CÁCH SỬ DỤNG, BẢO QUẢN, BẢO TRÌ KÍNH HIỂN VI

1 /Kính hiển vi ánh sáng truyền qua transmitted light microscope Là loại kính hiển quang học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, thường sử dụng một nguồn ánh sáng trắng rọi qua mẫu đặ

CÁCH SỬ DỤNG, BẢO QUẢN,

BẢO TRÌ KÍNH HIỂN VI

CÁC LỌAI KÍNH HIỂN VI

• KÍNH HIỂN VI THƯỜNG :

KÍNH HIỂN VI SOI NỔI

KHV SOI NỔI LƯU ĐỘNG

KHV GẮN CAMERA

KHV ĐIỆN TỬ

KHV CONFOCAL

ĐẦU KÍNH

THỊ KÍNH

VẬT KÍNH

TỤ QUANG

CAMERA

KÍNH HIỂN VI PHÂN CỰC

KÍNH HIỂN VI HÙYNH QUANG

KÍNH HIỂN VI GIẢNG DẠY

KHV GIẢNG DẠY 5 NGƯỜI

KÍNH HIỂN VI ĐẢO NGƯỢC

KHV VI THAO TÁC

SINH HIỂN VI ( KHÁM MẮT)

KHV PHẨU THUẬT 1

KHV PHẨU THUẬT 2

KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

A KHÁI NIỆM KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

Là một dụng cụ quang học hỗ trợ cho mắt gồm có nhiều lăng kính với các độ phóng đại khác nhau, có tác dụng làm tăng góc trông ảnh của những vật rất nhỏ mà ta

không thể nhìn thấy được bằng mắt

thường.

1/ Hệ thống giá đỡ gồm:

• Bệ, thân, đầu mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu bản.

2/ Hệ thống phóng đại gồm:

• Thị kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi mà người

ta để mắt và để soi kính, có 2 loại ống đôi và

ống đơn (Bản chất là một thấu kính hội tụ có

tiêu cự rất ngắn, dùng để tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát)

• Vật kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi quay về phía có vật mà người ta muốn quan sát, có 3 độ phóng đại chính của vật kính: x10, x40, x100

(Bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự

ngắn, đóng vai trò như kính lúp để quan sát ảnh thật).

3/Hệ thống chiếu sáng gồm:

• Nguồn sáng (gương hoặc đèn).

• Màn chắn, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua tụ quang.

• Tụ quang, dùng để tập trung những tia ánh sáng

và hướng luồng ánh sáng vào tiêu bản cần quan sát Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và

bàn để tiêu bản Di chuyển tụ quang lên xuống

để điều chỉnh độ chiếu sáng.

4/ Hệ thống điều chỉnh:

• Ốc vĩ cấp

• Ốc vi cấp

• Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống

• Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng của

tụ quang

• Núm điều chỉnh màn chắn

• Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu bản (trước, sau, trái, phải)

B KÍNH HIỂN VI

• Kính hiển vi (microscope) là thiết bị để

quan sát các vật thể có kích thước rất nhỏ

mà mắt thường không nhìn thấy được

Hình ảnh hiển vi của vật thể được phóng đại thông qua một hoặc nhiều thấu kính, hình ảnh này nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của thấu kính (hoặc các thấu kính) Khả năng quan sát của kính hiển vi được quyết định bởi độ phân giải.

1 /Kính hiển vi ánh sáng truyền qua

(transmitted light microscope)

Là loại kính hiển quang học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, thường

sử dụng một nguồn ánh sáng trắng rọi qua mẫu đặt trên một lam kính để

quan sát hình dạng và vi cấu trúc của mẫu Ảnh của mẫu là hình ảnh hai

chiều.

- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)

- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)

- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát

- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt

trên cùng một mâm vật kính

- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt Độ phóng đại điển

hình của thị kính là 2x, 5x, 10x, 15x

- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)

-Ống nối với camera (nếu có)

Nguyên lý: Kính hiển vi ánh sáng truyền qua

• Ánh sáng khả kiến từ nguồn được tập trung lại khi đi qua

tụ quang để truyền qua mẫu đặt trên lam kính Sau đó, ảnh của mẫu được tạo thành và phóng đại lần thứ nhất nhờ một thấu kính có tiêu cự ngắn (vài mm) gọi là vật

kính Hình ảnh này có thể tiếp tục được phóng đại lên nhiều lần nhờ thấu kính phóng Hình ảnh phóng đại cuối cùng của mẫu là ảnh thật, quan sát được nhờ thị kính (có tiêu cực dài hơn rất nhiều so với tiêu cự của vật

kính) hoặc được ghi lại nhờ CCD camera

• Độ phân giải của ảnh hiển vi quang học bị hạn chế bởi nhiễu xạ

• Theo công thức của Abbe – Rayleigh, khoảng cách nhỏ nhất dmin giữa hai điểm có khả năng phân biệt được

tính theo công thức:dmin = 1,22l/2NA trong đó l là bước

2/ Kính hiển vi soi nổi (stereoscopic microscope)

• Là loại kính hiển vi quang học được thiết kế

để quan sát hình ảnh bề mặt của mẫu vật thể

ở độ phóng đại thấp.

• Loại kính này thường sử dụng chùm ánh

sáng trắng chiếu tới bề mặt của vật thể, hình ảnh tạo ra bởi ánh sáng phản xạ thông qua hai trục quang học riêng biệt với hai vật kính (hoặc một vật kính phẳng), hệ thống kính

Gồm các bộ phận chủ yếu sau :

• - Nguồn sáng phản xạ (và truyền qua)

• - Bệ kính giữ thăng bằng có giá đặt mẫu

• - Lăng kính

• - Ống quan sát

• - Vật kính : thường bao gồm hai vật kính hoặc vật kính phẳng cố định, cho phép quan sát mẫu vật ở các góc độ khác nhau Độ phóng đại điển hình của vật kính : 1x ; 1,5x ; 2x.

• - Núm chỉnh độ phóng đại

• - Núm chỉnh độ hội tụ

• - Thị kính : là một ống hình trụ mang thấu kính Độ

phóng đại điển hình của thị kính : 10x, 15x, 20x và 30x

• -Ống nối camera (nếu có)

Kính hiển vi soi nổi

• Kính hiển vi soi nổi được thiết kế để quan sát

mẫu vật thể ở độ phóng đại thấp.

• Ảnh hiển vi soi nổi thường được tạo thành nhờ ánh sáng phản xạ trên bề mặt mẫu sau khi được chiếu sáng hơn là ánh sáng truyền qua

• Ánh sáng phản xạ đi qua hai vật kính hoặc một vật kính phẳng theo hai trục quang học song

song tạo nên hình ảnh ba chiều nhờ khả năng quan sát mẫu từ các góc độ khác nhau (γ) )

• Nhờ sử dụng các kính viễn vọng kiểu Galilê đặt trên một trống xoay (hoặc hệ thống các thấu

kính có khả năng phóng to hoặc thu nhỏ) nên có khả năng thay đổi được độ phóng đại của ảnh theo ý muốn.

3/ Kính hiển vi phân cực (polarizing

microscope)

• Là loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng phân

cực để quan sát, nghiên cứu định tính và

định lượng những mẫu có đặc tính lưỡng

chiết (có hai chỉ số khúc xạ)

• Kính hiển vi phân cực có khả năng cung cấp

những thông tin về màu hấp thụ và đường biên quang học giữa các chất liệu khác nhau (có chỉ só khúc xạ khác nhau) trong cùng

một mẫu Hình ảnh hiển vi phân cực có độ tương phản cao.

• Kính hiển vi quang học có hai nicon phân

cực ánh sáng, đặt thẳng góc nhau: nicon phân cực đặt dưới mâm kính, nicon phân tích đặt

giữa vật kính và thị kính

• Mẫu đá hoặc khoáng vật mài mỏng tới bề dày 0,03 mm, được gắn bằng nhựa Canađa vào tấm thuỷ tinh và đặt trên mâm kính KHVPC cho

phép xác định các hằng số quang học của

khoáng vật (chiết suất, lưỡng chiết suất, góc

quang học, màu tự nhiên, màu đa sắc của

- Bộ phân tích (có khả năng xoay vòng với góc đọc nhỏ)

- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu Vật kính có các độ phóng đại điển hình

khác nhau như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính

- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt Độ phóng đại điển

Kính hiển vi phân cực

• Không giống như các loại kính hiển vi quang học khác, kính hiển vi phân cực được thiết kế để

quan sát mẫu khi sử dụng ánh sáng phân cực

và đặc tính quang học không đẳng hướng của mẫu Loại mẫu này có những liên kết nội phân

tử phân cực tương tác với ánh sáng phân cực theo một hướng nhất định dẫn đến sự trễ pha Quá trình này được kiểm soát nhờ sự biến đổi biên độ giao thoa tại mặt phẳng tạo ảnh ban

đầu

• Để quan sát các mẫu lưỡng chiết (có hai chỉ số khúc xạ khác nhau), kính hiển vi phải được trang bị hai bộ phân cực, một

bộ đặt trên đường đi của chùm ánh sáng tới trước mẫu, bộ phân tích (bộ phân cực thứ hai) được đặt ở trục quang học giữa vật kính, sau khẩu độ và các ống quan sát hoặc camera

• Độ tương phản của ảnh tạo ra nhờ tương tác giữa ánh sáng phân cực phẳng với mẫu lưỡng chiết để tạo ra hai thành phần sóng riêng biệt (tia bình thường và bất bình thường) phân cực trong các mặt phẳng vuông góc thay đổi lẫn nhau

• Tốc độ của các thành phần này khác nhau và thay đổi hướng truyền khi đi qua mẫu

• Sau khi đi qua mẫu, các thành phần ánh sáng truyền lệch pha nhau nhưng tái kết hợp lại sau quá trình giao thoa khi đi qua

bộ phân tích.

4/ Kính hiển vi huỳnh quang (flourescence microscope)

• Là loại kính hiển vi quang học sử dụng một

nguồn ánh sáng kích thích để nghiên cứu,

quan sát các thuộc tính của mẫu sinh học

sau khi mẫu này nhuộm với chất phát huỳnh quang (hoặc mẫu tự phát huỳnh quang).

• Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang cũng cho phép

quan sát những thuộc tính sinh hóa và sinh

lý học của các tế bào sống Phụ thuộc vào

mục đích và đối tượng cần quan sát mà mẫu

có thể nhuộm với những chất phát huỳnh

4/ Kính hiển vi huỳnh quang

• Gồm các bộ phận chủ yếu sau :

- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen)

- Nguồn sáng kích thích huỳnh quang (đèn hơi thủy ngân, đèn hồ quang xenon…)

- Tụ quang để hội tụ chùm sáng

- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng

- Gương lưỡng hướng sắc (hoặc bộ phân chia chùm tia lưỡng sắc)

- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)

- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)

-

Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát.

- Vật kính : là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.

- Thị kính : là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x

- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)

4/ Kính hiển vi huỳnh quang

4/ Kính hiển vi huỳnh quang

• Hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước sóng

ngắn, năng lượng cao để kích thích các điện tử nội tại trong phân tử của mẫu nhảy lên quỹ đạo cao hơn (có mức năng lượng cao hơn) Khi các điện tử này quay trở lại quỹ đạo cũ (có mức năng lượng

ban đầu khi chưa bị kích thích) chúng phát ra một ánh sáng có

bước sóng dài hơn, năng lượng thấp hơn (thường nằm trong phổ ánh ánh sáng nhìn thấy) để tạo ra hình ảnh huỳnh quang

• Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn xenon hoặc thủy ngân để tạo ra ánh sáng tia cực tím, qua bộ lọc để dẫn vào kính và đi đến gương lưỡng hướng sắc - loại gương có khả năng phản xạ dải

bước bước sóng nhất định và cho phép một dải bước sóng khác đi qua

• Gương này phản xạ ánh sáng tia cực tím lên mẫu để kích thích

huỳnh quang nội tại trong các phân tử của mẫu

• Vật kính sẽ thu lại những ánh sáng có bước sóng huỳnh quang

được tạo ra đi đến gương lưỡng hướng sắc và thông qua một bộ lọc (để loại bỏ những ánh sáng không có bước sóng huỳnh quang)

C Hướng dẫn sử dụng

• C.1 Nguyên tắc, quy định chung khi sử dụng

- Người sử dụng kính hiển vi phải được đào tạo cơ bản về kiến thức liên quan.

- Người sử dụng kính lần đầu phải có sự

hướng dẫn của người có kinh nghiệm.

- Đọc kỹ hướng dẫn của từng loại kính

trước khi thao tác.

• C.2 Quy trình sử dụng kính hiển vi

2.1 Kính hiển vi ánh sáng truyền quang

i Bật công tắc khối nguồn

ii Nhấn công tắc khởi động trên kính

iii Đưa bộ lọc sáng vào trục quang học (nếu có)

iv Chỉnh tâm hai thị kính vào trục quang học

v Tăng tụ quang (nếu có) đến vị trí cao nhất (sử dụng núm hội tụ tụ quang)

vi Lựa chọn vật kính 10x đưa vào trục quang học vii.Mở hoàn toàn màn chắn sáng và khẩu độ

viii.Đưa mẫu và dịch chuyển giá đỡ mẫu đến vị trí phù hợp để quan sát

i Điều chỉnh độ hội tụ

iii Điều chỉnh độ hội tụ và chuẩn tâm tụ quang

iv Lựa chọn vật kính có độ phóng đại mong

muốn (lưu ý: khi thay đổi vật kính, có thể

không quan sát được hình ảnh của mẫu, do

đó phải điều chỉnh độ hội tu và khoảng cách giữa vật kính và mẫu).

v Khi chụp ảnh hoặc quan sát mẫu bằng

camera, phải mở chốt ngăn trục quang học (chốt này thường ở ngay dưới ống nối

camera)

• 2.2 Kính hiển vi soi nổi

iv Điều chỉnh khoảng cách giữa hai thị kính để

phù hợp với mắt người quan sát.

v Điều chỉnh điốp để phù hợp với mắt.

vi Điều chỉnh độ hội tụ và khoảng cách làm việc vii Thay đổi độ phóng đại, nếu muốn.

viii Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết

• 2.3 Kính hiển vi phân cực

i Bật công tắc nguồn

ii Điều chỉnh thị kính để phù hợp với mắt quan sát

iii Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để quan sát bằng hai thị

kính

iv Đưa vật kính 10x vào trục quang học Chỉnh thẳng chùm sáng

v Chỉnh tâm tụ quangvi Đưa mẫu lên giá và chỉnh tâm giá giữ mẫu

vi Chỉnh tâm vật kính

vii Điều chỉnh độ mở thích hợp của màng chắn khẩu độ và màng

chắn trường

viii Điều chỉnh độ hội tụ

ix Chọn vật kính phù hợp và sử dụng một giọt dầu nhúng vật kính

khi quan sát

x Điều chỉnh và lựa chọn chế độ quan sát thích hợp

xi Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để ghi nhận hình ảnh bằng

camera

• 2.4 Kính hiển vi huỳnh quang

• Quan sát ảnh hiển vi trường sáng

i Bật công tắc nguồn

ii Bật công tắc khởi động kính và điều chỉnh độ sáng thích hợp

iii Đưa các bộ lọc ánh sáng vào trục quang học (ví dụ: đưa các bộ

lọc ND8, ND32 và NCB11 đến chế độ IN ở kính Eclipse 90i,

Nikon)

iv Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học để quan sát bằng hai thị

kính

v Nâng tụ quang lên vị trí cao nhất (ví dụ: sử dụng núm chỉnh hội tụ

tụ quang ở kính Eclipse 90i, Nikon)

vi Chọn vật kính 10x vào trục quang học

vii Mở hoàn toàn màng chắn trường và màng chắn khẩu độ

viii Đưa mẫu lên giá và dịch chuyển giá mẫu (lên, xuống hoặc/và theo

chiều ngang, dọc) đến trường quan sát

ix Chỉnh hội tụ mẫu

x Chỉnh điốp và khoảng cách giữa các thị kính để phù hợp với mắt

quan sát

• Quan sát hình ảnh huỳnh quang

xi Chỉnh núm hội tụ tụ quang và chỉnh tâm tụ quang bằng các vít (cố định mâm tụ quang xoay)

xii Chọn vật kính thích hợp để quan sát mẫu

xiii Hạ thấp tụ quang đến vị trí thấp nhất

xiv Tắt nguồn sáng truyền qua (diascopic)

xv Đưa bộ lọc ánh sáng kích thích vào trục quang học

xvi Mở hoàn toàn màng chắn khẩu độ cho ánh sáng kích thích huỳnh quang

xvii Kiểm tra cửa trập cho ánh sáng kích thích huỳnh quang đã đóng

và mở nguồn sánh kích thích huỳnh quang

xviii Mở cửa trập của ánh sáng kích thích huỳnh quang và chỉnh tâm đèn

xix Đưa vật kính 10x vào trục quang học

xx Đưa mẫu vào giá đỡ và và dịch chuyển giá mẫu (lên, xuống

hoặc/và theo chiều ngang, dọc) đến trường quan sát

xxi Chỉnh hội tụ

xxiv Để ghi lại hình ảnh hiển vi bằng camera, ta thực hiện các bước sau:

+ Chỉnh kính để quan sát hình ảnh rõ ràng trước + Đẩy cái nẫy đóng mở trục quang học sang chế

độ hiển thị trên camera

+ Điều chỉnh đầu camera đến đúng vị trí để đạt

được hình ảnh rõ nét nhất trên màn hình.

+ Thiết lập các chế độ cài đặt của camera

+ Lựa chọn chế độ camera phù hợp cho đối tượng quan sát

+ Chỉnh chuẩn camera và hình ảnh

+ Chụp và lưu lại hình ảnh.

xxv Tắt nguồn sau khi quá trình quan sát mẫu kết thúc

TÓM TẮC CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

• Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ 1 giọt dầu soi để soi chìm trên phiến kính khi soi vật kính x100.

• Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp.

• Điều chỉnh ánh sáng.

• Điều chỉnh tụ quang: đối với vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính x100.

• Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính.

• Hạ vật kính sát vào tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản).

• Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên