TỔN THƯƠNG THỂ vân LIỀM ĐEN TRÊN mô HÌNH gây BỆNH PARKINSON BẰNG 6 – HYDROXYDOPAMIN ở CHUỘT CỐNG TRẮNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** TRỊNH THỊ NGỌC YẾN TỔN THƯƠNG THỂ VÂN - LIỀM ĐEN TRÊN MÔ HÌNH GÂY BỆNH PARKINSON BẰNG – HYDROXYDOPAMIN Ở CHUỘT CỐNG TRẮNG ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ HÀ NỘI – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** TRỊNH THỊ NGỌC YẾN TỔN THƯƠNG THỂ VÂN - LIỀM ĐEN TRÊN MÔ HÌNH GÂY BỆNH PARKINSON BẰNG – HYDROXYDOPAMIN Ở CHUỘT CỐNG TRẮNG Chuyên ngành: Mô – Phôi thai học Mã số: 62720101 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Mạnh Hà HÀ NỘI – 2015 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 6-OHDA : 6-Hydroxydopamin GABA : Gamma-aminobutyric Acid MFB : Medial Forebrain Bundle MSNs : Medium Spine Neurons MTPT : 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6 Tetrahydropyridin ROS : Reaction Oxygen Spieces TH : Tyrosine Hydroxylase MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Parkinson bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer đặc trưng thoái hóa tế bào thần kinh tiết dopamin đường thể vân – liềm đen não Bệnh Parkinson có nhiều phương pháp điều trị: điều trị nội khoa, kích thích não điện cực cấy vào nhân bèo nhạt nhân đồi biện pháp làm giảm triệu chứng bệnh Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ tế bào gốc vào điều trị bệnh phương pháp mang lại nhiều triển vọng cho bệnh Parkinson [1] Phương pháp cho có nhiều ưu điểm vượt trội không cải thiện triệu chứng lâm sàng bệnh mà làm ngừng tiến triển bệnh Các tế bào gốc ngoại bì thần kinh bào thai ghép vào thể vân biệt hóa thành tế bào sản xuất dopamin sau ghép, tạo synap với tế bào thần kinh người bệnh [2] Tuy nhiên, nghiên cứu bệnh nguyên, chế bệnh sinh cách điều trị nhiều hạn chế nhà nghiên cứu tiến hành thí nghiệm người bệnh sống Vì vậy, gây bệnh thực nghiệm loài động vật đóng vai trò quan trọng Ngay từ đầu kỷ XIX, nhà khoa học tiến hành mô hình gây bệnh thực nghiệm động vật cách gây tổn thương cho não nhiệt độ, phẫu thuật, chất gây độc hệ thần kinh để tìm hiểu tổn thương hệ thần kinh trung ương Sau đó, có nhiều mô hình gây bệnh thực nghiệm Parkinson loài động vật khác (chuột, mèo, linh trưởng, ruồi giấm….) phương thức khác chủ yếu sử dụng chất gây độc hệ thần kinh mô hình chuyển gen Mỗi mô hình gây bệnh có ưu điểm nhược điểm tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu mô hình gây bệnh chất gây độc hệ thần kinh cho mô hình thích hợp cho việc nghiên cứu ứng dụng biện pháp điều trị can thiệp bệnh Parkinson [3] [4] 6-hydroxydopamin (6-OHDA) chất gây độc thần kinh sử dụng mô hình gây bệnh Parkinson lần năm 1968 Ungerstedt Mô hình sau cải thiện trở thành mô hình gây bệnh phổ biến nghiên cứu chế phương pháp điều trị bệnh So với chất gây độc sử dụng mô hình gây bệnh 6-OHDA có khả gây thoái hóa tế bào thần kinh tiết dopamin từ từ, mô giống với trình diễn biến bệnh giống người dễ dàng đánh giá triệu chứng biểu bệnh não chuột bị tổn thương nên ứng dụng nhiều để nghiên cứu phương pháp điều trị [4] [5] Ở Việt Nam, năm 2013, môn