GAG>TAG

 cd41 đột biến điểm gen globin  tại codon 41/42 -TCTT

 cd43 đột biến điểm gen globin  tại codon 43 GAG>TAG

 cd71 đột biến điểm gen globin  tại codon 71/72 +A

 cd95 đột biến điểm gen globin  tại codon 95 +A

 cd119 đột biến điểm gen globin  tại codon 119 -G

 del1393 đột biến xóa đoạn gen globin  Del 1393 bp

 del9.6 đột biến xóa đoạn gen globin  Del 9,6 kb

E đột biến gen globin  tạo HbE (codon 26 GAG>AAG)

 Ivs1 đột biến điểm gen globin  tại IVS 1-1 G>T

 Ivs2 đột biến điểm gen globin  tại IVS 2-654 C>T

tail đột biến điểm gen globin  tại poly A tail T>C

 thal đột biến -thalassemia giảm hoặc không tổng hợp chuỗi globin β,

không bao gồm đột biến  E (codon 26 GAG>AAG)

() del đột biến xóa đoạn DNA chứa gen  và 

ARMS amplification refractory mutation system: hệ thống khuếch đại đột

Hct hematocrit: dung tích huyết cầu

HGVS Human Genome Variation Society: Hiệp hội Đa dạng Bộ gen người

HS hypersensitive site: vị trí rất nhạy cảm

IVS intervening sequence: trình tự chèn hay intron

MCH mean corpuscular hemoglobin: số lượng Hb trung bình hồng cầu MCV mean corpuscular volume: thể tích trung bình hồng cầu

MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification: khuếch đại nhiều

đoạn dò phụ thuộc kết nối NESTROFT naked eye single tube red cell osmotic fragility test: xét nghiệm sức

bền thẩm thấu hồng cầu 1 ống quan sát bằng mắt thường

OF osmotic fragility: xét nghiệm sức bền thẩm thấu

PCR polymerase chain reaction: phản ứng kéo dài chuỗi

sequencing giải trình tự

TMNS thiếu máu nhược sắc

WHO World Health Organisation: Tổ chức Y tế Thế giới

wt wild type: kiểu gen bình thường

KÝ HIỆU CÁC ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN

Đột biến gen globin α

SEA Đột biến xóa đoạn DNA khoảng 20 kb chứa 2 gen α và không tạo ra

được mRNA Loại đột biến α 0 -thalassemia Danh pháp HGVS: NG_000006.1:g.26264_45564del19301

Thai Đột biến xóa đoạn DNA khoảng 34 – 38 kb chứa 2 gen α và không

tạo ra được mRNA Loại đột biến α0-thalassemia Danh pháp HGVS: NG_000006.1:g.10664_44164del33501

Dutch 2 Đột biến xóa đoạn hoàn toàn nhóm gen có chiều dài gần 70 kb và

không tạo ra được mRNA Loại đột biến α 0 -thalassemia

- 3.7 Đột biến xóa đoạn DNA dài 3,7 kb bao gồm đầu 3’ gen α2 và đầu 5’

gen α1 Loại đột biến α + -thalassemia Danh pháp HGVS: NG_000006.1:g.34164_37967del3804

- 4.2 Đột biến xóa đoạn DNA dài 4,2 kb làm mất hoàn toàn gen α2 Loại

đột biến α + -thalassemia

 CS  Đột biến ở gen α2 tại codon 142, TAA (Stop) đổi thành CAA, làm

kéo dài thêm 31 codon tạo ra chuỗi globin Constant Spring variant Loại đột biến α + -thalassemia Danh pháp HGVS: HBA2:c.427T>C

 QS  Đột biến ở gen α2 tại codon 125, CTG (Leucine) đổi thành CCG

(Proline) tạo ra chuỗi globin Quong Sze variant rất kém bền Loại đột biến α+-thalassemia Danh pháp HGVS: HBA2:c.377T>C

 WS  Đột biến ở gen α2 tại codon 122, CAC (Histidine) đổi thành CAG

(Glutamine) tạo ra chuỗi globin Westmead variant Loại đột biến α + thalassemia Danh pháp HGVS: HBA2:c.369C>G

2 +832 G>A Đột biến ở gen α2 tại vị trí +832, A đổi thành G Loại đột biến α+

-thalassemia Danh pháp HGVS: HBA2:c.*+107A>G

Đột biến gen globin β

-28 A>G Đột biến vùng promoter, vị trí -28, A đổi thành G làm giảm phiên

mã gen β Loại đột biến: β+ Danh pháp HGVS: HBB:c.-78A>G Codon 17

AAG>TAG

Đột biến ở codon 17 thuộc exon 1, AAG (Lysine) đổi thành TAG (Stop) làm dừng dịch mã gen β tại codon 17 Loại đột biến: β 0 Danh pháp HGVS: HBB:c.52A>T

Codon 26

GAG>AAG

Đột biến ở codon 26 thuộc exon 1, GAG (Glutamate) đổi thành AAG (Lysine) Đột biến tạo ra chuỗi globin E variant đồng thời tạo

ra vị trí ghép nối bất thường với đầu 5’ của IVS-1 Kiểu gen dị hợp

tử chỉ gây ra thiếu máu nhẹ Kiểu gen đồng hợp tử là rối loạn lành tính Dị hợp tử kép HbE và đột biến β-thalassemia gây thiếu máu nặng Danh pháp HGVS: HBB:c.79G>A

IVS 1-1 G>T Đột biến ở intron 1 tại vị trí 1, G đổi thành T

(AGGTTGGT->AGTTTGGT), làm thay đổi GT của vị trí ghép nối bình thường

nên không tạo được mRNA Loại đột biến: β 0 Danh pháp HGVS: HBB:c.92+1G>T

Codon 95 +A Đột biến chèn thêm A vào codon 95 thuộc exon 2, làm lệch khung

dịch mã và dừng dịch mã ở codon 101 (TGA : Stop) Loại đột biến:

β 0 Danh pháp HGVS: HBB:c.287_288insA

IVS 2-654

C>T

Đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi thành T

(AAGGCAATA->AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới Loại đột biến: β+ nặng Danh pháp HGVS: HBB:c.316-197C>T

Codon 119 -G Đột biến ở codon 119 thuộc exon 3, mất đi G làm lệch khung dịch

Del 9,6 kb Xóa đoạn 9,6 kb của nhóm gen globin β, từ HBB 11982-L12805

đến 9.6 kb dw' HBB11980-L12803 Loại đột biến: β 0 Del 1393 bp Xóa đoạn gen  dài 1393 nucleotide cách codon bắt đầu khoảng

500 pb đến phân nửa IVS 2 Loại đột biến: β 0

()del Đột biến xóa đoạn DNA chứa gen  và gen , gây kiểu hình

-thalassemia với HbF tăng

5 Bảng 1.5 Kiểu hình huyết học của kiểu gen HbE 13

6 Bảng 1.6 Các phương pháp tầm soát thalassemia dựa trên

MCV và MCH

16

7 Bảng 1.7 Năng lực của NESTROFT trong các nghiên cứu 16

8 Bảng 1.8 Các kỹ thuật phân tử chẩn đoán -thalassemia và

10 Bảng 2.1 Tỉ lệ mang gen bệnh -thalassemia, -thalassemia và

HbE của người Việt Nam trong một số nghiên cứu

33

11 Bảng 2.2 Định nghĩa các biến số của nghiên cứu 34

12 Bảng 2.3 Các biến số kết cục và biến số nền của nghiên cứu 35

13 Bảng 2.4 Các thông số phản ứng giải trình tự gen globin 2 và

1

46

14 Bảng 2.5 Các thông số phản ứng giải trình tự gen globin  48

15 Bảng 2.6 Trình tự các mồi sử dụng trong giải trình tự gen 1,

2 và 

49

16 Bảng 3.1 Đối tượng tham gia và loại mẫu xét nghiệm chẩn

đoán đột biến gen

52

17 Bảng 3.2 Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu 53

18 Bảng 3.3 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen đột biến thalassemia

được phát hiện

55

STT Tên bảng Trang

19 Bảng 3.4 Tỉ lệ đột biến thalassemia trong 44.439 thai phụ

khám thai tại BVTD

55

20 Bảng 3.5 Số lượng và tỉ lệ các alen đột biến được phát hiện 56

21 Bảng 3.6 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen thalassemia 62

22 Bảng 3.7 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai

phụ và chồng

63

23 Bảng 3.8 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai 64

24 Bảng 3.9 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai

phụ và chồng

65

25 Bảng 3.10 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai 66

26 Bảng 3.11 Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia kèm

30 Bảng 3.15 Tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ dương tính giả của các công

thức tầm soát đối với thai phụ và chồng được xét nghiệm tìm

đột biến thalassemia

70

31 Bảng 3.16 Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát

theo kiểu gen -thalassemia

71

32 Bảng 3.17 Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát

theo kiểu gen -thalassemia

72

33 Bảng 3.18 Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát

theo kiểu gen -thalassemia kèm -thalassemia

74

34 Bảng 3.19 Đặc điểm các chỉ số huyết đồ và ferritin của thai

phụ và chồng được chẩn đoán tìm đột biến gen

45 Bảng 3.30 Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen

-thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến --thalassemia kèm dị

hợp tử -thalassemia hoặc HbE

86

46 Bảng 3.31 Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen

-thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến --thalassemia kèm dị

hợp tử -thalassemia hoặc HbE

87

47 Bảng 3.32 Đặc điểm tỉ lệ HbE theo kiểu gen -thalassemia ở

thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị hợp tử HbE

88

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

1 Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ âm tính giả của các tiêu chuẩn tầm soát ở

người đột biến E/

73

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

1 Sơ đồ 1.1 Quy trình xét nghiệm tầm soát thalassemia tại Hy

3 Sơ đồ 1.3 Quy trình tầm soát thalassemia dựa trên OF/DCIP

tại Thái Lan

27

5 Sơ đồ 2.2 Xác định thể thalassemia dựa trên huyết đồ, ferritin,

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Nhóm gen globin α và β và sự tổng hợp globin,

hemoglobin ở các giai đoạn phát triển

3

2 Hình 1.2 Sơ đồ đột biến xóa đoạn +-thalassemia 6

3 Hình 1.3 Sơ đồ đột biến xóa đoạn 0-thalassemia (a) và xóa

6 Hình 1.6 Sơ đồ minh họa tầm soát HbE bằng DEAE 18

10 Hình 1.10 Kết quả điện di mao quản xác định trình tự DNA

gen globin 

23

11 Hình 2.1 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 39

12 Hình 3.1 Kết quả dò tìm đột biến SEA, -4.2, -3.7 bằng Multiplex

Gap-PCR

58

13 Hình 3.2 Kết quả xác định đột biến SEA bằng Gap-PCR 58

14 Hình 3.3 Kết quả dò tìm đột biến điểm CS bằng enzyme cắt

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh thalassemia gây thiếu máu tan máu là bệnh thường gặp trẻ em Việt Nam và cũng là bệnh đơn gen phổ biến nhất trên thế giới, tạo gánh nặng lớn cho gia đình và xã hội Nguyên nhân của thalassemia là do đột biến gen globin làm giảm tổng hợp một hoặc nhiều các tiểu đơn vị globin để tạo hemoglobin bình thường Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người

Vấn đề quản lý bệnh thalassemia bao gồm việc phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu dài bệnh nhân đã có Tuy nhiên, cải thiện kết quả điều trị và quản lý lâu dài đòi hỏi rất nhiều nguồn lực Ngoài ra, tầm soát toàn bộ quần thể là việc khó khả thi Vì thế, chương trình kiểm soát thalassemia thường được tiến hành ở mức độ phòng ngừa cấp hai với trọng tâm là tầm soát và chẩn đoán trước sinh nhằm phòng ngừa các trường hợp bệnh mới và giảm tần suất hiện mắc của bệnh Các quốc gia có tần suất bệnh thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc tầm soát và chẩn đoán trước sinh Đến nay, các phương thức tầm soát đơn giản và hiệu quả chủ yếu dựa trên các chỉ số của xét nghiệm huyết đồ như thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) và Hb trung bình của hồng cầu (MCH) Việc xác định các loại alen đột biến thalassemia phổ biến trong quần thể cũng giúp cho công tác chẩn đoán xác định được hiệu quả, nhanh chóng và chính xác

Do có tỉ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam rất cần một chương trình phòng chống thalassemia Đến nay, các nghiên cứu về tầm soát và chẩn đoán trước sinh còn rất ít và quy mô nghiên cứu nhỏ Một số nghiên cứu đã xác lập

được các kỹ thuật dò tìm, phát hiện đột biến gen, bước đầu đã khảo sát một số đột biến và đặc điểm huyết học và đề nghị sử dụng chỉ số MCV và MCH để tầm soát thalassemia như khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới và một số quốc gia khác Tuy nhiên, nhiều câu hỏi về tầm soát, chẩn đoán trước sinh vẫn chưa được làm rõ như: khả năng sử dụng chỉ số MCV, MCH vào tầm soát thalassemia đạt hiệu quả ra sao? Tỉ lệ đột biến -thalassemia, -thalassemia là bao nhiêu, loại nào thường gặp hơn? Đặc điểm kiểu hình của các đột biến thalassemia phổ biến này ra sao? Nếu triển khai áp dụng vào tầm soát và chẩn đoán trước sinh -thalassemia và -thalassemia sẽ có hiệu quả như thế nào?

Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ‘Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh -thalassemia và -thalassemia’

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Khả năng tầm soát phát hiện -thalassemia, -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng của chỉ số MCV, MCH như thế nào; đặc điểm kiểu hình huyết học của các đột biến thalassemia ra sao?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định tỉ lệ đột biến thalassemia và tỉ lệ các loại alen đột biến thalassemia và -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng

-2 Xác định tỉ lệ phát hiện đột biến -thalassemia và -thalassemia và tỉ

lệ dương tính giả của tiêu chuẩn MCV < 80 fL và tiêu chuẩn MCH < 27 pg ở phụ nữ mang thai và chồng

3 Xác định kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia, thalassemia, -thalassemia kèm -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng

-Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC GEN GLOBIN VÀ SINH TỔNG HỢP HEMOGLOBIN

1.1.1 Đặc điểm chung của các gen globin

Các gen globin nằm trong 2 nhóm gen (gene cluster) globin  và globin  (hình 1.1)

Hình 1.1 Nhóm gen globin α và β và sự tổng hợp globin, hemoglobin ở các giai

đoạn phát triển

“Nguồn: Nguyen Khac Hoan, 2005” [76]

Đặc điểm chung của các gen globin là có 3 exon mã hóa trình tự chuỗi protein, 2 intron chứa chuỗi xen không mã hóa và vùng khởi động (promoter)

tuần

đầu 5’ của gen Các exon mã hóa cho 141 axít amin của chuỗi giống  và 146 axít amin của chuỗi giống  Các intron dài từ 117 đến 1264 nucleotid Đặc biệt, intron 2 ở gen  có vai trò quan trọng trong quá trình gắn đuôi poly(A), giải phóng mRNA khỏi khuôn mẫu và vận chuyển ra bào tương [104]

1.1.2 Nhóm gen globin α

Nhóm gen globin  dài gần 28 kb, nằm cách 170 – 430 kb đến đầu tận cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16pter-p13.3; MIM ID: HBA1,+141880 và HBA2, +141850) Tính từ thượng nguồn (5’) đến hạ nguồn (3’), nhóm gen globin  bao gồm: gen , vùng HVR (hypervariation region) , gen  giả, 1 cặp gen  giả, 1 cặp gen  chức năng, gen  không biểu hiện và cuối cùng là một vùng HVR khác [104] Người bình thường có 4 gen  globin (/) và 2 gen  globin (/) Gen

1 và 2 chỉ khác nhau 2 vị trí ở intron 2 và vùng 3’ không mã hóa Tuy mã hóa cùng 1 loại protein nhưng gen 2 tổng hợp lượng globin  cao gấp 3 lần gen 1, nên đột biến (ĐB) gen 2 cho kiểu hình thiếu máu nghiêm trọng hơn [104]

Nằm ở thượng nguồn cách nhóm gen globin  40 kb – 50 kb là vùng điều khiển nhóm gen chứa các trình tự MCS-R1 đến MCS-R4 tương ứng với các vị trí rất nhạy với DNAse 1 đặc hiệu hồng cầu là HS-48, HS-40, HS-33 và HS-10 Trong số này, HS-40 (MCS-R2) nằm cách vị trí mũ chụp mRNA của gen ζ 40 kb đóng vai trò thiết yếu trong kiểm soát biểu hiện nhóm gen α [90]

1.1.3 Nhóm gen globin β

Nhóm gen globin  nằm trên nhiễm sắc thể 11 (11p15.4; MIM ID: HBB, +141900) dài gần 50kb, gồm 1 gen  phôi thai, 2 gen  thai, 2 gen  và  người lớn, 1 gen giả , và sắp xếp theo thứ tự 5’ -  - G - A -  -  -  - 3’ Kiểu gen của người bình thường là /, /, / và GA/GA [104]

Cách gen  khoảng 5 – 25 kb về phía thượng nguồn là LCR (locus control region) điều hòa nhóm gen  LCR chứa các HS được đánh số từ 5’HS1 đến 5’HS5, chứa các motif gắn các yếu tố hoạt hóa phiên mã giúp điều khiển mở các domain của nhóm gen  và tăng cường biểu hiện gen [90]

1.1.4 Sinh tổng hợp globin

Ở người, sự tổng hợp các chuỗi globin thay đổi theo các giai đoạn phát triển, loại chuỗi globin ở giai đoạn sau thay thế cho loại chuỗi globin ở giai đoạn trước (hình 1.1) [76],[97] Giai đoạn phôi sớm, túi noãn hoàng sản xuất chuỗi globin  và  để tạo thành các hemoglobin (Hb) chính của phôi là Hb Gower 1 (22), Hb Gower 2 (22), Hb Portland 1 (22) và Hb Portland 2 (22) Khi thai khoảng 4 tháng, sự sản xuất globin  bị ngừng lại [104]

Từ tuần thai thứ 6, globin  và  bắt đầu được sản xuất, HbF (22) tăng trở thành Hb chính HbA (22) bắt đầu được sản xuất khi thai 28 tuần Đến khi sinh, tỉ lệ HbA chiếm khoảng 15% tổng số Hb, HbA2 (22) chiếm tỉ lệ rất nhỏ, phần lớn còn lại là HbF Tuy nhiên, chuỗi  và HbF giảm nhanh sau sinh, thường ổn định khoảng 1 tuổi nhưng đôi khi kéo dài đến 2 tuổi [104]

Ở người lớn bình thường, HbA chiếm đa số với tỉ lệ khoảng 96%, HbA2

có tỉ lệ 2,5% - 3%, HbF ít hơn 1% Tỉ số HbA2 : HbA ở mức 1:40 [17]

1.2 PHÂN LOẠI BỆNH THALASSEMIA

Thalassemia là một nhóm bệnh do ĐB gen globin làm giảm sản xuất một hoặc nhiều các tiểu đơn vị globin để tổng hợp các Hb bình thường Dựa trên loại globin bị ảnh hưởng mà bệnh được phân thành 2 loại chính là -thalassemia và -thalassemia Ngoài ra còn có các loại thalassemia hiếm như

-, -, - và -thalassemia, và hội chứng tồn lưu HbF di truyền (HPFH)

có HbF cao kéo dài suốt đời do bất thường quá trình chuyển đổi từ HbF sang HbA [104] Ở nhiều quần thể, thalassemia cùng tồn tại với các Hb variant tạo

Hình 1.2 Sơ đồ đột biến xóa đoạn  +-thalassemia

“Nguồn: Harteveld, 2010”[56]

Trong nhóm ĐB gây α0-thalassemia (hình 1.3), có 3 kiểu phổ biến nhất

là SEA ở vùng Đông Nam Á, MED và 20.5 ở vùng Địa Trung Hải Một số

ĐB ở vùng điều khiển nhóm gen HS-40 cũng cho kiểu hình như ĐB α0thalassemia [56]

-Hình 1.3 Sơ đồ đột biến xóa đoạn  0 -thalassemia (a) và xóa đoạn HS-40 (b)

“Nguồn: Harteveld, 2010”[56]

Các loại ĐB điểm thường xảy ra trên gen α2 và gây α+-thalassemia ĐB tạo Hb Constant Spring (HbCS - ký hiệu αCSα) khá phổ biến ở vùng Đông Nam Á với tỉ lệ có thể đến 5% Đột biến HbCS xảy ra ở codon kết thúc gen α2, term Codon TAA (stop)  CAA (Glutamine) làm dịch mã kéo dài đến bộ

ba kết thúc mới ở codon 173 tạo chuỗi globin Constant Spring variant dài 172 axít amin Người dị hợp tử αCSα/αα có HbCS trong máu khoảng 1%, thấp hơn so với các loại chuỗi globin α variant khác, thường ở mức 25% [35]

Trên lâm sàng, bệnh -thalassemia được chia làm 4 mức độ gồm bệnh

Hb Bart’s, bệnh HbH, -thalassemia 1 và -thalassemia 2

1.2.1.1 Bệnh hemoglobin Bart’s

Bệnh Hb Bart’s xảy ra do xóa mất 4 gen α-globin hay đồng hợp tử 0thalassemia rất phổ biến ở Đông Nam Á và Địa Trung Hải với kiểu gen phổ biến nhất là SEA/ SEA và MED/ MED Thành phần Hb Bart’s chiếm khoảng 80% Thai bị bệnh này thường tử vong ở tuần 23 – 38 hoặc sớm sau sinh với đặc điểm thiếu máu rất nặng, gan lách to, phù toàn thân, suy tim, đôi khi kèm theo các dị tật bẩm sinh khác, hồng cầu nhược sắc, hình dạng và kích thước rất thay đổi, nhiều hồng cầu nhân (hình 1.4) [20],[104]

-Phụ nữ mang thai bệnh Hb Bart’s có thể bị nhiều biến chứng trong thai

kỳ như: tăng huyết áp (61%), tiền sản giật (30%), xuất huyết bất thường trước sinh (11%) Các biến chứng khác có thể xảy ra như: suy thận, suy tim tắc nghẽn, nhau bong non, thiểu ối, sinh khó, sót nhau và băng huyết sau sinh Nếu không được quản lý tốt, tỉ lệ tử vong mẹ có thể đến 50% [17],[68]

Hình 1.4. Đặc điểm hồng cầu và đại thể thai chết lưu của bệnh Hb Bart’s

“Nguồn: Harteveld, 2010”[56]

Năm 1996, Dương Bá Trực và cộng sự đã mô tả một số đặc điểm biểu hiện kiểu hình của 171 bệnh nhi HbH tại bệnh viện Nhi trung ương (bảng 1.1) Tuy nhiên nghiên cứu này không xác định được kiểu gen [15]

Bảng 1.1 Đặc điểm huyết học trên 171 bệnh nhi HbH tại Việt Nam

Bệnh -thalassemia 1 xảy ra do ĐB 2 gen  in cis ( /) hoặc in trans

(-/-, -/T, T/T) Kiểu gen SEA/αα, -3.7/-3.7 và -α3.7/αCSα khá phổ biến ở Đông Nam Á Người bệnh không có triệu chứng lâm sàng, ngoại trừ

một số thay đổi về chỉ số huyết học Trẻ sơ sinh có Hb Bart’s tăng 5 – 10% Người lớn có các chỉ số MCH và MCV giảm, HbA2 và HbF bình thường, tỉ lệ tổng hợp globin  so với  giảm còn khoảng 0,7 – 0,8 [17] Năm 1998, Galanello và cộng sự đã mô tả đặc điểm huyết học trên 526 người lớn mang 1 hoặc 2 alen ĐB -thalassemia (bảng 1.2) [49]

Bảng 1.2 Đặc điểm các thông số huyết học theo kiểu gen α-thalassemia

“Nguồn: Galanello, 1998” [49]

Kiểu gen Giới

tính

Cỡ mẫu

Hb (g/dL)

SLHC (x 10 12 /L)

MCV (fL)

MCH (pg)

HbA2 (%)

Người lớn bình thường hoặc có chỉ số huyết học ở dạng thalassemia với HbA2 và HbF ở mức bình thường (bảng 1.2) [26],[49] Kiểu gen CS/ có thể có HbCS ở mức 0,1 – 1,5% trên điện di Hb có độ nhạy cao Tỉ lệ tổng hợp globin  so với globin  ở hồng cầu lưới ngoại vi khoảng 0,8 – 0,9 [17]

1.2.2 Bệnh -thalassemia

Bệnh β-thalassemia xảy ra do ĐB gen β dẫn đến không tổng hợp chuỗi globin β (0-thalassemia, ký hiệu 0) hoặc giảm tổng hợp (+-thalassemia, ký hiệu +) hoặc giảm rất ít (β silent) [96] Đến nay, hơn 200 ĐB β-thalassemia

đã được mô tả nhưng mỗi quần thể chỉ có một vài ĐB β-thalassemia phổ biến (bảng 1.3) Trên lâm sàng, -thalassemia được phân thành 3 thể major, intermedia và minor tùy theo mức độ thiếu máu (bảng 1.4) [21],[96]

Bảng 1.3 Các đột biến  -thalassemia phổ biến ở một số quần thể trên thế giới

“Nguồn: Nguyen Khac Han Hoan, 2005” [76]

Việt Nam

-28 A>G

Đông Nam Á

-28 A>G

Địa Trung Hải

IVS 1-1 G>A

Ấn Độ

Codon 8/9 +G

Bảng 1.4 Chẩn đoán, kiểu gen và đặc điểm kiểu hình của  -thalassemia

“Nguồn: Kohne, 2011” [66]

Chẩn đoán Kiểu gen

Triệu chứng đặc trưng

HbA2 tăng, thay đổi HbF 70 - 90%

Bệnh nặng, thiếu máu phụ thuộc truyền máu lâu dài

Hb 6 - 10 g/dL MCV 55 - 70 fL MCH 15 - 23 pg

HbA2 tăng, thay đổi HbF tăng đến 100%

Bệnh vừa Mức độ phụ thuộc truyền máu thay đổi β-thalassemia

 -thalassemia trait thường không có triệu chứng, kiểu gen dị hợp tử

0- hoặc +-thalassemia Đặc điểm huyết học là TMNS hồng cầu nhỏ

HbA2 tăng khoảng 2 lần so với bình thường [104]

1.2.3 Các thể -thalassemia và -thalassemia khác

1.2.3.1 Dị hợp tử hemoglobin E và -thalassemia

HbE rất phổ biến ở Đông Nam Á do ĐB gen , codon 26 GAG (Glutamate)  AAG (Lysine) ĐB tạo ra globin E variant đồng thời mang đặc tính +-thalassemia do tạo ra vị trí ghép nối giả Khi HbE kết hợp với ĐB

-thalassemia sẽ tạo ra kiểu hình được mô tả ở bảng 1.5 [96]

Bảng 1.5 Kiểu hình huyết học của kiểu gen HbE

HbE tăng đến 85%

HbA2 < 5%

HbF = 15 to 25%

Như thalassemia major

-1.2.3.2 Kiểu gen kép -thalassemia kèm -thalassemia

Sự cùng tồn tại ĐB -thalassemia có thể điều chỉnh kiểu hình của ĐB thalassemia Sự kết hợp -/- hoặc / với +/+ hoặc kiểu gen bệnh HbH với +/+ hoặc +/0 làm giảm bệnh cảnh -thalassemia thành vừa hoặc nhẹ Thừa 2 gen  (/) hoặc (/) kết hợp  thalassemia nhẹ tạo ra  thalassemia vừa Tuy nhiên thừa 1 gen  (/) thì kiểu hình sẽ là

- thalassemia nhẹ thay đổi tùy thuộc vào loại ĐB của gen -globin [96]

1.2.3.4 -thalassemia có hemoglobin A2 bình thường

Đây là thể hiếm gặp, thường do ĐB δ+- hoặc δ0-thalassemia cùng hiện

diện in cis hoặc in trans với ĐB β-thalassemia như δ059 (codon 59 +A) in cis

với β+ IVS1-110; +27 (G>T) in cis hoặc in trans với IVS2-745 [96] hoặc do

-thalassemia cùng tồn tại với -thalassemia [95]

1.2.3.5 -thalassemia có hemoglobin A2 tăng cao bất thường

Thể này có HbA2 tăng cao khác thường trên 6,5% Nguyên nhân thường

do xóa đoạn DNA chứa các yếu tố điều hòa nhóm gen  HbA2 tăng cao thường kèm với HbF tăng nhẹ [104]

1.2.3.6 Hemoglobin Constant Spring và -thalassemia

Kiểu gen đồng hợp tử αCSα/αCSα có đặc điểm kiểu hình thiếu máu vừa, vàng da nhẹ, lách to Hồng cầu nhược sắc, kích thước và hình dạng thay đổi, hồng cầu lưới tăng đến 10%, đời sống hồng cầu giảm, hiệu quả sinh hồng giảm nhẹ [35] Đôi khi kiểu gen đồng hợp tử này gây bệnh HbH [48] Đặc biệt gần đây Charoenkwan và cộng sự đã mô tả một trường hợp thai có kiểu gen αCSα/αCSα nhưng lại bị thiếu máu rất nặng và phù thai [30]

1.3 TẦM SOÁT VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

1.3.1 Các phương pháp tầm soát trước sinh

Tầm soát là tiến trình nhận diện những người nguy cơ cao bị một tình trạng sức khỏe cụ thể nào đó Qua kết quả tầm soát, đối tượng nguy cơ cao sẽ được xét nghiệm thêm để chẩn đoán xác định bệnh và được sử dụng phương pháp điều trị phù hợp để giảm nguy cơ và / hoặc biến chứng

Hiện nay, các phương pháp tầm soát thalassemia được sử dụng phổ biến trên thế giới là 2 thông số MCV và MCH trong xét nghiệm (XN) huyết đồ

Ngoài ra, các quốc gia có tỉ lệ mắc bệnh cao nhưng nguồn lực kinh tế không cao như Ấn Độ và Thái Lan thì có thể áp dụng phương pháp tầm soát dựa trên sức bền của hồng cầu như sức bền thẩm thấu OF (osmotic fragility), dichlorophenolindophenol (DCIP) [45] và diethyl aminoethyl (DEAE) [94]

Ưu điểm của các kỹ thuật này đơn giản, độ nhạy cao, giá thành thấp nhưng lại

có tỉ lệ dương tính giả rất cao, những người dương tính sẽ phải tiếp tục tầm soát bằng huyết đồ

1.3.1.1 Phương pháp sử dụng chỉ số MCV và MCH

Các phương pháp phổ biến sử dụng 2 thông số MCV và MCH để tầm soát người mang gen thalassemia như phương pháp của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Shine & Lal, Mentzer, England Fraser, và Pearson (bảng 1.6) [10]

Hầu hết các quốc gia trên thế giới dùng chỉ số MCV và MCH để tầm soát Nếu MCV 80 < fL hoặc MCH < 27 pg bước kế tiếp là điện di Hb định lượng HbA2, HbF và làm phết máu để tìm thể H [67] Tuy nhiên cách tiếp cận này có thể bỏ sót các trường hợp bệnh HbE, HbS, HbC, HbD vì người dị hợp tử có thể có MCV và MCH bình thường [45]

Ở các nước đa văn hóa như Mỹ, Canada, Úc việc phát hiện người mang gen bệnh Hb không thể chỉ đơn thuần dựa vào huyết đồ rồi mới chỉ định điện

di Hb Thay vào đó tất cả các phụ nữ mang thai thuộc nhóm chủng tộc có nguy cơ bệnh Hb hoặc bệnh thalassemia cao đều được tầm soát bằng huyết đồ

để đánh giá MCV và MCH và điện di Hb [67]

Bảng 1.6 Các phương pháp tầm soát thalassemia dựa trên MCV và MCH

Công thức Ý nghĩa Nguồn WHO, 1989

MCV (fL) và MCH (pg) Độ nhạy > 92,5%

< 1530 hướng chẩn đoán thalassemia

> 1530 không hướng chẩn đoán thalassemia

[87]

Mentzer, 1973

SLHC MCV

MCV (fL) và SLHC (106) là số hồng cầu

< 13 hướng chẩn đoán thalassemia

> 13 hướng chẩn đoán thiếu máu thiếu sắt

[72]

England và Fraser, 1973

4 , 3 100

5 ' MCV SLHC HB

DF

DF: yếu tố phân biệt; HB (g) hemoglobin MCV (fL) và SLHC (106) là số hồng cầu

< 0 hướng chẩn đoán thalassemia

> 0 hướng chẩn đoán thiếu máu thiếu sắt Không áp dụng khi mang thai, MCV> 80 fL

Bảng 1.7 Năng lực của NESTROFT trong các nghiên cứu

“Nguồn: Singh, 2008” [88]

Singh

(2008)

Kattamis (1981)

Mehta (1988)

Garakshaker (1990)

Raghavan (1991)

Thomas (1996)

Manglani (1997)

Maheshwari (1999)

Sirichotiyakul (2004)

Hiện tượng ly giải hồng cầu được đánh giá bằng mắt thường kết hợp với định lượng quang học ở bước sóng 540 nm (A540) và chia làm 3 mức độ: âm tính (ly giải 91 - 100%), nghi ngờ (86 - 90 %) và dương tính ( 85 %)

1.3.1.3 Xét nghiệm DCIP

Năm 1973, Frischer sử dụng chất nhuộm xanh DCIP để khảo sát các rối loạn enzyme của hồng cầu [44] HbE trở nên đục khi tiếp xúc với chất nhuộm này Phương pháp này được dùng khá phổ biến để tầm soát trước sinh HbE tại nhiều vùng khó khăn ở Thái Lan [45] và được phát triển thành kit chẩn đoán hoàn chỉnh [85] Ống XN được đọc trực quan bằng mắt, so sánh độ đục của dung dịch XN với mẫu chứng âm trên một tiêu bản có 3 đường kẻ song song đặt trên hộp đèn sáng (hình 1.5) [29]

Hình 1.5 Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu  E /  (bên phải) và mẫu bình thường

1.3.1.4 Xét nghiệm DEAE

Năm 2012, Tatu và Kasinrerk phát triển phương pháp 1 ống XN tầm soát HbE sử dụng DEAE trên nhựa cellulose Phương pháp này dựa trên nguyên lý sắc ký lỏng trao đổi điện tích âm với nhựa DEAE-cellulose làm phase trạm và dung dịch đệm dẫn truyền NaCl thực hiện trong ống kín [94] HbE/A2 không gắn với nhựa cellulose nên vẫn hòa tan trong dung dịch ly giải, trong khi các

Hb khác gắn hoàn toàn vào nhựa Kết quả dương tính khi ống dung dịch có màu đỏ trong (cho thấy có HbE hiện diện), kết quả âm tính khi dung dịch không có màu (chứng tỏ không có HbE) (hình 1.6) [94]

