Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Tên viết tắt ALL Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Acute lymphoblastic leukemia AML Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloid leukemia BCC Bạch cầu cấp Leukemia CE Cacboxyl esteraza Carboxyl esterase CS Cộng et al CD Dấu ấn miễn dịch Cluster of Differenciation FAB Hội nhà huyết học Pháp Mỹ - Anh French - American - British HHTB Nhuộm Hóa học tế bào Cytochemistry HLA - DR Kháng nguyên bạch cầu người Human Leukocyte antigen 10 LA Bệnh bạch cầu cấp Acute leukemia 11 L1 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho biệt hóa Homogenous small blast type 12 L2 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chưa biệt hóa Heterogenous blast type 13 L3 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại Burkitt Homogenous lager blast type 14 M0 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy biệt hóa tối thiếu Minimally differentiated acute myeloid 15 M1 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy tế bào trưởng thành Acute myeloblastic leukemia, without maturation 16 M2 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có tế bào trưởng thành Acute myeloblastic leukemia, with granulocytic maturation 17 M3 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tủy Acute promyelocytic leukemia 18 M4 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mono Acute myelomonocytic leukemia Tên Tiếng Việt Tên Tiếng Anh 19 M5 Bệnh bạch cầu cấp dòng mono Acute mono 20 M6 Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu Acute erythroid leukemia 21 M7 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiểu cầu Acute megakaryoblastic leukemia 22 NE Esteraza không đặc hiệu Non-specific esterase 23 NE - NaF Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF Non-specific esteraza - NaF inhibitor 24 PA Photphataza axit Acid photphatase 25 PAL Photphataza kiềm Alkaline photphatase 26 PAS Periodic Axit Schiff Periodic -Acid - Schiff 27 PER Peroxydaza Peroxidase 28 SD Sudan đen Sudan black 29 SLTBT Số lượng tế bào tủy The number of myeloid cells 30 WHO Tổ chức Y tế giới World Heath Organization DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp nhóm bệnh máu ác tính hệ thống tạo máu với đặc trưng tăng sinh tích tụ tế bào non máu tủy xương Bạch cầu cấp chia thành nhóm bạch cầu cấp dòng tủy bạch cầu cấp dòng lympho Bạch cầu cấp dòng tủy kết tích lũy tế bào non bất thường tủy xương Bạch cầu cấp dòng lympho bệnh tăng sinh ác tính trình tạo máu dòng lympho Những tế bào lấn át sinh máu bình thường tủy xương, chúng thoát máu ngoại vi thâm nhiễm vào quan nội tạng [23] Bệnh có hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng dẫn tới tử vong không phát điều trị kịp thời Vì vậy, việc xác định xác thể bệnh dòng tế bào bị ung thư có vai trò định điều trị Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào thể bệnh bạch cầu cấp dựa hai tiêu chuẩn FAB WHO Tiêu chuẩn FAB nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa năm 1976 tổng hợp kết hình thái học hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn bổ sung thêm kết miễn dịch di truyền [15, 17] Nhuộm hóa học tế bào gồm kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế NaF không ức chế, photphataza kiềm axit Ưu điểm phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành 1/4 so với phương pháp miễn dịch 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc đại, dễ triển khai Hiện nay, kít nhuộm có bán thị trường kít đơn, giá thành cao có nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu kỹ thuật nhuộm Sudan Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu nhiều lần Tại Việt Nam, thuốc thử hầu hết tự pha kết hợp với yếu điểm nên độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Theo Trần Ngọc Vũ cộng (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán hình thái học-hóa học tế bào miễn dịch 89,1%, giá trị dự báo bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 88,88% độ đặc hiệu 73,77% [25] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa phương pháp nhuộm hóa học cần phải có điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch di truyền [19] Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an nghiên cứu chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls Bộ kít khắc phục yếu điểm Nhằm đánh giá giá trị sử dụng kít, tiến tới thay hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết Mục