XÁC ĐỊNH LOẠI VI KHUẨN TRONG ỐNG TỦY CỦA RĂNG VIÊM QUANH CUỐNG MẠN TÍNH Trần Thị An Huy, Nguyễn Mạnh Hà, Nguyễn Vũ Trung Tóm tắt: Lý nghiên cứu: Xác định vi khuẩn ống tủy viêm quanh cuống mạn sở để lựa chọn thuốc bơm rửa sát khuẩn ống tủy nhằm làm vi khuẩn đem lại thành công điều trị.Phương pháp: Bệnh phẩm ống tủy 47 chân nuôi cấy điều kiện kị khí Vi khuẩn định danh PCR giải trình tự gen.Kết quả:Trong ống tủy có từ đến loài vi khuẩn 15 chivi khuẩn kỵ khí tùy tiện phát hiện, Streptococcuschiếm (70%), Nesseria, Haemophylus, Actinomyces chiếm 27,66%; 17,02%; 17,02% Có chivi khuẩn kỵ khí bắt buộc gồm Prevotella, Veillonella, Campylobacter, Lactobacillus, Fusobacterium Dialister Có4 chivi khuẩn hiếu khí (10,09%) chủ yếu làBacillus Vi khuẩn Haemophylus, Actinomyces,Streptococcus, Bacillus, Nesseriacó mặt hầu hết sưng đau(p< 0,01).Kết luận: Trong ống tủy viêm quanh cuống mạn tính có vi khuẩn kỵ khí (chiếm 89,81%)và vi khuẩn hiếu khí (10,19%), kỵ khí tùy tiện chiếm tỷ lệ cao (76, 86%).Từ khóa: Vi khuẩn nội nha I.ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm quanh cuống mạn tính bệnh miệng hay gặp Đâylà bệnh điều trị nội nha phức tạp Có hai phương phápđiều trị bệnh viêm quanh cuống mạn tính: Điều trị nội nha kết hợp với phẫu thuật cắt cuống Điều trị nội nha không phẫu thuật Trước đây, phương pháp Điều trị nội nha kết hợp với phẫu thuật cắt cuống áp dụng phổ biến Ngày nay, với tiến khoa học, điều trị nội nha không phẫu thuật mang lại kết điều trị cao, hạn chế lo lắng, căng thẳng trước phẫu thuật tai biến kinh phí cho người bệnh [1] Việc thành công điều trị nội nha không phẫu thuật liên quan đến việc làm vi khuẩn ống tủy hàn kín khít chiều không gian để mang lại lành thương vùng quanh cuống Thất bại điều trị nội nha hầu hết không loại bỏ vi khuẩn [2].Chúng ta loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn phương pháp bơm rửa tạo hình ống tủy có chỗ dụng cụ đưa tới [3] Đặt thuốc ống tủy công nhận có tác dụng diệt vi khuẩn sót lại sau trình tạo hình bơm rửa Trên thực nghiệm, Kalchinov cho thấy, thuốc sát khuẩn có ưu tác dụng diệt số loài vi khuẩn khác [4], Việc lựa chọndung dịch bơm rửa thuốc sát khuẩnống tủy thích hợp để làm vi khuẩn ống tủy cho viêm quanh cuống mạn tính vấn đề cần đặt ra.Điều phụ thuộc vào loại vi khuẩn có mặt ống tủy Trên giới có nhiềucông trình nghiên cứu vi khuẩn nội nha: Pinheiro cộng (2003) [2], ShaikhaAl-Samahi cộng năm2012[5] nghiên cứu vi khuẩn bệnh viêm quanh cuống mạn tính.Rôças (2012) phát số vi khuẩngặp bệnh viêm quanh cuống mà điều trị nội nha thất bại[6] Ở Việt Namchưa có nghiên cứu vi khuẩn thường gặp ống tủy viêm quanh cuống mạn tính Để góp phầnchọn lựa thuốc bơm rửa sát khuẩn hữu hiệu, mang lại kết tốt cho điều trị viêm quanh cuống mạn, chúng tôitiến hành nghiên cứu “Xác định loạivi khuẩn ống tủy viêm quanh cuống mạn” với mục tiêu sau: Xác định số vi khuẩn có ống tủy củarăng viêm quanh cuống mạn tính điều trị nội nha không phẫu thuật II.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân có viêm quanh cuống mạn tính điều trị Trung tâm Kỹ thuật cao Viện đào tạo Răng Hàm Mặt, Khoa Răng Hàm Mặt Bệnh viện Đại học Y Hải phòng Khoa Răng Hàm Mặt Bệnh viện Đại học Y Hà Nội 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân có chân viêm quanh cuống mạn tính, có tổn thương vùng cuống X-quang với đường kính nhỏ 10mm Bệnh nhân đủ sức khỏe để chữa hợp tác suốt trình điều trị.2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:Những định điều trị nội nha (Răng nứt dọc, không khả phục hồilại chức ăn nhai, thẩm mỹ;răng có chân dị dạng, ống tủy canxi hóa) 2.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 2.3 Địa điểm nghiên cứu: 2.3.1 Nghiên cứu lâm sàng: Tất bệnh nhân khám, chẩn đoán, lấy mẫu xét nghiệm Viện đào tạo Răng Hàm Mặt,Khoa Răng Hàm Mặt Bệnh viện Đại họcY Hải phòng,Khoa Răng Hàm Mặt Bệnh viện Đại học Y Hà nội 2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn: Tất cảmẫu xét nghiệm tiến hành Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu: Phần nghiên cứu nằm đề tài luận án nghiên cứu sinh Trong bệnh nhân đánh giá có mặt vi khuẩn ống tủy viêm quanh cuống mạntính trước sau điều trị Do vậy, thiết kế nghiên cứu phần thực chất mô tả có mặt vi khuẩn trước điều trị Cỡ mẫu tính theo công thức củanghiên cứu can thiệp lâm sàng không đối chứng đánh giá hiệu theo mô hình trước – sau 2.4.2 Mẫu nghiên cứu n1 = n2 = [ Z (1−α / ) p(1 − p ) + Z1− β [ p1 (1 − p1 ) + p2 (1 − p2 ) ]2 ( p1 − p2 ) * Cỡ mẫu: Trong đó: n1 = Cỡ mẫu nghiên cứu cho trước nghiên cứu n2=Cỡ mẫu nghiên cứu cho sau nghiên cứu Z (1−α / ) Z (1− β ) = Hệ số tin cậy (95%), = Lực mẫu (90%) p1= Tỷ lệ có nang u hạt ≤1 cm X- quang trước điều trị(100%) p2= Tỷ lệ có nang u hạt ≤1 cm X- quang, thành công sau điều trị 70% (dựa vào kết nghiên cứu Molven năm2002[7]) p= (p1 + p2 ) /2 Cỡ mẫu tối thiểu tính n1 = 47 2.4.4 Tiến hành nghiên cứu lâm sàng lấy bệnh phẩm 47 chẩn đoán viêm quanh cuống mạn tính qua khám lâm sàng chụp X-quang: + Khám lâm sàng: Đánh giá độ đổi màu răng, tìm lỗ rò, tìm nguyên nhân sang chấn khớp cắn, tổn thương tổ chức cứng không sâu Làm nghiệm pháp thử tủy máy thử tủy + Chụp X-quang để chẩn đoán Từ hình ảnh X-quang đánh giá kích thước tổn thương vùng cuống * Tiến hành lấy bệnh phẩm nghiên cứu vi khuẩn: Bệnh nhân lấy cao sẽ, vệ sinh miệng Nếu có lỗ sâu dùng mũi khoan tròn lấy hết ngà mủn, rửa lỗ sâu nước muối sinh lý Dùng đam cao su cô lập điều trị, sát trùng Betadin Dùng mũi khoan tròn, trụ vô trùng để mở vào buồng tủy ống tủy Dùng côn giấy vô trùng đưa vào buồng tủy ống tủy đặt phút, sau lấy côn giấy đưa vào eppendorf vô trùng Chuyển eppenford có chứa bấc bệnh phẩm đến Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương vòng giờ.Trong trình vận chuyển mẫu bệnh phẩm bảo quản lạnh hộp có chưa đá khô Tại Khoa xét nghiệm, bệnh phẩm nuôi cấy kỵ khí môi trường thạch máu môi trường socola điều kiện kỵ khí.Sau vi khuẩn mọc, đánh giá tính chất khuẩn lạc (hình thể, màu sắc, tan máu ).Chọn khuẩn lạc đại diện cho loại (trên môi trường BA kị khí) cấy chuyển sang môi trường môi trường BA kị khí khác để khuẩn lạc Nhuộm Gram để quan sát hình dạng vi khuẩn qua kính hiển vi; chụp ảnh hình thể vi khuẩn Trong chờ làm PCR khuẩn lạc bảo quản nhiệt độ -200 C + Định danh vi khuẩn kỹ thuật PCR:Quy trình PCR theo Takashi Suzuki cộng sự[8] PCR thực máy C 1000 hãng Biorad Giải trình tự Nucleotide hệ thống máy 3130 sequencer hãng Applied Biosystem Trình tự gen 16S sau giải trình tự, phân tích phần mềm ATGC 72 (Nhật) so sánh tương đồng ngân hàng liệu gen (GenBank) để xác định tên vi khuẩn Xử lý số liệu: Theo phương pháp thống kê y học, sử dụng chương trình SPSS 16.0 Kiểm định χ2 Giá trị p< 0,05 coi khác biệt có ý nghĩa thống kê III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bệnh phẩm từ ống tủy 47 viêm quanh cuống mạn tính qua nuôi cấy kỵ khí giải trình tự gen phương pháp PCR, tìm 38loại vi khuẩn khác xếp vào 25 chitheo Biểu đồ Biểu đồ 1: Tỷ lệ chi vi khuẩn phát đượcở 47 viêm quanh cuống mạn Nhận xét:Streptococcus chiếm tỷ lệ cao (70%) Tiếp đến chiNesseria, Haemophylus, Actinomyces chiếm 27,66%; 17,02%; 17,02%.Enterococcus faecalis tìm thấy 5/47 Có chi vi khuẩn kỵ khí bắt buộc gồm Prevotella, Veillonella, Campylobacter, Lactobacillus, Fusobacterium Dialister.Có chi vi khuẩn hiếu khí tổng số 25 chi tìm ống tủy,trong đóBacillus chiếm tỷ lệ cao (17,2%) A Hình 1: Kết điện di sản phẩm gen 16 rRNA, giếng số 11 sản phẩm PCR khuẩn lạc số 11 B Hình 2: Kết giải trình tự gen khuẩn lạc số 11 Mỗi có từ 1đến loài vi khuẩn Có 28/47 có đến loài vi khuẩn; 19/47 có từ loài vi khuẩn trở lên Có tất 108 khuẩn lạc thuộc 25 chi vi khuẩn kỵ khí hiếu khí nuôi cấy phân lập xác định Bảng 1: Tỷ lệ vi khuẩn kỵ khí hiếu khí Vi khuẩn Hiếu khí Số lượng 11 Tỷ lệ (%) 10,18 Kỵ khí bắt buộc Kỵ khí tùy tiện Tổng 14 83 108 12, 96 76, 86 100,00 Nhận xét: Vi khuẩn kỵ khí tùy tiện chiếm tỷ lệ cao (76,86%), vi khuẩn kỵ khí bắt buộc chiếm 12,96%, thấp vi khuẩn hiếu khí (10,18%) Vi khuẩn kỵ khí bao gồm vi khuẩn kỵ khí bắt buộc kỵ khí tùy tiện chiếm 89,82% Trong tổng số 25 chi vi khuẩn phát ống tủy 47 răng, có chi vi khuẩn hay gặp là: Streptococcus, Bacillus, Haemophylus, Actinomyces, Nesseria Sự phân bố chi vi khuẩn có sưng đau theo bảng 2: Bảng 2: Phân bố chi vi khuẩn ống tủy có sưng đau không sưng đau Triệu chứng lâm sàng Vi khuẩn Streptococcus Bacillus Haemophylus Actinomyces Nesseria Răng có sưng đau n % 27 81,81% 100,00 100,00 100,00 10 71,43 Răng không sưng đau n % 18,19 0, 00 0, 00 0, 00 28,57 Tổng n 33 8 13 % 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 p p0,05) IV BÀN LUẬN Kết nuôi cấy43 răngchưa điều trị điều trị nội nha phát thấy có mặt vi khuẩn Điều phù hợp với thực tế, hầu hết chưa điều trị nội nha Theo Pinheiro (2003) cấy vi khuẩn ống tủy 60 điều trị nội nha lại, có 15% vi khuẩn không mọc [2] Nguyên nhân ống tủy điều trị nội nha córất vi khuẩn Vi khuẩn lấy với mùn ngà trình bơm rửa, vi khuẩn lại cư trú vùng chóp Nghiên cứu cho thấy, có từ đến vi khuẩn khác ống tủy, tính theo chi ống tủy có từ đến chi.Có 28 mà ống tủy có đến loài vi khuẩn; 19 ống tủy có từ vi khuẩn trở lên Ống tủy điều trị nội nha thường thấy có chi vi khuẩn tương tự nghiên cứu Pinheiro (2003) điều trị nội nha có viêm quanh cuống mạn tính Theo nghiên cứu này, 28/51 có chi vi khuẩn [2].Trong nghiên cứu chúng tôi, số chi vi khuẩn nhiều ống tủy cao chưa điều trị nội nha Trong nghiên cứu này, phát 38 loài vi khuẩn thuộc 25 chi, chủ yếu chi vi khuẩn kỵ khí số vi khuẩn hiếu khí Các vi khuẩn kỵ khí tùy tiện chiếm tỷ lệ cao vềsố loài,đứng đầu làStreptococcichiếm 70%.Trong chủ yếu làStreptococcus sanguinis(24/47 răng).Tiếp đến Nesseiria, Haemophylus, Actinomyces,Bacillus chiếm tỷ lệ 27,66%; 17,02%; 17,02% Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Anda Mindere (2010) viêm quanh cuống mạn điều trị tủy,Streptococcus Actinomyces chiếm tỷ lệ cao (27%; 27%)[10] Ở ống tủy viêm quanh cuống Streptococcusvà Actinomyceslà vi khuẩn đáp ứng với điều trị Chúng thường tìm thấy điều trị nội nha không thành công Những vi khuẩn có khả thích ứng với thay đổi môi trường.Enterococcus facalis tìm với tỷ lệ 8,51%, chủ yếu điều trị tủy lại Đây vi khuẩn thách thức điều trị nội nha [6],[9] Các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc phát đượcgồm: Veillonella, Lactobacillus, Campylobacter, Fusobacterium, Oribacterium, Dialister, Prevotella Nghiên cứu Pinheiro phát Lactobacilli, Campylobacter, Dialister, Prevotella, Fusobacteriumtrong ống tủy viêm quanh cuống mạn điều trị nội nha Điều chứng tỏ rằng,đây vi khuẩn khó điều trị Theo kết nghiên cứu Bảng 1, tỷ lệ vi khuẩn kỵ khí 89,82% Trong đó, vi khuẩn kỵ khí tùy tiện 76,86%; vi khuẩn kỵ khí bắt buộc 12,96% Vi khuẩn kỵ khí tùy tiện chiếm tỷ lệ cao Chúng thường xuất điều trị tủy lại [9].Nghiên cứu củaAnda Mindere phát 56% vi khuẩn kỵ khí tùy tiện cao vi khuẩn kỵ khí bắt buộc (29%) hiếu khí (15%) [10] Vì để thành công điều trị, phải áp dụng kỹ thuật tạo hình ống tủy đại kết hợp với dung dịch bơm rửa thuốc sát khuẩn phù hợp Bảng cho thấy, 33 có Streptococcus ống tủy, 27/33 có sưng đau (chiếm 81,81%).13 phát có Nesseiria,10/13 có sưng đau (chiếm 71,43%) có mặt vi khuẩn Haemophylus, Actinomyces, Bacillusđều phát răng, 100% có sưng đau.Kết nghiên cứu Pinheiro ShaikhaAl-Samahicũng cho thấy,Streptococcus, Actinomyces, Bacillus có liên quan đến sưng đau [2],[5] Bảng 3cho thấy, có lỗ rò có loài vi khuẩn hiếu khí nhiều không lỗ rò (có loài vi khuẩn hiếu khíđược tìm thấy) Tuy nhiên, khác biệt ý nghĩa thống kê với p>0,05 Tương tự tất có lỗ rò, phát có51 khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí Trong lỗ rò 46 Sự khác biệt ý nghĩa thống kê Ở có lỗ rò, thường có xâm nhập vi khuẩn hiếu khí kỵ khí từ môi trường vào ống tủy qua lỗ rò Hoặc là, lỗ rò tạo môi trường tốt cho vi khuẩn hiếu khí phát triển V KẾT LUẬN: Trong ống tủy viêm quanh cuống mạn tính có vi khuẩn kỵ khí hiếu khí Vi khuẩn kỵ khí tùy tiện chiếm tỷ lệ cao 76,86% Ở có sưng đau, thường có vi khuẩn kỵ khí tùy tiện hiếu khí TÀI LIỆU THAM KHẢO Trịnh Thị Thái Hà (2013),“Bệnh lý cuống răng”,Chữa vàNội nha,Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr 80-91 Pinheiro E.T, Gome B.P (2003), "Microorganisms from canal of root-filled teeth with periapical lessions", International Endodontic Journal, 36, pp -11 Peters L.B, Van Winkelhoff A.J, Buijs J.F (2002), “Effects of instrumentation, irrigation and dressing with calcium hydroxide on infection in pulpless teeth with periapical bone lesions”,Int, Endod J, 35(1), pp 13-21 Kalchinov V, DimitrovSl., Belcheva M (2009), “In vitro study of bactericidal effect of antimicrobial agents used in modern endodontics”,Journal of IMAB Annual Proceeding (Scientific Papers), book 2, pp 79-82 ShaikhaAl-Samahi, Mohammad Al-Omari(2012),“Detection of bacteria in endodontic samples and its association with defined clinical signs and symptoms of endodontic infection”,J Clin Microbiol, 50(5), pp 1721-1724 Isabela N Rôças , José F Siqueira, Jr (2012), “Characterization of Microbiota of Root Canal-Treated teeth with Posttreatment Disease”,Journal of clinical Microbiology, 50(5), pp 1721-1724 Molven O., Halse A., Fristad I.(2002), “Periapical changes following root-canal treatment observed 20-27 years postoperatively”,International Endodontic Journal, 35, pp 784–789 Takashi Suzuki, Hirotoshi Iihara, Toshihiko Uno (2007), “Suture-Related Keratitis Caused by Corynebacterium macginleyi- case reports”,Journal of clinical microbiology, Nov., pp 3833–3836 Rosé F.Siqueira Jr., Isabela N Rocas (2014), "Endodontic Microbiology", Endodontic: Principles and Practice, Chapter 3, pp 38 -46 10 Anda Mindere, Rita Kundzina, Vizma Nikolajev(2010), "Microflora of root filled teeth with apical periodontitis in Latvian patients”,Stomatologija, Baltic Dental and Maxillofacial Journal, 12, pp.116-121 DETECTIONS OF MICROORGANISMS FROM ROOT CANALS OF TEETH WITH CHRONIC PERIAPICAL LESIONS Tran Thi An Huy, Nguyen Manh Ha, Nguyen Vu Trung Abstract Aim:The objective of the present study was to identify the bacteria in root canals of teeth with chronic periapical lesions Methodology:Forty seven teethwith chronic periapical lesions were selected for this study Samples from root canals were taken, cultured on the proper media Bacteria were identified by PCR and sequencing.Results: Microorganisms were recovered from 47 teeth In most cases, one or 9species per canal were found There were fifth teen facultative anaerobic genus (76,86%), represented asStreptococci (70%), Nesseria, Haemophylus, Actinomyces: 27,66%; 17,02%; 17,02% There were six obligate anaerobic genus (12,96%): Prevotella, Veillonella, Campylobacter, Lactobacillus, Fusobacterium, Dialister; four aerobic species (10,09%), mainly wereBacillus.Haemophylus, Actinomyces, Streptococcus, Bacillus presented in almost the chronic apical periodontitis teeth with pain (p< 0.01) Conclusion: This reseach detectived anaerobic genus of bacteria and anaerobic genus of bacteria in root canals of teeth with chronic periapical lesions Facultative anaerobic bacteria was the most commonly found Keywords:Microorganisms in Endodontic, Endodontic microbiology 10