Nghiên cứu qui trình tổng hợp liên tục và tinh chế celecoxib (toàn văn)

Tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ diketon với hydrazin Phương pháp tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ đi từ dion 6 với hydrazin 7 đã được nhiều tác giả nghiên cứu, các quy trình

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Ngô Quốc Anh

Hà Nội - 2016

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về celecoxib 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất [9],[25],[31],[33] 3

1.1.2 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng 4

1.1.2.1 Viêm và cơ chế chống viêm của NSAIDs 4

1.1.2.2 Tác dụng 6

1.1.3 Tác dụng phụ 7

1.1.4 Chống chỉ định [3] 8

1.1.5 Chỉ định, liều dùng và cách dùng [3] 9

1.1.6 Dạng thuốc và biệt dược 9

1.2 Phương pháp tổng hợp 10

1.2.1 Tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ diketon với hydrazin 10

1.2.2 Tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ butynon với hydrazin 13

1.2.3 Tổng hợp celecoxib bằng phản ứng đóng vòng 1,3 15

1.3 Phương pháp tinh chế 16

1.3.1 Kết tinh 16

1.3.2 Một số phương pháp kết tinh celecoxib 17

ii

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.2 Thiết bị thí nghiệm 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Tổng hợp hóa học và tinh chế 22

2.3.1.1 Tổng hợp hóa học 22

2.3.1.2 Tinh chế 23

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc 23

2.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết 23

2.3.2.1 Khẳng định cấu trúc 24

2.3.3 Kết quả 24

2.3.3.1 Kiểm nghiệm celecoxib 24

2.3.3.2 Xác định độc tính cấp (LD50) 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 26

3.1 Triển khai quy trình tổng hợp celecoxib ở quy mô phòng thí nghiệm

26 3.1.1 Tổng hợp liên tục 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion 27

3.1.1.1 Thiết kế phản ứng tổng hợp liên tục 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion đi từ 4-metylacetophenon và este của axit trifluoroacetic theo mô hình dòng chảy quy mô phòng thí nghiệm .27

3.1.1.2 Tổng hợp 1-(4-methylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (6) Xác định hiệu suất tối ưu của phản ứng ngưng tụ Claisen trong hệ phản ứng dòng chảy thực nghiệm 37

3.1.2 Tổng hợp celecoxib 40

3.1.2.1 Khảo sát điều kiện dung môi trong phản ứng tổng hợp celecoxib .40

iii

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol của 4-SAPH/diketon đến sự tạo thành

celecoxib và sản phẩm phụ regioisomer 42

3.1.2.3 Khảo sát điều kiện nhiệt độ 43

3.2 Tinh chế celecoxib 44

3.2.1 Khảo sát, xây dựng phương pháp kết tinh celecoxib bằng các loại dung môi 44

3.2.2 Khảo sát, xây dựng phương pháp kết tinh celecoxib lại bằng các loại dung môi/nước 47

3.3 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc 50

3.3.1 Kiểm tra độ tinh khiết 50

3.3.2 Khẳng định cấu trúc 51

3.3.2.1 Phổ hồng ngoại (IR) 51

3.3.2.2 Phân tích phổ khối lượng (MS) 53

3.3.2.3 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) của sản phẩm tổng hợp 54

3.4 Kết quả kiểm nghiệm 57

3.5 Kết quả thử độc tính cấp 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

Kết luận 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

A Tiếng Việt 60

B Tiếng Anh 60

PHỤ LỤC 64

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2: Tác dụng ức chế cyclooxygenase của celecoxib, IC50(µM) [18] 7

Bảng 1.3: Một số các thông số dược động học của celecoxib [7],[18] 7

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của Celecoxib và các NSAID trên tim mạch [12] 8

Bảng 2.1: Danh sách các nguyên liệu, hóa chất, dung môi sử dụng 19

Bảng 3.1: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) .29

Bảng 3.2: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng 31

Bảng 3.3: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng 33

Bảng 3.4: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng 35

Bảng 3.5: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng 37

Bảng 3.6: Hiệu suất và thời gian của phản ứng tổng hợp celecoxib trong một số dung môi 41

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dung môi lên sự tạo thành celecoxib .41

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ 4-SAPH/diceton lên sự tạo thành celecoxib và sản phẩm phụ regioisomer .42

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng và tỷ lệ tạo thành celecoxib và đồng phân regioisiomer .43

Bảng 3.10: Hiệu suất và độ tinh sạch của celecoxib theo tỷ lệ Celecoxib/aceton .45

Bảng 3.11: Hiệu suất và độ tinh sạch của celecoxib theo tỷ lệ Celecoxib/acetonitrile 46

Bảng 3.12: Hiệu suất và độ tinh sạch của celecoxib theo tỷ lệ Celecoxib/MeOH 47

Bảng 3.13: Bảng tỷ lệ celecoxib/aceton/nước ảnh hưởng đến hiệu suất 48

Bảng 3.14: Bảng tỷ lệ celecoxib/acetonitrile/nước ảnh hưởng đến hiệu suất .49

Bảng 3.15: Bảng tỷ lệ celecoxib/MeOH/nước ảnh hưởng đến hiệu suất 50

v

Bảng 3.16: Giá trị Rf, hệ dung môi khai triển và nhiệt độ nóng chảy các chất tổng hợp được 51 Bảng 3.17: Số liệu phổ IR của các chất tổng hợp được 52 Bảng 3.18 : Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất tổng hợp được 53 Bảng 3.19: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR của các chất tổng hợp được và Celecoxib chuẩn .55 Bảng 3.20: Số liệu độ dịch chuyển hóa học (ppm) phân tích phổ 13C-NMR của các chất tổng hợp được và Celecoxib chuẩn 56 Bảng 3.21: Kết quả kiểm nghiệm celecoxib 58

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của celecoxib .3

Hình 1.2: Cơ chế tác dụng của cyclooxygenase [1] 5

Hình 1.3: Một số thuốc chống viêm không steroid .6

Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp celecoxib theo phương pháp 1 .10

Hình 1.5: Tổng hợp liên tục celecoxib theo Zhi .12

Hình 1.6: Sơ đồ tổng hợp celecoxib theo WO 03/024400 .13

Hình 1.7: Sơ đồ tổng hợp 1,1,1-trifluoro-4-(methylphenyl)-3-butyn-2-on (9) 13

Hình 1.8: Sơ đồ tổng hợp celecoxib theo phương pháp của Lynette [20] 15

Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp chất (6) 22

Hình 2.2: Sơ đồ tổng hợp celecoxib 23

Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp Celecoxib 26

Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp chất (6) 27

Hình 3.3: Phản ứng tổng hợp liên tục diketon 2 đi từ 4-metylacetophenon và este của axit trifluoroacetic trong mô hình phản ứng dòng chảy liên tục .28

Hình 3.3: Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo chất (6) 39

Hình 3.4: Phản ứng tổng hợp celecoxib 40

Hình 3.5: Sự hỗ biến ceto – enol của chất (6) .54

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

COA : Certificate Of Analysis

CTPT : Công thức phân tử

Et3N : Triethylamin

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu lăng cao

(High – Performance Liquid Chromatography)

IC50 : Nồng độ ức chế 50%

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

KLPT : Khối lượng phân tử

MS : Phổ khối (Mass spectrometry)

MTBE : Metyl tert-butyl ether

NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Nuclear Magnetic NSAIDs : Các thuốc giảm đau hạ sốt chống viêm không steroid

(Non Steroidal Anti-inflammatory Drugs)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) là một trong những nhóm thuốc được dùng phổ biến nhất với ước tính khoảng 33 triệu người dùng trong một ngày trên toàn thế giới Tuy vậy, hạn chế lớn nhất của nhóm thuốc này là tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa Có tới khoảng một phần ba số bệnh nhân sử dụng nhóm thuốc này có triệu chứng viêm loét dạ dày, tá tràng [15]

Nhiều giải pháp để hạn chế tác dụng phụ này như dùng kèm thuốc bảo vệ niêm mạc (ví dụ như thuốc kháng thụ thể H2, ức chế bơm proton…), tạo dạng bào chế giảm kích ứng niêm mạc… đã được sử dụng nhưng các giải pháp này đều có những hạn chế nhất định

Việc tìm ra hai đồng dạng (isoform) COX-1 và COX-2 của men COX (cyclooxygenase) tham gia tổng hợp các prostaglandin (PG) từ acid arachidonic đã

mở ra hướng mới để khắc phục tác dụng phụ trên đường tiêu hóa của các NSAID [14],[32],[1] Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 là dẫn chất của diaryl như celecoxib, valdecoxib, parecoxib, etoricoxib, rofecoxib, lumiracoxib làm giảm PG gây viêm song vẫn duy trì quá trình tổng hợp các PG bảo vệ đường tiêu hóa [6],[1] Tuy nhiên,

do sự gia tăng nguy cơ huyết khối và nhồi máu cơ tim của nhóm thuốc này nên hiện nay chỉ còn celecoxib, parecoxib và etoricoxib được lưu hành trên thị trường, trong

đó celecoxib là thuốc được sử dụng rộng rãi nhất [8], tính riêng năm 2008, doanh số toàn cầu của thuốc này đã đạt 5,5 tỷ đô la

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm và mưa nhiều, các bệnh thấp khớp, viêm xương khớp… chiếm tỉ lệ khá cao nên nhu cầu về các NSAID nói chung và celecoxib nói riêng khá lớn Celecoxib sử dụng tại Việt Nam, kể cả sản xuất trong nước vẫn phải nhập nguyên liệu từ nước ngoài nên giá thành cao hơn các thuốc chống viêm khác, làm hạn chế khả năng tuân thủ điều trị của bệnh nhân khi dùng lâu dài Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất nguyên liệu celecoxib tại Việt Nam

để người bệnh có cơ hội được sử dụng celecoxib generic từ nguyên liệu trong nước

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về celecoxib

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất

- CTPT: C17H14F3N3O2S

- Trọng lượng phân tử: 381,08 g/mol

- Công thức cấu tạo:

N N

CF3

H3C

SOO

H2N

(5)

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của celecoxib

- Tên khoa học: yl]benzensulfonamid [25]

4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1 Cảm quan: Dạng bột kết tinh trắng hoặc vàng nhạt

- Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 157-159oC [31], 159-162oC [20], 162,3oC [24]

160,5 Độ tan: Celecoxib rất ít tan trong nước, độ tan trong nước là 3160,5 7µg/ml ở

pH = 7,0 và nhiệt độ 40oC, tan tốt trong methanol, cloroform và aceton Celecoxib ở dạng vô định hình thì dễ tan hơn dạng kết tinh

- pKa: Celecoxib thể hiện tính axit yếu với pKa = 11,1 do đó độ tan của celecoxib sẽ thay đổi theo pH của môi trường hòa tan

- Tính bất đối: Celecoxib không chứa trung tâm bất đối

4

1.1.2 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

1.1.2.1 Viêm và cơ chế chống viêm của NSAIDs

* Viêm và vai trò sinh lý của cyclooxygenase

+ Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do các mô bị kích thích hoặc tổn thương Đó là một phản ứng phức tạp của các mô liên kết và tuần hoàn mao mạch

ở nơi bị tác động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức phận Viêm có thể do nhiều nguyên nhân gây ra như nhiễm khuẩn, thiếu máu cục bộ, phản ứng kháng nguyên-kháng thể, hóa chất, nhiệt độ và tác nhân cơ học…

+ Khi bị tổn thương, màng tế bào giải phóng ra phospholipid màng Dưới tác dụng của phospholipase A2, chất này bị chuyển thành axit arachidonic Tiếp theo

đó dưới tác dụng của cyclooxygenase (COX), axit này bị chuyển hóa thành các prostaglandin Tác dụng của prostaglandin tùy thuộc vào vị trí tác dụng Khi được tạo ra tại nơi viêm, prostaglandin làm tăng tình trạng viêm cục bộ và làm tăng sự mẫn cảm với đau Ngược lại, đối với màng nhày của dạ dày và ruột, prostaglandin

có tác dụng bảo vệ và tăng tưới máu màng nhày [1]

