2.2. Lai ADN · Đánh dấu gián tiếp: Đánh dấu gián tiếp được thực hiện theo 3 bước: thực hiện phép lai giữa mẫu dò và mẫu ADN đích, phản ứng giữa nhóm chức năng và protein bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo (reporter) và cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu. Bảng 1.5. Liệt kê một số hệ thống đánh dấu gián tiếp. Nhóm chức năng bám protein Nhóm tín hiệu (reporter) Tài li d Biotin-dUTP/steptavidin Digoxigenein- dUTP/antidigoxigenein Sulphone/antisulphone Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase Leary et al (1982) Kessler et al Dinitrophenyl/antinitrophenyl Poly(dA)/poly(dT) Acetyllaminofluorene/anti- acetylaminofluorene Europium chelate Piruvate kinase Horseradish peroxidase Alkaline phosphatase (1990) Syvanen e (1986) Leller et al (1990) Morrisey & Collins (1989) Tchen et al (1984) Mặc dù có nhiều hệ thống đánh dấu và phát hiện tín hiệu nhưng kinh nghiệm cho thấy hệ thống biotin và digoxidenin cho độ nhạy cao hơn cả. Hai hệ thống này có thể phát hiện tới mức dưới picrogam acid nucleic. Trong trường hợp với biotin thì đôi khi có mức độ nhiễu nền cao do biotin có mặt trong các sinh phẩm, còn đối với digoxigenein thì có thể không gặp khó khăn này. + Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ: Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là 32 P và 35 S. Kết quả của phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát hiện trên X-phim hoặc nhấp nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể đạt tới dưới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phương pháp này là không đạt được sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như việc quản lý chất thải. Xuất phát từ thực tế trên mà càng ngày người ta càng quan tâm đến các phương pháp đánh dấu phi phóng xạ. Mục tiêu là đạt được một hệ thống đánh dấu có độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất phóng xạ. Bảng dưới đây liệt kê các yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh dấu mẫu dò: 1, Dễ gắn với acid nucleic theo phương pháp đơn giản và có độ lặp lại cao. 2, Bền trong điều kiện lai và bảo quản. 3, Không bị ảnh hưởng và làm ảnh hưởng đến phản ứng lai. 4, Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong dịch thể (liquid phase) hay có chất mang (solid phase). 5, Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản. 6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai. 7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện. 8, Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá. Tuy nhiên, nếu theo các yêu cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ thống đánh dấu phi phóng xạ nào thoả mãn. Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao và đó là lý do các phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là phương pháp dựa trên các enzym như Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase. Tuy nhiên phương pháp sử dụng các chất phóng xạ hiện tại vẫn đang được dùng cho một số phòng thí nghiệm đặc biệt. · Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ. Có 3 phương pháp đánh dấu phi phóng xạ: 1, Dùng cơ chất hoá phát xạ và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơ chất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ ánh sáng và sau đó là phương pháp phát hiện bức xạ này. * Với nguồn cơ chất hoá phát quang có loại như AMPPD (Bronstein, Edward & Voyta, 1989) có thể được dùng trực tiếp như là cơ chất cho enzym Alkaline phosphatase trong phép lai ADN đạt độ nhạy cao trong thời gian ngắn (Bronstein et al., 1990). * Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase trên cơ sở giải phóng D-luciferin từ cơ chất, ví dụ D-luciferin-O- phosphate (Miska và Geiger., 1987). Hai phương pháp này tương đối nhạy và đang được sử dụng rộng rãi. Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng . xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như vi c quản lý. mang (solid phase). 5, Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản. 6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai. 7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện. 8, Có thể ứng. phương pháp đánh dấu phi phóng xạ: 1, Dùng cơ chất hoá phát xạ và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơ chất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ ánh sáng và sau đó là phương