Tuyển choṇ các chủng vi sinh vâṭ taọ chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản

Trình bày các phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế bào.. Đưa ra kết quả và thảo luận: tuyển chọn các chủng vi sinh vật; tạo chế phẩm.. Hi

Tuyển cho ̣n các chủng vi sinh vâ ̣t ta ̣o chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy

sản

Nguyễn Thi ̣ Quỳnh Trang

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vâ ̣t ho ̣c; Mã số: 60 42 40

Người hướng dẫn: TS Bùi Thị Việt Hà

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Tổng quan tài liệu về tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới ; ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủy sản : nhiệt độ, độ ph, độ mặn Nghiên cứu tình hình ứng du ̣ng biê ̣n pháp sinh ho ̣c trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản ; vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước nuôi tôm, cá cũng như biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong việc cải tạo nước đầm nuôi trồng thủy sản Qua đó đưa ra ưu điểm và nhược điểm của biê ̣n phấp sử du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất, nước tại địa bàn Hà Nội Trình bày các phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế bào Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật Đưa ra kết quả và thảo luận: tuyển chọn các chủng vi

sinh vật; tạo chế phẩm

Keywords: Sinh học; Vi sinh vật; Xử lý nước thải; Nuôi trồng thủy sản

Content

1 Tổng quan tài liệu

Hiện nay, nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành kinh tế quan trọng của dât nước ta Tuy nhiên, việc nuôi trồng thủy sản cũng gặp không ít khó khăn Nguyên nhân chính là do các loài thủy hải sản rất nhạy cảm với môi trường, nếu môi trường không đảm bảo thì chúng rất dễ mắc bệnh và chết gây thiệt hại lớn cho người nuôi Điều đó cũng ảnh hưởng không nhỏ tới lợi ích quốc giá

Việc dùng các hóa chất và chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đang bộc lộ các nhược điểm như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng… hiện nay, người ta đã biết đến một biện pháp có thể cải thiện hiểu quả chất lượng nuôi trồng thủy sản đó là sử dụng chế phẩm sinnh học Chế phẩm sinh học (probiotic) được biết đến như là

quả xử lý nước ô nhiễm nhằm thay thế cho các loại thuốc kháng sinh và hóa chất đã được sử dụng trước đây

Ở nước ta việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản chỉ mới ứng dụng nhiều từ năm 2000 trở lại đây, qua thực tế sử dụng đã cho thấy kết quả tốt hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở nuôi tôm các đều sử dụng chế phẩm vi sinh vật Hiện nay các loài vi sinh vật Bacillus, Lactobacillus, nhón vi khuẩn quang dương,hóa dưỡng… được sẻ dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh hoc

2 Nguyên liêu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vi sinh vật

- Các chủng vi sinh vật phân lập được từ các mẫu đất, nước thuộc địa bàn Hà Nội

2.2 Phân lập và tuyển chọn

Các mẫu phân lập được pha loãng tới độ pha loãng cần thiết rồi cấy gạt trên môi trường thạch dinh dưỡng Nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 24 giờ Các khuẩn lạc mọc lên được kiểm tra hiển vi và kiểm tra các đặc điểm khác, nếu phù hợp sẽ được tuyển chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3 Xác định các hoạt tính enzym, kháng khuẩn, khả năng oxy hóa nitrat:

- Xác định hoạt tính enzym, hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp nhỏ dịch

- Xác định khả năng oxy hóa nitrat bằng cách đo hàm lượng nitrit theo phương pháp Therner và đo hàm lượng nitrat theo phương pháp Bruice

2.4 Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của vi sinh vật 2.5 Phương pháp tạo chế phẩm:

- Xác định một số điều kiện lên men xốp thích hợp cho các vi sinh vật lựa chọn

- Thử nghiệm chế phẩm vừa tạo được trong xử lý nước NTTS bị ô nhiễm với 1 bình đối chứng và 3 bình thí nghiệm

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập và tuyển chọn

- Từ các mẫu đất và nước ở địa bàn Hà Nội, chúng tôi đã phân lập được 31 chủng vi khuẩn Bacillus Thử hoạt tính enzym của các chủng này thì thu được năm chủng có hoạt tính mạnh nhất tiếp tục tiến hành thí nghiệm thì thu được kết quả như bảng sau:

