NGHIÊN cứu KHẢ NĂNG ức CHẾ QUÁ TRÌNH SINH ACID của STREPTOCOCCUS MUTANS

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC HẢI PHÒNG ĐỖ THỊ HƢNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH SINH ACID CỦA STREPTOCOCCUS MUTANS TỪ DỊCH CHIẾT LÁ SIM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC KHÓA 2012 - 2016 HẢI PHÒNG – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC HẢI PHÒNG ĐỖ THỊ HƢNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH SINH ACID CỦA STREPTOCOCCUS MUTANS TỪ DỊCH CHIẾT LÁ SIM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC KHÓA 2012 - 2016 Hƣớng dẫn khoa học: Ts Bạch Thị Nhƣ Quỳnh HẢI PHÒNG – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả, số liệu trình bày khóa luận tốt nghiệp hoàn toàn trung thực, khách quan, không chép từ nghiên cứu khác Hải Phòng, ngày 30 tháng năm 2016 Người viết Đỗ Thị Hưng LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô Ban giám hiệu, Phòng đào tạo đại học, môn trường Đại học Y Dược Hải Phòng dìu dắt, dạy dỗ em năm học qua Em xin trân trọng cảm ơn thầy cô khoa Kỹ thuật y học tận tình dạy dỗ em suốt năm học tập Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Bộ môn Sinh học phân tử đồng hành em trình thực khóa luận Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Bạch Thị Như Quỳnh người hướng dẫn em nghiên cứu hoàn thành khóa luận Bước đầu làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, cô dạy cho em từ điều Ở cô em học tập tính chủ động công việc lòng nhiệt huyết với nghề Sự nhiệt tình giúp đỡ cô khiến em thêm động lực vượt qua khó khăn để hoàn thành khóa luận cách tốt Em xin gửi lời cảm ơn đến phòng Hóa sinh thực vật - Viện công nghệ sinh học – Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình thực khóa luận Con muốn thể lòng biết ơn tới công lao sinh thành, nuôi nấng cha mẹ Cảm ơn gia đình, người thân yêu sát cánh bên con, quan tâm, động viên tạo điều kiện cho học tập Cuối xin gửi lời cảm ơn tới người bạn giúp đỡ, động viên học tập sống Hải Phòng, ngày 30 tháng năm 2016 Sinh viên Đỗ Thị Hưng CHỮ VIẾT TẮT ADS Arginine deiminase CC Column chromatography DNA Deoxyribonucleic acid EPS Extracellular polysacharides EtOAc Ethyl acetate FDI Federal Dental International GTF Glucosyltransferase Gtf Glucosyltransferase HIV Human immunodeficiency virus MeOH Methanol OD Optical Density PCR Polymerase chain reaction PTS Phosphotransferase system TLC Thin layer chromatography TSA Tryptic soy agar UV Ultra Violet MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sâu vi khuẩn Streptococcus mutans 1.1.1 Tình hình sâu giới Việt Nam 1.1.3 Vi khuẩn Streptococcus mutans khả gây sâu 1.2 Các biện pháp ngăn ngừa sâu 1.2.1 Sử dụng chất kháng khuẩn 1.2.2 Sử dụng chất thay đường 11 1.2.3 Liệu pháp thay (replacement therapy) 12 1.2.4 Vacxin 13 1.3 Cây sim 14 1.3.1 Giới thiệu v Sim Rhodomytus tomentosa 14 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.1.3 Hóa chất 16 2.1.4 Trang thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu tế bào 17 2.2.1.1 Đo phát triển tế bào vi khuẩn 17 2.2.1.2 Đo mức độ sinh acid tế bào pH drop 17 2.2.2 Các phương pháp tách chiết phân đoạn thực vật 18 2.2.2.1 Tách chiết phân đoạn dung môi hữu khác 18 2.2.2.2 Sắc ký lớp mỏng 19 2.2.2.3 Sắc ký cột nhanh hay sắc ký cột chân không QCC VCC 20 2.2.2.4 Sắc ký cột silica gel 20 2.2.3 Xử lý số liệu 20 Chƣơng 3: KẾT QUẢ 21 3.1 Khả ức chế trình sinh acid S Mutans dịch chiết sim 21 3.2 Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu 22 3.2.1 Tách chiết phân đoạn dung môi hữu khác 22 3.2.3 Tinh phân đoạn quan tâm sử dụng cột sắc ký silica gel 26 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 31 4.1 Đánh giá khả kháng vi khuẩn S Mutans thông qua ức chế sinh acid ức chế giảm ph môi trường 32 4.2 Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu 34 4.2.1 Tách chiết phân đoạn dịch chiết sim dung môi hữu khác 34 4.2.2 Tinh phân đoạn quan tâm cột sắc ký chân không QCC cột sắc ký silica gel 35 KẾT LUẬN 39 KHUYẾN NGHỊ 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sự thay đổi v số sâu người Việt Nam theo độ tuổi Hình 1.2 Cấu trúc nguyên nhân dẫn đến sâu Hình 1.3 Ảnh hiển vi điện tử vi khuẩn Streptococcus mutans Hình 1.4 Cây sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk) 14 Hình 2.1.Máy đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức 18 Hình 3.1 Khả ức chế sinh acid tế bào S mutans biofilm dịch chiết sim 21 Hình 3.2 Sơ đ tách chiết phân đoạn dịch chiết sim 22 Hình 3.3 Thành ph n chất dịch chiết phân đoạn hexane, ethyl acetate methanol sim 22 Hình 3.4 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết sim lên sinh acid vi khuẩn S mutans 23 Hình 3.5 Sơ đ tinh phân đoạn quan tâm cột sắc ký chân không 24 Hình 3.6 Cột sắc ký QCC phân đoạn sim EtO c 25 Hình 3.7 Cột sắc ký silica gel phân đoạn sim sau qua cột QCC 27 Hình 3.8 Sơ đ phân tách phân đoạn chiết có hoạt tính quan tâm sau qua cột sắc ký silica gel 28 Hình 3.9 Ảnh hưởng phân đoạn tinh Sa, Sb Sc lên acid vi khuẩn S mutans 29 Hình 3.10 Sắc ký đ phân đoạn Sb Sc cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi hexane : acetone : 30 Hình 4.1 Các phân đoạn phân tách sau sắc ký chân không QCC dịch chiết sim EtO c 36 Hình 4.2 Cột sắc ký silica gel phân đoạn sim sau qua cột QCC 36 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết kiểm tra hoạt tính kháng sinh acid 12 phân đoạn phân tách 26 Bảng 4.1 So sánh tác dụng số dịch chiết thực vật lên sinh acid vi khuẩn S mutans 33 Bảng 4.2 Tác dụng số dịch chiết thực vật lên sinh acid S mutans GS-5 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâu bệnh miệng phổ biến có xu hướng ngày tăng lên nước phát triển Tổ chức Y tế giới đ cảnh báo v mức độ phổ biến bệnh sau bệnh tim mạch ung thư 10 Theo số liệu (09/2012) Hội Răng Hàm Mặt Việt Nam, thực tế có tới 90 dân số Việt Nam đối mặt với vấn đ v miệng, phổ biến sâu dẫn đến 11 Đây tỷ lệ thuộc hàng cao giới Ngay nước phát triển Hoa Kỳ, tỷ lệ sâu tới 84% lứa tuổi niên Trong năm qua, chi phí cho việc chăm sóc, sửa chữa Việt Nam đ lên tới nhi u tỷ đ ng Bệnh sâu vi khuẩn mảng bám sử dụng carbonhydrate để lên men tạo acid, chủ yếu lactic Môi trường acid s phá vỡ cân hệ vi khuẩn đường miệng Khi lượng acid đủ lớn s hòa tan chất khoáng có men dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành hố gây sâu 29 Streptococcus mutans xác định tác nhân gây sâu người S mutans phát tất mảng bám răng, có số lượng cao v ng sâu nguyên nhân chủ yếu dẫn đến bệnh sâu 29 Do đó, S mutans sử dụng đối tượng điển hình cho nghiên cứu v sâu Hàng loạt biện pháp khác nhằm ngăn chặn bệnh sâu đ nghiên cứu ứng dụng như: sử dụng chất kháng khuẩn, sử dụng chất thay đường; sử dụng liệu pháp thay thế; sử dụng vaccine Trong đó, biện pháp sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát sâu tỏ hữu hiệu Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài chất kháng khuẩn có chất hoá học thường gây phản ứng phụ không mong muốn làm đổi màu 30 Sc Sb Hình 3.10 Sắc ký đ phân đoạn Sb Sc cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi he ane : acetone (5 : Kết thu Hình 3.10 cho thấy phân đoạn Sc có thành ph n chất thể qua số vạch sắc ký rõ rệt so với phân đoạn Sb 31 Chƣơng BÀN LUẬN Streptococcus mutans xác định tác nhân gây sâu người Vi khuẩn mang hai đặc tính gây bệnh đặc biệt, khả sinh, chịu acid cao sinh polysaccharide ngoại bào EPS mạnh EPS khung để tạo thành mảng bám răng, có tính chất biofilm sinh học Sâu bệnh liên quan viêm lợi gingivitis , viêm quanh (periodontitis) thuộc số bệnh gây biofilm Do đó, S mutans sử dụng đối tượng điển hình cho nghiên cứu v sâu Như vậy, nói kiểm soát sâu kiểm soát đặc tính gây bệnh S mutans, hay nói cách khác tìm kiếm chất kháng khuẩn có khả ức chế sinh acid (anti-acidogeneic agents ức chế tạo biofilm (anti-biofilm agents) S mutans Các hợp chất tự nhiên chiết xuất từ thực vật xem có nhi u ti m ứng dụng thực tế Các nghiên cứu đ phát thấy hợp chất polyphenol chè xanh Camellia sinensis L có khả chống sâu thông qua chế ức chế trình đường phân ức chế hoạt độ enzyme glucosyltransferase GTF enzyme có vai trò tạo glucan, sở để hình thành mảng bám Lopes & cs 24 đ phát thấy acid tannic (một polyphenol từ thực vật có khả ức chế hình thành gốc •OH phản ứng Fenton có mặt ion Fe2+ Nhi u loại dịch chiết thực vật đ nghiên cứu thử nghiệm khả chống sâu răng, ức chế hình thành mảng bám Ở Việt Nam, nghiên cứu v chất kháng khuẩn sâu tự nhiên c ng đ tiến hành năm g n Nghiên cứu Nguy n Thị Mai Phương cộng , , 35 cho thấy chất α-mangostin từ dịch chiết vỏ măng cụt ức chế tới 50 hoạt độ enzyme phosphotransferase system PTS , F- TPase, N DH oxidase enzyme trình đường phân 32 n ng độ M Nghiên cứu Nguy n Quang Huy cộng c ng cho thấy dịch chiết từ vỏ Sao đen Hopea odorata Roxb , Sắn thuy n (Syzygium polyanthum Wight Walp c ng chất tinh g m acid asiatic, hopea phenol, malibatol thu từ dịch chiết đ u có tác dụng ức chế trình sinh acid, diệt khuẩn hay kìm h m hoạt độ enzyme FATPase, PTS chủng S mutans GS-5 S mutans H2 phân lập từ người Việt Nam [4] Các nghiên cứu g n đ cho thấy dịch chiết sim Thái Lan ethanol acetone có tính kháng khuẩn cao, đặc biệt với vi khuẩn Staphylococus arueus kháng methilciliine Ngoài ra, dịch chiết c ng thể hoạt tính kháng biofilm thông qua việc ức chế hệ thống QSS 30 , 36 Đi u gợi ý dịch chiết sim chứa chất kháng sâu Vì vậy, đ tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng vi khuẩn S mutans, tác nhân gây sâu chủ yếu người, dịch chiết ethanol sim tr ng Việt Nam thông qua việc tìm hiểu khả ức chế sinh acid vi khuẩn S mutans 4.1 Đánh giá khả kháng vi khuẩn S Mutans thông qua ức chế sinh acid (ức chế giảm ph môi trƣờng Vi khuẩn S mutans xem tác nhân gây sâu khả sinh acid cao chủ yếu acid lactic , đặc biệt môi trường dư thừa glucose Chính acid hóa mảng bảm chí đến pH 4,0) đ dẫn đến làm mòn men gây sâu Vì vậy, hoạt tính ức chế sinh acid vi khuẩn xem thí nghiệm khởi đ u để khảo sát tác dụng bảo vệ hợp chất c n quan tâm Trong thí nghiệm này, tế bào đưa vào môi trường dư thừa glucose, trình glycolysis sinh acid bị dừng lại pH thấp thiếu chất đường phân glucose Hoạt tính ức chế sinh acid vi khuẩn S mutans đánh giá thông qua việc xác định khả 33 ức chế giảm pH môi trường tế bào S mutans đ xử lý với dịch chiết nghiên cứu Kết nghiên cứu trình bày hình 3.1 Số liệu thu cho thấy dịch chiết sim đ ức chế rõ rệt sinh acid vi khuẩn S mutans Giá trị pH cuối c ng thu với dịch chiết n ng độ 0,01; 0,05; 0,1; 0,3 l n lượt 3,94; 4,69; 4,94 5,1 mẫu đối chứng không xử lý dịch chiết 3,5 Như vậy, dịch chiết ethanol sim tr ng Việt Nam c ng có khả ức chế sinh axit S mutans Vì vậy, đ tiến hành phân lập chất có hoạt tính sinh học quan tâm từ đối tượng thực vật Khi so sánh với nghiên cứu tác giả Nguy n Thị Thúy nh – Đại học Khoa học tự nhiên 2011 số loài thực vật khác Húng Quế, Lấu Ba Vì, Xoan, Lược Vàng, Duối c ng cho kết tương đương với nghiên cứu Sau 90 phút thí nghiệm, kết cho thấy mẫu đối chứng ĐC pH cuối c ng đ u nằm khoảng 4,0 - 4,6 Trong mẫu có bổ sung dịch chiết thực vật pH cuối c ng cao hơn, với giá trị tương ứng từ 4,94 đến 6,12 [1] Bảng 4.1 So sánh tác dụng số dịch chiết thực vật lên sinh acid vi khuẩn S mutans Thực vật thu dịch chiết Giá trị pH sau 90 phút Sim (0.3 %) 5,10 Duối (10%) 5,06 Lược Vàng 10 4,94 Xoan (10%) 5,08 Lấu Ba Vì 10 6,12 Húng quế (10%) 5,42 Xoài (10%) Lá xoài 5,87 Thân xoài 5,78 34 Kết c ng tương đương với nghiên cứu tác giả Nguy n Quang Huy (2009) – Bảng 4.2 [5] Bảng 4.2 Tác dụng số dịch chiết thực vật lên sinh acid S mutans GS-5 Loại dịch chiết n ng độ 10 % pH cuối (sau 60 phút Mẫu đối chứng 4.01 Chàm tía 5.24 Hương nhu trắng 4.92 Kim ngân 5.37 Quỷ châm thảo 5.20 Sài đất 4.76 Sắn thuy n 6.51 Bảng 4.1 bảng 4.2 cho thấy mặc d n ng độ thấp nhi u (0.3 dịch chiết Sim c ng cho tác dụng ức chế sinh acid tương đương chí tốt số loài thực vật đ nghiên cứu khác 4.2 Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu 4.2.1 Tách chiết phân đoạn dịch chiết sim dung môi hữu khác Sau kiểm chứng đối tượng nghiên cứu sim có chất mang hoạt tính quan tâm chất có khả ức chế sinh acid S mutans , bước tiến hành tách chiết dung môi có độ phân cực khác Dung môi có độ phân cực khác s hòa tan chất có độ phân cực khác Sử dụng tính chất nghiên cứu đ tiến hành phân tách dịch chiết sim với dung môi: - Hexane: độ phân cực thấp 35 - Ethyl acetate (EtOAc): độ phân cực trung bình - Methanol MeOH : độ phân cực cao Nguyên liệu dạng bột mịn kg chiết rút theo tỉ lệ kg nguyên liệu: lít dung môi tương ứng Mỗi loại dung môi tiến hành chiết rút l n Hình 3.2 Cao chiết thu sau cô cất quay chân không đ sử dụng để phân tích sơ thành ph n dịch chiết sắc ký lớp mỏng hình 3.3 c ng đánh giá hoạt tính kháng sinh acid S Mutans hình 3.4 Kết nghiên cứu cho thấy dịch chiết dung môi EtO c chứa thành ph n chất phức tạp chạy TLC cho vạch – hình3.3), khả ức chế trình sinh acid phân đoạn c ng tốt nhất: sau 105 phút giữ pH dung dịch 5,3 