Phân tích QTL thực vật Tìm hiểu phân tích tính trạng số lượng thực vật Nguyễn V Cường1 Khoa Di truyền chọn giống trồng, Đại học Cornell, Bang New York, Hoa Kỳ Biên tập viên: Hương Hà, Stanford University, Stanford, California, USA * Mọi thắc mắc viết xin liên hệ email cvn6@cornell.edu Tóm tắt: Ở trồng, tính trạng nông học quan trọng suất thường tính trạng số lượng chịu ảnh hưởng nhiều gene khác ảnh hưởng môi trường Đối với tính trạng việc xác định locus điều khiển tính trạng (Quantitative Trait Locus-QTL- mapping) dựa việc phân tích kiểu gene kiểu hình quần thể phân li áp dụng công cụ thống kê định.Bài phân tích giới thiệu sơ qua phương pháp QTL mapping thông qua nghiên cứu suất lúa Abstract: In crop plants, important agronomical traits like yield are quantitative traits influenced by many genes and by the environment.Theidentification of quantitative trait loci (QTL mapping) for these traits is based on analyzing genotypes and phenotypes in segregating populations and applying appropriate statistical tests This article briefly introduces a basic QTL mapping method applied in a study of rice yield Từ khoá: Phân tích QTL | thị phân tử | tách dòng gene | suất Giới thiệu đại trà diện tích lớn Để tăng suất, nghiên cứu thường tập trung vào tăng số lượng hạt lúa số cây.Đây đại lượng đo đếm cách xác, điều kiện quan trọng phân tích di truyền số lượng, phương pháp xác định xác kiểu hình tính trạng cần nghiên cứu dù có áp dụng kĩ thuật phân tích phân tử thống kê sau này, kết tìm không phản ánh chất di truyền tính trạng Sinh học thực vật ngành khoa học dựa nhiều vào phương pháp kỹ thuật việc nắm phương pháp kỹ thuật nàysẽ giúp nghiên cứu nhiều vấn đề cụ thể khác nhau.Trong tóm lược không định tổng hợp kết nghiên cứu mà muốn mượn báo xuất sắc(1)để giới thiệu sơ qua phương pháp phân tích tính trạng số lượng thực vật Ashihaki et al(1)khảo sát khác biệt suất hai giống lúa việc phân tích kiểu hình kiểu gene quần thể tạo từ hai giống tìm xác gene liên quan đến suất, tính trạng quan trọng trồng Năng suất tính trạng số lượng phức tạp.Về tổng hợp nhiều tính trạng khác nhau.Năng suất có hệ số di truyền thấp, ảnh hưởng lớn yếu tố môi trường.Năng suất tính số tấn/hecta.Ở ngũ cốc hạt nhỏ lúa, suất tính tích số số lượng hạt lúa trọng lượng hạt.Năng suất đặc tính mang tính quần thể thực tế sản xuất tính trạng so sánh diện tích sản xuất với hàng nghìn không cá thể đơn lẻ, song nghiên cứu quy mô nhỏ bước khởi đầu để khảo sát | www.vjs.org Phương pháp xác định locus tính trạng số lượng Như đề cập trên, suất tính trạng số lượng, khác biệt suất phân li hai gene mà phân li nhiều gene, với ảnh hưởng gene nhỏ Tính trạng số lượng không phân li thành nhóm cụ thể ta đơn giản sử dụng nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu Thay vào đó, giải pháp cho nghiên cứu tính trạng xác định vị trí locus tính trạng số lượng dựa marker phân tử (QTL mapping) Ở thực vật, có hai phương pháp QTL mapping: 1) Sử dụng quần thể tạo từ phép lai kiểm soát (ví dụ quần thể F2, quần thể lai trở lại ) 2) Sử dụng quần VJS | May 2014 | Volume | Issue | c05144 Phân tích QTL thực vật thể tự nhiên, giao phấn tự không kiểm soát(phương pháp gọi lập đồ kết hợp - association mapping).Phương pháp 1) phù hợp cho loài có vòng đời ngắn, dễ lai tạo tạo nhiều hạt hệ sau, đồng thời có phương thức tính toán đơn giản hơn.Phương pháp 2) có lợi tạo quần thể phân li, phù hợp cho loài giao phấn, vòng đời dài phân tích nhiều allele lúc Tuy phương pháp 2) có nhiều yếu tố gây nhiễu giao phấn chọn lọc không kiểm soát phép thống kê phức tạp hơn.Ở đây, Ashihaki et al(1)sử dụng phương pháp 1) với quần thể tạo từ phép lai hai bố mẹ.Việc phân tích thống kê kiểu gene kiểu hình cá thể quần thể phân li giúp tìm vùng nhiễm sắc thể có liên quan với tính trạng cần nghiên cứu Kết thống kê cho biết ảnh hưởng mạnh hay yếu vùng nhiễm sắc thể với tính trạng để có nghiên cứu Các yêu cầu cho QTL mapping từ quần thể lai có kiểm soát liệt kê bảng bên.Hiện nay, kỹ thuật xác định kiểu gene giải trình tự nhanh chóng giúp cho việc lập đồ phân tử xác định kiểu gene cá thể dễ dàng bố định (japonica indica) để có nhiều đa hình trình tự DNA hai bố mẹ, tạo thuận lợi cho thiết kế marker phân tử cho phân tích sau này.Thêm vào đó, hai giống bố mẹ chọn giống lúa thương phẩm nên kết nghiên cứu áp dụng cho sản xuất dễ dàng Song song với suất (cụ thể số lượng hạt lúa số cây), tác giả nghiên cứu tính trạng chiều cao hai giống bố mẹ có chiều cao khác nhau.Trong lịch sử chọn giống lúa, giống thấp IR8 (Viện nghiên cứu lúa giới (IRRI)) giúp đứng thẳng, không bị nghiêng đổ.Đặc điểm giúp phát triển quang hợp tốt chăm bón tốt, giúp tăng suất trồng Giống thấp coi sở cho “cuộc cách mạng xanh” châu Á năm 60 kỉ 20 Từ hai giống bố mẹ trên, việc tạo quần thể phân li từ hai bố mẹ Quần thể phân li hệ F2 hay hệ lai trở lại Ở Ashikari et al(1)đã tạo quần thể đặc biệt để bắt đầu nghiên cứu quần thể backcross inbred lines (BIL)- lai trở lại cận giao tái tổ hợp Quần thể tạo cách hệ F1 lai trở lại với hai bố mẹ, giống japonica Koshihikari,thay tự thụ phấn Sau sử dụng phương pháp hạt hệ (single seed descent) để chọn dòng hệ tiếp theo, đến hệ F7 gần hệ gene dòng trạng thái đồng hợp tử Vì tác giả lại tạo quần thể này? Như đề cập trên, tính trạng suất có ảnh hưởng lớn từ môi trường, tính trạng thường xác định thông qua giá trị trung bình nhiều cá thể cá thể Việc tạo dòng đồng hợp tử giúp họ lặp lại việc đo suất hệ (trồng nhiều hơn) để có số liệu đáng tin cậy suất mà giữ nguyên kiểu gene cần đánh giá Quá trình tạo dòng BIL giúp họ tạo dòng gần đẳng gene (nearly isogenic lines) để tiện lợi cho việc cô lập xác gene sau này.Hơn nữa, dòng đồng hợp tử nên trồng để nghiên cứu nhiều kiểu hình khác cần xác định kiểu gene lần, thuận lợi cho việc hợp tác nghiên cứu sau Các tác giả sử dụng 96 dòng BIL để tiến hành phân tích QTL Yêu cầu phải có marker phân tử toàn hệ gene Các yêu cầu cho QTL mapping từ quần thể lai có kiểm soát • Có marker phân tử (trung hòa, đồng trội) • Có đồ di truyền liên kết phân tử • Các quần thể có “mất cân liên kết” (linkage disequilibrium - LD) LD hiểu cách đơn giản biết kiểu gene locus suy kiểu gene locus khác - thường nằm cạnh nhiễm sắc thể • Có phương pháp đo lường kiểu hình tính trạng tin cậy • Có phương pháp thống kê /phần mềm để xác định liên kết marker tính trạng Ashikari et al(1)chọn hai bố mẹ hai giống lúa khác suất, giống thuộc dòng lúa ôn đới japonica có suất không cao chất lượng tốt, tạo loại gạo Koshihikari (gạo dùng sushi) giống lúa nhiệt đới indica có suất cao chất lượng không cao bằng, tạo loại gạo Habataki Điểm cần ý việc tác giả chọn hai giống có suất khác đồng thời có khác biệt nguồn gốc khu vực phân | www.vjs.org VJS | May 2014 | Volume | Issue | c05144 Phân tích QTL thực vật lập đồ liên kết marker quần thể phân tích.Việc lập đồ liên kết chất dựa tượng phân li, liên kết gene tái tổ hợp quần thể phân li phân tích để xác định vị trí marker nhiễm sắc thể Trước hết ta cần có marker phân tử, thể đa hình trình tự DNA hai hệ gene bố mẹ Các đa hình DNA thường dùng cho phân tích đồ gene gồm: 1) Sai khác nucleotide (Single Nucleotide Polymorphisms – SNPs), 2) Đa hình chèn thêm nucleotide (deletion/insertion), 3) Đa hình thay đổi số trình tự lặp lại liên tiếp (như microsatellites ) Đây là loại đa hình xác định dựa phương pháp PCR cắt enzyme giới hạn thông dụng phòng thí nghiệm.Như đề cập trên, hai dòng lúa bố mẹ nghiên cứu thuộc hai nhóm japonica indica.Hai nhómnày có cách li lịch sử nghiên cứu cho thấy có nhiều đa hình DNA.Thêm vào đó, trình tự lúa nhóm japonica giải mã thời điểm tiến hành nghiên cứu nên việc phát triển marker phân tử hai nhóm giống toàn hệ genome điều làm Ashikari et al(1) chọn phân tích 200 marker trải 12 nhiễm sắc thể lúa Sau có marker xác định kiểu gene quần thể phân tích, họ dùng công cụ tính toán để lập nhóm liên kết tính khoảng cách di truyền marker Về bản, trình gồm hai phép tính: 1) xác định phân li độc lập hay liên kết marker,2) có liên kết xác định trật tự khoảng cách marker dựa tần số trao đổi chéo Với số lượng marker lớn lên tới hàng trăm, chí hàng nghìn việc tính toán tay Hiện có nhiều phần mềm giúp ta việc tính toán này, kể đến chương trình thông dụng Mapmaker, Joinmap hay r/QTL Sau xác định kiểu gene cá thể quần thể phân tích lập đồ gene liên kết, việc xác định giá trị kiểu hình tính trạng nghiên cứu cá thể Khi có số liệu kiểu gene kiểu hình, câu hỏi đặt lúc liệu có liên quan vị trí marker đồ với kiểu hình tính trạng nghiên cứu Đối với quần thể phân li dựa việc lai bố mẹ báo phân tích thì, chất, việc kiểm tra xem liệu có sai khác cách có ý nghĩa thống kê kiểu hình cá thể mang allele từ bố so với cá thể mang allele từ mẹ vị trí marker định (Hình 1).Có nhiều phương pháp để kiểm tra việc phương pháp kiểm tra phép toán t-student phân tích phương sai (ANOVA) Trên thực tế phương pháp phân tích QTL phổ biến dùng phương pháp interval mapping (dò tìm theo đoạn) (2), ước lượng vị trí QTL hai marker sử dụng phép thống kê giá trị ODDs (viết dạng logarithm of ODDs - LOD) Giá trị ODDS tỉ số xác suất kiện (H1) xác suất kiện (H2) Ví dụ: Ta tham gia vào trò chơi tung đồng xu đặt cược xuất mặt sấp, người chủ trò tung 10 lần liên tiếp mặt ngửa! Liệu có gian lận đây? Xác suất để “đồng xu” có hai mặt mặt ngửa (người chủ trò gian lận) tung 10 lần liên tiếp mặt ngửa (H1) (1)10=1 Xác suất để đồng xu có hai mặt (sấp ngửa, tức đồng xu thật) tung 10 lần liên tiếp mặt ngửa (H2) (0.5)10 = 10-3 Giá trị ODDS H1/H2 = 1000 LOD 3, có nghĩa khả người chủ trò sử dụng đồng xu có hai mặt mặt ngửa (gian lận) cao gấp 1000 lần khả sử dụng đồng xu có hai mặt sấp ngửa (đồng xu thật) Hình Ví dụ liên kết marker với tính trạng (NS-Năng suất) Cây đồng hợp tử allele mẹ kí hiệu 1, đồng hợp tử allele bố, 3, dị hợp tử, A,B,C,D marker Ở | www.vjs.org VJS | May 2014 | Volume | Issue | c05144 Phân tích QTL thực vật marker C D, mang allele bố, 3, có suât cao có mang allele mẹ, 1, thể có liên kết gene tính trạng Sự sai khác kiểu hình kiểm tra phép tính t student hay ANOVA giá trị LOD R2 cho QTL lớn, dễ dàng phân biệt nhóm kiểu hình khác (QTL làm tăng số lượng hạt tới 92 hạt) Do đó, xác suất có gene vùng QTL ảnh hưởng đến tính trạng cao (LOD = 9, khả có QTL cao 109 lần so với khả QTL) Đối với tính trạng chiều cao cây, tác giả xác định QTL lớn Ph1 (LOD = 6.5, R2 = 30%).QTL nằm vùng gene “cách mạng xanh” semi-dwarf1 phân lập giải trình tự(4).Đọc trình tự cho thấy Habataki, giống chọn làm bố phép lai này, có đột biến đoạn gene Kết coi tiêu chuẩn so sánh cho thấy thí nghiệm QTL xác.Có điểm thú vị giống Koshihikari với cao số lượng hạt có QTL tăng chiều cao QTL giảm chiều cao, QTL tăng số lượng hạt QTL giảm số lượng hạt Có thể thấy số QTL làm tăng hay giảm tính trạng kiểu hình không phản ánh kiểu hình tính trạng cuối cá thể.Trên thực tế, QTL tương tác với để tạo tính trạng Như từ toàn hệ genome với 12 nhiễm sắc thể, kĩ thuật QTL mapping, tác giả khoanh vùng vị trí có liên quan đến tính trạng cần nghiên cứu Để tiếp tục tìm xác gene ảnh hưởng,họchọn QTL có giá trị lớn để phân lập Bước gọi fine mapping, xác đinh vị trí QTL xác đến cụ thể gene Để thuận tiện tăng xác cho trình tìm vị trí gene độ phân giải cao, tác giả phát triển dòng đẳng gene (nearly isogenic line NIL) cho vị trí QTL cần nghiên cứu cách lai lại nhiều lần với hai bố mẹ sử dụng marker phân tử để chọn lọc Các dòng gần đẳng genenày giúp tạo đồng cho quần thể phân li, giảm tượng tương tác gene ảnh hưởng đến việc đo đạc kiểu hình (Mendel hóa tính trạng số lượng).Các dòng dùng làm bố mẹ để tạo quần thể F2.Phân tích nhanh cách sử dụng 96 F2 từ dòng đẳng gene NIL-Gn1 tác giảxác định thực tế có tới QTL Gn1a Gn1b vùng QTL Gn1a xác định xác nằm khoảng marker R3192 C12072S, chọn để tách dòng Ngoài ra, vùng Gn1a xác định đồ Một điểm cần ý phân tích QTL số lượng phép kiểm tra Trong phép thử,nếungưỡng tin cậy chọn giá trị p ≤ 5% để kết luận có sai khác có ý nghĩa thống kê thìvì nhiều marker sử dụng nên có nhiều phép thử lúc xác suất để phép thử ngẫu nhiên có giá trị p ≤ 5% lớn (dương tính giả - false positive) Do cần phải dùng kỹ thuật thống kê hiệu chỉnh, ví dụ phương phápBonferonni, Benjamini – Hochberg FDR hay hoán vị (permutation) để chọn ngưỡng giá trị p thích hợp.Trong phân tích QTL phương pháp interval mapping, thường với giá trị LOD từ trở lên, khả vị trí QTL có liên quan đến tính trạng cần quan tâm cao (Hình 2) Hình Giá trị LOD dựng dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể với vị trí marker Hình thể đỉnh QTL với giá trị LOD =46 Đường gạch đứt đoạn thể ngưỡng LOD =3 thường dùng để xem xét liên kết marker tính trạng Hình trích dẫn Yano et al (3) Các tác giả xác định QTL cho số lượng hạt QTL cho chiều cao cây.Đối với tính trạng số lượng hạt bông, giá trị LOD dao động từ 1.5-9 Một giá trị phân tích QTL cần ý giá trị R2 hay PVE (Phenotypic variance explained - phần trăm giải thích khác biệt kiểu hình vị trí QTL đó) Giá trị tính từ phép phân tích phương sai ANOVA đề cập Không ngạc nhiên QTL Gn1 có giá trị LOD =9 có giá trị R2 cao nhất: 44%, Cả hai | www.vjs.org VJS | May 2014 | Volume | Issue | c05144 Phân tích QTL thực vật vật lí với dòng BAC chứa toàn vùng có marker (hình 2G trongAshikari et al(1)) Với việc trình tự hệ gene lúa giải mã cộng với xác định xác khoảng cách vật lí marker giúp việc xác định gene trở nên dễ dàng thiết kế nhiều marker biết trật tự chúng vùng cần phân tích Bài toán lúc sử dụng quần thể phân li lớn với nhiều marker vùng phân tích để xác định cá thể có trao đổi chéo, so sánh với kiểu hình để thu hẹp độ lớn vùng cần tìm kiếm Ở tác giả sử dụng tới 13000 F2, song cần ý tác giả không cần xác định kiểu hình toàn 13000 mà có tượng trao đổi chéo Khi độ lớn vùng tìm kiếm nhỏ, tỉ lệ trao đổi chéo thấp cần nhiều cá thể để có xác suất tìm có trao đổi chéo vùng nhỏ (1cM tương đương với tỉ lệ 1% trao đổi chéo giao tử 1cM nhiều vùng lớn chứa tới vài chục gene) Các tác giảđã thu hẹp vùng liên quan đến tính trạng với độ lớn 6.3 kb có gene khoảng này, gene cytokinin oxidase OsCKX2 Hình tóm lược bước xác định tách dòng QTL Hình Sơ đồ bước dò tìm tách dòng QTL BC: quần thể lai trở lại RIL: Recombinant inbred lines - quần thể cận giao tái tổ hợp BIL: Backcross inbred line - quần thể lai trở lại cận giao tái tổ hợp Liệu kết luận gene ảnh hưởng đến tính trạng?Để chứng minh điều đòi hỏi tác giả cần tìm thêm nhiều allele gene so sánh tính trạng chúng.Nếu tác giả cần tạo chuyển gene làm tăng hay giảm biểu gene để xem có thay đổi tương ứng kiểu hình hay không.Ashikari et alđã tiến hànhtìm thêm nhiều giống có allele khác nhau, đồng thời tạo chuyển gene thể rõ việc tăng hay giảm biểu geneOsCKX2 ảnh hưởng đến | www.vjs.org số lượng hạt Các kết chứng minh khác biệt biểu gene chất di truyền QTL nghiên cứu.Các tác giả tiến hành thêm bước áp dụng gene cho chọn giống, kết hợp với allele làm thấp cho thấy việc áp dụng vùng nhiễm sắc thể chứa locus Gn1 làm tăng số lượng hạt tới 30%.Có điểm cần ý ở locus Gn1, dạng allele cho suất cao xuất phát từ dòng indica, có lợi chuyển vào dòng japonica Do nước trồng lúa VJS | May 2014 | Volume | Issue | c05144 Phân tích QTL thực vật Tài liệu tham khảo indica Việt Nam việc áp dụng QTL chưa có nhiều lợi ích Kết luận Tóm lại nghiên cứu hoàn chỉnh xác định gene cho tính trạng khó suất lúa.Với việc thiết kế thí nghiệm xác tiến hành phương pháp nghiên cứu cẩn thận, công phu giúp nhóm nghiên cứu thành công.Bài báo thiết lập tiêu chuẩn cao để nghiên cứu di truyền tính trạng số lượng hướng tới Đối với Việt Nam, nước ta có nhiều giống trồng quý đặc hữu có tính trạng nông học chất lượng cao Việc phân lập gene dựa phương pháp di truyền sinh học phân tử nâng cao hiểu biết trình sinh học sinh vật mà đóng góp trực tiếp cho việc chọn tạo giống trồng có định hướng cách xác Các tiến kỹ thuật giúp giảm giá thành việc xác định kiểu gene nhiều lần lợi cần nắm bắt Việc quan trọng bảo tồn nguồn gene quý trung tâm giống trồng quốc gia, thiết kế thí nghiệm để lai tạo quần thể khảo sát kiểu hình, tìm gene hay thị phân tử hữu ích để áp dụng vào sản xuất | www.vjs.org Ashikari M, et al (2005) Cytokinin oxidase regulates rice grain production Science 309(5735):741-745 Lander ES & Botstein D (1989) Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLPlinkage maps Genetics 121(1):185-199 Yano M, et al (1997) Identification of quantitative trait loci controlling heading date in rice using a high-density linkage map Theoretical and Applied Genetics 95(7):1025-1032 Sasaki A, et al (2002) Green revolution: a mutant gibberellin-synthesis gene in rice Nature 416(6882):701702 Đọc thêm Tanksley SD (1993) Mapping polygenes Annual Review of Genetics 27:205-233 Yano M (2001) Genetic and molecular dissection of naturally occurring variation Current Opinion in Plant Biology 4(2):130-135 Lời cảm ơn: Tác giả xin cảm ơn Quỹ Giáo dục Việt Nam VEF tài trợ phần cho nghiên cứu Về tác giả: T.S Nguyễn Viết Cường nhận tiến sĩ di truyền thực vật đại học Cornell, New York, Hoa Kỳ năm 2014 Tác giả nghiên cứu di truyền cà chua, cụ thể tìm gene ảnh hưởng đến trình phát triển chín gene làm tăng chất lượng giá trị dinh dưỡng cà chua VJS | May 2014 | Volume | Issue | c05144