Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử 1

Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử 1

Bài 12 Phân loại vi sinh Sinh Học Phân Tử Khái quát phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống: Trước công tác phân loại vi sinh vật dựa đặc tính hình thái, sinh lý hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả sinh acid môi trường sắc tố tạo thành v.v Các đặc trưng bộc lộ hạn chế đặc tính dùng cho nhóm vi sinh vật (Enterobacteriaceae) lại khơng có ý nghĩa nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria) Hạn chế phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị định tên vi sinh vật lồi, bao gồm nhóm thể có mức độ tương đồng cao đặc điểm hình thái Các phương pháp dựa phản ứng sinh hóa: Từ hạn chế việc xác định đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu tập trung vào phản ứng sinh hóa đặc trưng cho vi sinh vật riêng biệt Sự khác biệt phản ứng có ý nghĩa cho phân loại vi sinh vật - API20E KIT, nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác Nói chung có nhiều nơi dùng kỹ thuật nhìn chung kết cịn nhiều sai số nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trường hợp gene định phản ứng sinh hóa nằm plasmid lại bị nhiều nguyên nhân khác tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi q trình ni cấy dẫn đến sai khác làm sai kết - Phân biệt thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào để sau thực khuẩn thể nhân lên thành hạt tế bào chủ, với số vi khuẩn thực khuẩn thể xâm nhiễm lại không làm tan tế bào vi khuẩn chúng tồn với tế bào vật chủ Dựa vào khác biệt mà người ta dùng thực khuẩn thể khác để phân biệt đối tượng vi khuẩn nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm khó giải đặc tính mẫn cảm vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi điều kiện ngoại cảnh vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác thực khuẩn thể khác Mặt khác nữa, thực khuẩn thể dễ thay đổi đặc tính làm thay đổi chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ - Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây phương pháp dùng lâu hiệu sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt) Ngun tắc dựa vào nhóm định kháng nguyên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao protein vỏ) Ưu phương pháp kháng huyết dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, nhiều trường hợp đặc trưng cho lồi Nói chung phương pháp ổn định hạn chế chủ yếu phương pháp chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết khơng đồng phịng thí nghiệm tính ổn định lần lặp lại - Phân biệt loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin chất peptid kháng khuẩn sinh vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo loại bacteriocin có khả kháng lại bacteriocin Bởi có nhiều loại vi khuẩn phân loại dựa vào kiểu bacteriocin Kết luận: Có nhiều phương pháp truyền thống sử dụng nhiều nghiên cứu phân loại khơng có phương pháp tỏ vạn thích hợp cho đối tượng vi sinh vật, tính xác đạt kết hợp nhiều phương pháp khác Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày tiến sinh học phân tử mở khả ứng dụng hữu hiệu phân loại học nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu phương pháp truyền thống tập trung số đối tượng vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử áp dụng đối tượng vi sinh vật Nói chung phương pháp sinh học phân tử tập trung vào kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic + Phân tích protein + Phân tích lipopolysaccharid + Hóa phân loại học Trong phần tập trung giới thiệu số kỹ thuật phân loại liên quan đến acid nucleic Các phần sau giới thiệu phương pháp liên quan đến polysaccharid, lipoprotein hóa phân loại 2.1 Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan trình tự acid nucleic thơng qua giải trình tự ADN lai ADN a Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích bao gồm tách plasmid, so sánh loại plasmid kích thước sau tinh plasmid xử lý enzym cắt hạn chế, sau điện di gel agarose so sánh đa hình mảnh cắt để phân biệt chủng vi sinh vật với Plasmid vòng Streptomyces Borrelia Plasmid nhân tố di truyền nhân chép độc lập với nhiễm sắc thể Cấu trúc plasmid sợi đôi ADN khép kín theo vịng Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ sợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia Streptomyces) Plasmid tìm thấy hầu hết vi khuẩn số vi sinh vật nhân thực bậc thấp nấm men + Tách plasmid: Thơng thường lượng plasmid có tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic tế bào Như vậy, ta phải thực phép tách plasmid khỏi ADN nhiễm sắc thể Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nguyên tắc chung phá tế bào vi khuẩn dùng enzym, siêu âm hay dung dịch kiềm có chất tẩy rửa SDS TritonX-100, sau việc loại ADN nhiễm sắc thể protein Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat Lúc phần lớn thành phần ADN nhiễm sắc thể protein tế bào bị kết tủa bị loại li tâm plasmid nằm dịch tủa tách kết tủa với ethanol hay isopropanol Đây phương pháp có hiệu để tách plasmid, thực tế hiệu tách plasmid có kích thước nhỏ cao nhiều so với plasmid có kích thước lớn (>100 Kb) Với plasmid có kích thước lớn cần thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy nguyên nhân học Với cách tách plasmid sản phẩm thu có lẫn đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp nhiễm ARN Để tránh nhiễm ARN cần xử lý với RNase (ribonuclease A) Tuy nhiên, tách theo phương pháp như: - Tách Caeseium chloride - Tách KIT QIAGENE - Tách kỹ thuật khác + Điện di plasmid gel agarose: Sau thu plasmid phải tiến hành kiểm tra trước phân tích kết điện di gel agarose để biết phổ plasmid kích thước chúng Khi tiến hành điện di nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, mM EDTA, pH 8.0) TPE (80 mM Tris- phosphats mM EDTA, pH 8.0) Sau điện di, gel nhuộm với ethidium bromide phát tia UV (310 nm) Nồng độ ethidium bromide khoảng mg/l thời gian nhuộm 10 phút Sau rửa lần nhanh nước loại ion trước nhìn UV chụp ảnh làm tài liệu Một số vấn đề cần lưu ý phân tích plasmid: gel thơng thường plasmid thấy dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy dạng mạch thẳng bị cắt endonuclease Dạng di chuyển tốc độ cao siêu xoắn (Hình 1.1) Hình 1.1 Di chuyển plasmid mạch thẳng (L) siêu xoắn (OC) điện di Đôi việc tách plasmid phức tạp đặc biệt trường hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn mảnh ADN nhiễm sắc thể Trong trường hợp có nhiễm RNA chúng di động nhanh trừ trường hợp plasmid không nhầm lẫn plasmid siêu xoắn dạng plasmid đứt gãy plasmid khác Một ý khác tránh nhầm lẫn so sánh kích thước plasmid siêu xoắn dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng Thực tế so sánh plasmid siêu soắn với kích thước Khi tiến hành phân biệt chủng vi khuẩn đương nhiên thực so sánh chủng có plasmid với Cũng nên ý chủng giống đặc tính miễn dịch có chung kết phân tích plasmid Phép phân tích có hiệu mẫu có nhiều loại plasmid, nhiên phải tính đến việc plasmid bị trình bảo quản + Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế: Cho đến nay, người ta tìm thấy 400 enzym cắt hạn chế Mục đích kỹ thuật bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid Tức người ta phân biệt khác plasmid có kích thước Như vậy, xử lý plasmid với hay kết hợp số enzym cắt hạn chế kết thu đoạn ADN cắt có kích thước khác Kết có độ lặp lại cao, dễ sử dụng so sánh mẫu khác Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế sản xuất tiêu thụ thị trường, enzym có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid Thông thường xử lý enzym sau mẫu phát gel agarose polyacrylamid Tuỳ thuộc vào kích thước mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau: Bảng 1.1 Nồng độ agarose kích thước mẫu ADN tương ứng Nồng độ agarose (%) 0.3 Kích thước ADN (kb) 1-7 0.5 0.7-45 0.8 0.4-20 1.0 0.3-10 1.2 0.2-8 1.5 0.2-6 2.0 0.1-5 Theo kinh nghiệm nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ băng ADN có ý nghĩa cho so sánh khơng nên 10 băng nên có băng kích thước nhỏ kích thước lớn Tuy nhiên, băng lớn khơng nên vượt q 10 băng có kích thước lớn khó di chuyển gel Trong trường hợp so sánh nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước phép phân tích dấu vân tay cho lần phân tích khác Như trình bày trên, phân tích chủng vi sinh vật dựa vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối tượng có nhiều plasmid phương pháp xử lý enzym cắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trường hợp nghiên cứu dịch tễ học chủng có phổ plasmid hay plasmid có kích thước giống Người ta ứng dụng kỹ thuật nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm (Hamburger) Các plasmid từ chủng khác có phổ khác đặc điểm cắt enzym cắt hạn chế Kết tạo mảnh ADN đặc trưng cho cá thể làm sở cho phép so sánh Tuy nhiên khó so sánh kết thu từ phịng thí nghiệm khác nhau, không dùng loại enzym cắt hạn chế Một lý cần đề cập đến xuất đột biến ngẫu nhiên vị trí enzym cắt, kết tạo khác biệt phổ thu từ mảnh cắt b Phân tích ADN nhiễm sắc thể: Phương pháp phân tích bao gồm việc tách ADN nhiễm sắc thể cắt enzym cắt hạn chế để phân biệt vi sinh vật với Một ý tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy nguyên nhân học Nói chung mảnh cắt nên có kích thước nhỏ 50 kb Việc tách mảnh cắt thực dựa vào kỹ thuật điện di trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style="text-align: justify; margin-top: 6.0pt"> Như kỹ thuật dấu vân tay không áp dụng trường hợp tế bào mang plasmid mà kỹ thuật sử dụng với nhiễm sắc thể cho trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp Liên quan đến vấn đề phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết xử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật Ở cách chọn loại enzym cắt hạn chế vơ quan trọng, theo cách chọn tạo nhiều mảnh cắt nên phân biệt băng riêng rẽ trường hợp khác lại tạo mảnh cắt có kích thước lớn khó tách theo kỹ thuật điện di có Các vi sinh vật khác có tỷ lệ GC khác (dao động từ 25-75%) mảnh cắt thu sau xử lý enzym cắt hạn chế khác Theo Nei M Li W H (1979) số mảnh cắt thu tính lý thuyết là: a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2 Trong đó: g - tỷ lệ GC ADN r1 - số cặp GC r2 - số cặp AT vị trí cắt enzym giới hạn sử dụng a - số vị trí cắt sử dụng enzym cắt hạn chế Mặt khác, người ta vào kết nghiên cứu vị trí cắt gene vi sinh vật làm sở cho cách chọn enzym cắt Thông thường cho phép phân tích người ta ghi số băng cắt enzym tính tốn kích thước mảnh tạo thành làm sở cho phép phân tích sau Tuy nhiên, nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích phương pháp tách ADN thơng thường dẫn đến thay đổi kích thước đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác có mặt plasmid lẫn tạo khác biệt giả kết phân tích, để khắc phục nhược điểm người ta phải thực phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết phân tích + Kỹ thuật điện di trường xung điện (điện di trường điện thay đổi, PFGE) - Nguyên tắc: Trước tiên mẫu đưa vào phân tích phải xử lý trước loại enzym cắt hạn chế mà có điểm cắt Kết phải tạo mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước khơng thể điện di theo phương pháp thơng thường mà tách kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis ) Kỹ thuật PFGE lần Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu Tuy nhiên sau có nhiều tác giả mơ tả lại kỹ thuật này, có sai khác nhiều sở lý thuyết phương pháp nhau: Mục đích kỹ thuật tăng khả di động mảnh ADN có kích thước lớn điện trường, thành phần gel đệm không thay đổi theo phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theo phương pháp thơng thường điện di liên quan đến di động mảnh ADN có kích thước khác gel agarose trường điện không đổi Kết phân tử lớn khó di động phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo tách biệt trường điện di Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả di động lại trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến mảnh ADN có kích thước khác thay đổi hướng di động Như kết mảnh có kích thước khác có khả di động khác Kích thước lớn mức độ di động chậm Sự di động khác ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước khơng phải gel agarose phương pháp điện di thơng thường, hình 1.2 Hình 1.2 Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau xử lý với Sma I với chủng Haemophilus ìnluenzae Tiếp theo mơ tả Schwartz va Cantor, Smith Codemine (1990) đề cập đến di chuyển mảnh ADN khác hàm số tuyến tính với kích thước chúng Trên sở điều chỉnh xung điện điện trường Tuy nhiên nhân tố khác có mối tương tác lẫn ảnh hưởng đến khả di động ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose nồng độ ion đệm - Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giống phương pháp chuẩn bị ADN plasmid Một vấn đề thường xảy đứt gãy ngẫu nhiên ADN dẫn đến sai khác kết phân tích Để hạn chế điều người ta phải thực kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT (Schwartz va Cantor – 1984 Smith, Klco 1988) Theo phương pháp hỗn dịch tế bào (dịch nuôi cấy dịch huyền phù) trộn với LMT agarose 37oC Hỗn dịch xử lý với enzym chất tẩy rửa để tách ADN NST khỏi thành, màng tế bào, RNA protein Sau xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease tế bào với proteinase K N-lauroylsarcosine để loại thành phần khác tế bào Kết phần LMT agarose có chứa ADN NST dùng làm mẫu chạy gel 0.5-1.0% (nên làm tan 65oC) đưa lên mẫu chạy gel PFGE, tài liệu Smith (1988) mô tả chi tiết cách chuẩn bị mẫu từ tế bào có khơng có thành tế bào: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tế bào thực vật động vật Nói chung với trường hợp có thành tế bào cần đến enzym phá thành tế bào Lượng ADN NST thường dao động khoảng 0.5-20 µg ADN thích hợp Nếu q nhiều ADN khơng thể phân tích được, cịn q khơng thể phát băng ADN kết phân tích Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE giữ năm lạnh có chứa 0.5M EDTA - Sau thu ADN NST mẫu LMT agarose tiến hành xử lý với enzym giới hạn loại có điểm cắt Tuy nhiên mẫu phải xử lý với PMSF để bất hoạt protein K sau PMSF lại phải loại bỏ sau số lần rửa với chất tẩy rửa EDTA Sau cần phân nhỏ mẫu agarose xử lý với đệm enzym cắt hạn chế qua đêm tube sau tồn mẫu sử dụng để tách trường xung điện Bảng 1.2 liệt kê enzym cắt hạn chế dùng cho phân tích PFGE Bảng 1.2 Một số enzym cắt hạn chế dùng cho kỹ thuật PFGE AatII Vị trí cắt GACGT/C ApaI GGGCC/C ClaI AT/CGAT MluI A/CGCGT NarI GG/CGCC NheI G/CTAGC NotI GC/GGCCGC NruI TCG/CGA PvuI CGAT/CG SacII CCGC/GG SalI C/TCGAC SfiI GGCC(N)4/NGGCC SmaI CCC/GGG XhoI C/TCGAG Enzym - Ứng dụng kỹ thuật phân tích PFGE: Kỹ thuật PFGE sử dụng cho nghiên cứu nhiều đối tượng khác (xem bảng 1.3) Bảng 1.3 Minh hoạ chủng vi sinh vật phân tích dựa kết PFGE thu từ đoạn nhiễm sắc thể Vi sinh vật nghiên cứu Tài liệu tham khảo Acinetobacter baumannii Gouby et al (1992) Brucella spp Campylobacter hyointestinalis Campylobacter jejuni Yan et al (1991) CADNida arabicans Vasquez et al (1991) CADNida prapsilosis Carruba et al (1991) Coxiella burnettii Heizen et al (1990) Enterobacter cloacae Haertl ADN BADNlow (1993) Enterococcus faecium MirADNa et al (1991) 10 Escherichia coli 11 Listeria monocytogenees 12 Leptospira spp 13 Mycobacterium tuberculosis 14 Neisseria meningitidis 15 Psedomonas aeruginosa 16 Shigella spp 17 Staphylococcus aureus 18 Streptococci ssp Allardet, Servent et al (19980 Salama et al (1992) Bohm ADN Karch (1992) Brosch et al (1991) Herrmann et al (1992) Zhang et al (1992) Bygraves ADN Maiden (1992) Boukadida et al (1987) Sodati ADN Piffaretti (1991) Prevost et al (1992) Single ADN Martin (1992) Mỗi đối tượng có đặc trưng riêng kết phân tích PFGE dùng cho nghiên cứu so sánh với tương đồng Đối với nhiều đối tượng có nhiễm sắc thể khơng thiết phải thực nhiễm sắc thể mà cần số nhiễm sắc thể mà thơi Ví dụ trường hợp C.albicans Monod (1990) cần thực phép phân tích với tổ hợp số nhiễm sắc thể đủ Cho dù theo cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác kết phép phân tích PFGE giống Phép phân tích PFGE ứng dụng cho nghiên cứu mức độ loài với loài Một số điểm cần lưu ý sử dụng kỹ thuật PFGE: + Kỹ thuật đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật kinh nghiệm việc tách nhiễm sắc thể đơi gặp khó khăn số đối tượng vi sinh vật + Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát sai khác nhỏ mẫu, đặc biệt thực với enzym kết giống không chắn hai mẫu giống hồn tồn Điều có nghĩa kỹ thuật nên dùng để xác định khác cịn việc xác định giống khơng đủ tin cậy Tuy nhiên xác định khác đơi mẫu có plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cần xét đến nguồn ADN tạo sai khác giả + Sự khác biệt mẫu phát dùng enzym cắt hạn chế khác Tóm tắt: Phương pháp phân tích plasmid phương pháp dùng phổ biến phịng thí nghiệm chuẩn đốn vi sinh vật Việc kết hợp phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn chế tạo phân tích xác với thơng tin đáng tin cậy mẫu phân tích Tuy nhiên, phân tích mẫu dựa plasmid cần lưu ý plasmid bị qua hệ phân chia, dẫn đến sai lệch kết nghiên cứu Khi thực phép phân tích PFGE với plasmid lớn khắc phục hạn chế phép phân tích với plasmid nhỏ Phương pháp PFGE dùng rộng rãi phịng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng đối tượng dễ nuôi cấy cho kết tốt hạn chế giá thành thiết bị yêu cầu cao kỹ thuật kinh nghiệm Mặt khác sử dụng enzym cắt hạn chế khó phát mức độ sai khác Như kết hợp phép phân tích plasmid, PFGE lai ADN cho kết tin cậy 2.2 Lai ADN Nguyên tắc tiến hành sau: ADN tổng số tách xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp khơng cần xử lý với enzym cắt hạn chế) sau điện di gel agarose chuyển lên màng lai Mẫu dò (probe) chuẩn bị lai với màng ADN Kết phép lai cho biết khác biệt mẫu ADN khác Phép lai tiến hành dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung Bắt đầu đứt gãy liên kết hydrogene hoá chất (kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc hai sợi đơn ADN tách gọi trạng thái biến tính ADN (denature) Nếu thời điểm người ta cho vào ADN đánh dấu biến tính (mẫu dị) sau tạo điều kiện hồi biến xuất (renature), lúc cho phép sợi đơn mẫu dò bắt cặp với sợi đơn mẫu ADN ban đầu (target ADN) Mức độ lai phụ thuộc vào tính đặc hiệu (sự tương đồng) mẫu dò mẫu gốc điều kiện cho phép lai thực (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lện mẫu dị, kích thước mẫu dị) Như vậy, việc chọn điều kiện xác cho phép lai có ý nghĩa quan trọng cho tính đặc hiệu kết phép lai Sau lai, bước rửa đệm thích hợp để loại mẫu dò dư cuối phép đo xạ đánh dấu (tuỳ theo phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hố chất phát xạ huỳnh quang) để đánh giá mức độ tương đồng phép lai Nói tóm lại số nhân tố tham gia vào kết phép lai là: mẫu dò ADN, phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai điều kiện tiến hành phương pháp đánh giá kết phép lai + Chọn mẫu dò: Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai Nhìn chung nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò Về mặt đưa số nội dung chủ yếu tiêu chí chọn mẫu dị theo Stahl Amann (1991) sau: Mẫu dị lai với ADN đích (target) khơng lai với nguồn ADN khác có mặt mẫu lai Khi phân tích mẫu vi sinh vật với mẫu dị nên đoạn nucleotid đặc trưng cho mẫu phân tích để phân biệt với sinh vật khác Tuy việc chọn mẫu dò mang tính kinh nghiệm, mẫu dị đơi khơng cần phải toàn gene mà đoạn gene mã hố cho đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay gene chức plasmid) Với cách chọn mẫu dị có kích thước nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi mẫu dò tổng hợp nhân tạo phép lai thực nhanh (dưới 30 phút) với mẫu dò lớn thời gian kéo dài (khoảng 16 giờ) Hạn chế lớn mẫu dị nhỏ khó khăn đánh dấu dẫn đến giảm tính đặc hiệu phép lai Một cách thường sử dụng thiết kế mẫu dị từ chuỗi ARN thơng tin 16S Cách chọn vào đoạn ADN có mặt đại diện mức độ loài, loài hay thuộc chi nghiên cứu + Các phương pháp đánh dấu: Các kỹ thuật đánh dấu ADN xem lĩnh vực phát triển mạnh sinh học phân tử Nói chung kỹ thuật đánh dấu chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp gián tiếp Trong phương pháp trực tiếp phần đánh dấu để phát gắn vào acid nucleic Đối với phương pháp gián tiếp có phần chức gắn vào acid nucleic phần lại phát gián tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu phát kỹ thuật miễn dịch Sau chi tiết phương pháp đánh dấu · Đánh dấu trực tiếp: - Bảng đưa loại chất dùng cho phương pháp đánh dấu trực tiếp dựa vào việc nhân ADN đánh dấu lên tăng độ nhạy so với phương pháp đánh dấu thực với mồi đơn lẻ Đối với phương pháp đánh dấu trực tiếp nhóm tạo tín hiệu gắn trực tiếp liên kết hoá trị với nucleic mẫu dò - Đánh dấu trực tiếp bao gồm bước chính: tạo tín hiệu dựa vào liên kết hố trị nhóm tín hiệu với mẫu dò thực phép lai mẫu nghiên cứu mẫu dò Bảng 1.4 Một số chất dùng cho đánh dấu trực tiếp Nguồn tạo tín hiệu 32 P 35 S Tài liệu Southern (1975) Collins& Hunsaker (1985) Alkaline phophatase Renz&Kurz (1984) Ethidium Albarella & ADNerson(1986) Fluorescein Amman & ctv (1988) Horseradish peroxidase Urdea ctv(1988) Microperoxidase Heller& Shneider(1983) Nitrobenzofuran Draper (1984) Tetramethylorhodamine Amman&ctv(1990) Hình 1.3 Minh hoạ phương pháp đánh dấu trực tiếp (A) gián tiếp (B) ... phương pháp khác Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày tiến sinh học phân tử mở khả ứng dụng hữu hiệu phân loại học nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu phương pháp truyền... đối tượng vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử áp dụng đối tượng vi sinh vật Nói chung phương pháp sinh học phân tử tập trung vào kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic + Phân tích... (19 90) Enterobacter cloacae Haertl ADN BADNlow (19 93) Enterococcus faecium MirADNa et al (19 91) 10 Escherichia coli 11 Listeria monocytogenees 12 Leptospira spp 13 Mycobacterium tuberculosis 14