Bảng 3.1: Hoạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn

Kí hiệu chủng Hoạt tính enzym (D-d,mm)

Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

Như vậy, chủng TL1 có hoạt tính enzym mạnh hơn cả Tiến hành xem xét các đặc điểm hình thái, sinh thái của chủng này chúng tôi xác đinh TL1 thuộc chi Bacillus

3.1.2 Lactobacillus:

Chúng tôi đã phân lập được chủng L5 có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh

Bảng 3.8: Hoạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5

Chủng

Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)

V parahaemolyticus E coli Salmonella typhi

Tiến hành xem xét đặc điểm hình thái sinh thái của chủng này cho thấy L5 thuộc chi Lactobacillus Sau đó tiến hành giải trình tự ARN 16s chủng L5 đã xác định được đây là loài

L plantarum

3.1.3 Các chủng oxy hóa nitrat

Phân lập được 13 chủng oxy hóa amôni và 10 chủng oxy hóa nitrit Trong đó hai chủng NA7 và NT2 có khả năng sinh trưởng và chuyển hóa các hợp chất nito cao nhất Sau khi nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh hóa chúng tôi xác định được NA7 thuộc chi Nitrosomonas và NT2 thuộc chi Nitrobacter

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng:

Chủng Bacillus phát triển tốt nhất trên môi trường LB với pH = 7, thời gian thích hợp là 48h, với nguồn cacbon là bột ngô và nguồn nito là bột đậu tương

Chủng L plantarum L5 phát triển tốt nhất trên môi trường có pH = 6-7, sau 48h với nồng độ muối là 2%

3.3 Tạo chế phẩm

3.3.1 Điều kiện lên men xốp thích hợp:

Môi trườ ng lên men xốp thích hợp : môi trường cám trấu, tỷ lệ cám: trấu thích hợp: tỷ lệ 5:5, thời gian lên men xốp: với Bacillus: 4 ngày; với Lactobacillus L5: 5 ngày, nhiệt độ: với Bacillus TL1: 30oC và với L plantarum L5: 35oC; độ ẩm (tỷ lệ nước: cám + trấu): 5: 5

3.3.2 Thử nghiệm chế phẩm trong xử lý nước NTTS:

Sau khi xử lý 10 ngày, chúng tôi thu được kết quả như sau:

các thông

số đơn vi ̣

Bình thí nghiệm Bình đối chứng Ngày

đầu

Sau 3 ngày

Sau 7 ngày

Sau 10 ngay

Ngày đầu

Sau 3 ngày

Sau 7 ngày

Sau 10 ngày

pH đv pH 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,1 Độ muối ‰ 21 19 19 20 21 20 19 20 Nitơ tổng

số mg/l N

7,00±

0,30

5,30±

0,42

5,00±

0,15

4,36±

0,11 7,00 7,01 6,98 6,92

NH3 N 1,34±

0,21

0,52±

0,023

0,15±

0,032

0,07±

0,015

1,34 1,33 1,35 1,32

NO2- mg/l 0,23±

0,02

0,17±

0,01

0,13±

0,03

0,12±

0,01 0,23 0,19 0,17 0,18

COD mg/l

15±

0,5

11,02±

0,49

7,08±

0,20

5,10±

0,36

15 14,2 13,9 13,5

BOD mg/l

8,9±

0,17

6,8±

0,16

4,7±

0,20

3,5±

0,10

8,9 8,2 8,0 7,8

Kết quả cho thấy sau 10 ngày thí nghiệm ở các bình thí nghiệm (có thêm chế phẩm) các chỉ số lý hóa sinh hóa của nước giảm rõ rệt và đạt dưới mức ô nhiễm: Nito tổng giảm 37,7% sau 10 ngày xử lý, NH3 giảm 91,8%, NO2 giảm 47,8%, COD giảm 66,0% và BOD giảm 60,6% Còn ở bình đối chứng (không thêm chế phẩm), các chỉ số đó giảm rất chậm và rất ít, nước vẫn ở tình trạng bị ô nhiễm

4 Kết luận

Đã tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có khả năng làm sạch nước được sử dụng để tạo chế phẩm vi sinh vật: chủng Bacillus TL1, chủng L plantarum L5, chủng Nitrosomonas NA7 và chủng Nitrobacter NT2 Tạo chế phẩm probiotic dạng rắn, bước đầu thử nghiệm chế phẩm trong xử lý nước NTTS Kết quả cho thấy chất lượng nước đã chuyển biến đáng kể theo chiều hướng tích cực sau 10 ngày xử lý

The sellection of microorganism strains to produce probiotic to treat aquaculture wastewater

1 Preface:

Nowadays, aquaculture is one of key industry in our country However, aquaculture also faces many difficulties It causes mainly by the high sensitive of aquatic animals to environment, if the environment is good enough, the animals will get deseases easily and die causing big loss for people That also effect to national benefit The use of chemic and antibiotic in aquaculture is disclosing their weaknesses, such as causing polluted environment, affect to consumers’ health… At present time, it is known that there is a method that can improve effectively the quality of aquaculture, it is the use of probiotic Probiotic is known as “alive microorganisms that given into the body an enough amount will useful for body health” For aquaculture, probiotic is considered as a safety and effective method to treat wastewater aiming to replace antibiotic and chemical substances that used before

2 Microorganisms and research methods:

2.1 Microorganisms

- Strains isolated from soil, water pattern in Hanoi

2.2 Isolation and selection

These patterns to isolate were mixed into water to the right level, then grow in a culture medium Put in 28 – 30oC for 24 hours The developed colonies were studied with microscope và studied other characters, if it was suitable to the demand, select it for farther experiments

2.3 Specify the enzyme, anti-bacteria activities, nitrate oxidation:

- Specify the enzyme, anti-bacteria activities by drop method

- Specify the nitrate oxidation activity by measure nitrite and measure nitrate

2.4 Study some conditions of culture affecting growth’s abitity of microorganisms

2.5 Method of produce probiotic:

- Identify some suitable fermentation condition for selected organisms

- Experiment probiotic in treating aquaculture wastewater with 1 control vessel and 3 exrperimental vessels

3 Result and discuss:

- Isolated 31 Bacillus strains Study their enzyme activities and find out 5 strains have the highest actitivities Then continue to experiment the 5 strains’ enzyme activities and result to the table:

Table 3.1: The 5 selected strains’ enzyme activities

Strains Enzyme activities (D-d, mm)

So, TL 1 strains has the highest enzyme activities Study its complexition we identify this strain as Bacillus genus

3.1.2 Lactobacillus:

We isolated L5 that can resist some bacteria c90ausing deseases

Strain Anti-bacteria activities (D-d, mm)

V parahaemolyticus E coli Salmonella typhi

Study this strain’s complexition, we found out that it be longs to Lactobacillus genus Then

we study the sequence of RNA 16s and found that it was L plantarum species

3.1.3 Nitrate oxidation strains

Isolated 13 amonia oxidation strains and 10 nitrite oxidation strains NA7 strain and NT2 strain are able to grow and convert the highest nitrogen compounds After studied their complexition, we specified NA7 strain belongs to Nitrosomonas genus and NT2 belongs to Nitrobacter genus

3.2 The elements affect growth ability:

Bacillus TL1 grow best in LB culture medium with pH = 7 in 48 hours and has a carbon source as may flour and has a nitrogen source as soybean flour

L plantarum L5 grow best in culture medium with pH = 6-7 in 48 hours with 2% NaCl

3.3 Produce probiotic

3.3.1 The suitable condition for fermentation

Medium for fermentation: bran + rice husk; the suitable rate: 5 brans : 5 rice husk; time: 4 days for Bacillus and 5 days for L plantarum L5; temperature: 30oC for Bacillus and 35oC for L plantarumL5; moisture: 5:5

3.3.2 Experiment probiotic in aquaculture wastewater:

After 10 days of treatment, we had the following result:

Indexed unit

Experimental vessels Control vessel First

day

After 3 days

After 7 days

After

10 days

First day

After

3 days

After 7 days

After 10 days

pH pH unit 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,1 Salt

concentration ‰ 21 19 19 20 21 20 19 20

Total nitrogen mg/l N 7,00±

0,30

5,30±

0,42

5,00±

0,15

4,36±

0,11 7,00 7,01 6,98 6,92

NH3 N 1,34±

0,21

0,52±

0,023

0,15±

0,032

0,07±

0,015

1,34 1,33 1,35 1,32

NO2- mg/l 0,23±

0,02

0,17±

0,01

0,13±

0,03

0,12±

0,01 0,23 0,19 0,17 0,18

COD mg/l

15±

0,5

11,02±

0,49

7,08±

0,20

5,10±

0,36

15 14,2 13,9 13,5

BOD mg/l

8,9±

0,17

6,8±

0,16

4,7±

0,20

3,5±

0,10

8,9 8,2 8,0 7,8

After ten days of experiment, the result shown that the chemiphysical and chembiotic indexes

in the experimental vessels decreased considerably and no more polluted: totol nitrogen decreased 37,7%; NH3 decreased 91,8%; NO2 decreased 47,8%; COD decreased 66,0% and BOD decreased 60,6% Meanwhile, in the control vessels these indexes decreased slowly and

a little, the water was still polluted

4 Conclusion

Selected 4 strains can clean the water to use to produce probiotic: Bacillus TL1, L plantarum L5, Nitrosomonas NA7 and Nitrobacter NT2 Produce solid probiotic, experiment

to use the probiotic for treating aquaculture wastewater The result shown that water quality was changed to good condition considerablely after 10 days of treatment

References

Tiếng Viê ̣t:

1 Nguyễn Tác An (1996), Phương pháp quản lý chất lượng nước phục vụ nuôi trồng thủy

hải sản, Giáo trình cao học, Đa ̣i ho ̣c thủy sản Nha Trang

2 Nguyễn Tác An (1998), Báo cáo đề tài “Điều tra hiện trạng môi trường ven biển thành

phố Nha Trang và đề xuất các giải pháp cải thiê ̣n và phát triển môi trường” , Nha

Trang

3 Bộ khoa học công nghệ và môi trường (2000), Tiêu chuẩn nước sinh hoạt TCVN

6772-2000, tiêu chuẩn nước cho bảo vệ đời sống thủy sinh TCVN 6773-6772-2000, Hà Nội

4 Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước giàu hợp chất nitơ và photpho, Nhà xuất bản Khoa học tự

nhên và Công nghệ, Hà Nội

5 Lê Văn Cát, Đỗ Thị Hồng Nhung, Ngô Ngọc Cát (2006), Nước nuôi thủy sản: Chất

lượng và biện pháp cải thiện chất lượng, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội

6 Công ty cổ phần chứ ng khoán An Bình – Phòng phân tích (2010), Báo cáo Ngành Thủy

sản Việt Nam

7 Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản (2000), “Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh, hóa chất

và chế phẩm trong môi trường nuôi tôm”, Trích tham luận tại hội nghị phát triển

nuôi tôm tạo sản phẩm vệ sinh thực phẩm khu vực miền chung và miền nam, Thông

tin Khoa học công nghệ, số 9, tr 11-12

8 Cục Khai thác và Bảo vệ Nguồn lợi thủy sản (2003), Chuyên đề : Tình hình nuôi trồng

thủy sản trên thế giới và các vấn đề đáng quan tâm – số 4 / 2003

9 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất

bản Giáo dục, Hà Nội

10 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục,

Hà Nội

11 Hồ Thanh Hải (1999), Tiềm năng về điều kiê ̣n tự nhiên và nguồn lợi sinh vật vùng triều

cửa sông ven biển cho phát triển thủy hả i sản, Báo cáo hội thảo khoa học về quản

lý và sử dụng bền vững tài nguyên và môi trường đất ngập nước cửa sông ven biển , Hà Nội