Nghiên cứu tầm soát HbE trên 113 người và so sánh với điện di trên thạch cellulose acetate cho thấy DEAE phát hiện được 7 trường hợp HbE dương tính phù hợp hoàn toàn với kết quả điện di trên thạch [94]

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa tầm soát HbE bằng DEAE

“Nguồn: Tatu, 2012”[94]

1.3.2 Các phương pháp chẩn đoán di truyền phân tử

Nhiều phương pháp di truyền phân tử đã được phát triển, ứng dụng vào chẩn đoán thalassemia ở người và chẩn đoán trước sinh Tùy theo điều kiện của mỗi quốc gia và của phòng thí nghiệm mà kỹ thuật cụ thể được sử dụng

và điều chỉnh (bảng 1.8)

Bảng 1.8 Các kỹ thuật phân tử chẩn đoán  -thalassemia và  -thalassemia

-thalassemia -thalassemia

ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐÃ BIẾT

Realtime PCR Pornprasert 2011 [81] Pornprasert 2011 [80]

ARMS (amplification refractory

Microarrays Cremonesi 2007 [25] Cremonesi 2007 [25]

RFLP (restriction fragment length

ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN ĐÃ BIẾT

Realtime PCR Pornprasert [81] Pornprasert [80]

Gap-PCR Tan 2001 [93] Faa 1992 [42]

ĐỘT BIẾN CHƯA BIẾT

MLPA (multiplex ligation-dependent

Southern blot Kan 1979 [64]

Chemical cleavage of mismatch Dianzani 1991 [37]

1.3.2.1 Kỹ thuật khuếch đại alen đặc hiệu ARMS

Kỹ thuật ARMS được Newton mô tả năm 1989 để tìm ĐB điểm gen 1 antitrypsin [75] Năm 1990, Old và cộng sự áp dụng kỹ thuật này để phát hiện

ĐB -thalassemia [77] Tại Việt Nam, Trương Đình Kiệt năm 2003 và

Nguyễn Khắc Hân Hoan năm 2008 đã báo cáo các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ARMS để phát hiện ĐB -thalassemia [5],[6]

ARMS dựa trên đặc tính sự bổ sung nucleotide không tương hỗ ở đầu 3’

sẽ ngăn chặn sự kéo dài của mồi, làm phản ứng PCR không thể xảy ra (hình 1.7) Để xác định sự hiện diện của một ĐB cụ thể thì đầu tận của đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu cho 2 dạng bình thường và ĐB Mồi bình thường sẽ trơ với đoạn DNA mang ĐB và mồi ĐB sẽ trơ với đoạn DNA bình thường, chúng chỉ bắt cặp và cho ra sản phẩm PCR với đoạn DNA đặc hiệu

DNA bình thường

DNA đột biến

Hình 1.7 Nguyên lý của kỹ thuật ARMS

Đây là phương pháp đơn giản, chi phí thấp và có thể thực hiện ở dạng đa mồi (multiplex) Tuy nhiên, các đoạn mồi có thể bị thoái hóa và tạo ra những sản phẩm không đặc hiệu

1.3.2.2 Kỹ thuật Gap-PCR

Gap-PCR được sử dụng để phát hiện những ĐB xóa đoạn - và - thalassemia [32],[93],[100] Đối với 1 ĐB cụ thể, kỹ thuật này sử dụng 1 đoạn mồi chung và 2 đoạn mồi bổ sung cho alen bình thường và alen ĐB ở gần vị trí đứt gãy của gen Các alen được nhận diện dựa vào kích thước khác nhau của sản phẩm PCR được khuếch đại Hình 1.8 minh họa nguyên lý của kỹ

thuật gap-PCR với sản phẩm khuếch đại của alen ĐB SEA (P1P2) có kích thước khác với alen bình thường (P1P3)

Hình 1.8 Nguyên lý của kỹ thuật gap-PCR

1.3.2.3 Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn dò phụ thuộc kết nối MLPA

Kỹ thuật MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) dựa trên sự khuếch đại bằng PCR các đoạn dò DNA được lai thành công với trình

tự đích đặc hiệu và được chia thành 4 bước chính (hình 1.9)

 Bước 1: Biến tính chuỗi DNA đích và lai qua đêm với các đoạn dò đặc hiệu Các đoạn dò này gồm 2 chuỗi oligonucleotide riêng biệt, trên mỗi chuỗi đều mang trình tự mồi

 Bước 2: Phản ứng nối liền 2 chuỗi của đoạn dò bằng ligase sau khi cả hai chuỗi này đã lai thành công với trình tự đích

 Bước 3: Khuếch đại các đoạn dò đã lai và nối thành công bằng PCR nhờ vào trình tự mồi đã được thiết kế sẵn ở 2 đầu

 Bước 4: Phân tách đoạn sản phẩm PCR bằng điện di mao quản Những đoạn dò không được khuếch đại sẽ không cho tín hiệu khi điện di

Khác với các multiplex PCR chuẩn, kỹ thuật này chỉ dùng một cặp mồi cho tất cả các đoạn dò và có thể lai cùng lúc 40 – 50 đoạn dò cho các vị trí

10kb

Inter  HVR

40kb

HS40

khác nhau Sản phẩm sau PCR là các đoạn DNA có kích thước 130 – 480 bp được phân tách đoạn bằng điện di mao quản Kết quả sẽ được phân tích bằng cách so sánh các đỉnh DNA với mẫu chuẩn tham chiếu (hình 1.9) [58]

Hình 1.9 Nguyên lý của kỹ thuật MLPA

1.3.2.4 Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn

Đoạn DNA muốn khảo sát sau khi được khuếch đại bằng PCR sẽ được cắt tại các trình tự đặc hiệu bằng các enzyme cắt giới hạn Các vị trí cắt trên DNA có thể thay đổi tùy thuộc sự hiện diện của ĐB dẫn đến việc tạo ra các

đoạn DNA có kích thước khác nhau và được phát hiện bằng điện di trên gel [24],[57] Kỹ thuật này đơn giản, nhanh chóng và có độ tin cậy cao