pH dịch chiết hexane, MeOH, mẫu đối chứng l n lượt là: 4,7; 4,7; đ ng thời khối lượng cao chiết thu c ng nhi u 79,63 g nên lựa chọn cho bước tinh 4.2.2 Tinh phân đoạn quan tâm cột sắc ký chân không (QCC) cột sắc ký silica gel Sắc ký chân không thường sử dụng để phân tách nhanh chất có nguyên liệu Phương pháp c ng cho phép phân tách khối lượng lớn nguyên liệu ban đ u Với khối lượng cao khô phân đoạn EtO c lên tới 79,63g, đ sử dụng cột QCC hình 3.7 để tiến hành phân tách nhanh Hệ dung môi sử dụng bước sắc ký bao g m: 12 phân đoạn hình 3.5) Các phân đoạn phân tách F1 – F12 Hình 3.5; 4.1 sau thu lại, làm khô tiến hành đánh giá hoạt tính kháng sinh acid S mutans 36 Hình 4.1 Các phân đoạn phân tách sau sắc ký chân không QCC dịch chiết sim EtOAc Kết kiểm tra hoạt tính kháng sinh acid 12 phân đoạn phân tách thu Bảng 3.1 cho thấy phân đoạn tương ứng với hệ dung môi EtO c 10 EtO c 20 có hoạt tính ức chế sinh acid S mutans cao Vì hai phân đoạn đ d n lại để tiếp tục phân tách chất quan tâm kỹ thuật sắc ký cột silica gel Hình 3.7; hình 4.2 Hình 4.2 Cột sắc ký silica gel phân đoạn sim sau qua cột QCC 37 Hai phân đoạn F2 F3 thu sau quay cất khô có khối lượng tổng cộng 25,3 g đ đưa lên cột sắc ký silica gel có kích thước x 50 cm Hình 4.2 Hệ dung môi ph hợp để tách chất quan tâm cột silica gel đ thử nghiệm lựa chọn EtO c 10 hexane Các phân đoạn rửa cột 100 ml thu lại, kiểm tra thành ph n TLC, tiến hành d n phân đoạn có phổ TLC giống quay cất khô chân không Cuối c ng, phân đoạn chiết sau bước sắc ký đ thu lại, ký hiệu Sa 11,92 g ; Sb 5,63 g ; Sc 4,92 g tiến hành đánh giá hoạt tính quan tâm Hình 3.8; 3.9) Các phân đoạn Sb Sc có hoạt tính quan tâm cao so với phân đoạn Sa đối chứng, gợi ý chúng chứa chất có hoạt tính quan tâm nhi u Độ phân đoạn c ng kiểm tra TLC Kết thu Hình 3.10 cho thấy phân đoạn Sc có thành ph n chất thể qua số vạch sắc ký rõ rệt so với phân đoạn Sb Có số thời điểm pH đo dung dich thời điểm sau lại cao thời điểm trước phân đoạn Sa pH thời điểm 80 phút 4,3 pH sau 20 phút thời điểm 100 phút lại cao 4,4 Tuy nhiên, sai số ngẫu nhiên ý nghĩa thống kê Như vậy, sau qua cột sắc ký QCC CC, độ phân đoạn đ u tăng lên qua bước phân tách Tuy nhiên, chất quan tâm chưa tinh hoàn toàn Phân đoạn Sc có hoạt tính quan tâm mạnh có độ cao phân đoạn Sb Đi u gợi ý lựa chọn phân đoạn cho nghiên cứu sâu v ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme liên quan đến sinh chống chịu acid c ng hình thành cấu trúc biofilm vi khuẩn S mutans 38 Như vậy, ph n nghiên cứu đ khẳng định dịch chiết sim có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu S mutans cao Khả chúng có chứa chất ức chế trình sinh acid vi khuẩn S.mutans, tác nhân gây sâu người 39 KẾT LUẬN - Đ xác định dịch chiết sim ethanol, methanol, ethyl acetate hexane có khả kháng vi khuẩn sâu thông qua việc ức chế sinh acid - Phân đoạn ethyl acetate có hoạt tính kháng sinh acid mạnh so với phân đoạn hexane methanol - Đ thu nhận phân đoạn Sc từ phân đoạn chiết ethyl acetate thông qua bước sắc ký là: (1) sắc ký chân không (2) sắc ký cột silica gel sử dụng phương pháp rửa chiết bước rửa chiết gradient 40 KHUYẾN NGHỊ - Xác định cấu trúc hóa học định danh chất tinh - Đánh giá tác dụng chất tinh lên số enzym liên quan đến trình sinh chống chịu acid S mutans - Nghiên cứu khả ức chế hình thành biofilm S mutans dịch chiết sim Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguy n Thị Thúy nh 2011 , “Nghiên cứu khả kháng khuẩn sâu số loài thực vật”, Luận án Thạc sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Arodzinxki A M., Arodzinxki D M (1981), Sách tra cứu tóm tắt sinh lý thực vật , Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Võ Văn Chi 2012), điển thuốc iệt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr 567 - 568 Nguy n Quang Huy (2009), “Nghiên cứu tác dụng số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans’’, Luận án Tiến sỹ Sinh học Nguy n Thị Mai Phương, Phan Tuấn Nghĩa, Nguy n Thị Ngọc Dao, Đặng Minh Phương 2003 , "Tác dụng dịch chiết vỏ măng cụt (Garcinia mangostana L lên vi khuẩn sâu Streptococcus mutans", Hội nghị Khoa học Sự sống lần thứ 2, Huế, tr 983 - 986 Nguy n Thị Mai Phương, Phan Tuấn Nghĩa, Đỗ Ngọc Liên, Nguy n Thị Ngọc Dao 2004 , "Thành ph n polyphenol vỏ măng cụt (Garcinia mangostana L tác dụng ức chế sinh acid vi khuẩn sâu Streptococcus mutans", Tạp chí Dược học, (44), tr 18 - 21 Nguy n Thị Mai Phương 2005 , Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kháng khuẩn lên trình sinh lý hoá sinh vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans, Luận án Tiến sỹ Sinh học Nguy n Thị Thịnh (2008), Nghiên cứu đáp ứng với stress oxi hóa vi khuẩnStreptococcus mutans, Luận án thạc sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội 10 Tr n Văn Trường, Trịnh Đình Hải, Spencer J A., Thomson R K (2002), “Đi u tra sức khoẻ miệng toàn quốc Việt Nam 1999 - 2000”, Tạp chí Y học Việt Nam, 8, tr - 10 TIẾNG ANH 11 Belli W A and Marquis R E (1991), Adaptation of Streptococcus mutans and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture Appl Environ Microbiol 57(4), pp 1134 – 1138 12 Bowen W H., Koo H 2011 , “Biology of Streptococcus mutans - derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogeneic biofilms”, Caries Res, 45, pp.69-86 13 drugs Chen C P., Lin C C., Namba T 1989 , “Screening of Taiwanese for antibacterial activity against Streptococcus mutans”, J Ethnopharmacol, 27, pp 285 - 295 14 Dewhirst F E , Chen T., Izard J., Paster B J., Tanner A C., Yu W H., Lakshmanan A., Wade W G (2010), “The human oral microbiome”, J Bacteriol, 192: 5002 - 5017 15 Duckworth R M., Morgan S N., Murray M 1987 , “Fluoride in saliva and plaque following use of fluoride-containing mouthwashes”, J Dent Res, 59, pp.1187 – 1191 16 Hamilton - Miller J M T (2001 , “ nti-cariogenic properties of tea (Camellia sinensis ”, J Med Microbiol, 50, pp 299 - 302 17 Hardie J M 1992 , “Oral microbiology: current concepts in the microbiology of dental caries and periodontal disease”, Brit Dent J, 172, pp 271 – 278 18 Iio M., Uyeda M., Iwanani T., Nakagawa Y 1984 , “Flavonoids as a possible preventive of dental caries”, Agric Biol Chem, 48, pp 2143 – 2145 19 Keyes P H 1960 , “Infections and transmissible nature of experimental dental caries”, Arch Oral Biol., 1, pp 304 - 320 20 Loesche W J (1986), “Role of Streptococcus mutans in human dental decay”, Microbiol Rev, 50(4), pp 353 – 380 21 Limsuwan S., Hesseling-Meinders A., Voravuthikunchai S P., van Dijl J M., Kayser O 2011 , “Potential antibiotic and anti - infective effects of rhodomyrtone from Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk on Streptococcus pyogenes as revealed by proteomics’’, Phytomedicine, 18(11), pp 934 - 940 22 Limsuwan S., Kayser O., Voravuthikunchai S P 2012 , “ ntibacterial activity of Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk leaf extract against clinical isolates of Streptococcus pyogenes’’, Evid Based Complement Alternat Med.; 697183 23 Marquis R E., Burne R 2001 , “Biofilm acid base physiology and gene expression in oral bacteria”, Methods Enzymeol, 337, pp 403 - 415 24 Marshall M.V., Cancro P.L., and Fischman L.S., (1995), Hydrogen peroxide: A review of its use in dentistry, J Periodontol., 66, pp 786-796 25 Marsh P and Marin M V 2000 , “Oral Microbiology 4th edition”, Reed Education and professional publishing Ltd, USA 26 Nguyen P T M and Marquis R E 2011 , “ ntimicrobial actions of alpha - mangostin against oral Streptococci”, Can J Microbiol, 57(3), pp 217 - 225 27 Nguyen P T M., Baldzac J D., Olslo J., Marquis R.E (2005), “ ntimicrobial actions of benzimidazoles against oral bacteria”, Oral Microl Immunol, 20, pp – 28 Quivey R G., Kuhnert W L and Hahn K 2000 , “ daptation of oral streptococci to low pH”, Adv Microbiol Physiol, 42, pp 239 - 274 29 Saising J., Ongsakul M., Voravuthikunchai S P 2011 , “Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk ethanol extract and rhodomyrtone: a potential strategy for the treatment of biofilm-forming staphylococci’’, J Med Microbiol, 60(Pt 12), pp 1793 - 1800 30 Sheng J., Marquis R E (2006), “Enhanced axit resistance of oral streptococci at lethal pH values associated with axit-tolerant catabolism and with TP synthase activity”, FEMS Microbiol Lett.,262, pp 93 – 98 31 Vasavi H S., run B., Rekha P D 2013 , “Inhibition of quorum sensing in Chromobacterium violaceum by Syzygium cumini L and Pimenta dioica L.”, Asian Pac J Trop Biomed, 3(12), pp 954 – 959 32 Wilson M 1996 , “Susceptibility of oral bacterial biofilms to antimicrobial agents”, J Med Microbiol, 44, pp 79 - 87 33 Xiao J., Koo H 2010 , “Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms”, J Appl Microbiol, 108, pp 2103 – 2113 [...]... trị p < 0.05 21 Chƣơng 3 KẾT QUẢ 3.1 Khả năng ức chế quá trình sinh acid trên S Mutans của dịch chiết lá sim Kết quả nghiên cứu v ảnh hưởng của dịch chiết lá sim lên sự sinh acid của vi khuẩn S mutans được trình bày trong hình 3.1 7.5 6.5 pH 5.5 4.5 3.5 2.5 0 15 30 45 60 75 90 Thời gian (phút Hình 3.1 Khả năng ức chế sự sinh acid của tế bào S mutans trên biofilm của các dịch chiết lá sim ( Đối chứng;... tác dụng ức chế quá trình sinh acid, diệt khuẩn hay kìm h m hoạt độ các enzyme F-ATPase, PTS của chủng S mutans GS-5 và S mutans H2 phân lập từ người Việt Nam [5] Trong những năm g n đây, nhóm nghiên cứu của Voravuthikunchai và cộng sự 30 , 31 , 32 đ phát hiện thấy dịch chiết lá sim Rhodomyrtus tomentosa iton Hassk có khả năng ức chế sự sinh trưởng của hàng loạt các vi khuẩn trong đó có S mutans Những... Ảnh hƣ ng của các phân đoạn dịch chiết lá sim lên sự sinh acid của vi khuẩn S mutans Đối chứng (); MeOH (); Hexane (); EtOAc() Nhận xét: - Kết quả thu được ở hình 3.4 cho thấy: sau 105 phút pH của dịch chiết trong MeOH, Hexane, EtOAc l n lượt là 4,7; 4,7; 5,3 và pH của mẫu đối chứng là 4 - Như vậy, các phân đoạn dịch chiết lá sim đ u có khả năng ức chế quá chế quá trình sinh acid của S Mutans và... có S mutans Những số liệu nghiên cứu ban đ u này gợi ý rằng dịch chiết lá sim có chứa chất kháng khuẩn sâu răng mới và triển vọng Xuất phát từ những t n tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, c ng như để góp ph n khai thác ngu n nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta, chúng tôi thực hiện đ tài: Nghiên cứu khả năng ức chế quá trình sinh acid của vi khuẩn streptococcus mutans từ dịch chiết lá sim... chức năng của màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong quá trình đường phân và sử dụng glucose - Các tác nhân không phải ion: các ion không tích điện có khả năng ức chế các enzyme trên màng tế bào, dẫn đến làm giảm sử dụng glucose - Enzyme: một số enzyme có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi khuẩn hay làm tăng hoạt tính lysozyme - Các đường đa (polyol): có khả năng làm thay đổi quá trình đường... trong mảng bám, ức chế sự phát triển hoặc quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, làm giảm sự gắn kết của vi khuẩn với b mặt răng vì vậy ngăn ngừa sự tạo mảng bám, hạn chế quá trình tích tụ hay liên kết bắc c u vì vậy ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn Các đặc tính quan trọng nhất của chất kháng khuẩn là ngăn ngừa sự gắn kết, sự xâm nhi m của vi khuẩn và tác động đến quá trình trao đổi chất của chúng Các... được cho thấy dịch chiết lá sim đ ức chế rõ rệt sự sinh acid của vi khuẩn S mutans Giá trị pH cuối c ng thu được sau 90 phút với dịch chiết ở các n ng độ 0,01; 0,05; 0,1; 0,3 l n lượt là 3,94; 4,69; 4,94 và 5,1 trong khi ở mẫu đối chứng không xử lý dịch chiết là 3,65 Như vậy, dịch chiết ethanol của lá sim tr ng tại Việt Nam c ng có khả năng ức chế sự sinh axit của S mutans 22 3.2 Thu nhận phân đoạn... dụng kháng sinh và chống nhi m tr ng của Rhodomyrtone từ cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.) trên vi khuẩn Streptococcus pyogenes 16 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy: - Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS-5 được lấy từ bộ sưu tập giống của phòng thí nghiệm của GS Robert... 3.5 sau đó được thu lại, làm khô và tiến hành đánh giá hoạt tính kháng sự sinh acid của S mutans Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sự sinh acid của 12 phân đoạn phân tách được thể hiện ở Bảng 3.1 26 Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sự sinh acid của 12 phân đoạn phân tách Phân Hệ dung môi rửa cột Hoạt tính ức chế sự sinh acid đoạn F1 100% Hexane _ F2 10% EtOAc trong Hexane +++ F3 20% EtOAc trong... các quá trình sinh học, không làm tổn thương lớp màng nhày ở miệng và ít độc Vì thế có thể nói sử dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu răng Có 6 nhóm chất kháng khuẩn chính là: 11 - Cation: các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng của màng, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn - Anion: các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng