Việc cung cấp các NAD(P)H là yếu tố then chốt trong trong việc sản xuất vi sinh vật của xylitol từ xylose. Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung NAD(P)H, acetaldehyde dehydrogenase 6 (ALD6) và acetyl-CoA synthetase 1 (ACS1) được biểu hiện quá mức đưa vào nấm men tái tổ hợp Saccharomyces cerevisiae từ việc lên men khử Pichia stipitis xylose gen. các hoạt động phân tích bên trong ống nghiệm nhằm xác nhận biểu thức hàm số của cả hai enzyme. Nuôi cấy mẻ trong lượng glucose giới hạn cho phép xác định được khả năng lên men của Saccharomyces cerevisiae BJ3505:dXR chủng biểu hiện tốt ACS1 hoặc ALD6 được thực hiện bằng cách bổ sung đường 600 g / L trong sự hiện diện của 100 g / L xylose Trong số đó, ACS1 với biểu hiện quá mức đã cho kết quả tốt nhất trong sản xuất xylitol: Nồng độ xylitol 91,3 g / L và 1,76 g / L h xylitol, đó là 25% và tăng 11%, so với việc kiểm soát và biểu hiện chủng giống ALD6 tốt. Xem xét những thay đổi của tăng trưởng tế bào,sản phẩm ethanol và acetate, một điều đáng chú ý của sản xuất xylitol bằng ACS1 biểu hiện quá mức dường như được gán cho năng lượng và sự phát sinh ra NAD (P) H thông qua một quá trình chuyển hóa từ acetaldehyde để acetyl-CoA và chu kỳ TCA
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BÀI DỰ THI CUỘC THI TÌM HIỂU
Bài báo cáo :
TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC QUÁ BIỂU HIỆN
ACETALDEHYDE DEHYDROGENASE 6 AND ACETYL-COA SYNTHETASE 1 TRONG SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM XYLITOL BẰNG TÁI TỔ HỢP
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
GVHD: Nguyễn Minh Hải Nhóm 5:
1 Vũ Thị Thu Hiền 11116027
2 Trần Thi Thu Hiền 11116026
3 Nguyễn Thị Anh Thư 11116066
4 Nguyễn Khắc Quí 11116052
5 Đào Quang Minh 11116038
1ffgg111111116015
Tp HCM, tháng 3 năm 2014
Trang 2Mục lục
TÓM TẮT 3
1 Lời giới thiệu 3
2 Nguyên liệu và phương pháp 4
2.1 Chủng và Plasmid 4
2.2 Thao tác di truyền 4
2.3 Điều kiện môi truờng nuôi cấy 6
2.4 Các phương pháp phân tích 7
2.5 Phân tích hoạt tính enzyme 7
3 Kết quả và bàn luận 9
THAM KHẢO 12
Trang 3TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC QUÁ BIỂU HIỆN ACETALDEHYDE
DEHYDROGENASE 6 AND ACETYL-COA SYNTHETASE 1 TRONG SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM XYLITOL BẰNG TÁI TỔ HỢP SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
TÓM TẮT
Việc cung cấp các NAD(P)H là yếu tố then chốt trong trong việc sản xuất vi sinh vật của xylitol từ xylose Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung NAD(P)H, acetaldehyde dehydrogenase 6 (ALD6) và acetyl-CoA synthetase 1 (ACS1) được biểu hiện quá mức đưa vào nấm men tái tổ hợp Saccharomyces cerevisiae từ việc lên men khử Pichia stipitis xylose gen các hoạt động phân tích bên trong ống nghiệm nhằm xác nhận biểu thức hàm số của cả hai enzyme Nuôi cấy mẻ trong lượng glucose giới hạn cho phép xác định được khả năng lên men của Saccharomyces cerevisiae BJ3505:dXR chủng biểu hiện tốt ACS1 hoặc ALD6 được thực hiện bằng cách bổ sung đường 600 g / L trong sự hiện diện của 100 g / L xylose Trong số đó, ACS1 với biểu hiện quá mức đã cho kết quả tốt nhất trong sản xuất xylitol: Nồng độ xylitol 91,3 g / L
và 1,76 g / L h xylitol, đó là 25% và tăng 11%, so với việc kiểm soát và biểu hiện chủng giống ALD6 tốt Xem xét những thay đổi của tăng trưởng tế bào,sản phẩm ethanol và acetate, một điều đáng chú ý của sản xuất xylitol bằng ACS1 biểu hiện quá mức dường như được gán cho năng lượng và sự phát sinh ra NAD (P) H thông qua một quá trình chuyển hóa từ acetaldehyde để acetyl-CoA và chu kỳ TCA
1 Lời giới thiệu
Xylitol là một loại đường thay thế phổ biến với hàm lượng calo thấp, vị mát và
vị ngọt chất lượng cao (Lee et al., 2009) Các xylitol hàng năm trên thị trường được ước tính là 340,000,000 $ trong năm 2008 (Akinterinwa et al., 2008) Cho đến nay, các
vi sinh vật khác nhau đã được phát triển để sản xuất xylitol từ xylose: Candida tropicalis Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli và Corynebacterium glutamicum (Akinterinwa và các cộng sự, 2008; Kim và cộng sự, 2010; Lee và cộng sự, 2000) Trong số đó, một loại men GRAS là S cerevisiae (Ries, 2009) không có cách nào trao đổi chất nên nó nên nó đã được các kỹ thuật di truyền biểu hiện thành các tái tổ hợp xylitol (XR) Enzyme đầu tiên chuyển hóa xylose (Hình 1) do đó tái tổ hợp S cerevisiae có thể sản xuất xylitol với năng suất chuyển đổi gần như 100% (Akinterinwa et al, 2008; Lee và cộng sự, 2000; Chung và cộng sự, 2002) Trong khi
đó, XR- trung gian chuyển đổi xylose xylitol yêu cầu NAD (P) H như một yếu tố đông thời, trong đó việc cung cấp đầy đủ là một yếu tố rất quan trọng cho sản xuất xylitol hiệu quả (Granstr ¨ om et al., 2007)
Trong các nghiên cứu trước đó , điều chế trực tiếp và gián tiếp của NAD(P)H
đã được thực hiện trong S cerevisiae tái tổ hợp thể hiện gen mã hóa XYL1 với P
Trang 4stipites XR Ví dụ, transhydrogenase hòa tan (EC1.6.1.1) xúc tác chuyển đổi đảo ngược của NADH thành NADPH và glucose-6-phosphat dehydrogenase là một enzyme chuyển hóa chính để tạo ra NADPH trong con đường pentose phosphate oxy hóa được biểu hiện rõ rang S cerevisiae tái tổ hợp có thể sản xuất xylitol (Jeun et al.,2003; Kwon et al.,2006) Sự suy giảm đồng thời hoạt động của Phosphoglucose isomerase (EC5.3.1.9) và cải thiện glucose-6-dehydrogenase phosphate tăng năng suất xylitol thông qua sự thay đổi của lượng glucose từ đường phân quá trình pentose phosphate sản xuất NADPH (Oh et al.,2007).Trong khi đó, vì sự vắng mặt của các enzym chuyển hóa để xúc tác thêm quá trình oxy hóa của xylitol, S cerevisiae tái tổ hợp thể hiện XR phải yêu cầu đồng chất cho quá trình sản xuất tăng trưởng tế bào và xylitol Theo bối cảnh này, một mức giới hạn glucose của quá trình lên men fed-batch được thiết kế để duy trì một mức độ cơ bản của nồng độ glucose trong canh trường nuôi cấy ,canh trường cho quá trình ngăn chặn sự xâm nhập của các chất dị hóa của
sự hấp thu xylose và tạo ra năng lượng và NAD(P)H (Lee etal.,2000; Chung et al.,2002; Bae et al.,2004) Trong nghiên cứu này, hai enzym chuyển hóa liên quan gián tiếp sự tái tạo đồng yếu tố, NADPH phụ thuộc vào acetaldehyde dehydrogenase 6 và acetyl-CoA synthetase 1 (ACS1, EC6.2.1.1) được biểu hiện rõ ràng trong tái tổ hợp S cerevisiae có chứa gen XR các stipitis P để điều tra hoạt động của chúng trong sản xuất xylitol Khảo nghiệm hoạt động của chúng đã khẳng định sự biểu hiện chức năng của cả hai enzym Lên men fed-batch với một chiến lược để duy trì nồng độ glucose ở mức cơ bản đã được thực hiện trong sự hiện diện của nồng độ xylose cao để đánh giá
năng lực sản xuất xylitol của các chủng S cerevisiae tái tổ hợp.
2 Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Chủng và Plasmid
E coli TOP10 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) được sử dụng cho thao tác gen.
S cerevisiae BJ3505: DXR thể hiện P stipitis xylose reductase (XR) được xây dựng
để sản xuất xylitol trước đây (Chung et al.,2002), trong đó gen mã hóa XYL1 P stipitis XR được tích hợp thể nhiễm sắc trong nhiều chuỗi δ và thể hiện một cách chủ yếu dưới chất hoạt hóa GAPDH S cerevisiae CEN.PK2-1D được sử dụng cho việc cung cấp các DNA nhiễm sắc thể nấm men Plasmid p426GPD và p424GPD cùng với chất hoạt hóa GPD và CYC1 terminator được sử dụng cho sự thể hiện của ALD6 và ACS1 Chủng nấm men và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 1
2.2 Thao tác di truyền
Các ALD6 gen mã hóa acetaldehyde dehydrogenase 6 và sự ACS1 gen mã hóa
acetyl-CoA synthetase được PCR-khuếch đại từ nhiễm sắc thể DNA S cerevisiae Thủ tục chung cho thao tác DNA theo các báo cáo trước đây Các
oligomer DNA gen cụ thể được thiết kế như sau: F_ALD6_SpeI and R_ALD6_XmaI
Trang 5for ALD6; F_ACS1_EcoRI and R_ACS1_XhoI cho ACS1 Các trình tự nucleotide của ADN mồi được mô tả trong bảng 2 Sau khi xác nhận kích thước ước tính DNA, sản phẩm PCR với gen ALD6 và gen ACS1 và plasmid p426GPD và p424GPD được điều trị bằng các enzym giới hạn tương ứng (Bảng 2) Gen ALD6 được lắp vào đầu lasmid p426GPD và gen ACS1 đã được thực hiện vào plasmid p424GPD kết quả trong việc xây dựng các plasmid pALD6 và pACS1, tương ứng Gen ALD6 cũng như các gen ACS1 được đặt nằm phía sau chất hoạt hóa GDP trong mỗi plasmid Sự thay đổi của nấm men theo phương pháp lithium-acetate
Hình 1 Sơ đồ biểu diễn glucose và chuyển hóa xylose trong tái tổ hợp S cerevisiae
biểu hiện gen XR Tên của các enzym được in nghiêng và viết tắt như sau: XR, xylose reductase; ADH, alcohol dehydrogenase; ALD6, aldehyde dehydrogenase 6; ACS1, acetyl-CoA synthetase 1
Bảng 1: Chủng S cerevisiae và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này
Trang 62.3 Điều kiện môi truờng nuôi cấy
Môi trương LB (10g/Ltryptone, 5g/Ly east extract and 10g/LNaCl) được sự dụng cho quá trình nuôi cấy E coli Môi trường tổng hợp toàn bộ (SC)( 6.7g/Yeast có nguồn gốc nitơ không có axit amin ) Sigma,St.Louis, USA) và 20g/L glucose) mà không uracil hoặc tryptophan đã được sử dụng cho lựa chọn các biến nạp Môi trường YPD 10g / L chiết nấm men, 20 g / L peptone và glucose 20g / L) đã được sử dụng cho
sự phát triển tế bào tái tổ hợp các chủng S cerevisiae và sản xuất xylitol Các Glycerol của các tế bào nấm men được lưu trữ tại -70 độ C đã được cấy vào các 5ml môi trường YPD Sau một đêm môi trường tại 30 độ C và 200 rpm trong một tủ ấm lắc (Vision,Korea), canh trường nuôi cấy đã được chuyển vào 500 ml bình tqm giác với 100ml môi trường YPD Sau 12 h nuôi cấy ở môi trường tại 30 độ C và 200 rpm, các
tế bào được thu hoạch và lơ lửng trong 50 ml nước cất và và tế bào huyền phù được
sử dụng như chất cấy vào cho môi trường nuôi cấy chính Đối với sản xuất xylitol, một giới hạn glucose trong quá trình lên men fed-batch đã được thực hiện theo các báo cáo trước đó với 1 số sửa đổi (Kwon et al.,2006; Oh et al.,2007) 1 3.7 L-scale phản ứng sinh học (Bioengineering AG,Wald,Switzerland) chứa 1L khối lượng lên men của môi trường YPD và 100g / L xylose ban đầu Mật độ quang học ban đầu của canh trường nuôi cấy được đặt vào khoảng 0.5 bằng cách của tế bào huyền phù trước khi nuôi Sau khi sự suy giảm của glucose ban đầu ngày càng tăng, 600g/L dung dịch glucose được cho vào liên tục theo tỉ lệ 1.8 g / h (Kwon et al.,2006) PH trung bình được duy trì ở 5,0 bằng cách thêm 2N NaOH hoặc 2 N HCl thông qua việc nuôi cấy Tốc độ thổi khí
và khuấy trộn đã được cố định lần lượt ở mức 500 rpm và 1vvm
Bảng 2: PCR primers được sử dụng trong nghiên cứu này
Trang 7Các trang công nhận các enzym hạn chế được in nghiêng.
2.4 Các phương pháp phân tích
Khối lượng tế bào khô được ước tính bằng cách đo mật độ quang học ở 600 nm bước sóng với một quang phổ kế (Ultrospec 2000, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) và tính toán bằng cách sử dụng phương trình chuyển đổi sau đây: khối lượng tế bào khô (g/L) = 0.30 x OD600nm Các giá trị nồng độ của glucose, xylose, xylitol, ethanol và acetate được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (Agilent 1100 series LC, USA) trang bị cột phân tích carbohydrate Cột này
đã được gia nhiệt ở 60oC và tốc độ dòng chảy của dung môi acid sulfuric 5mM đổ vào
là 0.6mL Phát hiện được thực hiện bởi một máy dò RI (Aligent 1100 series, USA) Nồng độ protein được xác định bằng bộ kit khảo nghiệm protein (Bio-Rad, Richmond,
CA, USA) và albumin huyết thanh bò (Sigma, USA) được sử dụng làm chuẩn
2.5 Phân tích hoạt tính enzyme
Để chuẩn bị chiết xuất lượng protein thô, các tế bào nấm men được thu hoạch
và vo thành viên lơ lửng trong dung dịch đệm phosphate (pH 8.0) 50mM trong đó có hỗn hợp chất ức chế protein (Roche, Basel, Switzerland) Thể vẩn tế bào đã được pha loãng để điều chỉnh mật độ quang học của nó ở 20 Sau khi phối trộn một lượng thích hợp acid có khả năng rửa sạch các hạt thủy tinh(0.45-0.52mm, Sigma, USA) với các thể vẩn tế bào, ống có chứa thể vẩn được xoáy nước mạnh trong 1 phút và ướp lạnh trong nước đá trong vòng 3 phút Sau bốn lần lặp lại, các mảnh vỡ tế bào và hạt thủy tinh đã được gỡ bỏ bằng cách ly tâm ở 1200 rpm và 4oC trong 2 phút Phần nổi lên trên
bề mặt chứa và phần chiết xuất protein thô đưuọc nhặt ra đem đi bảo quản ở 4oC dành cho việc phân tích hoạt tính enzyme
Khảo nghiệm hoạt động của aldehyde dehydrogenase 6 (ALD 6) theo báo cáo trước
đó với một số sửa đổi (Park và các cộng sự, 2011) Hỗn hợp khảo nghiệm gồm có 50
mM potassium phosphate buffer (pH=8.0), 50 mM acetaldehyte, 0.4 mM dithiothreitol, 5 mM MgCl2, 0.4 mM NADP+ Hoạt tính của nhựa tổng hợp Acetyl-CoA (ACS1) được xác định khi sử dụng bộ kit R-BioPharm acetate (148261) Hỗp hợp phản ứng chứa 2.7 mM ATP, 0.2 mM coenzyme A, 10 mM potassium phosphate, 1.1 mM NAD+, 9.4 mM L-malate, 5.5 đơn vị L-lamate dehydrogenase và 1.4 đơn vị
Trang 8nhựa tổng hợp citrate Sau khi bổ sung vào hỗn hợp phản ứng các chiết xuất thô, đưuọc theo dõi ở bước sóng hấp thụ 340 nm Tất cả các phản ứng được tiến hành ở
30oC Một đơn vị (U) của ALD6 và ACS1 sẽ xác định được lượng enzyme tham gia oxi hóa 1µmol NADPH và giảm bớt 1µmol NAD+, tương tự như thế mỗi phút tương ứng với mỗi điều kiện Hoạt tính enzyme đặc trưng đưuọc tính bằng cách hoạt động của enzyme bằng nồng độ protein tế bào
Fig.2 Glucose limited Fed-Batch fermentation of S cerevisiae BJ3505: XR/pALD6 + p424GPD (a,b) và BJ3505: XR/p426GPD + pALD6 (c,d) in YLD medium with
Trang 9100g/L cxylose at 200 rpm, 1vvm và 30oC The arrow indicates the start point feeding
of 600g/L glucose at 1.8g/h feed rate Symbols are denoted as follows: dry cell mass; glucose; xylitol; xylose; tam giác đen thuận ethanol; tam giác đen ngược acetate
3 Kết quả và bàn luận
Để khẳng định chức năng đã thể hiện của ALD6 và ACS1, các tế bào
S.cerevisiae tái tổ hợp đã được cho phát triển trong môi trường YPD 100 mL đúng
12h và thu protein thô trong mỗi dòng để chuẩn bị cho khảo nghiệm hoạt tính của
protein S.cerevisiae BJ3505:XR/pALD6 + p424GPD cho thấy hoạt tính acetaldehyte
dehydrogenase đặc trưng của 8.0 ± 0.2 mU/mg protein và BJ3505: XR/p426GPD + pACS1 hoạt động nhựa tổng hợp acetyl CoA đặc trưng của 22.7 ± 0.9 mU/mg protein,
đó là 1.2 và cao hơn so với giá trị tương ứng của các chủng kiểm soát 1,3 lần Các hoạt động cải tiến xác nhận các biểu hiện chức năng của cả hai enzyme
Như đã nêu, S cerevisiae BJ3505:δXR không có enzyme đặc hiệu để chuyển
hóa xylitol thành năng lượng và sản xuất cofactor Nhiều nghiên cứu sử dụng xylitol
để nuôi cấy S Cerevisiae có gen tái tổ hợp, lựa chọn phương pháp nuôi bề mặt trong
môi trường có nồng độ xylose cao (Akinterinwa et al., 2008; Lee et al., 2000; Chung
et al., 2 002; Jeun et al , 2003; Kwon et al., 2006; Oh et al., 2007; Bae et al., 2004) Trong đó, quá trình lên men Fed-batch có giới hạn glucose đặc trưng là phương pháp hữu ích để tạo ra năng lượng và sản xuất cofactor, đồng thời ngăn cản tích tụ quá nhiều ethanol có ảnh hưởng tiêu cực để sản xuất xylitol (Lee et al., 2000) và giảm tác dụng
ức chế chuyển hóa xylitol thành glucose (Lee et al., 2002)
Để nghiên cứu ảnh hưởng của ALD6 và ACS1 qua việc sản xuất xylitol, quá trình lên men Fed-batch giới hạn của glucose được thực hiện Trong hình 2 và 3, sau khi bổ sung glucose lần đầu tiên được tiêu thụ hoàn toàn, ở một nồng độ glucose Dung dịch được nuôi liên tục và xylose được chuyển hóa thành xylitol Nồng độ glucose được duy trì ở một mức độ cơ bản Các sản phẩm phụ như ethanol và acetate tích lũy trong nước dùng nuôi cấy Kết quả sản xuất xylitol thu được trong quá trình lên men Fed-batch giới hạn của glucose được tổng hợp trong Bảng 3 Lượng xylitol dựa trên xylose tiêu thụ ước tính hơn 0,92 (g / g) trong tất cả các quá trình lên men Trong trường hợp NADPH phụ thuộc vào ALD6 vượt mức (Hình 2c và d), trên 90% xylose ban đầu thêm vào được chuyển hóa thành xylitol, trong đó nồng độ cuối cùng là 13% cao hơn so với control strain Để cải thiện trong sản xuất xylitol cần bổ sung nhiều NADPH hơn để phản ứng chuyển hóa xylose
Trang 10Hình 3 Giới hạn của glucose trong quá trình lên men fed-batch S cerevisiae
BJ3505:δXR/pACS1+p426GPD (a,b) và BJ3505:δXR/pACS1+pALD6 (c,d) trong môi trường 100 g /L xylose tại 200 rpm, 1 VVM YPD và 30oC Mũi tên chỉ điểm bắt đầu
bổ sung 600 g /L glucose, tốc độ bổ sung 1,8 g/h Kí hiệu được biểu thị như sau: , khối lượng tế bào khô, , đường; , xylose; xylitol; , ethanol; acetate
Bảng 3: Kết quả tóm tắt của nuôi mẻ lên men chủng S cerevisiae BJ3505: δXR