- Các nghiên cứu đã cho thấy có hai loại COX, được gọi là 1 và

COX-2 có chức năng khác nhau và các thuốc chống viêm tác dụng với mức độ khác nhau trên COX-1 và COX-2

+ COX-1 có mặt ở hầu hết các mô, thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung, tinh hoàn… có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của tế bào, tham gia vào quá trình sản xuất các prostaglandin sinh lý, tạo chất nhày bảo

vệ dạ dày

+ COX-2 được phát hiện ra vào năm 1991, enzym này có ở hầu hết các mô với nồng độ thấp, ở các tế bào tham gia vào phản ứng viêm, có chức năng thúc đẩy quá trình viêm [5],[14],[16]

Do đó, các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 sẽ có tác dụng chống viêm mạnh mà

ít gây tác dụng phụ như: viêm loét dạ dày, tá tràng, xuất huyết dạ dày…[1],[18],[26]

5

Hình 1.2: Cơ chế tác dụng của cyclooxygenase [1]

* Phân loại các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs)

Theo tác dụng, cấu trúc hóa học các NSAIDs được chia thành các nhóm sau:

Bảng 1.1: Phân loại thuốc chống viêm không steroid [1]

Nhóm acid salicylic Aspirin (1)

Tổ chức bình thường

Prostaglandin

I2 (Nội mô mạch máu)

Prostaglandin

I2 (Thận) (-)

(-)

Loại ức chế chọn

lọc COX-2

Nhóm sulfonanilid Nimesulid

Hình 1.3: Một số thuốc chống viêm không steroid

Hiện nay, các NSAIDs rất đa dạng, được sử dụng rộng rãi nhưng những thuốc

có tác dụng chọn lọc trên COX-2 thì không nhiều Trong những năm gần đây, những hợp chất thuộc nhóm coxib với tác dụng ức chế chọn lọc trên COX-2 đã hình thành một nhóm thuốc kháng viêm mới, ít tác dụng phụ trên dạ dày, tá tràng Các

dẫn chất đầu tiên thuộc nhóm này được đưa vào sử dụng là celecoxib (5)

(Celebrex), rofecoxib (Vioxx), valdecoxib (Bextra),… Tuy vậy, đã có những cảnh báo tác dụng phụ trầm trọng trên tim mạch (nhồi máu cơ tim, đột quỵ) nên cả rofecoxib và valdecoxib đã rút khỏi thị trường [8],[28]

1.1.2.2 Tác dụng

Celecoxib là một thuốc ức chế chọn lọc COX-2, có tác dụng chống viêm, làm

giảm các dấu hiệu và triệu chứng của viêm xương khớp (viêm khớp), viêm khớp dạng thấp, viêm cột sống dính khớp [10],[19],[30] Celecoxib có khả năng ức chế

7

COX-2 cao hơn trên COX-1 tới 350 lần Tính chọn lọc và một số các thông số dược động học của celecoxib được trình bày lần lượt ở bảng 1.2 và bảng 1.3

Bảng 1.2: Tác dụng ức chế cyclooxygenase của celecoxib, IC50(µM) [18]

IC50(COX-2) IC50(COX-1) IC50(COX-1)/IC50(COX-2)

Bảng 1.3: Một số các thông số dược động học của celecoxib [7],[18]

Cmax(ng/ml) Tmax(giờ) T1/2(giờ)

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng ngoài tác dụng chống viêm thì celecoxib còn có tác dụng giảm đau, chống ung thư [13],[21],[26], giảm tỷ lệ xuất hiện và số lượng các khối u [3]

1.1.3 Tác dụng phụ

- Viêm loét dạ dày tá tràng: Tác dụng phụ của celecoxib trên đường tiêu hóa giảm một cách đáng kể so với các thuốc chống viêm trước đó (ví dụ như naproxen, ibuprofen và diclofenac)[10],[19],[23],[30] Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng có đối chứng trên 5285 bệnh nhân dùng celecoxib (Celebrex) liều 200mg/ngày hoặc cao hơn với thời gian từ một đến sáu tháng cho thấy chỉ có hai bệnh nhân bị chảy máu đường tiêu hóa sau khi dùng thuốc 14-22 ngày [3]

- Trên tim mạch : So với các NSAID khác tác dụng phụ của nhóm coxib trên đường tiêu hóa giảm nhưng trên tim mạch thì hay gặp hơn [2]

Trelle, S và cộng sự đã tiến hành 21 thử nghiệm trên 116429 bệnh nhân sử dụng celecoxib và các NSAID khác để so sánh ảnh hưởng trên tim mạch Kết quả được thể hiện ở bảng 1.4

8

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của Celecoxib và các NSAID trên tim mạch [12]

Tỉ lệ bệnh nhân có ảnh hưởng đến tim mạch (%) NSAID

Nhồi máu cơ tim Đột quỵ Tử vong do ảnh hưởng đến tim mạch

- Nghiên cứu CLASS (Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study): Nghiên

cứu độ an toàn khi sử dụng celecoxib liều cao dài ngày trong điều trị viêm xương khớp hoặc thấp khớp Nghiên cứu thực hiện trên 7968 bệnh nhân Các bệnh nhân được điều trị bằng celecoxib với liều 400mg/2 lần/ngày (lớn hơn từ 2 – 4 lần so với liều điều trị thông thường; n=3987), ibuprofen 800mg/3 lần/ngày (n=1985) hoặc diclofenac 75mg/2 lần/ngày (là liều điều trị thông thường; n=1996) trong thời gian 6 tháng Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ biến chứng loét ở các liều điều trị trong ba nhóm thuốc trên Phân tích cụ thể các chỉ tiêu cho thấy tỷ

lệ biến chứng loét và các triệu chứng loét ở nhóm dùng celecoxib thì thấp hơn nhóm dùng ibuprofen nói chung và thấp hơn cả những bệnh nhân điều trị ibuprofen mà không kèm với aspirin [29]

- Đau cấp tính, điều trị đau thống kinh nguyên phát

- Trị liệu bổ sung trong polip tuyến trong gia đình (familial adenonatous polyposis)

* Liều lượng và cách dùng

- Thoái hóa khớp: liều duy nhất 200mg/ ngày hoặc 100mg x 2 lần/ ngày

- Viêm khớp dạng thấp: 100-200mg x 2 lần/ ngày

- Viêm cột sống dính khớp: 200mg/ ngày hoặc 100mg x 2 lần/ ngày

- Đau cấp tính và đau bụng kinh nguyên phát: khởi đầu với liều 400mg, dùng tiếp theo với liều 200mg, nếu cần thiết trong ngày đầu tiên Trong các ngày tiếp theo, liều đề nghị là 200mg x 2 lần/ ngày, khi cần

- Trị liệu bổ sung trong polip tuyến trong gia đình: 400mg x 2 lần/ ngày, uống trong khi ăn

1.1.6 Dạng thuốc và biệt dược

- Dạng thuốc: Viên nang 100mg, 200mg

- Biệt dược: Có thể kể tên một số biệt dược chính là:

+ Celebrex (Pfizer, Mỹ)

+ Celedol (Ipca, Ấn Độ)

+ Cefalox (Dược phẩm OPV, Việt Nam)

+ Celcoxx (Getz Pharm, Pakistan)

+ Cilexid (MEDIPLANTEX, Việt Nam)

10

1.2 Phương pháp tổng hợp

Celecoxib (4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]

benzen sulfonamid (5) nằm trong nhóm các hợp chất có chứa vòng pyrazol, nhóm

chất chứa khá nhiều hoạt chất có tác dụng điều trị Các nghiên cứu về tổng hợp celecoxib đã được tiến hành từ rất lâu ở nhiều nước trên thế giới, qua các tài liệu thu thập được chúng tôi xin giới thiệu 3 phương pháp chính

1.2.1 Tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ diketon với hydrazin

Phương pháp tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ đi từ dion (6) với hydrazin (7) đã được nhiều tác giả nghiên cứu, các quy trình phản ứng theo phương

pháp này tuy khác nhau ở điều kiện phản ứng như dung môi, nhiệt độ… nhưng đều diễn ra theo 2 bước và bên cạnh sản phẩm chính là celecoxib thì đều tạo ra sản

phẩm phụ regioisomer (8)

- Bước 1: Diketon (6) được tạo ra bằng phản ứng ngưng tụ Claisen giữa

4-metylacetophenon với etyl trifluoroacetat với sự có mặt của NaOMe/MeOH

- Bước 2: Phản ứng ngưng tụ đóng vòng 4-sulfonamidophenylhydrazin

hydrochlorit (4-SAPH.HCl) (7) với diketon (6) trong những điều kiện khác nhau để

thu được celecoxib

Việc nghiên cứu hiệu chỉnh, tối ưu hóa phương pháp này cũng đã được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới công bố

Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp celecoxib theo phương pháp 1

11

* Trong bằng phát minh sáng chế của Mỹ, Talley cùng các cộng sự đã tiến

hành tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ diketon (6) với phenyl hydrazin hydroclorit (7) trong ethanol, đun hồi lưu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trong điều

kiện có khí argon, sau khi kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi metylen

chlorit/hexan thu được celecoxib (5) và một regioisomer (8) với tỷ lệ 99,5 : 0,5 và

hiệu suất 46% [31]

Quy trình này có thuận lợi là sử dụng dung môi etanol dễ kiếm, rẻ tiền, tiến hành ở nhiệt phòng nhưng thời gian phản ứng kéo dài, lại tiến hành ở điều kiện khí argon và cho hiệu suất rất thấp, tỉ lệ sản phẩm phụ khá cao

* Cũng trong một bằng phát minh sáng chế của Mỹ, O’Shea và cộng sự cũng

mô tả qui trình hai bước để tổng hợp celecoxib với một phản ứng ngưng tụ tương tự giữa diketon và phenyl hydrazin hydrochlorit trong một dung môi amit Celecoxib thu được dưới dạng sản phẩm solvat hóa trong dung môi amit, được tách và thu hồi bằng cách kết tinh trong isopropanol và nước [24] Quy trình này cho hiệu suất khá cao (89%) nhưng quy trình tiến hành phức tạp, thời gian cũng kéo dài hơn 24 giờ, phải sử dụng nhiều loại dung môi và quá trình kết tinh phải lặp lại nhiều lần làm qui trình kém tính khả thi

* Trong một qui trình khác, Letendre và cộng sự đã tiến hành phản ứng ngưng

tụ trong isopropanol với sự có mặt của axit trifluoroacetic (0,5-1,5 đương lượng) Nhờ tối ưu các điều kiện phản ứng như nhiệt độ (50oC), pH (sử dụng pH axit) và lựa chọn được dung môi thích hợp (isopropanol), hiệu suất sản phẩm thu được là tốt đồng thời hạn chế tối đa sự tạo thành sản phẩm phụ Tuy vậy, quá trình xử lý phản ứng lại rất phức tạp do phải liên tục điều chỉnh pH và thời gian để xử lý một mẻ phản ứng dài [17]

* Mới đây, vào năm 2008, Anumula cùng cộng sự đã đưa ra quy trình tổng hợp celecoxib tương đối đơn giản, thời gian phản ứng ngắn, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, hiệu suất phản ứng cao, đặc biệt sản phẩm thu được sau khi kết tinh lại có độ tinh khiết đến 99,9% Đây là quy trình có thể mở rộng quy mô để áp dụng vào sản xuất [4]

12

Quy trình như sau:

- Tổng hợp: Cho 4-sulphonamidophenylhydrazin hydrochlorit và trifluoro-l-[4-(metyl)phenyl] butan-1,3-dion vào bình phản ứng, thêm hỗn hợp dung môi etylacetat : nước (1:1), khuấy và đun trong 5 giờ ở 75-80oC Sau đó hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến 0-5°C, khuấy trong 1 giờ, lọc và rửa chất rắn bằng nước, sấy khô thu được celecoxib

4,4,4 Tinh chế: Celecoxib thu được ở trên được kết tinh lại trong toluen ở 80°C, tẩy màu bằng than hoạt tính Làm lạnh đến 10-15oC, khuấy 1 giờ, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng toluen, sấy khô Độ tinh khiết của sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp HPLC

* Zhi và cộng sự công bố một qui trình “one-pot” gồm hai giai đoạn để tổng hợp celecoxib Bước 1, diketon được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ Claisen giữa một keton và ester trong môi trường bazơ Bước 2, diketon tạo thành trong dung dịch phản ứng được ngưng tụ trực tiếp mà không cần tinh chế với 4-SAPH để tạo thành celecoxib [34] Qui trình này sau đó được áp dụng ở qui mô công nghiệp để tổng hợp celecoxib và thương mại dưới tên biệt dược CELEBREX® của Pharmacia Corporation

Hình 1.5: Tổng hợp liên tục celecoxib theo Zhi

Cho đến nay, các qui trinh kết tinh được công bố thường sử dụng các hỗn hợp dung môi khác nhau, ví dụ như hỗn hợp isopropanol/nước [16], etylacetat/isooctan [18], diclorometan/hexan [19], Cơ bản đã xác định được 3

13

dạng kết tinh chính của celecoxib, ký hiệu lần lượt là dạng I, II và III [20] Các dạng kết tinh này được xác định và phân biệt với nhau dựa vào dữ liệu phổ nhiễu xạ tia X (P-XRD), quét nhiệt vi sai (DSC), và phổ hồng ngoại (IR) Giữa

ba dạng kết tinh trên, dạng III có độ bền nhiệt động cao hơn hai dạng I và II

1.2.2 Tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ butynon với hydrazin

Nhằm tránh sự tạo thành sản phẩm phụ regioisomer, Reddy và cộng sự phát triển một phương pháp mới tổng hợp celecoxib bằng cách ngưng tụ 1,1,1-

trifluoro-4-(metylphenyl)-3-butyn-2-on (9) với phenylhydrazin (7) trong phản ứng

một giai đoạn theo hình 1.6 [27]

Hình 1.6: Sơ đồ tổng hợp celecoxib theo WO 03/024400

Trong đó, chất (9) có thể được tổng hợp từ toluen và dẫn chất hoặc từ 4-metyl

phenylacetylen theo sơ đồ hình 1.7 [27]

Hình 1.7: Sơ đồ tổng hợp 1,1,1-trifluoro-4-(methylphenyl)-3-butyn-2-on (9)

14

Quy trình tổng hợp chất (9) như sau:

* Đi từ nguyên liệu toluen:

+ Giai đoạn 1: Cho toluen phản ứng với 4-ethoxy-1,1,1-trifluorobut-3-en-2-on với xúc tác là các axit Lewis (ví dụ: ZnCl2) trong CH2Cl2 tạo ra 1,1,1-trifluoro-4-p-

tolylbut-3-en-2-on (10)

+ Giai đoạn 2: Chất (10) phản ứng với Br2 ở nhiệt độ phòng trong dung môi trơ (ví dụ: CH2Cl2,CHCl3 ) tạo ra hợp chất trung gian dibromo Tách HBr trong

môi trường bazơ (ví dụ: KOH/EtOH) thu được chất (9) Tinh chế bằng cách kết tinh

trong dung môi phù hợp hoặc sử dụng sắc ký cột

* Đi từ dẫn xuất halogen của toluen:

+ Giai đoạn 1: Ban đầu p-halogenotoluen phản ứng với metyl acrylat với

sự có mặt chất xúc tác paladi (II) acetat để tạo ra metyl 3-p-tolylacrylat (11)

+ Giai đoạn 2: Chất (11) tiếp tục phản ứng với trimetyl

(trifluorometyl)silan, xúc tác là cesi fluorit tạo thành chất (10)

+ Giai đoạn 3: Tương tự giai đoạn 2 khi đi từ nguyên liệu là toluen

* Đi từ 4-methyl phenylacetylen:

+ Giai đoạn 1: Cho 4-metyl phenylacetylen (12) phản ứng với carbon

monoxit, oxy, metanol, ở 0,5atm và 25oC trong 15 giờ, xúc tác là muối paladi (II), clorohydroquinon (HQ-Cl), molypdovanadophotphat (NPMoV), phân lập bằng sắc

ký cột trên silicagel thu được chất (13)

+ Giai đoạn 2: Chất (9) được tạo thành bằng cách cho chất (13) phản ứng

với trimetyl(trifluorometyl)silan, xúc tác là cesi fluorit trong dung môi hữu cơ trơ ví

dụ như: diclorometan, THF, ở nhiệt độ khoảng 15-30°C

Phương pháp này có ưu điểm chỉ tạo thành duy nhất một đồng phân vị trí

mong muốn nhưng việc tổng hợp sản phẩm trung gian (9) lại phải tiến hành qua

nhiều bước phức tạp, có sử dụng xúc tác paladi, cũng tốn nhiều thời gian và hầu hết đều cần phải qua bước tinh chế bằng cột sắc ký [27].Vì vậy, phương pháp này không khả thi ở quy mô công nghiệp

15

1.2.3 Tổng hợp celecoxib bằng phản ứng đóng vòng 1,3

- Lynette và cộng sự cũng phát triển một phương pháp tổng hợp celecoxib thông qua phản ứng đóng vòng 1,3 để thu được celecoxib với độ chọn lọc cao Tuy nhiên phương pháp này cũng phức tạp, sử dụng nhiều loại dung môi, nguyên liệu đắt tiền và khó kiếm, hiệu suất tạo thành celecoxib lại chỉ đạt 52% [20]

O N

Me

N N

Me

F3C

SO2NH2(17)

(5)

(16)

Et3N, THF/EtOAc 5-10oC

Hình 1.8: Sơ đồ tổng hợp celecoxib theo phương pháp của Lynette [20]

- Quy trình phản ứng gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Cho 4-SAPH.HCl (7) vào acetonitril, làm lạnh đến 5–10oC, thêm

từ từ trifluoroacetic axit anhydrit (TFAA) Ngừng làm lạnh và để phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ Cô đặc hỗn hợp phản ứng đến còn 1/3 thể tích ban đầu, thêm MTBE-heptan (1:1) để tách sản phẩm kết tủa ra khỏi hỗn hợp phản ứng Làm lạnh đến 0-5oC, để yên 1 giờ, lọc, rửa tủa bằng heptan, sấy dưới áp suất giảm ở

50oC thu được 4-[2-(trifluoroacetyl)hydrazino] benzensulfonamit (14)

16

+ Giai đoạn 2: Cho chất (14) vào trong etylcetat Làm lạnh hỗn hợp đến 5–

10oC, thêm benzensulfonyl clorit, nhỏ từ từ N-methylmorpholin Khuấy trộn để phản ứng diễn ra trong 1 giờ Thêm nước vào hỗn hợp phản ứng, khuấy trong 30 phút Tách lấy lớp hữu cơ, rửa bằng dung dịch NaCl bão hòa sau đó làm khan bằng MgSO4 và cô đến còn 1/2 thể tích Thêm heptan vào để kết tủa sản phẩm ở nhiệt độ phòng, lọc lấy tủa, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm ở 50oC thu được N-[4-

(aminosulfonyl)phenyl]-2,2,2-trifluoro etanhydrazonoyl benzensulfonat (16)

+ Giai đoạn 3: Hòa tan chất (16) trong THF và làm lạnh đến 5–10oC Dung dịch morpholin enamin trong hỗn hợp THF/Et3N được nhỏ từ từ vào hỗn hợp phản ứng Sau khi phản ứng kết thúc, cho dung dịch HCl 4N vào và khuấy trong 0,5-1 giờ Thêm ethylacetat vào, lắc kỹ, tách lấy lớp hữu cơ, rửa bằng nước, làm khan bằng MgSO4 Bốc hơi dung môi, thêm heptan để kết tủa celecoxib Lọc, kết tinh lại celecoxib trong isopropanol-nước (1:1)

Từ các nhận xét trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp qui trình “one-pot” gồm hai giai đoạn để tổng hợp celecoxib Bước 1, diketon được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ Claisen giữa một keton và ester trong môi trường bazơ Bước 2, diketon tạo thành trong dung dịch phản ứng được ngưng tụ với 4-

SAPH (7) để tạo thành celecoxib [34]

1.3 Phương pháp tinh chế

1.3.1 Kết tinh

Kết tinh dùng để tách các chất rắn ra khỏi hỗn hợp của chúng Phương pháp kết tinh đơn giản nhất là phương pháp kết tinh từ dung dịch bão hòa Hòa tan chất rắn cần kết tinh trong dung môi thích hợp ở nhiệt độ sôi (thường là nhiệt độ sôi của dung môi) Ðến khi chất tan hoàn toàn (không thừa dung môi) Nếu dung dịch có màu thì thêm than hoạt tính (hàm lượng 1- 2% hàm lượng chất tan) và đun sôi dung dịch, rồi lọc nóng ngay loại chất bẩn (giai đoạn lọc nóng thao tác nhanh) Dung dịch sau khi lọc để nguội từ từ sẽ kết tinh Có thể lặp lại 2 - 3 lần để thu được sản phẩm sạch

17

- Có thể tạo mầm tinh thể bằng hạt, bằng đũa thủy tinh Tinh thể kết tinh được đem lọc rồi làm khô

Ðiều quan trọng là phải biết chọn và thử dung môi hòa tan: các chất phân cực

dễ tan trong dung môi phân cực, các chất không phân cực dễ tan trong dung môi không phân cực

Các dung môi phân cực như: nước, alcol, ete, este, acid axetic

Các dung môi không phân cực như: benzen, hexan, xyclohexan, CCl4, Cacbon diSunfua

- Có thể dùng hỗn hợp dung môi (hệ dung môi 2, 3 cấu tử)

- Các dung môi được chọn phải thỏa mãn một số tính chất sau:

+ Dung môi sử dụng phải tan tốt chất hòa tan tại nhiệt độ sôi của dung môi

và rất ít tan ở nhiệt độ thường và lạnh

+ Không phản ứng hóa học với chất tan

+ Các tạp chất không tan với dung môi được chọn ở nhiệt độ cao hoặc hòa tan tốt ở nhiệt độ thường và lạnh

+ Dung môi chọn phải dễ dàng bay hơi khỏi bề mặt tinh thể

+ Nhiệt độ sôi của dung môi phải thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của chất rắn khoảng 10 - 15%

1.3.2 Một số phương pháp kết tinh celecoxib

Sử dụng hệ dung môi diclorometan/hexan để kết tinh celecoxib có một số nhược điểm Đầu tiên, quá trình kết tinh cần tới một thể tích lớn dung môi (trung bình 20 lần thể tích mỗi loại diclorometan hoặc hexan cho mỗi gram celecoxib), dẫn đến giảm hiệu quả kinh tế và không thân thiện môi trường khi nâng cấp lên qui mô công nghiệp Mặt khác sử dụng diclorometan không tốt cho môi trường và sức khỏe con người, còn hexan lại dễ gây cháy nổ

Một số qui trình kết tinh celecoxib sử dụng hệ dung môi isopropanol/nước [17] Tuy nhiên celecoxib thu được có đặc tính xốp như bông dẫn đến tỷ trọng thô thấp và tính chất trơn chảy kém Mặt khác những tiểu phân tinh thể celecoxib dạng

Có quá trình kết tinh celecoxib lại sử dụng một số dung môi hydrocarbon như n-tetradecane hay n-decane Nhìn chung các qui trình này đều phức tạp và không có lợi về năng lượng vì đây đều là các dung môi có nhiệt độ sôi cao, quá trình kết tinh tiêu tốn nhiều dung môi, và phải tiến hành ở nhiệt độ cao (từ 100 đến 165oC), trong một khoảng thời gian dài dẫn đến sinh ra nhiều tạp chất, sản phẩm phụ Do vậy những qui trình như vậy rất khó có thể nâng cấp lên qui mô công nghiệp

Tóm lại, chủng loại dung môi, thể tích dung môi sử dụng, và phương pháp tinh chế/kết tinh đóng vai trò quan trọng đối với việc hình thành chọn lọc một dạng tinh thể nào đó của celecoxib Những nghiên cứu công nghệ nhằm cải tiến, hoàn thiện qui trình kết tinh celecoxib, đặc biệt là thu được chọn lọc dạng tinh thể III có

độ bền động học cao, giúp cải thiện độ tơi mịn, đặc tính trơn chảy và đặc tính chịu nén của nguyên liệu celecoxib khi bào chế các dạng viên nén hay viên nang có nghĩa thực tiễn và khoa học to lớn

19

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1: Danh sách các nguyên liệu, hóa chất, dung môi sử dụng

18 Than hoạt tính

20 N,N-dimetylformamit Trung Quốc

20

2.2 Thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu phản ứng với các kích cỡ khác nhau, sinh hàn hồi lưu, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu lọc Buchner, ống đong, pipet, bình chiết )

- Giấy lọc, tủ lạnh

- Thiết bị phản ứng dòng liên tục (Plug Flow Reactor) ( Anh)

Thiết bị phản ứng dòng chảy ống (còn được gọi là dòng

chảy cắm) là một trong hai loại thiết bị phản ứng chính

trong lĩnh vực kỹ thuật hóa học Trong thiết bị phản ứng

dòng chảy ống, các dòng dung dịch hóa chất được kết

hợp và phản ứng trong khi chúng chảy qua ống Các

chất lỏng được bơm vào thiết bị phản ứng tại một thời

gian nhất định sẽ không phản ứng với chất lỏng được

bơm vào tại một thời điểm khác Do đó, hỗn hợp chất

lỏng phản ứng có thể được coi như là dịch chuyển trong

thiết bị thành các “gói” rời rạc

Các bộ phận chính của thiết bị:

Ống phản ứng : là một ống polyethylene đường kính 5 mm, dài 20 mét Ống này

được đặt trong một bình chứa nước hình trụ Nhiệt độ của nước được điều khiển bởi một bộ điều khiển vi xử lý với một đầu dò RTD Ống phản ứng được trang bị một đầu thăm dò RTD, bộ phận khuấy trộn, van trộn chất phản ứng, đường ra cho sản phẩm và một van lấy mẫu tại đầu ra của ống phản ứng

Điều khiển nhiệt độ: có khả năng lập trình nhiệt độ để tối ưu hóa hiệu suất sản

phẩm bằng cách kiểm soát nhiệt độ trong ống phản ứng tại các giá trị khác nhau trong phản ứng Bộ điều khiển được trang bị với một đầu dò RTD Một tùy chọn giao diện giao tiếp (RS-232 hoặcRS-422) cũng có sẵn để cho phép theo dõi bằng máy tính hoặc thực hiện việc kiểm soát quá trình

21

Bơm nạp chất : hai máy bơm hóa chất điện tử chế tạo từ vật liệu không ăn mòn Tốc độ dòng chảy có thể được thay đổi trong khoảng 10-300ml /phút Tốc độ dòng chảy có thể được điều khiển bằng tay hoặc bằng điều khiển từ xa và có thể được điều khiển/kiểm soát bằng máy tính

Bộ phận hiệu chuẩn lưu lượng dòng chảy: một cổng ra cho phép kiểm tra việc hiệu chuẩn lưu lượng của các máy bơm

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không Büchi (Thụy Sĩ)

- Máy cất quay chân không Büchi R-210 (Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt HSD-180/330 (Hàn Quốc)

- Bản mỏng Silicagel Kieselgel 60F254 (Merck)

- Đèn tử ngoại có bước sóng 254nm

- Máy đo điểm nóng chảy tại Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn Lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000 - 600 cm-1

- Phổ khối lượng (MS) ghi trên các máy LC-MS-IonTrap Agilent 1100 và FTICR-MS Varian 920 tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) ghi trên máy Bruker AV500 tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), hiệu chỉnh theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

- Phân tích HPLC được tiến hành trên máy Waters 2695 Alliance HPLC Systems gắn khối phổ FTICR-MS Varian 920 tại tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Bước 1: Tổng hợp liên tục 1-(4-methylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion đi từ

4-methylacetophenon và este của axit trifluoroacetic theo mô hình dòng chảy quy

mô phòng thí nghiệm

Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp chất (6) Thiết bị sử dụng:

Thiết bị phản ứng dòng Vapourtec seri E của hãng

Vapourtec, vương quốc Anh Các bộ phận chính của

thiết bị:

+ 02 bơm, tốc độ từ 0,1 đến 10 ml, áp suất đến 10 bar

+ 01 ống phản ứng dung tích 10 ml, có điều nhiệt lên

đến 1500C, chính xác ±10C

Bước 2: Tổng hợp celecoxib

Celecoxib được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ

diketon với phenylhydrazin theo sơ đồ phản ứng sau:

23

Hình 2.2: Sơ đồ tổng hợp celecoxib 2.3.1.2 Tinh chế

Lần 1: Khảo sát kết tinh celecoxib thô bằng 3 loại dung môi : metanol,

aceton, acetonitril

Lần 2: Khảo sát kết tinh lại celecoxib bằng 3 hệ dung môi: aceton/nước,

acetonitril/nước, metanol/nước

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc

2.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết

- Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy

và định lượng phương pháp HPLC

- Phân tích thành phần, hàm lượng sản phẩm chính và sản phẩm phụ regioisome trong sản phẩm tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa Học, Viện KH&CN Việt Nam Qui trình chung và điều kiện phân tích mẫu celecoxib như sau:

+ Pha dung dịch mẫu: cân chính xác khoảng 0,1mg mẫu hòa tan trong 1ml methanol

+ Pha động: Dung môi A: Nước + 0.1% acid formic

Dung môi B: Methanol

Tỷ lệ dung môi A/B: 40/60

24

2.3.2.1 Khẳng định cấu trúc

Các phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR sẽ được sử dụng để khẳng định cấu trúc của celecoxib cũng như các chất trung gian trong quy trình tổng hợp Các dữ liệu phổ được biện giải phù hợp với công thức dự kiến, có so sánh với

các dữ liệu đã công bố

2.3.3 Kết quả

Celecoxib tổng hợp được mang kiểm nghiệm và xác định độc tính cấp (LD50)

2.3.3.1 Kiểm nghiệm celecoxib

TCCS của sản phẩm được xây dựng dựa theo tiêu chuẩn của Công ty Aarti Drugs Limited (Ấn Độ) đang thương mại hóa trên thế giới (phụ lục 29)

- Mất khối lượng do làm khô

+ Tiêu chuẩn theo CoA: Không được quá 0,5%

+ Dùng chén cân thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu Sấy khô chén đến khối lượng không đổi ở điều kiện chân không, 105oC trong 3 giờ

- Nhiệt độ nóng chảy

+ Nhiệt nóng chảy của chất thử phải nằm trong khoảng 159-162oC

+ Sấy khô chất thử ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy

+ Cho mẫu thử đã sấy khô vào mao quản thủy tinh có hàn một đầu cao khoảng 2,5 - 3,5 mm, và tiến hành đo nhiệt nóng chảy

số lượng chuột chết trong 72 giờ Xác định liều tối đa không gây chết chuột và liều tối thiểu gây chết chuột 100%

Lập bảng số liệu thu được và tính LD50 theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon Phương pháp này phải tiến hành vẽ đồ thị với trục hoành hiển thị liều dùng và trục tung hiển thị số chuột chết tương ứng với mỗi liều Biểu diễn đường thực nghiệm và đường lý thuyết trên một đồ thị Xác định phương trình tuyến tính bậc một và hệ số tương quan R Nếu hệ số tương quan R > 0,9 thì có thể sử dụng phương trình này để xác định LD50 Tất cả việc tính toán và vẽ đồ thị trên đây được tiến hành trên phần mềm MS Excel

26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

3.1 Triển khai quy trình tổng hợp celecoxib ở quy mô phòng thí nghiệm

Thiết bị phản ứng dòng liên tục Vapourtec

Methyltrifluoroacetat +

isopropanol (IPA)

Sản phẩm ngưng tụ diketon (6) sạch

(Dung dịch A)

(Dung dịch B)

4-sulphonamidophenyl hydrazin hydroclorit

Nhỏ từ từ,

Khuấy đều 80 0 C

Sản phẩm celecoxib thô

27

Dựa vào các điều kiện thí nghiệm đã công bố và các hóa chất cho phép, tiến hành tổng hợp celecoxib theo một qui trình gồm hai giai đoạn để tổng hợp celecoxib Bước 1, diketon (6) được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ Claisen giữa một keton và este trong môi trường bazơ Bước 2, diketon (6) tạo thành trong dung dịch phản ứng được với 4-SAPH (7) để tạo thành celecoxib

3.1.1 Tổng hợp liên tục 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion

3.1.1.1 Thiết kế phản ứng tổng hợp liên tục 1-(4-metylphenyl)-

4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion đi từ 4-metylacetophenon và este của axit

trifluoroacetic theo mô hình dòng chảy quy mô phòng thí nghiệm

Tiến hành tổng hợp diketon (6) theo sơ đồ phản ứng sau:

Thiết bị phản ứng dòng liên tục Vapourtec

Metyltrifluoroacetat +

isopropanol (IPA)

(Dung dịch A)

Sản phẩm ngưng tụ diketon (6)

28

Hình 3.3: Phản ứng tổng hợp liên tục diketon 2 đi từ 4-metylacetophenon và este của axit trifluoroacetic trong mô hình phản ứng dòng chảy liên tục

Tiến hành thí nghiệm: Quy trình phản ứng sử dụng thiết bị Vapourtec

a Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 10ml metylacetophenon (74,8 mmol, d=1,004) trong 10,5 ml IPA cho từ từ vào dung dịch 20 ml NaOCH3 25%/CH3OH (92,6 mmol) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút

4-ở nhiệt độ phòng (25-30°C)

b Chuẩn bị dung dịch 2 gồm 9 ml metyltrifluoroacetat (89,5 mmol, d=1,273) trong 52,5 ml IPA

c Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste

d Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA)

e Đặt nhiệt độ phản ứng 1000C

f Tốc độ kênh A, Kênh B = 25µl/min

g Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent)

h Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%

i Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction

j Chuyển kênh A, B sang Solvent

k Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All

l Tắt máy

m Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ Lớp nước được chiết 3 lần với EtoAc, mỗi lần 10 ml Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml, cất

- Hiệu suất tổng hợp của phản ứng: Phản ứng được tiến hành 3 lần để tính

hiệu suất trung bình Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6)

Hiệu suất TB (%)

68,4

Phản ứng tổng hợp diketon (6) trong dung môi isopropanol với tác nhân là

NaOCH3/CH3OH xảy ra tương đối dễ dàng nhưng hiệu suất chưa cao, có thể do điều kiện nhiệt độ, tốc độ dòng chảy, nồng độ của 4-metylacetophenon, nồng độ của metyltrifluoroacetat và không khí ẩm hoặc dụng cụ phản ứng hoặc dung môi chưa được sấy khô, làm khan nên chứa nước và giảm tính bền vững của các anion hình thành trong quá trình tách loại proton làm giảm hiệu suất

Để nâng cao hiệu suất của phản ứng chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát nồng

độ tối ưu của 4-metylacetophenon, nồng độ tối ưu của metyltrifluoroacetat, khảo sát nhiệt độ tối ưu và tốc độ dòng chảy tối ưu của phản ứng

 Tổng hợp 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (2) Xác định nồng độ tối ưu của chất 4-metylacetophenon tham gia phản ứng theo mô hình dòng chảy

Quy trình tổng hợp chung:

c Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste

d Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA)

e Đặt nhiệt độ phản ứng 1000C

f Tốc độ kênh A, Kênh B = 25µl/min

g Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent)

h Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%

i Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction

j Chuyển kênh A, B sang Solvent

k Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All

l Tắt máy

m Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ Lớp nước được chiết 3 lần với EtOAc, mỗi lần 10 ml Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml; cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm

Kết quả

4-metylacetophenon (mmol/ml) Hiệu suất (%)

Bước đầu kết luận, hiệu suất tốt nhất đạt được với nồng độ metylacetophenon >1,6mmol/ml và < 3,2mmol/ml

4- Tổng hợp 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (6) Xác định nồng độ tối ưu của este của axit trifluoroacetic tham gia phản ứng theo mô hình dòng chảy

Quy trình tổng hợp chung: