Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát

MỞ ĐẦU Ung thư gan năm dạng ung thư phổ biến giới, đứng hàng thứ ba nguyên nhân gây chết ung thư toàn cầu Cơ hội sống sót bệnh nhân mắc ung thư gan thấp, tỷ lệ sống sót khoảng 36%, đặc biệt số nơi tỷ lệ 17% sau đến năm chẩn đoán mắc bệnh [31] Hàng năm có khoảng 600.000 người chẩn đoán mắc ung thư gan gần số số lượng người chết năm [36] Từ số cho thấy thực tế việc chẩn đoán điều trị ung thư gan giới gặp nhiều khó khăn Proteomics công cụ số phân tích hệ protein thể sinh vật Kỹ thuật proteomics áp dụng cho nghiên cứu thị sinh học bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư quản, ung thư vòm họng, ung thư gan, ung thư máu Việc nghiên cứu kỹ thuật proteomics ngày mở rộng, đem lại kết ngày lớn ứng dụng sinh học, y học, dược học nghiên cứu chế trình sinh học [39] Ung thư gan nguyên phát dạng ung thư xuất phát từ tế bào gan chiếm đến 90% trường hợp ung thư gan Nhiễm virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) mạn tính xơ gan cho nguyên nhân dẫn đến ung thư gan [35] Việt Nam nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao nhiễm HBV HCV Do đó, việc phát sớm ung thư gan quan trọng việc điều trị loại ung thư Thực luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích proteomic mô gan người bị ung thư gan nguyên phát” với mục đích: Phân tích protein ty thể, microsome phần lại tế bào tách từ mô gan ung thư mô gan bình thường bệnh nhân ung thư gan -1- Phân tích so sánh biểu protein ty thể, microsome phần lại mô gan ung thư mô gan bình thường bệnh nhân ung thư gan nhằm tìm protein đặc trưng có liên quan đến bệnh Đề tài thực phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội -2- Chương – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƯ GAN Ung thư gan bệnh lý ác tính phổ biến giới Bệnh khó chẩn đoán, tiên lượng xấu, tỷ lệ tử vong cao tử vong thời gian ngắn kể từ phát Trong năm 2008 ước tính có 12 triệu trường hợp chẩn đoán mắc ung thư, triệu người chết khoảng 25 triệu người sống chung với ung thư giới Tại Mỹ, năm 2009 ước tính có 22.620 trường hợp chuẩn đoán mắc ung thư, 18.160 người chết Ung thư gan (UTG) gồm hai loại nguyên phát thứ phát Dạng nguyên phát hình thành từ mô gan, dạng thứ phát tạo nên tế bào từ quan khác thể di thông qua máu, hạch bạch huyết tới gan tạo khối u (nên gọi ung thư gan di căn) Dưới kính hiển vi, tế bào ung thư di gan nhìn giống tế bào ung thư mà chúng xuất phát Do đó, phạm vi khoá luận này, xin đề cập đến ung thư gan nguyên phát với dạng ung thư phổ biến ung thư biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [52] 1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát Các khối u ác tính nguyên phát gan phát sinh từ thành phần biểu mô biểu mô, ung thư biểu mô loại hay gặp nhất, chiếm vị trí quan trọng bệnh học UTG Dựa vào đặc điểm hình thái sinh hoá tế bào, UTG nguyên phát phân loại thành dạng sau [3]: - Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma – HCC) dạng ung thư ác tính xuất phát từ tế bào gan, chiếm khoảng 90% dạng UTG nguyên phát Bệnh nhân mắc HCC có nguy tử vong cao - Ung thư biểu mô đường mật (Cholangio carcinoma) dạng có khối u ác tính gan bao gồm tế bào giống tế bào biểu mô đường mật Bệnh thường gặp lứa tuổi cao so với ung thư tế bào gan, trung bình khoảng -3- 65 tuổi Dạng chia thành thể thể ngoại vi thể trung tâm - Ung thư hỗn hợp tế bào gan – đường mật (hepatocholangiocarcinoma) dạng mang đặc điểm mô bệnh học hai loại nói trên, nói chung gặp - Ung thư nguyên bào gan (hepatoblastoma) dạng thường gặp trẻ em, người trưởng thành - Ung thư nội mạch máu dạng biểu bì (Epithelioid hemangioendothelioma) loại mô tả, thường gặp tuổi 50, 2/3 số trường hợp phát phụ nữ 1.1.2 Các giai đoạn ung thư gan Ung thư gan chia làm giai đoạn: • Trong giai đoạn I, có khối u không lây lan sang mạch máu gần • Trong giai đoạn II, có khối u lan mạch máu gần đó; nhiều khối u, không số lớn cm • Giai đoạn III chia thành giai đoạn IIIA, IIIB, IIIC; Trong giai đoạn IIIA, điều sau tìm thấy: nhiều khối u lớn cm khối u lan rộng đến chi nhánh mạch máu gần gan Trong giai đoạn IIIB, có hay nhiều khối u kích thước mà có hai: lây lan đến quan lân cận khác với túi mật, bị hỏng thông qua màng khoang phúc mạc Trong giai đoạn IIIC, ung thư lan đến hạch bạch huyết gần • Trong giai đoạn IV, ung thư lan tràn vượt gan đến nơi khác thể, chẳng hạn