12 Nguyễn Văn Hảo (2002), Một số vấn đề về kĩ thuật nuôi tôm sú công nghiệp, Nhà xuất

bản Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh

13 Lại Thúy Hiền (1998), “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn khử

sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8, tr 37-38

14 Nguyễn Đứ c Hô ̣i (1996), Phương pháp thu và phân tích mẫu lý – hóa học nước, Trung

tâm thông tin KHKT và kinh tế thủy sản , Viê ̣n nghiên cứu thủy sản 1, Hà Nội

15 Hoàng Huệ (1996), Xư ̉ lý nước thải, Nhà xuất bản Xây dựng, Hà Nội

16 Khoa Thuỷ Sản, trường Đại học Cần Thơ (2000), Cẩm nang ki ̃ thuật nuôi thủy sản nước

lợ, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội

17 Lê Văn Khoa (Chủ biên) (2003), Chỉ thị sinh học môi trường, Nhà xuất bản Giáo dục

18 Trần Tường Lưu (1994), “Đánh giá về một số khía cạnh môi trường liên quan đến bệnh

tôm ở khu vực phía Nam”, Báo cáo kết quả nghiên cứu chương trình khảo sát

nguyên nhân gây chết tôm nuôi tại khu vực phía Nam và biện pháp phòng trừ để phát triển nghề nuôi tôm, Phần I, Viện nghiên cứu môi trường thủy sản II, thành

phố Hồ Chí Minh

19 “Một số bệnh tôm nuôi và biện pháp phòng chống”, Thông tin khoa học công nghệ thủy

sản, số 9/2002

20 Nguyễn Văn Nam, Phạm Văn Ty “Vai trò của chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy

sản”, Tạp chí Thông tin Khoa học Công nghệ - Kinh tế thủy sản, số 3/2007, tr 27 –

28

21 Nguyễn Trọng Nho (1994), Tình hình nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam, một số đặc

điểm của tôm sú, Đại học Thủy sản

22 Nguyễn Trọng Nho – Tạ Khắc Thường và ctv (1996), Các chỉ tiêu sinh thái chủ yếu

trong các ao nuôi tôm ở các tỉnh Nam Trung bộ và vấn đề nâng cao năng suất ở đây, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ, Nha Trang

23 Nguyễn Trọng Nho, Tạ Khắc Cường, Lục Minh Diệp , Nguyễn Thi ̣ Xuyến (1997), Nghiên

cứu cải tiến quy trình nuôi tôm sú thi ̣t tại Khánh Hòa đạt h iê ̣u quả kinh tế cao và năng suất ổn đi ̣nh, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Nha Trang

24 Lương Đức Phẩm (2000) Vi sinh vật lương thực và thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục,

Hà Nội

25 Lương Đức Phẩm (2002), Công nghệ xử lý nước thải bằng các biện pháp sinh học, Nhà

xuất bản Giáo dục, Hà Nội

26 Văn Phú (2003), “Bio – niềm tin trọn ve ̣n của người nuôi tôm ”, Tạp chí thủy sản ,

(12/2002, 1/2003)

27 Lê Thị Phượng (2010), Nghiên cứu chất lượng nước trong các đầm nuôi tôm vùng rừng

ngập mặn ven biển huyê ̣n Giao Thủy , tỉnh Nam Định và một số biện pháp sinh học làm sạch nước trong các đầm nuôi tôm, Luâ ̣n án tiến sĩ sinh ho ̣c

28 Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội

29 Phan Lương Tâm và ctv (1998), “Kết quả bước đầu đánh giá nguyên nhân gây chết tôm ở

các tỉnh phía Nam”, Tạp chí thủy sản, Hà Nội, tr 149-162

30 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Hà Nội

31 Đặng Ngọc Thanh (1974), Thủy sản họ c đa ̣i cương , Nhà xuất bản đại học và trung học

chuyên nghiê ̣p , Hà Nội

32 PGS TS Ngô Tự Thành (2001), “ Sự phân bố, sinh trưởng và sinh tổng hợp protease

ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội”, Tạp chí sinh học 23, tr 153-157

33 Nguyễn Việt Thắng (1998), “Xác định nguyên nhân chính gây bệnh cho tôm ở Đồng

bằng sông Cửu Long và các giải pháp tổng hợp”, Các công trình nghiên cứu khoa

học công nghệ thủy sản 1991-1995, Vụ Khoa học công nghệ, Hà Nội, tr 163-173

34 Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động của sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD, chlo hữu

cơ trong môi trường nước ảnh hưởng đến khả năng xảy ra bệnh đốm trắng, bệnh

đàu vàng trên tôm nuôi ở Khánh Hòa”, Tạp trí thủy sản, 43, Bộ Thủy sản-Trung

tâm nghiên cứu thủy sản III, tr 5-15