Penicillin là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm nhất dùng chữa một số bệnh do vi khuẩn vào những năm đầu của chiến tranh thế giới thứ hai. Ngày nay chất kháng sinh này được sản xuất với một lượng rất lớn và được dùng khá phổ biến trong y học
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊNĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
BỘ MÔN VI SINH VẬT HỌC – KHOA SINH HỌC
Tiểu luận môn công nghệ sinh học Vi Sinh Vật
Chủ đề:
GIỚI THIỆU QUI TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN VÀ NHỮNG CẢI BIẾN TRONG CẤU TRÚC TẠO CÁC PENICILLIN BÁN TỐNG HỢP CHỐNG LẠI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Giảng viên : TS Phạm Thế Hải Học viên thực hiện : Vũ Thị Thùy Linh Lớp : K23 - QH 2014 – 2016
Hà Nội, 2016
Trang 2Chương 4: Cải biến penicillin tạo ra các kháng sinh bán tổng hợp chống lại
khả năng kháng thuốc của vi khuẩn
……… 20
Tài liệu tham khảo
Trang 3Lời mở đầu
Từ thế kỷ XIX người ta đã biết các vi sinh vật có thể sống cộng sinh, cũng như cótác dụng đối kháng giữa chúng với nhau Đến năm 1929, A.Fleming quan sát thấy nhữngkhuẩn lạc của mốc penicillin notatum ức chế sinh trưởng tụ cầu khuẩn Staphylococus.Chất có tác dụng ức chế do mốc này tiết ra được gọi là penicillin Từ đó đến nay việcnghiên cứu chất có hoạt tính kháng sinh được chú trọng rất nhiều và đạt được nhiều kếtquả rực rỡ
Ngày nay người ta đã biết trên 2000 chất kháng sinh, nhưng chỉ mới có khoảng 50chất được dùng vào tư liệu hóa học chữa các bệnh nhiễm vi sinh vật trong y học và một số
ngành khác Một trong những chế phẩm chất kháng sinh phổ biến là penicillin.
Penicillin là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm nhất dùngchữa một số bệnh do vi khuẩn vào những năm đầu của chiến tranh thế giới thứ hai Ngàynay chất kháng sinh này được sản xuất với một lượng rất lớn và được dùng khá phổ biếntrong y học
Vì những lí do như vậy mà em lựa chọn chủ đề “ Giới thiệu quy trình xản suất
Penicillin và các cải biến trong cấu trúc tạo các penicillin bán tổng hợp chống lại khả năng kháng thuốc của vi khuẩn”
CHƯƠNG 1: LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ SẢN XUẤT KHÁNG SINH
PENICILIN
Trang 4Năm 1928, trong phòng thí nghiệm vi khuẩn học của Bệnh viện Mary ở Luân đôn Thủ đô Vương quốc Anh, nhà bác học Fleming đã tình cờ phát hiện một sự kiện mới lạ đó
-là vòng vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh được tạo ra bởi một loạinấm mốc Penicillium notatum từ không khí rơi vào đĩa nuôi cấy vi khuẩn Fleming đãtách riêng loại nấm mốc đó và nuôi cấy chúng trong các môi trường khác nhau và sau đóxác định được rằng các dịch nuôi cấy penicillium notatum có hoạt tính kháng lại nhiều loại vikhuẩn gây bệnh Từ môi trường nuôi cấy penicillium notatum, ông và các cộng sự đã tách riêngđược một chất có màu trắng có hoạt tính kháng sinh rất mạnh và ông đặt tên chất đó là penicillin.Nhưng ông chưa tinh chế được chất này vì thời kỳ đó chưa đủ điều kiện để nuôi cấy một lượng lớnnguyên liệu
Phải chờ đến năm 1941, các nhà bác học Anh là Abraham, Chain và Florey mới tinh chếđược penicillin dưới dạng ổn định và nghiên cứu được phương pháp lên men để điều chế đủ lượngcần thiết cho việc thử lâm sàng điều trị hiệu nghiệm các bệnh nhiễm khuẩn đã tạo điều kiện nhanhchóng việc đầu tư nghiên cứu sản xuất penicillin ở quy mô công nghiệp Năm 1943 penicillin đãđược sản xuất ở quy mô lớn ở Mỹ để phục vụ chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn cho thương bệnhbinh trong thế chiến thứ hai Sau đó Nga và một số nước khác cũng đã sản xuất được penicillin G
CHƯƠNG 2: CÁC VI SINH VẬT SẢN XUẤT PENICILLIN VÀ QUÁ
TRÌNH TỔNG HỢP CỦA CHÚNG 2.1 Các vi sinh vật sản xuất penicillium và đặc điểm dinh dưỡng của chúng
Trang 5Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm mốc penicillium vàAspergillus Nhưng các chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicilliumchrysogenum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệp kháng sinh Những chủngđầu tiên được nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trên cơ sở chất tự nhiên tạo thành 10-15đv/ml kháng sinh.
Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc:
Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt
và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của những khuẩn ty bạctrắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môitrường
Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty
cơ chất cũng có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạttính kháng sinh thấp Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này vàthường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính củagiống
Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri
Trang 6Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau
Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định Đặc tính này đặtcho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinh kháng sinh caonhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất Nhiệm vụ này có một ýnghĩa rất lớn trong công nghiệp các giống này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thểtới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được nhữnggiống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh
Chúng ta cần phải nhận thức rằng các nấm penicillium thường dễ biến đổi về hìnhthái và giảm khả năng sinh kháng sinh Khi xảy ra biến đổi thì sẽ sinh ra hàng loạt nhữngchủng mới từ giống cơ bản và nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật lúc này là phải chọn lạinhững khuẩn lạc khoẻ có nhiều ưu điểm, tiếp theo cần phải tiến hành những biện phápbảo quản thích hợp
Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giaiđoạn phát triển:
1 Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế
bào chất chưa phân hoá Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính
2 Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trong
không bào dần dần biến mất Ở cuối giai đoạn này xuất hiện những giọt chất béo nhỏ
3 Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế
bào chất rất ưa kiềm
Trang 74 Giai đoạn IV: Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung
tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm
5 Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống và có chứa những không bào,ở giữa
có một hoặc một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến mất Tính ưa kiềm tiếp tục giảm
6 Giai đoạn VI: Khuẩn ty vẫn giữ được dạng hình trống nhưng không còn
những hạt bắt màu trung tính, các không bào bắt màu da cam hoặc màu hồng đồng đều.Các hạt chất béo không còn Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân
Quá trình lên men penicillin cũng thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng(ứng với những giai đoạn phát triển I, II, III) và pha sinh penicillin (ứng với những giaiđoạn IV, V, VI)
Nguồn carbon trong lên men penicillin bằng nấm Penicillium chrysogenum có thể
là glucoza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, các axit hữu cơ (lactic, axetic, formic), cácaxit amin…đường lactoza cho hiệu suất penicillin cao nhất và thường được dùng trongcông nghiệp Nấm thường sử dụng đường lactoza chậm Vì vậy, trong thực tế lactozađược dùng phối hợp cùng đường khác (glucoza, sacaroza…) trong môi trường dinhdưỡng
Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucoza và axit lacticcủa cao ngô Sa đó lactoza mới được sử dụng (chủ yếu trong pha tạo penicillin) Khi trongmôi trường cạn lactoza và không bổ sung các chất dinh dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tựphân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kếtthúc lên men trước thời điểm này
Nguồn nitơ dùng trong sinh tổng hợp penicillin có thể là những hợp chất hữu cơ(axit amin, pepton, protein) và vô cơ (amoniac, các muối amon và nitrat).Amoniac đượcnấm penicillium chrysogenum đồng hoá nhanh hơn cả Trong quá trình nuôi cấy N-NH3
được tạo thành từ cao ngô do phản ứng khử amin các hợp chất nitơ Nấm mốc sử dụng
N-NH3 trước tiên và nồng độ của chất này trong thời gian đầu tăng lên, vì tốc độ tạo thành
nó nhanh hơn tốc độ sử dụng, tiếp theo đó được giảm rất nhanh cùng với tốc độ sinhtrưởng, phát triển của nấm mốc và tiếp tục giảm cho đến khi hệ sợi của mốc bị tự phân.Tốc độ sử dụng amoniac phụ thuộc vào nguồn cacbon trong môi trường Trong trường
Trang 8hợp nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hoặc các nguồn cacbon dễ tiêu hoá khác, amoniacđược sử dụng nhanh hơn khi môi trường có lactoza Nitrat được nấm mốc đồng hoá khitrong môi trường không có nguồn nitơ hữu cơ.
Lưu huỳnh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh tổnghợp của nấm mốc Nguồn lưu huỳnh thường dùng là muối sunfat của kali, natri và amon.Các chất này tham gia vào tổng hợp metionin, sixtin, biotin, tiamin…hoặc trạng thái liênkết yếu là tốt hơn cả Nhiều công trình nghiên cứu cho biết, khi trong môi trường có mặtđồng thời L-sixtin và sunfat thì lưu huỳnh của axit amin này dễ đi vào phân tử penicillinhơn lưu huỳnh của các gốc sunfat Song, dùng axit amin trong sản xuất không kinh tế chonên người ta thường dùng tiosunfat natri (Na2S2O3) Lưu huỳnh của chất này rất dễ diđộng Trong môi trường dinh dưỡng có tiosunfat cùng với cao ngô hiệu suất penicillin cóthể tăng hai lần
Cơ chế biến đổi các hợp chất lưu huỳnh từ dạng oxy hoá sang dạng khử có thể theo
sơ đồ của Arnstein (1954) như sau:
Sunfat Sunfit Tiosunfit sixtinTrong tế bào sixtin dễ biến thành sixtein và ngược lại Sixtein có một ý nhĩa lớnnhư một tác nhân khử nhờ nhóm sunfuhydrin ( -SH )
pH môi trường thích hợp cho penicillium chrysogenum phát triển nằm trongkhoảng 6 - 6.5 Môi trường kiềm hoặc axit hơn đều làm cho mốc phát triển chậm Trongquá trình lên men pH môi trường thay đổi tuỳ thuộc vào tốc độ sử dụng các hợp chấtcacbon và N-NH
2.2 Một số quá trình tổng hợp penicillium:
Trang 9Sự tổng hợp và biến dưỡng penicillin
Trang 10Sự tổng hợp penicillin N và deasetoxycephalosporin C
CHƯƠNG 3: GIỚI THIỆU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN
Trang 113.1 Đặc điểm chung
Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sảnxuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai Ngay cả bằng sáng chế cũng cógiới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra công nghệ sản xuất côngnghiệp Theo hãng gist-brocades, toàn bộ dây chuyền chia làm 4 công đọan chính:
Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hay penicillin G)
Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên
Hiện nay người ta sản xuất penicillin theo hai phương pháp:
Phương pháp lên men bề mặt.
Nguyên liệu
Chuẩn bị môi trường lên men Lên men
Thu nhận và tinh chế
Nhân giống
Giống
Penicill in
Trang 12 Phương pháp lên men chìm.
3.2.1 Phương pháp lên men bề mặt:
Trong những năm 30 đến những năm 50 của thế kỷ XX, phương pháp nuôi cấy bềmặt được áp dụng rộng rãi để sản xuất kháng sinh từ nấm penicillin chrysogenum…
a) Giống Penicillin chrysogenum: là nấm sợi đơn bào hở Khi mới phát triển
trong môi trường đặt thì tạo ra 2 khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màutrắng Sau 1 ngày nuôi cấy, các khuẩn ty chuyển sang màu xanh sám và đính bào tử bắtđầu xuất hiện Thời gian này cũng xuất hiện một ít bào tử trần từ tiền bào tử nằm trongcác đính bào tử Các bào tử lần lượt tạo thành theo thời gian nuôi cấy và cuối cùng nấmpenicillin có màu sẫm hơn
Nấm sợi penicillium chrysogenum.
Nấm penicillin: thuộc họ hiếu khí bắt buộc, do đó trong quá trình nuôi phải cung
cấp khí liên tục Phương pháp bảo quản được dùng nhiều nhất là phương pháp cấy truyềnđịnh kì trên thạch hàng tháng kết hợp với bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản bằng hạtngũ cốc bảo quản theo phương pháp đông khô cũng được sử dụng
b)Nguyên liệu: Cám và hạt ngũ cốc các lọai, nguyên liệu được bổ sung nước sao
cho độ ẩm đạt 55-60%W và được hấp thanh trùng ở 121oC trong 30-45 phút Ngay saukhi kết thúc thanh trùng, chúng được tải vào những khay hình chữ nhật có kích thước dài1-1.2 m, rộng 0.6-0.8 m, cao 5-6 cm Lớp môi trường cho vào đấy dày 2-3 cm để đảm bảo
độ thóang khí trên tòan bộ bề mặt và mặt dưới của môi trường Một số cơ sở dùng nguyên
Trang 13liệu là các hạt ngũ cốc thì lớp môi trường dày hơn (3-4 cm) do các hạt ngũ cốc tạo ra môitrường có độ thoáng khí hơn.
Trong trường hợp cám quá mịn thì phải trộn thêm trấu xay nhỏ (thêm khoảng 25%) hoặc cùi bắp xay nhỏ trước khi thanh trùng
20-Để làm môi trường nhân giống, người ta cũng làm như trên Chỉ có một điểm khác
là sau khi làm ẩm môi trường đến độ ẩm nhất định, người ta phân phối chúng vào cácdụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng bằng 1/5 hay 1/6dung tích của dụng cụ, đậy kín bằng nút bông và thanh trùng ở 121oC(0.5 at) trong 30phút rồi để nguội mới cấy giống
c) Quá trình nhân giống: bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm Trong các nhà
máy, mỗi lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống Một ống dùng để kiểm tratrước khi sản xuất, một dùng để sản xuất và một dùng để bảo quản
Song song đó, người ta chuẩn bị một bình tam giác dung tích 200-250ml và chuẩn
bị 50g môi trường Môi trường được thanh trùng và làm nguội đến 30oC
Đổ 10ml đã thanh trùng và làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh chobào tử hòa trộn vào nước Bằng biện pháp vô trùng (thực hiện trong các tủ cấy vô trùng)chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên, lắc cho thật đều rồi chuyển chúng sang tủ ấm30-37oc.Nuôi ở điều kiện này cho đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môi trường
Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp 1.Cứ tiếp tục thựchiện ta có giống cấp 2, cấp 3 cho đến khi đủ 5-10% giống cho sản xuất
Cứ mỗi một cấp độ nhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng môi trườngtăng từ 10-15 lần Trong trường hợp vượt quá 1 ký người ta nuôi trên những khay
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh hiện nay, thường là dùng những chủngbiến đổi gen Công nghệ biến đổi gen đã tạo ra những chủng siêu tổng hợp kháng sinh.Theo Talaro (1993), từ chủng penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổnghợp 6mg/l, hiện nay người ta đã có những chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả năngsinh tổng hợp 85000ng/l penicillin
Trang 14d) Quá trình lên men: khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội đến 30oC,tiến hành trộn giống với tỉ lệ 5-10% Các khay được xếp chồng lên nhau trên những giá
đỡ với khoảng cách nhất định để thoáng khí và thoáng nhiệt
Nấm penicillium trong quá trình phát triển thường tạo ít nhiệt hơn nấmAspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả năng phát triển và sinh tổng hợp, người tathường thổi khí bằng quạt gió có lắp hệ thống làm sạch
Quá trình lên men kéo dài 6-7 ngày ở 24-28oC
Trong lên men bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng Môi trường lỏng dùngtrong nuôi cấy bề mặt thu nhận penicillin bao gồm:
Cao ngô (bắp) 50g Lactose 30g NaNO3 3g
KH2PO4 0.5g MgSO4 0.25g
C6H5CH2COOH 0.2g ZnSO4 0.044g Nước
Dung dịch lên men được khử trùng ở 121oC (0.5 at) trong 30 phút, được phân khối vàocác khay giống các khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáy các khay này không được đục lỗ vì phải chứa môi trường lỏng Chiều cao của dung dịch môi trường trong các khay là 3-4 cm Người ta cũng tiến hành lên men trong khoảng thời gian là 6-7 ngày ở nhiệt độ lên men là 24-28o
Váng nấm sợi được giữ lại sau khi đã rút hết dịch lên men, được tiếp tục sử dụng chonhững lần lên men kế tiếp Ở những lần lên mentiếp theo người ta chỉ đổ thêm dịch lênmen vào Các thí nghiệm cho thấy chỉ nên sử dụng lại 3-4 lần, vì những lần sau hiệu suấtthu nhận kháng sinh sẽ giảm dần