tiêu đề tài là: Đánh giá phù hợp kít nhuộm hóa học tế bào phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học di truyền bệnh nhân bạch cầu cấp chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986) Nội dung nghiên cứu: − Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp bệnh nhân chọc tủy lần đầu Viện Huyết học-Truyền máu trung ương − Đánh giá tính phù hợp phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch di truyền bệnh nhân chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB − Đánh giá giá trị kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC, nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình sinh máu 1.1.1 Cơ quan sinh máu Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức) tổ chức võng mô Thời kì phôi thai, quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch Sau sinh, trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) xảy tủy đỏ xương Đến tuổi trưởng thành, trình sinh máu diễn đầu xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay vài khu vực sinh máu tủy biệt hóa dòng lympho T B [6] 1.1.2 Quá trình sinh máu Hiện nhiều công trình chứng minh, dòng tế bào máu sinh từ tế bào gốc vạn Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn tùy theo kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn biệt hóa để tạo thành tế bào có chức cần thiết [11] Ba kích thích tố tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu colony-stimulating factors với interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu Quá trình sinh máu điều hòa yếu tố di truyền đặc biệt tế bào bị chết theo chương trình [13] 1.2 Bệnh bạch cầu cấp 1.2.1 Khái niệm chung Bệnh bạch cầu cấp tình trạng bệnh lý cấp tính tế bào sinh máu với đặc điểm tăng số lượng bạch cầu bất thường tủy xương máu ngoại vi, tủy xương có 30% tế bào non (blast) tổng số tế bào có nhân, phá hủy trình sinh máu bình thường tủy xâm nhiễm vào quan [12] 1.2.2 Dịch tễ học − Theo công bố Rebecca Siegel MPH cộng (2015) năm 2014, Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Tỷ lệ nam (3.100) nữ (3.150) gần nhau, số tử vong gây bệnh 1.450 người [52]; − Tại Mỹ, hàng năm xuất khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy 100.000 dân có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp dòng lympho toàn quốc [44]; − Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu tiến hành đầy đủ dịch tễ học bệnh bạch cầu cấp toàn quốc theo tổng kết Viện Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ cao (32.1%) số bệnh máu đến khám điều trị Bệnh viện Bạch Mai [7] 1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh Cho tới nguyên nhân gây bệnh chưa sáng tỏ Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh: − Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có nguy bị bạch cầu cấp; − Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp; − Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho, Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm − Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị số bệnh di truyền hội chứng Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cao bị bạch cầu cấp [12] 1.2.4 Cơ chế bệnh sinh − Sự hoạt động gen ung thư (oncogene): Các gen bình thường yếu tố tác động trở thành gen bất thường gây ung thư gọi gen ung thư Sản phẩm gen ung thư protein bất thường, có hoạt tính mạnh, gây rối loạn trình sinh sản biệt hóa tế bào; − Gen ức chế ung thư: Các công trình nghiên cứu gần chứng minh tế bào bình thường có gen kiểm soát tăng sinh, gen dẫn đến kiểm soát phân chia tế bào, gây u; − Hoạt hóa oncogen bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa kích thích tăng sinh tế bào Khi gen giải phóng kết hợp với gen ức chế bị kìm hãm làm tăng trưởng mạnh phát triển khối u làm tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37] − Một số biến đổi gen thường gặp bạch cầu cấp dòng lympho thể Bảng 1.1 [10] Bảng 1.1 Biến đổi di truyền tiên lượng bạch cầu cấp dòng lympho Tiên lượng Tốt Loại bất thường Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21) Trung bình Trên lưỡng bội từ 47-50 NST; 46XX/XY (bộ NST bình thường); Chuyển đoạn t(1;19) Xấu Thiểu bội, NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14) 1.2.5 Phân loại • Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB 1976 Bạch cầu cấp dòng tủy chia làm thể từ M1 đến M7: − Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa; − Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa; − Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu chia làm nhóm: + M3h: chứa hạt đặc hiệu lớn; + M3v: chứa hạt đặc hiệu nhỏ − Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm nhóm: + M4: lơ xê mi cấp tủy - mono; + M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu toan − Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono: + M5a: ≥80% tế bào mono monoblast; + M5b:[...]... chảy đã cho phép tự động hóa đạt kết quả tin cậy cao [45] Phương pháp hình thái học -nhuộm hóa học tế bào cùng với miễn dịch và di truyền được ứng dụng rộng rãi trong chuyên ngành Huyết học để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB và tiêu chuẩn WHO [28, 32, 34, 49] Hiện nay, trên thế giới thường sử dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau: 1.3.1 Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff... tế bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu Dòng hồng cầu, mono, lympho (trừ bệnh bạch cầu tế bào tóc -tế bào B hay còn gọi là Hairy cell) và dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả âm tính [40, 56] 1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh học và đặc biệt trong chuyên ngành Huyết học- Truyền... Trong bệnh bạch cầu cấp, kết quả của phương pháp hình thái học -nhuộm hóa học tế bào, phương pháp marker và di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp cũng như thể bệnh Việc xác định chính xác thể bệnh quyết định việc dùng thuốc điều trị đặc biệt là các thuốc nhắm đích Trong bệnh bạch cầu kinh, nhuộm photphataza kiềm thường bị giảm điểm nhuộm và có giá trị phân biệt với các bệnh. .. bổ sung thêm các tiêu chuẩn dấu ấn miễn dịch và di truyền để nâng cao độ chính xác trong phân loại dòng tế bào và thể bệnh Bảng 1.3 là một ví dụ của Asa Barnes [26] về tổ hợp các kết quả của ba phương pháp: Hình thái học -hóa học tế bào, marker CD, di truyền để phân loại dòng tế bào lympho và thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986) 20 Bảng 1.3 Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm... mạnh Các tế bào monoxit và lymphoxít bình thường có độ dương tính rất thấp Các dòng tế bào khác như dòng tủy, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu, tương bào dương tính dạng lan tỏa, còn tế bào bạch cầu ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như âm tính Những tính chất khác nhau đó là cơ sở của kỹ thuật nhuộm hóa học bạch cầu để phân biệt các dòng tế bào và xếp loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28]... Tiến hành so sánh phân loại thể bệnh bạch cầu cấp bằng bộ kít HICYTEC của 20 bệnh nhân mới và 10 bệnh nhân hồi cứu với kết luận thể bệnh của Viện Huyết học- Truyền máu trung ương đối với bạch cầu cấp dòng lympho Đối với bạch cầu cấp dòng tủy thì so sánh phân loại thể bệnh bạch cầu cấp bằng bộ kit HICYTEC của 22 bệnh nhân mới và 8 bệnh nhân hồi cứu với kết luận thể bệnh của Viện Huyết học- Truyền máu trung... đoán là bệnh bạch cầu cấp từ tuyến khác chuyển đến Viện Huyết họcTruyền máu trung ương từ 27/08/2014-15/06/2015 Mỗi mẫu kéo 10 tiêu bản, chuyển về Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bệnh viện 19-8, Bộ Công an tiến hành nhuộm bằng bộ nhuộm HICYTEC gồm 10 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào Tiến hành đọc kết quả và phân loại thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB dựa trên kỹ thuật 33 hình thái học -hóa học tế bào Qua 100 mẫu... quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo FAB 32 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyết học- Truyền máu trung ương 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn − Bệnh nhân có các triệu chứng nằm trong tiêu chuẩn về mặt lâm sàng bạch cầu cấp; − Bệnh nhân chọc tủy lần đầu, được chẩn đoán xác định bạch. .. các tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính trong kỹ thuật nhuộm này Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu giảm trong bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 30, 40, 43] Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại tế bào B, tế. .. trong bạch cầu cấp M2; t(15;17) trong bạch cầu cấp M3; Inversion (inv) 16 trong bạch cầu cấp M4Eo; t(9;22) trong bạch cầu cấp dòng lympho 1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào Nhuộm hóa học tế bào từ lâu đã trở thành đối tượng được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu phát triển các kỹ thuật nhằm phát hiện các enzym cũng như các chất chuyển hóa có trong nội bào tế bào Năm