Mô-Phôi trường Đại học Y Hà Nội tiến hành đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu ứng dụng qui trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai động vật người để điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm” Để đánh giá hiệu việc điều trị cần mô hình gây bệnh giống với diễn biến bệnh để đánh giá tổn thương khả phục hồi tế bào thần kinh tiết dopamin Do đó, tiến hành đề tài: “Tổn thương thể vân - liềm đen mô hình gây bệnh Parkinson 6-Hydroxydopamin chuột cống trắng” với hai mục tiêu: Xác định cấu trúc thể vân, liềm đen não chuột cống trắng Đánh giá tổn thương tế bào tiết dopamin thể vân liềm đen sau tiêm 6-hydroxydopamin vào thể vân chuột cống trắng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Parkinson mô hình gây bệnh Parkinson 1.1.1 Đại cương bệnh Parkinson Bệnh Parkinson rối loạn thần kinh thoái hóa tiến triển với ba triệu chứng lâm sàng điển hình: run, cứng (rigidity) giảm vận động Bệnh phát lần vào năm 1817 James Parkinson, thường gặp người 50 tuổi Đây bệnh tương đối phổ biến với tỉ lệ mắc bệnh giới 90-120/100.000 dân, Việt Nam 1,6% người 65 tuổi, tần suất mắc bệnh nam cao gấp 1,5 lần nữ Tỉ lệ mắc có xu hướng tăng với tỉ lệ mắc 20/100 000 dân/năm [1] Đến năm 60 kỷ XX, người ta tìm dopamin - chất dẫn truyền trung gian hóa học não có vai trò quan trọng bệnh sinh bệnh Parkinson 1.1.2 Giải phẫu mô bệnh học bệnh Parkinson Mô bệnh học bệnh Parkinson thoái hóa nơron tiết dopamin đường thể vân - liềm đen Khi 60% tế bào bị biểu triệu chứng lâm sàng Mất tế bào không thấy liềm đen mà liềm xanh, vỏ não, đồi thị [3] [6] Đặc điểm mô bệnh học bệnh parkinson có mặt thể Lewy Thể Lewy chất vùi trong, đồng tâm, bắt màu toan có bào tương tế bào thần kinh liềm đen Trung tâm thể khối tròn đặc, không đồng nhất, xung quanh quầng sáng Dưới kính hiển vi điện tử, thể Lewy có đường kính khoảng 15 µm, trung tâm tập trung nhiều túi cầu đậm độ điện tử, xung quanh vòng sợi dày – 10 nm Thể Lewy gặp nhiều liềm đen, thể vân, nhân lưng dây thần kinh phế vị, chất lưới trung não cầu não, gặp vùng đồi, thể Luys hạch giao cảm Cấu tạo nên thể Lewy gồm có xơ thần kinh nhiều loại protein bao gồm α-synuclein, parkin, ubiquitin thành phần αsynuclein [7] [8] [9] Thực chất trình hình thành thể Lewy chưa làm sáng tỏ người ta hướng nhiều tới bất thường chuyển hóa tế bào thần kinh [7] Vị trí tổn thương bệnh Parkinson đường thể vân – liềm đen Năm 1959, Carlson tìm đường vòng dopamin Lượng dopamin chiếm 50% catecholamin hệ thần kinh trung ương Thể vân chiếm 80% lượng dopamin não Những nghiên cứu năm gần chết tế bào hệ tiết dopamin có vai trò quan trọng việc gây bệnh Các hệ thống tiết dopamin nhiều bị ảnh hưởng khác phụ thuộc vào giai đoạn bệnh Phần đặc liềm đen (substantia nigra pac compacta) bao gồm thân tế bào thần kinh tiết dopamin tiếp nối chủ yếu vào thể vân bị tổn thương khoảng 40 – 80%, nhiên tế bào gian não bị tổn thương khoảng 40 – 50% Ngay phần đặc liềm đen tổn thương không đồng nhất: vùng đuôi vùng bụng bên bị tổn thương nặng nề phần khác Ngoài ra, số tế bào thần kinh thuộc hệ tiết dopamin võng mạc, đặc biệt điểm vàng bị tổn thương Có điều đặc biệt không thấy tổn thương tế bào tiết dopamin quanh cuống não, đồi, tủy sống tế bào thần kinh thuộc hệ tiết adrenalin nhân xanh (locus coeruleus), tế bào thần kinh tiết serotonin nhân đan (n Raphe), tế bào thần kinh tiết cholin nhân meynert nhân cuống – cầu não lại bị tổn thương Như vậy, tổn thương nhiều hệ lý giải phần phong phú triệu chứng lâm sàng thể bệnh Diễn biến trình tổn thương tế bào tiết dopamin khó xác định Khi xem xét hình ảnh giải phẫu bệnh liềm đen người bình thường 10 người mắc bệnh parkinson, liềm đen có màu nhợt sắc tố Các tác giả thống dấu hiệu bệnh parkinson run, tăng trương lực xuất 50 – 70% tế bào thần kinh tiết dopamin liềm đen bị thoái hóa Trong lâm sàng nghiên cứu khó để định lượng tế bào tiết dopamin thoái hóa sinh thiết người bệnh sống để đánh giá xác mức độ tổn thương Việc định lượng thực thông qua phương pháp chụp chức não chụp cắt lớp phát photon đơn (SPECT), chụp cắt lớp phát điện tử dương (PET) Tuy nhiên, tiến triển từ từ, nặng dần lên bệnh nói lên tổn thương, hủy hoại tế bào thần kinh chức Gần đây, có công trình nghiên cứu diễn biến lâm sàng trình dẫn truyền dopamin cho thấy có lẽ vùng đuôi bụng phần đặc liềm đen bị tổn thương trước tiên, sau đến vùng mỏ, lưng, gian não Hiện tượng tổn thương lan tỏa hệ tiết dopamin cho thấy chế bệnh tổn thương tế bào thần kinh 33 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: môn Mô - Phôi, trường Đại học Y Hà Nội - Thời gian: nghiên cứu thực thời gian từ tháng 10/2015 6/2016 2.4 Qui trình thực 2.4.1 Tiêm 6-OHDA vào thể vân não chuột - Gây mê màng bụng cho chuột Ketamin liều 100 mg/kg - Cố định chuột bàn định vị Hình 2.1: Bàn định vị não chuột - Cạo lông vùng đầu chuột, rạch da theo đường não chuột Xác định tọa độ tiêm: tiêm lần tọa độ cách phía đuôi thóp 4,4 mm, cách đường 1,2 mm, bên màng cứng 7,8 mm, với đường ngang (toothbar) đặt đường ngang tai (interaural) 2,4 mm Tiêm lần vị trí cách thóp phía đuôi 4,0 mm, cách đường 0,8 mm, bên màng cứng 8,0 mm, với đường ngang đặt đường ngang tai 3,4 mm 34 Bregma Lambda 9.0 mm Bregma Interaural Line Lambda 10.0 mm Incisor Bar Hình 2.2: Xương sọ chuột [40] Vị trí, khoảng cách thóp trước (Bregma) thóp sau (Lamda) đường ngang tai (Interaural line) Dùng vi tiêm microsyringe Hamilton tiêm 2.5 µl 6-OHDA (3 µg/µl - 0.2 mg/ml ascorbate-saline) Giết chuột vào thời điểm: sau tiêm 6-OHDA: tuần (5 chuột), tuần - (5 chuột), tuần (5 chuột) Phẫu tích lấy não chuột làm tiêu vi thể, siêu vi thể, hóa mô - miễn dịch để đánh giá tổn thương thể vân liềm đen, so sánh bên não lành không tiêm bên não tiêm 6-OHDA: sử dụng atlat não chuột để phẫu tích qua vùng có chứa thể vân liềm đen 2.4.2 Cấu trúc hình thái vi thể Xác định cấu trúc vi thể vùng thể vân liềm đen não chuột bên não lành bên não tiêm 6-OHDA thời điểm tuần, tuần tuần  Phương pháp: Nhuộm Hematoxylin & Eosin (H.E) - Cố định mảnh mô Formadelhyd 10%: ngày 35 - Chạy qua cồn 70°, 80°, 90°, 100°: 2giờ/cốc - Chạy qua toluene: giờ/ cốc x cốc - Ngấm nến - Đúc block paraffin - Cắt lát mỏng 3-4 μm - Khử paraffin toluene - Tẩy toluene cồn - Ngâm nước cất: – 10 phút - Nhuộm nhân Hematoxylin - Rửa nước thường - Nhuộm bào tương Eosin - Nhúng cồn 100°  Chạy qua nước: ngày Lên kính Nhuộm Cajal II: - Cố định mô não cồn ammoniac: - Rửa nước - Nhuộm dung dịch AgNO3 1,5%, 37°C: ngày - Ngâm vào nước cất phút - Ngâm vào dung dịch Acid pyrogalic 1%, 37ºC: ngày - Rửa nước cất phút - Khử nước cồn - Khử cồn toluene - Đúc block - Cắt tiêu - Tẩy paraffin qua cốc toluene - Qua toluene ấm 1-2 36 - Gắn lamen 2.4.3 Xác định cấu trúc siêu vi - Cố định Glutarandehyt 2,5%/ cacodylate 0,1M, pH 7,2-7,4 qua đêm 4°C - Rửa mẫu dung dịch cacodylate 0,1M (15 phút/lần x lần) - Cố định a.osmic 1%/ cacodylate 0,1M nhiệt độ phòng - Rửa mẫu cacodylate 0,1M 15 phút x lần - Khử nước cồn nồng độ tăng dần 50°, 70°, 90°, 100° (15 phút/ lần x lần) - Tẩy cồn propylene oxyte (15 phút/lần x 2) - Ngâm eponxy nguyên chất qua đêm - Đúc eponxy nguyên chất nhộng gelatin (60° - 48 giờ) - Cắt lát mỏng 30-40 nm, đặt lưới đồng có màng fowar - Nhuộm Uranyl acetate: 10 phút citrate chì: phút - Để mẫu khô tự nhiên 2.4.4 Nhuộm hóa mô miễn dịch với marker TH - Cố định PFA 4%, nhiệt độ phòng - Ngâm sucrose 20% qua đêm 4°C để mô chìm xuống đáy dung dịch - Đúc OCT - Đông lạnh -20ºC đến -80ºC - Cắt lát – 10 μm máy cắt lạnh - Để mẫu mô khô 30 phút nhiệt độ phòng - Rửa PBS 0,1 M pha với triton X-100 0,3% 10 phút/ lần x lần - Hoạt hóa kháng nguyên dung dịch đệm natri citrate 0,1M, pH 6.0 96° 20 phút - Đưa lại nhiệt độ bình thường, chạy nước 10 phút - Rửa tiêu PBS 0,1 M pha triton X-100 (0,3%) 30 phút x lần - Block kháng nguyên không đặc hiệu dung dịch: 5% NGS; 0,3% Triton X-100 PBS 0,1 M nhiệt độ phòng 37 - Nhuộm kháng thể TH (Abcam, ab 112, pha loãng 1/750) qua đêm 4°C - Rửa PBS 0,1M 1giờ/lần x3 lần - Nhuộm kháng thể huỳnh quang (Alexa Fluor 546 goat anti rabbit, pha loãng 1/200) 2h nhiệt độ phòng, từ bước tránh ánh sáng - Rửa PBS 0,1M 1giờ/lần x lần - Nhuộm nhân Sytox Green (pha loãng 1/10000) phút - Rửa PBS 0,1M 10 phút/ lần x3 lần - Dán lamen Fluoromount G 2.4.5 Định lượng số lượng tế bào tiết dopamin liềm đen - Cắt lát cắt liên tiếp qua toàn liềm đen (sử dụng atlat não chuột [40], lát cắt có chiều dày 20 µm - Nhuộm hóa mô miễn dịch với marker TH toàn lát cắt - Đếm số lượng tế bào tiết dopamin nửa bán cầu lát cắt Đếm tế bào nguyên vẹn, nhân bào tương rõ ràng Sử dụng công thức hiệu chỉnh Abercrombie (1946) để tránh sai số đếm lặp lại tế bào lát cắt liên tiếp, từ tính số lượng tế bào thực tế lát cắt [41] [42] T N=n D+T Trong đó: N : Tổng số tế bào thực tế n : Số lượng tế bào đếm D : Đường kính trung bình tế bào đếm T : Độ dày lát cắt - Tính số lượng trung bình tế bào tiết dopamin nửa bán cầu não k N= N ∑ Ni i =1 k : Số lượng tế bào tiết dopamin trung bình bên bán cầu não Ni: Số lượng tế báo tiết dopamin lát cắt 38 k: tổng số lát cắt 2.4.6 Mật độ sợi thần kinh dương tính TH thể vân Trên lát cắt qua vùng thể vân, đặt đường thẳng có chiều dài 100 µm nửa bán cầu Đếm tất sợi thần kinh cắt qua đường thẳng bên bán cầu não Coi tổng số sợi thần kinh dương tính TH bên não lành 100%, tính tỷ lệ phần trăm sợi thần kinh dương tính TH bên não tiêm 6OHDA so với bên não lành [43] 2.5 Các tiêu nghiên cứu - Đặc điểm đại thể vủa thể vân liềm đen bên não không tiêm bên não tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần - Cấu trúc vi thể thể vân liềm đen bên não không tiêm bên não tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin nhuộm Cajal II - Cấu trúc siêu vi thể thể vân liềm đen bên não không tiêm bên não tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần - Số lượng tế bào thần kinh tiết dopamin tiêu nhuộm hóa mô miễn dịch với marker TH bên não không tiêm bên não tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần - Tỷ lệ mật độ sợi thần kinh dương tính TH giảm thể vân sau tuần, tuần tuần so với bên não lành 2.6 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm chuột cống trắng nằm phạm vi đề tài độc lập cấp Nhà nước hội đồng đạo đức trường Đại học Y Hà Nội thông qua 39 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Đặc điểm đại thể lát cắt qua vùng chứa thể vân Hình 3.1: Hình ảnh đại thể qua vị trí tiêm 6-OHDA thể vân Hình 3.2 Hình ảnh đại thể liềm đen 3.2 Cấu trúc vi thể thể vân Hình 3.3: Đặc điểm vi thể thể vân bên não lành nhuộm H.E Hình 3.4: Tổn thương vi thể thể vân sau tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần nhuộm H.E Hình 3.5: Tiêu nhuộm Cajal II thể vân bên não lành Hình 3.6: Tiêu nhuộm Cajal II thể vân sau tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần 3.3 Cấu trúc siêu vi thể thể vân Hình 3.7: Cấu trúc siêu vi thể thể vân bên não lành Hình 3.8: Cấu trúc siêu vi thể thể vân sau tiêm 6-OHDA tuần, tuần tuần 3.4 Cấu trúc vi thể liềm đen Hình 3.9 Đặc điểm vi thể liềm đen nhuộm H.E bên não lành bên não tổn thương Hình 3.10 Tiêu nhuộm Cajal II bên não lành bên não tổn thương 3.5 Cấu trúc siêu vi thể liềm đen 40 Hình 3.11 Cấu trúc siêu vi thể liềm đen bên não lành Hình 3.12 Cấu trúc siêu vi thể liềm đen bên não tiêm 6-OHDA tuần, tuần, tuần 3.6 Tổn thương tế bào tiết dopamin Hình 3.13: Định khu tế bào tiết dopamin tiêu nhuộm TH Biểu đồ 3.1: Số lượng tế bào tiết dopamin liềm đen Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ sợi thần kinh dương tính TH thể vân CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Đại thể cắt qua thể vân liềm đen 4.2 Cấu trúc thể vân 4.2.1 Đặc điểm vi thể 4.2.2 Đặc điểm siêu vi thể 4.3 Cấu trúc liềm đen 4.3.1 Đặc điểm vi thể 4.3.2 Đặc điểm siêu vi thể 4.4 Tổn thương tế bào tiết dopamin thể vân liềm đen 41 42 DỰ KIẾN KẾT LUẬN DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Chương (2011), “Bệnh học thần kinh”, Nhà xuất Y học, Hà Nội Brundin P., Kordower J.H (2012), “Neuropathology in transplants in Parkinson's disease: implications for disease pathogenesis and the future of cell therapy”, Prog Brain Res, 200, pp 221 – 241 Ebadi M., Pfleiffer R.F (2005), “Parkinson’s disease”, Library of congress cataloging – in – publication data, NewYork Le W., Sayana P., Jankovie J (2014), “Animal models of Parkinson’s disease: A gateway to therapeutics”, Neurotherapeutics, 11, 1, pp: 92-110 Simola N., Morelli M., Anna R C (2007), “The 6-Hydroxydopamine model of Parkinson’s disease”, Neurotoxicity Research, 11, pp 151 – 157 Braak H., Braak E (2000), “Pathoantomy of Parkinson’s disease”, J Neurol, 247 (2), pp – 10 Allegi RF, Ranalli C.G, de Daras A (1997), “Neuropsychologic evaluation in parkinson’s disease”, Medicina Buenos-Aires, 52 (2), pp 141 – 144 Pappolla, M.A (1986), “Lewy bodies of Parkinson’s disease Immune electron microscopic demonstration of neurofilament antigens in constituent filaments”, Arch Pathol Lab Med., 110, pp 1160–1163 Spillantini, M.G., Crowther, R.A., Jakes, R., Hasegawa, M., and Goedert, M (1998), “α-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies”, Proc Natl Acad 10 Sci, 95, pp 6469–6473 Deumens R, Blockland A., Prickaerts J (2002), “Modeling Parkinson’s disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of nigrostriatal pathway”, 11 Exp Neurol, 175, pp 303 – 317 Beal M.F (2001) “Experimental models of Parkinson’s disease”, Nat Rev Neurosci, 2, pp 325 – 334 12 Blesa J., Phani S., et al (2012), “Classic and new animal models of Parkinson’s disease”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 160, pp 13 241 – 251 Skaper S.D., Giusti P (2010), “Transgenic mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease”, CNS Neurol Disorf Drug Targets, 9, 4, 14 pp 455 – 470 Feany M.B., Bender W.W (2000), “A Drosophila model of Parkinson’s 15 disease”, Nature, 404, pp 394 – 398 Stevens D.A., Lee Y., et al (2015), “Parkin loss leads to PARIS-dependent declines in mitochondrial mass and respiration”, Proc Natl Acad Sci USA, 16 17 112, 37, pp 696 – 701 Nguyễn Văn Huy (2005), “Giải phẫu người”, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Chương, Guy Lazorthes (1997), “Hệ thần kinh trung ương”, tập 1, 18 Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Chương (1995) “Đặc điểm giải phẫu chức não tủy ứng dụng 19 vào lâm sàng thần kinh”, Nhà xuất Y học Tepper J.M., Tecuapetla F., Koos T., Ibanez-Sandoval O (2010), “Heterogeneity and diversity of striatal GABAergic interneurons” Front 20 Neuroanat, 4, pp 150 – 157 Yelnik J., Percheron G., et al (1993), “Cholinergic nerons of the rat and primat striatum are morphologically different”, Prog Brain Res, 99, 21 pp 25 – 34 Yager L.M., Garcia A,F., Wunsch A.M., Ferguson S.M (2015), "The ins and outs of the striatum: Role in drug addiction", Neuroscience, 301, pp 22 529 – 541 Chinta S.J., Andersen J.K (2005), “Dopaminergic neurons”, The 23 International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 37, 5, pp 942- 946 Prakash N., Wurst W (2006), “Development of dopaminergic neurons in the mammalian brain”, Cell Mol Life Sci, 63, 2, pp 187 – 206 24 German D.C., Manaye K.F (1993), “Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat”, The 25 Journal of Comparative Neurology, 331, pp 297 – 309 Bjorklund A, Dunnett SB (2007), “Dopamine neuron systems in the brain: 26 an update”, Trends Neurosci, 30, 5, pp 194 – 202 Cossette M., Lecomte F., Parent A (2005), “Morphology and distribution of dopaminenergic neurons instrinsic to the human striatum”, Journal of 27 28 Chemical Neuroanatomy, 29, pp.1 – 11 Gaetano Di Chiara (2002), “Dopamine in the CNS”, Springer, Newyork Prensa L., Parent A (2001), “The nigrostriatal pathway in the rat: A singleaxon study of the relationship between dorsal and ventral tier nigral neurons and the striosome/matrix striatal compartments”, The Journal of 29 Neuroscience, 21, 18, pp 7247 – 7260 Sauer H., Oertel W.H.(1994), “Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lessions with 6hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical 30 study in the rat”, Neuroscience, 59, pp 410 – 415 Glinka Y., Gassen M., Youdim M.B.H (1997), “Mechanism of 6hydroxydopamine neurotoxicity”, Journal of Neural Transmission 31 Supplementa, 50, pp 55 – 66 Venderova K., Park D.S (2012), “Programmed cell death in Parkinson’s 32 disease”, Advance 41, pp 42-44 Tobon-Velasco J.C., Limon-Pacheco J.H., (2013), “6-OHDA- induced apoptosis and mitochondrial dysfunction are mediated by early modulation of intracellular signals and interaction of Nrf2 and NF-κB 33 factors”, Toxicology, 304, pp 109 – 119 Marti M.J., Saura J, et al (2002), “Striatal 6-Hydroxydopamine induces apoptosis of nigra neurons in the adult rat”, Brain Research, 958, pp 185 – 191 34 Saito Y., Nisho K., Ogawa Y., et al (2007), “Molecular mechanism of 6hydroxydopamine-induced cytotoxicity in PC12 cells: involvement of hydrogen peroxide-dependent and – independent action, Free Radical 35 Biology & Medicine, 42, pp 675 – 685 Zuch C.L., Nordstroem V.K., et al (2000), “Time course of degenerative alterations in nigral dopaminergic neurons following a 6-Hydroxydopamine 36 lesion”, The Journal of Comparative Neurology, 427, pp 440 – 454 Bove J., Perier C (2012), “Neurotoxin-based models of Parkinson's 37 disease”, Neuroscience, 211, pp 51 – 76 Przedborski S., Levivier M., et al (1995), “Dose-dependent lesions of the dopaminergic nigrotriatal pathway induced by intrastriatal injection of 6- 38 Hydroxydopamine”, Neuroscience, 67 (3), pp 631 – 647 Willard A M., Bouchard R S., Gittis A H (2015), “Differential degradation of motor deficits during gradual dopamine depletion with 6- 39 hydroxydopamine in mice”, Neuroscience, 301, pp 254 – 261 Morales I., Sanchez A., et al (2015), “The degeneration of dopaminergic synapes in Parkinson’s disease: a selective animal model”, Behavioural 40 Brain Research, 24, pp 110 – 119 Paxinos G., Watson C (2013), “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”, 41 Seventh edition, NewYork Khaindrava V.G., Ershov P.V., et al (2010), “Optimization of dopaminergic neuron counting in substantia nigra of Parkinson mice”, Cell 42 and Tissue Biology, 4, 4, pp 391 – 398 Yuan H., Sarre S., et al (2005), “Histological, behavioural and neurochemical evaluation of medial forebrain and striatal 6-OHDA lesions as rat models of Parkinson’s disease”, Journal of Neuroscience Methods, 43 144, pp 35 – 45 Bohlen O., Halbach (2013), “Analysis of morphological changes as a key method in studying psychiatric animal models”, Cell Tissue Res, 354, pp 41 – 50