1.3.2.5 Kỹ thuật phân tích trình tự gen

Kỹ thuật phân tích trình tự gen bằng máy tự động dựa trên nguyên tắc Sanger sử dụng 4 loại dideoxynucleotide triphosphat (ddNTP) được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang khác nhau để kết thúc chuỗi DNA Kỹ thuật phân tích trình tự gen trực tiếp bằng máy tự động có thể phân tích 300 - 1000 nucleotide trong 1 phản ứng Kỹ thuật được ứng dụng chủ yếu để phát hiện nhanh ĐB điểm hoặc xóa đoạn ngắn [63]

Phản ứng giải trình tự tương tự như PCR, nhưng chỉ sử dụng một mồi duy nhất do đó chỉ nhân được chuỗi DNA đơn Với sự hiện diện của các ddNTP phản ứng có thể kết thúc ngẫu nhiên ở bất cứ vị trí nào Nên kết quả cuối cùng là tạo nên nhiều đoạn DNA đơn có độ dài khác nhau được gắn huỳnh quang của ddNTP ở đầu 3’ Sản phẩm sau đó được điện di mao quản, đoạn kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn đoạn kích thước dài Hệ thống phần mềm giải trình tự sẽ thực hiện việc phân biệt kích cỡ các đoạn DNA, ghi lại dữ liệu màu huỳnh quang dưới dạng các đỉnh sắc phổ (hình 1.10)

Hình 1.10 Kết quả điện di mao quản xác định trình tự DNA gen globin 

1.4 CÁC QUY TRÌNH TẦM SOÁT VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

Các quy trình tầm soát, CĐTS với các loại XN được sử dụng phụ thuộc vào đặc điểm ĐB, chủng tộc, nguồn lực và hệ thống y tế của mỗi quốc gia

1.4.1 Quy trình tầm soát tại Hy Lạp

Hy Lạp có tỉ lệ người mang gen bệnh thalassemia rất cao Mô hình phòng chống thalassemia rất thành công của Hy Lạp tập trung vào tầm soát các phụ nữ mang thai và CĐTS người tầm soát dương tính như sơ đồ 1.1 [20]

Sơ đồ 1.1 Quy trình xét nghiệm tầm soát thalassemia tại Hy Lạp

thalassemia

- & thalassemia

HbF

Thiếu sắt

Bình thường

Bù sắt &

kiểm tra

Thể HbH

() thalassemia trait () thalassemia trait

-thalassemia có HbA2 bình thường

()- thalassemia HPFH

HbE hoặc khác

1.4.2 Quy trình tầm soát tại Canada

Canada là quốc gia có nguồn lực y tế mạnh, có đặc điểm dân số xã hội

đa văn hóa với thành phần dân cư di dân từ các vùng có tần suất mang gen bệnh thalassemia và bệnh Hb cao trên thế giới Quy trình tầm soát và chẩn đoán - và -thalassemia được thực hiện như sơ đồ 1.2 [67]

Sơ đồ 1.2 Quy trình tầm soát và chẩn đoán thalassemia tại Canada

“Nguồn: National Guideline, 2008”[67]

Chủng tộc Bệnh nhân + người phối ngẫu có nguy cơ thalassemia / bệnh Hb

Hb bình thường

MCV < 80 fL MCH < 27 pg Tăng HbA2 hoặc HbF

Hb variant (HbE, HbS…)

Người phối ngẫu:

bình thường 1 người  thal

1 người  thal

Vợ + chồng:

Cả 2 đều  thal hoặc

 thal + HbE/HbS/HBC Cả 2 mang gen

HbS/HbE/HBC

Người phối ngẫu bình thường

Vợ + chồng: thể H (+) hoặc

ferritin + HbA2 bình thường

Tư vấn di truyền, xét nghiệm tìm đột biến gen vợ + chồng

Đề nghị chẩn đoán trước sinh tìm đột biến gen cho thai (nếu có)

Nguy cơ thai bị bệnh thalassemia hoặc Hb thấp

Tất cả các thai phụ thuộc chủng tộc nguy cơ cao được tầm soát bằng XN huyết đồ và điện di Hb Nếu có bất thường thì tầm soát thêm người phối ngẫu bằng XN huyết đồ, phết máu tìm thể H, điện di Hb định lượng HbA2 và HbF

 Người có MCV < 80 fL hoặc MCH < 27 pg có thể bị - và/hoặc thalassemia và/hoặc TMNS Các loại Hb variant S, C, D, E có thể xác định bằng điện di Hb -thalassemia trait có thể chẩn đoán bằng điện di Hb định lượng HbA2 và HbF với HbA2 > 3,5%

- Nếu MCV thấp nhưng điện di Hb bình thường thì cần chẩn đoán phân biệt với thiếu máu thiếu sắt và -thalassemia bằng XN ferritin huyết thanh

và phết máu ngoại vi tìm thể H

 Xác định là mang gen -thalassemia nếu có thể H Tuy nhiên, XN thể

H có độ nhạy thấp và phụ thuộc vào chủ quan người đọc Vì thế thể H âm tính không thể loại trừ -thalassemia ở người thuộc chủng tộc nguy cơ cao

 Trường hợp thai phụ không thiếu sắt và thể H âm tính thì vẫn phải XN người phối ngẫu để xác định nguy cơ sinh con bệnh Hb Bart’s XN gen để xác định tình trạng mang ĐB -thalassemia

 Nếu cả 2 vợ chồng đều là người mang gen ĐB thalassemia hoặc Hb variant thì cần được tư vấn để XN tìm ĐB gen ở thai

Năm 1992, Skogerboe và cộng sự công bố độ nhạy của XN thể H ở bệnh nhân -thalassemia 1 khoảng 90% [89] Hiện nay XN tìm ĐB gen ngày càng nhanh chóng và chi phí thấp nên có thể bỏ qua bước nhuộm thể H và thực hiện tầm soát phân tử trực tiếp cho tất cả các trường hợp có MCV hoặc MCH thấp không giải thích được [67]