xương hay phổi Các khối u có kích thước lan mạch máu gần hạch bạch huyết [53] -4- 1.1.3 Nguyên nhân ung thư gan Mỗi tác động xấu làm tăng nguy mắc bệnh ung thư Các bệnh ung thư khác có tác nhân gây bệnh khác Ví dụ, để da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời mạnh tác nhân dẫn đến ung thư da Hút thuốc tác nhân dẫn đến ung thư phổi, miệng, quản, bàng quang, thận, nhiều quan khác Nhưng việc có một, hay có vài tác nhân nghĩa người mắc bệnh Các nhà khoa học tìm thấy số tác nhân làm tăng khả dẫn đến ung thư biểu mô tế bào gan UTG xem biến chứng phổ biến bệnh mãn tính thường gặp gan Chúng thường gặp nhiều độ tuổi khác nhau, hàng năm có khoảng 5,5–14,9/100.000 người mắc bệnh ước tính khoảng 600.000 – 1.000.000 ca tử vong [31] Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh khác nhiều tuỳ theo khu vực địa lý giới, phương Đông phương Tây Khu vực có tỷ lệ phát bệnh cao Đông Á, Đông Nam Á khu vực Nam sa mạc Sahara Nghiên cứu dịch tễ học xác định yếu tố nguy UTG bao gồm: nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV), viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) dẫn đến viêm gan mãn tính; xơ gan; nhiễm độc aflatoxin (AF); loại hoá chất gây ung thư rượu, asen, dioxin (hình 1),… rối loạn chuyển hoá apocphirin, thiếu hụt α–1 antitrypsin, bệnh Wilson, chứng nhiễm sắc tố sắt di truyền Ngoài yếu tố độ tuổi, giới tính, yếu tố di truyền,… ảnh hưởng đến nguy mắc bệnh Mặc dù yếu tố nguy gây UTG tác động đến tế bào gan theo đường khác cuối dẫn đến biến đổi di truyền hình thành tế bào ung thư -5- Hình 1: Các nguyên nhân gây ung thư gan [57] Nhiễm virus HBV yếu tố nguy hàng đầu UTG toàn giới, phân bố địa lý tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính tỷ lệ mắc bệnh có mối tương quan chặt chẽ Ví dụ Trung Quốc, nước thuộc khu vực Đông Nam Á, Nam sa mạc Sahara có tỉ lệ mức cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), tiêm vaccine dự phòng HBV ngăn ngừa khoảng 70% UTG vùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao HBV retrovirus có vật chất di truyền dạng ADN sợi đơn Những báo cáo từ đầu thập niên 80 cho thấy diện ADN HBV hệ gen tế bào gan khoảng 90% trường hợp bệnh nhân ung thư gan [3] Nhiều nghiên cứu chứng minh ADN HBV chèn vào hệ gen người làm biến đổi ADN nhiễm sắc thể, hoạt hoá gen ung thư c–Myc, c–Fos,… bất hoạt số gen ức chế khối u TP53 Ngoài ra, sản phẩm protein hệ gen HBV HBx, protein gen pre S/S hoạt hoá gen ung thư dẫn tới thúc đẩy nhanh chu trình tế bào ức chế trình chết theo chương trình (apoptosis) Nhiễm virus HCV yếu tố nguy thứ UTG Có khoảng 2–4% số trường hợp nhiễm HCV mạn tính phát triển thành UTG Ở quốc gia, vùng lãnh thổ tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính thấp thường có tần suất UTG thấp -6- trung bình, trừ Nhật Bản (nơi mà virus HCV yếu tố nguy số 1) Số ca tử vong UTG Nhật tăng mạnh từ năm 1975 trở đi, thời gian tỷ lệ nhiễm HBV không đổi, có viêm gan HCV tăng lên tương ứng với tỷ lệ tử vong Những nghiên cứu gần cho thấy sản phẩm protein HCVcó thể tương tác với protein vật chủ tham gia vào trình phát triển, tăng sinh điều hòa hoạt động tế bào dẫn đến hình thành tế bào ác tính Có ba protein xem chứng tham gia vào trình protein lõi (core protein), NS3 NS5A Aflatoxin (AF) mycotoxin tiết từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, thường mọc lạc hạt ngũ cốc ẩm ướt, chứng minh gây UTG thực nghiệm súc vật (hình 2) AF chất tương tác với virus HBV tăng đáng kể nguy mắc UTG AF gây đột biến gen, đột biến gen p53 quan sát thấy nhiều Hàng loạt nghiên cứu đột biến gen này, đặc biệt đột biến G/T codon 249 tìm thấy bệnh nhân UTG khu vực có phơi nhiễm AF cao [31] Hình 2: Cơ chế gây ung thư tác nhân ung thư gan [13] -7- Ngoài nguyên nhân yếu tố khác tuổi, giới tính, chủng tộc hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid, rối loạn trao đổi chất nhiễm sắt mô, thiếu hụt α1-antitrypsin góp phần làm tăng nguy dẫn đến ung thư gan [35] 1.1.4 Chẩn đoán điều trị ung thư gan 1.1.4.1.Chẩn đoán Gan cấu tạo chủ yếu tế bào biểu mô gan, loại tế bào có khả tái sinh mạnh, ung thư gan phát triển nhanh Đồng thời, triệu chứng ung thư gan thường biểu lộ bệnh nghiêm trọng, đó, việc điều trị ung thư gan gặp nhiều khó khăn Đây nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ tử vong ung thư gan cao Việc chẩn đoán ung thư gan giai đoạn sớm vô cần thiết Có hai phương pháp thông dụng để chẩn đoán ung thư gan xét nghiệm chẩn đoán vật lý xét nghiệm máu tìm alpha fetoprotein (AFP) huyết bệnh nhân bị ung thư Để chẩn đoán có triệu chứng ung thư gan, số phương pháp chẩn đoán vật lý áp dụng như: siêu âm, chụp cắt lớp (CT), chụp cộng hưởng từ (MRI - Magnetic Resonance Imaging), chụp X- quang Tuy nhiên, phương pháp tốn kém, phụ thuộc nhiều vào máy móc không hiệu để phát khối u giai đoạn sớm Cách chẩn đoán thứ hai thông dụng việc xét nghiệm thị AFP huyết AFP glycoprotein có khối lượng 70kDa, tổng hợp gan túi noãn hoàng giai đoạn thai nhi, sau tiết vào huyết tuần thứ 13 thai kỳ Sau sinh, nồng độ AFP huyết giảm không phát người trưởng thành khỏe mạnh AFP -8- dùng để sàng lọc người có nguy bị ung thư gan cao AFP sau trẻ sinh ra, diện máu người lớn có nghĩa có biến đổi tế bào gan có khả mắc ung thư gan cao [10] Tuy vậy, AFP máu không đặc trưng cho ung thư gan tăng người bị viêm gan Hơn nữa, độ nhạy phương pháp AFP không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thư gan mà hàm lượng AFP máu bình thường (đặc biệt bệnh nhân có khối u nhỏ 3cm) [11] Hàm lượng AFP cao cho nghi ngờ chắn bệnh nhân mắc ung thư gan Các xét nghiệm giúp chẩn đoán ung thư gan, đa số trường hợp cách để chắn lấy mảnh khối u xem xét kính hiển vi Điều gọi sinh thiết Có nhiều cách khác để có mẫu khối u Trong số trường hợp, mẫu sinh thiết thực phẫu thuật Nếu khối u lớn lan rộng khắp gan, kim rỗng đặt qua da bụng vào gan Sinh thiết mẫu thực thời gian phẫu thuật nội soi 1.1.4.2 Điều trị Có nhóm điều trị chính: phẫu thuật không phẫu thuật Nhóm phẫu thuật phương thức điều trị triệt căn, có dự hậu tốt hẳn, cắt gan điều trị chọn lựa, nhiên có khoảng 10-20% bệnh nhân có khả cắt bỏ UTG Ghép gan nhằm loại bỏ gan bị xơ hóa UTG, nhiên, vấn đề thiếu gan cho để ghép Điều trị không phẫu thuật dùng: Thuyên tắc mạch hóa trị, chích cồn qua da, phá hủy u nhiệt, phá hủy u sóng tần số radio, hóa trị toàn thân với Doxorubicin, xạ trị qui ước, điều trị nhắm đích Điều trị phẫu thuât: Phẫu thuật cắt gan, ghép gan, hủy u laser hay đông lạnh cho u bề mặt -9- 1.2 CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC 1.2.1 Khái quát Như biết, việc chẩn đoán phát sớm ung thư gặp nhiều khó khăn Những phương pháp áp dụng thời không đủ khả để tạo bước đột phá việc chẩn đoán sớm ung thư, đặc biệt ung thư gan Trong năm gần có hướng nghiên cứu trọng yếu việc nghiên cứu tìm kiếm thị sinh học Chỉ thị sinh học (biomarker) phân tử biểu kiện sinh học Chỉ thị sinh học đơn chất, glucose thị bệnh tiểu đường, phân tử protein, kháng thể thị bệnh nhiễm trùng, hay dấu ấn ADN thị cho bệnh liên quan đến di truyền Với phát triển kỹ thuật sinh học đại, người ta nghiên cứu nhiều phân tử mẫu bệnh phẩm microarray, proteonomics [16] Trong nghiên cứu bệnh học, thị sinh học phân tử gây bệnh hay phân tử tạo sau bệnh phát triển Biomarker gọi “chỉ thị” tượng sinh học, nghiên cứu gần chứng minh tính hữu dụng thị sinh học cho nhiều môn sinh học từ nghiên cứu đến ứng dụng Các nhà nghiên cứu thị sinh học tin tưởng thị sinh học chứa đựng bí ẩn bệnh lý, việc truy tìm thị sinh học giúp đạt kết có tầm ứng dụng hữu hiệu lớn lao y học Những ứng dụng gồm phương pháp chẩn đoán xác cho bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh ), bệnh miễn nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh yếu tố môi trường Chỉ thị sinh học có nhiều kỳ vọng ứng dụng đo lường hiệu ứng thuốc [5] 1.2.2 Các phương pháp nghiên cứu thị sinh học ung thư -10- Hình 20 Cây chủng loại phát sinh protein p53 theo phương pháp maximum likehood Hình 21 Cây chủng loại phát sinh protein p53 theo ClustalX2 Kết phân tích chủng loại phát sinh phương pháp Maximum parsimony, Maximum likelihood ClustalX cho thấy trình tự P53 người nhóm với Macaca mulatta (khỉ vàng) Vì vậy, kết bảo đảm độ tin cậy -57- Ty thể bào quan quan trọng, coi nhà máy sản xuất lượng tế bào Tại xảy trình hô hấp tế bào, chuyển ôxy chất dinh dưỡng thành adenosine triphosphate (ATP) ATP “dòng” lượng hóa học tế bào để cung cấp lượng cho hoạt động Không có ty thể, động vật bậc cao không tồn tế bào chúng thu nhận lượng thông qua hô hấp yếm khí, trình hiệu nhiều Trên thực tế, ty thể giúp tế bào sản xuất lượng nhiều gấp 15 lần so với tế bào bào quan Các động vật có cấu trúc phức tạp, bao gồm người, cần lượng lớn lượng tồn ATP synthase protein nằm màng ty thể có vai trò việc tổng hợp adenosine triphosphate (ATP) từ adenosine diphosphate (ADP) phosphat vô ATP synthase cấu tạo hai phần F0 F1 Phần F1 bao gồm tiểu đơn vị: alpha, beta, gamma, epsilon, delta Phần F0 bao gồm tiểu đơn vị b2, c từ đến 12 xếp đối xứng Phần F0 F1 liên kết lõi trung tâm (dưới đơn vị gamma epsilon) nhánh bên (b delta) Dòng electron kích hoạt đĩa màng lõi trung tâm quay, quay điều khiển lực tiểu đơn vị beta với nucleotide (ADP ATP) đẫn đến tạo lượng ATP (hình 22) Hình 22 Mô hình phân tử ATP synthase [7] -58- Trong nghiên cứu này, nhận thấy biểu tăng mạnh protein ATP synthase Sự biểu tăng protein mẫu protein ty thể phù hợp với giả thiết tăng sinh nhanh chóng tế bào ung thư đặc biệt ung thư gan đòi hỏi nguồn lượng lớn tăng cường enzyme ATP synthase giúp tổng hợp lượng nhanh chóng Trong nghiên cứu này, Hexokinase biểu tăng Hexokinase enzyme phosphoryl hóa đường cacbon thành hexose phosphate, có phần lớn các sinh vật, glucose chất quan trọng hexokinase, glucose-6phosphate sản phẩm quan trọng chúng Đây enzyme tham gia vào trình đường phân tế bào Quá trình đường phân trình thiếu tế bào trình cung cấp lượng ATP cho tế bào hoạt động [48] Ở động vật có vú, hexokinase gồm bốn dạng isozyme quan trọng, nằm vị trí khác tế bào có động học khác chất, điều kiện chức sinh lý Chúng kí hiệu hexokinase I, II, III IV A, B, C D Hexokinase I, II III isozyme có lực cao với glucose hexokinase II/B dạng chủ yếu giữ vai trò điều hòa kiểu tế bào động vật có vú hàm lượng tăng lên nhiều loại bệnh ung thư Hexokinase II/B có liên quan đến lượng sinh học trình apoptosis tế bào Theo nghiên cứu Kim Cộng (2007), họ mối liên quan HK II trình làm ổn định ty thể tế bào HCC Những phát nghiên cứu liên quan đến tham gia HK II trong điều hòa ổn định ti thể tế bào ung thư gan Đặc biệt, nghiên cứu cho thấy tình trạng thiếu oxy làm tăng ổn định ty thể theo HK II, HK II ức chế hoạt hóa tín hiệu apoptosis qua ty thể Hơn hệ thống HK II ức chế biểu tính hiệu kháng u gây apoptosis Theo nghiên cứu này, họ thấy thiếu hụt oxy gián tiếp tăng HK II gây ổn định ty thể 3-BrPA gây thay đổi cấu trúc PTPC đưa đến hoạt hóa tín hiệu apoptosis ty thể Các chế hoạt hóa phụ -59- thuộc tín hiệu apoptosis ty thể phức hệ nhiều chế dẫn đến giải phóng Cytochrome C Ví dụ, họ protein proapoptosis Bcl2, chẳng hạn tBid, Bax/Bak Bim điều hòa apoptosis tương tác với VDAC màng ty thể [38] Nó mở lỗ thay đổi tính thấm ty thể làm thủng màng giải phóng protein phía màng Cytochrome C, AIF Smac/DIABLO Mặc dù cấu trúc lỗ bán thấm ty thể không hoàn toàn giải thích trọn vẹn, PTPC phức hợp nhiều loại protein gồm VDAC, ANT, CypD HK II Trong nghiên cứu này, người ta nhận thấy HK II ức chế 3-BrPA phân hủy HK II từ PTPC nguyên nhân PTPC mở giải phóng Cytochrome C bào tương Do đó, quan sát chung cho thấy HK II gây chế tế bào lại môi trường thiếu oxy, tăng tính thấm HCC HK II ức chế biểu tính hiệu kháng u hoạt hóa tín hiệu apoptosis ty thể phát triển khối u Nghiên cứu cho thấy biểu mức HK II mô u so với mô bình thường Vì vậy, để ngăn phát triển khối u cần giảm lượng HK II [57] Chúng ta biết, tế bào gan có tốc độ phân chia phát triển nhanh, đặc biệt chúng chuyển sang trạng thái ung thư Điều đòi hỏi protein tham gia điều hòa kiểm soát việc chép, phiên mã dịch mã tế bào phải tăng cường hoạt động Trong nghiên cứu này, nhận dạng protein tham gia vào trình phiên mã dịch mã NAD-dependent deacetylase sirtuin-6, Rho guanine nucleotide exchange factor, Neural retinaspecific leucine zipper protein, Zinc finger protein 806 ty thể protein Myelin transcription factor 1-like protein, Translin-associated factor X-interacting protein microsome Tất protein có biểu tăng mô ung thư Yếu tố Rho protein gồm có tiểu đơn vị có lực cao với ARN đơn, có hoạt tính helicaza ATP-aza để tháo xoắn sợi lai ADN-ARN Khi bám vào ARN, yếu tố Rho phân giải ATP Năng lượng giải phóng giúp chuyển -60- dọc sợi ARN sinh tới bong bóng phiên mã, sau yếu tố Rho tách đôi ADNARN giải phóng ARN NAD-dependent deacetylase có khả tác động tới 'Lys-9' 'Lys-56' histone H3 Sự acetyl hóa histone H3 dị nhiễm sắc giai đoạn S chu kỳ tế bào Deacetylates 'Lys-9' histone H3 đích NF-Kappa-B điều hòa giảm biểu tập hợp gen đích NF-Kappa-B Sự deacetyl hóa nucleosome ngăn cản RELA liên kết với ADN đích Điều cần thiết cho liên kết ADN với telomere giai đoạn-S để trì telomere bình thường giúp cho ổn định di truyền Họ protein Zinc finger protein tham gia vào việc điều hòa phiên mã Zinc finger protein gắn với ADN vị trí liên kết với yếu tố phiên mã, protein điều hòa, protein biểu tăng ngăn cản hoạt động phiên mã tế bào ung thư [51] Trong trình miễn dịch chống ung thư, dường vai trò đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thường xuyên chiếm ưu Quá trình có tham gia phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu (MHC), người gọi HLA Trong phân tích proteomics microsome này, nhận dạng protein MHC class I (MHC I) Protein biểu giảm mô gan ung thư so với mô gan bình thường Protein MHC tích lũy lưới nội chất làm nhiệm vụ nơi trung chuyển phân tử Trong tế bào mang virus hay tế bào ung thư, kháng nguyên nội sinh nằm tế bào chất, vi thể proteasome chế biến thành peptide kháng nguyên Các peptide TAP vận chuyển vào khoang lưới nội chất để liên kết với rãnh MHC I Sau đó, phức hệ MHC Ipeptide kháng nguyên đóng gói cách bọc màng vận chuyển lên bề mặt tế bào để trình diện cho tế bào TCD8+, kích thích tế bào T sản sinh Lymphokin để tiêu diệt tế bào mang kháng nguyên nội sinh Khi tế bào bị nhiễm virus nội sinh, lượng MHC I tổng hợp dư thừa, sẵn sàng làm nhiệm vụ -61- trình diện kháng nguyên nội sinh Trong nghiên cứu chúng tôi, protein MHC I giảm, điều gợi ý rằng, trình tiến triển thành ung thư tế bào gan làm ảnh hưởng tới đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào ung thư không bị tiêu diệt thiếu hụt nhận diện kháng nguyên nội sinh [2] Beta-actin protein tham gia cấu trúc tế bào, có tính bảo thủ cao, liên quan đến dạng vận động tế bào khác biểu tất tế bào nhân chuẩn Sự polymer hóa actin hình cầu (G-actin) dẫn tới hình thành cấu trúc sợi (F-actin) cấu trúc xoắn kép Mỗi actin gắn với phân tử khác Thiếu hụt actin gây rối loạn vận động liên quan đến thần kinh từ dẫn đến rối loạn trương thể kéo dài co trơn nguyên nhân tư vận động bất bình thường Trong nghiên cứu chúng tôi, beta-actin biểu tăng rõ rệt gel mô ung thư, kết việc tế bào gan ung thư tăng sinh nhanh chóng kéo theo thành phần tham gia cấu tạo tế bào tăng [47] Trong nghiên cứu này, nhận thấy có biểu Major vault protein mô ung thư Major vault protein protein màng mã hóa gene MVP Vaults cấu trúc gồm nhiều tiểu đơn vị, có vai trò tham gia kênh vận chuyển chất nhân tế bào chất Protein gián tiếp tham gia kháng lại thuốc thông trình vận chuyển Nó phân bố rộng rãi mô bình thường, biểu mức tế bào ung thư đa kháng thuốc Sự biểu mức protein thị đầy tiềm việc khám điều trị bệnh [45] Trong nghiên cứu này, thấy biểu đa dạng protein khác biệt không đặc trưng riêng bệnh Những thị riêng cho bệnh hình thành chuỗi tác động tổng hợp với bệnh khác, điều góp phần bổ sung cho ý kiến thị ung thư không đặc hiệu với riêng loại ung thư mà phản ánh mối liên quan chặt chẽ tiến triển bệnh ung thư với trình viêm bệnh lý khác thể -62- KẾT LUẬN Qua trình phân tích proteomics mô gan từ bệnh nhân ung thư gan, rút số kết luận sau: Bằng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ MALDI-TOF MS, xác định biểu khác biệt protein ty thể microsome tách từ mô gan ung thư mô gan bình thường: - Phân tích protein ty thể xác định 43 spot protein biểu khác biệt gel nhận dạng 18 protein, có 13 protein định danh protein giả thiết - Phân tích protein microsome xác định 27 spot protein biểu khác biệt gel nhận dạng 23 protein, có 16 protein định danh protein giả thiết Các protein nhận dạng ty thể bao gồm protein cấu trúc tế bào, protein tham gia vào trình miễn dịch bảo vệ thể, trình trao đổi chất, phiên mã, dịch mã Đặc biệt có protein: HSP 70, HSP 60, ATP synthase biểu tăng, protein p53, MHC I có biểu giảm rõ rệt mô ung thư Các protein nhận dạng gel microsome bao gồm protein tham gia vào trình trao đổi chất, điều hòa phiên mã, miễn dịch protein cấu trúc tế bào Đặc biệt protein: HSP 70, MVP, Zinc finger Betaactin có biểu tăng mô ung thư Trên sở phân tích chủng loại phát sinh mức phân tử chương trình phylip cho thấy Hsp70 người thuộc nhóm với Hsp70 số động vật khác Xenopus laevis, Bos taurus, Oryctolagus cuniculus, Megalobrana amblycephala, Mus musculus, Rattus norvegicus, P53 người gần gũi với P53 khỉ vàng (Macaca mulatta) -63- KIẾN NGHỊ Từ thực tế nghiên cứu trên, đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục thu thập mẫu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thư gan nguyên nhân khác giai đoạn ung thư khác nhằm phân tích biến đổi thành phần protein liên quan đến bệnh Thu thập mẫu huyết tương bệnh nhân viêm gan B C tiến triển thành ung thư gan bệnh nhân ung thư gan có tiền sử nhiễm HBV HCV nhằm tìm hiểu mối liên hệ viêm gan B, C ung thư gan Kết hợp phân tích proteomics huyết tương mô gan để tìm mối liên hệ hai hệ protein này, nhằm tìm thị ung thư gan đặc hiệu dễ dàng nhận biết, phục vụ cho chẩn đoán sớm ung thư gan -64- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phan Văn Chi (2006), PROTEOMICS Khoa học hệ gene, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Hà Văn Mạo, Hoàng Kỷ, Phạm Hoàng Phiệt (2006), Ung thư gan nguyên phát, Nhà xuất y học Vũ Minh Thiết, Nguyễn Nam Long, Đặng Thành Nam (2004), “Ngiên cứu hệ proteomic huyết người kết nối sắc ký lỏng Nano đa chiều hệ khối phổ liên tục”, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2004, [16] NCCB định hướng Y-Dược học, Học viện Quân Y, Hà Nội, tr 470474 Tài liệu tiếng Anh Aderson, M.P, A.N.L.(2006), "A List of Candidate Cancer Biomarker for Targeted Proteomics", Bio Ins, 1, PP 1–48 Amy J Clippinger and Michael J Bouchard (2008), “Hepatitis B Virus HBx Protein Localizes to Mitochondria in Primary Rat Hepatocytes and Modulates Mitochondrial Membrane Potential”, J Virology, 82 (14), PP 6798-6811 Andries K V., Guillemont J, Winkler H, Van Gestel (2005), “A diaryquinolime drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis”, Science, 307 (7), PP 223-227 -65- Brachmann R K , Vidal M & Boeke J D (1996): “Dominant-negative p53 mutations selected in yeast hit cancer hot spots”, Proc Natl Acad Sci USA, 93, PP 4091-5000 Bakos A.D, Hutson S.P, (2008), “BRCA mutation-negative women from hereditary breast and overian cancer families: a qualitative study of the BRCA-negative experience”, NIH, 11(3), PP 205-207 10 Deng-Fu Yao, Z.Z.D.A.M.Y (2007), “Specific molecular marker in hepatocellular carcinoma”, Science, 6(3), PP 241-247 11 Shahid a Khan (2009), “Diagnosis of hepatocellular carcinoma” World J Gastroenterol, 15(11), PP 1301-1314 12 Nguyen Minh Đuc, Nguyen Thi Ngoc Ha, Trinh Hong Thai, (2009), “Proteomic analysis of bone marrow cells from leukemia patients”, Proceedings of the National Conference on Proteomics, April 01-02 , 2009 in Do Son, p.65-78 13 Farazi P.A., Depinho R.A, (2006), “Hepatocelular carcinoma phathogenses: from genes to evironment”, Nat Rev Cancer, 6, PP 674-687 14 Govekar R.B And Zingde S.M, (2007), "Cancer Proteomics: How Far are We from Clinics" Int J Hum Genet, 7(1), PP 91-97 15 Harris C C (1996), “Structure and function of the p53 tumor suppressor gene: clues for rational cancer therapeutic strategies” JNCI, 88, PP 1442-1455 16 He M., Zhai R., Wei X., Wang Q., Jiang M R Z., Huang Y., and Zhang Z, (2008), “Detection and identification of NAP-2 as a biomarker in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma by proteomic approach”, Pro Sci, 6, PP 1-11 -66- 17 Huong T T T., Thai T H (2006), “Plasma proteomic analysis of acute myeloid leukemia”, Program & Abstracts Joint Third AOHUPO and Fourth Structural Biology and Functional Genomics Conference, PP 250 18 Jain K., M.D., Fracs, Ffpm, (2002, "Role of Proteomics in Diagnosis of Cancer", Tech Cancer Res & Treatt, 1(4), PP.281-286 19 Jesus M Matos, Frank A Witzmann,(2009), “A Pilot Study of Proteomic Profiles of Human Hepatocellular Carcinoma in the United States”, J Surg Res, 155(2), PP 237–243 20 Jennifer S Carew and Peng Huang (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mole Cancer, 9, PP 1476-4598 21 Kim W., L.S.O., Kim J S., Ryu Y H., Byeon J., Kim H, Kim Y., Heo J S., Park Y M., and Jung G, (2003), “Comparison of Proteome between Hepatitis B Virus- and Hepatitis C Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clinl Cancer Res, 9, PP 5493–5500 22 K Nakamura, X.Z., M Fujimoto, T Tanaka, J Kimura-Akada, H.Furumoto, Y Kuramitsu, B Jordan, (2008), “1D-SDS-PAGE and Nano-LC- MS/MS for Membrane Proteomics of Mouse Liver Microsomes (MPI sample) and its Application to Human Proteomics of ER from Jurkat Cells”, J Pro & Bio, S2, PP.114-115 23 Kondo T.(2008), “Tissue proteomics for cancer biomarker development Laser micro dissection and 2D-DIGE”, PP 5493-5500 24 Lane S., William, (2007), “Comparative Cytochrome P450 Proteomics in the Livers of Immunodeficient Mice Using Mole Cell Bio, 6, PP 953-962 -67- 18 O Stable Isotope Labeling”, 25 Le Naour F., B.F., Misek D E., BresChot C., Hanash S M., and Beretta L, (2002), “A Distinct Repertoire of Autoantibodies in Hepatocellular Carcinoma Identified by Proteomic Analysis”, Mole & Cell Prot, 1, PP.197–203 26 Liebler D.C (2002), “Introduction to Proteomics”, Humana Press Inc, New Jersey 27 Lupberger J., H.E (2007), “Hepatitis B virus-induced oncogenesis”, World J Gast, PP 74-81 28 Mai.T.N, Thai T H (2009), “Proteomic analysis of liver tissue from some animals in the region exposed to dioxin at Ma Da area, Dong Nai province”, VNU Jounal of Science, Nat,Sci & Tech, 24, PP 13-19 29 Maria Pleguezuelo, Laura M Lopez-Sanchez, Antonio Rodriguez-Ariza, Jose L Montero, Javier Briceno, Rubenciria, and Jordi Muntane (2010), “Proteomic analysis for developing new biomarkers of hepatocellular carcinoma”, World J Hepatol, (3), PP 127-135 30 Mary A C and Laura J F, (2005), “GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma”, J Hepat, 43 (6), PP 1007-1012 31 Mazzanti R., L Gramantieri, and L Bolondi (2008), “Hepatocellular carcinoma: Epidemiology and clinical aspects”, Molec Asp Med, 29(1– 2), PP 130–143 32 M Hollstein, B Shomer, M Greenblatt, T Soussi, E Hovig, R Montesano & C C Harris (1996), “Somatic point mutations in the p53 gene of human tumors and cell lines: updated compilation” Nucl Aci Res, 24, PP 141-156 -68- 33 M Hsiao, J Low, E Dorn, D Ku, P Pattengale, J Yeargin (1994) “Gain of function mutations of the p53 gene induce lymphohematopoietic metastatic potential and tissue invasiveness” Am J Pathol (145), PP 402-414 34 M S Greenblatt, W P Bennett, M C Hollstein & C C Harris (1994), “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis”, Cancer Res , 54, PP 4855-4878 35 Mohammad Hossein Somi Md Assistant Professor (2005), “Hepatocellular carcinoma”, Hepat Hepat,5(3),PP 65-67 36 Nikolova M S., D.O.M.G., Medical Faculty, Medical University Sofia, (2007), “Molecular pathogenesis of Hepatocellular carcinoma ”, Bal J Med Genetics, 10 (1), PP 15-22 37 Paradis V., B.P (2007), “In the new area of noninvasive markers of hepatocellular carcinoma In the new area of noninvasive markers of hepatocellular carcinoma”, J Hepat, 46, PP.11-49 38 Pastorino JG, Shulga N, Hoek JB (2002), “Mitochondrial binding of hexokinase II inhibits Bax-induced cytochrome c release and apoptosis”, J Biol Chem, 277, PP 7610–7618 39 Polanski M., A.N.L (2006), “A List of Candidate Cancer Biomarkers for Targeted Proteomics”, Bio Ins, 1, PP.1-48 40 Qin L.X., T.Z.Y (2002), "The Prognotics molecular markers in hepatocellular carcinoma", World J Gast, 8(3), PP 385-392 41 Sun W., X.B., Sun Y, Du X., Lu M., Hao C., Lu Z., Mi W., Wu S., Wei H., Gao X., Zhu Y., Jiang Y., Qian X., and He F, (2007), “Proteome Analysis of Hepatocellular Carcinoma by Two-dimensional Difference Gel Electrophoresis”, Mole & Cell Pro, 6, PP.1798–1808 -69- 42 Thai T H., Huong T T T (2005), “Plasma proteomic analysis of acute myeloid Leukemia patients”, VNU, Journal of science, Nat.,Sci., & Tech, 4, PP 54-60 43 William Cs Cho (2007), "Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery", Mole Cancer, 10, PP 6-25 44 Wong C H., C.S.K.P., Chan H.L.Y., Tsui S.K.W (2006), “The Molecular Diagnosis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clin Lab Sci, 43(41), PP.69-101 45 Rowan S., Ludwig.R L , Haupt.Y , Bates.S , Lux.X , Oren.M, 1996 “Specific loss of apoptotic but not cell cycle arrest function in human tumour derived p53 mutant”, EMBO J, 15, PP 827-838 Tài liệu tham khảo từ website 46 http://biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/en/proteomics.htm (13/11/2010) 47 http://.cancer.org/docroot/CRI/CRI_2_1x.asp?dt=25Cancer.org2 (11/10/2010) 48 http://en.wikipedia.org/wiki/Hexokinase (02/12/2010) 49 http://en.wikipedia.org/wiki/Major_vault_protein (14/11/2010) 50 http://en.wikipedia.org/wiki/Heat_shock_protein#Cancer_vaccine_adjuvant (23/11/2010) 51 http://www.uniprot.org/uniprot/?query (08/10/2010) 52 http://www.medicinenet.com/script/main/art?articlekey=104954 (14/09/2010) 53 http://www.siteman.wustl.edu/PDQ.aspx?id=662&xml=CDR256491.xml (27/11/2010) -70- 54 http://www.antigenics.com/products/tech/hsp/ (24/10/2010) 55 http://www.bioscience.org/2005/v10/af/1736/figures.htm (15/12/2010) 56 http://www.bioscience.org/1997/v2/d/soehnge/d538-551.htm (29/10/2010) 57 http://www.hopkinsmedicine.org/liver_tumor_center/conditions/cancerous_li ver_tumors/hepatocellular_carcinoma.html (12/12/2010) 58 http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n4/full/nrm2384.html (12/12/2010) 59 http://mct.aacrjournals.org/content/6/9/2554.abstract (26/09/2010) -71- [...]... quan [14] Vì nguyên nhân chính của ung thư gan là viêm gan B, C nên rất nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đối tượng là bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan Để -16- tìm hiểu khác biệt trong biểu hiện protein trong mô ung thư gan có tiền sử viêm gan B nhằm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thư, các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành phân tích hệ protein các tế bào gan ung thư bằng kĩ... 1.3.3 Proteomics trong nghiên cứu ung thư gan Tác hại của ung thư gan đối với sức khỏe con người và xã hội là vô cùng lớn Việc phân tích proteomics ung thư gan hứa hẹn sẽ cung cấp cho chúng ta sự hiểu biết đầy đủ hơn về các tác nhân gây ung thư gan, quá trình tiến triển bệnh và hơn nữa là đưa ra các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới cho bệnh nhân HCC Việc phân tích proteomics không chỉ dừng lại ở... proteomics để bước đầu phân tích hệ protein mô gan ung thư, so sánh với mô gan bình thư ng trên cùng một bệnh nhân nhằm tìm ra những protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này -27- CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí khối u của bệnh nhân ung thư tế bào gan Mẫu đối chứng là mô gan lành cách 5cm trên lá gan đó tại vị... trong môi trường ảnh hưởng không tốt đến hệ protein sinh vât Ung thư gan là một căn bệnh hiểm nghèo phổ biến ở nước ta Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu proteomics ung thư, đặc biệt là ung thư gan, tuy nhiên, ở Việt Nam hiện rất ít nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích proteomics mô gan ở bệnh nhân ung thư gan Do vậy, trong đề tài này chúng tôi đã sử dụng phương pháp proteomics... [29] Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây khối u ác tính gây tử vong cao Tỷ lệ mắc HCC ở Hoa Kỳ đang gia tăng Matos và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu proteomics ung thư gan của người Mỹ Khối u và mô từ ba bệnh nhân HCC người Mỹ bị viêm gan và không liên quan đến viêm gan đã được phân tích để tìm sự khác biệt phổ biến trong biểu hiện protein Protein đã được phân. .. hiện của hệ protein của các mô trong HCC liên quan mật thiết với các yếu tố gây bệnh và cơ chế ung thư gan có thể diễn ra khác nhau do các yếu tố HBV và HCV [21] -18- Cũng trên đối tượng các bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan B, tháng 4 năm 2008, Min He và cộng sự [16] đã công bố kết quả nghiên cứu phát hiện và xác định NAP-2 như là một chỉ thị sinh học của ung thư gan liên quan đến viêm gan. ..Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở bệnh nhân ung thư, có nồng độ thay đổi liên quan đến sự phát sinh và tăng trưởng của những khối u ác tính Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao... cứu phân tích proteomics so sánh đáp ứng của CYP trong mô gan chuột xử lý vơi 1,4-bis-2- (3,5dichloropyridyloxybenzene) (TCPOBOP) và mô đối chứng nhằm dự đoán đáp ứng của thuốc Trong nghiên cứu này, họ đã tiến hành phân tích so sánh proteomics P450 của gan chuột dưới tác động của TCPOBOP Phương pháp nghiên cứu gồm thu microsome bằng ly tâm, phân tách các protein microsome bằng phương pháp điện di, phân. .. trong mô, hay chỉ với nghiên cứu proteomics huyết tương Việc tìm kiếm các chỉ thị trong huyết tương kết hợp với nghiên cứu trên mô sẽ giúp chúng ta tiến gần hơn đến việc chẩn đoán ung thư một cách đơn giản và chính xác hơn chỉ với một xét nghiệm máu đơn giản Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics trên các dòng tế bào ung thư, phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhân ung thư gan đã... 2-5% của bệnh này khi dùng để chẩn đoán chung) Một số chỉ thị protein khác cũng đã được phát hiện từ nghiên cứu các bệnh ung thư tiền liệt tuyến, ung thư phổi, ung thư bàng quang, và ung thư buồng trứng; về các bệnh tim mạch đã có một số chỉ thị protein được cho là có liên quan đến bệnh nghẽn động mạch 1.2.3 Nghiên cứu chỉ thị sinh học với ung thư gan Với ung thư gan, việc nghiên cứu các chỉ thị sinh học