PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM IN VIVO và IN VITRO và HOẠT TÍNH SINH học của các hợp CHẤT tự NHIÊN từ THỰC vật

Theo đánh giá của tổchức y tế thế giới WHO, 80% dân số trên toàn thế giới vẫn tin dùng các loài thảo dượccho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn 60% các tác nhân hóa trị liệu có

Hiện nay một trong những hướng chính để phòng ngừa và chữa trị bệnh tật lànghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên Theo đánh giá của tổchức y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giới vẫn tin dùng các loài thảo dượccho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn 60% các tác nhân hóa trị liệu cónguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên.

Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học không nhữnggiúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn có thể phân lập đượccác hợp chất để tiến hành tổng hợp hay bán tổng hợp ra các hoạt chất mới có hoạt tínhcao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị

Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí của dân tộc đặt ra lúc này vừa là vậnhội và cũng là thử thách đối với những nhà khoa học nói chung và cho những nhà nghiêncứu trong lĩnh vực công nghiệp dược nói riêng Bằng nhiều phương pháp thử nghiệmkhác nhau, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được ứng dụng của các hợp chất tự nhiênnhư: ankaloid, flavonoid, saponin, glycozid, steroid, tinh dầu trong các lĩnh vực y học,

dược học và thực phẩm chức năng Bởi vậy chúng tôi đã tiến hành: Khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và các phương pháp thử nghiệm invitro và invivo.

Phần 1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật

1 Khái niệm và phân loại các hợp chất tự nhiên

Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các quá trình trao đổi chất trong

cơ thể sống Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên

nhiên được gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên

Dựa vào chức năng sinh học người ta chia các hợp chất chứa trong cây thành hainhóm lớn:

Chất trao đổi bậc một : Là các chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của cây nhưcác hydrat cacbon, lipit và các axit amin, chúng là thành phần không thể thiếu trong câycỏ

Chất trao đổi bậc hai: Là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng không phải là

để nuôi sống và phát triển cây Chúng có thể có ở cây này nhưng vắng mặt ở cây kia Cácchất trao đổi bậc hai thường là đối tượng nghiên cứu quan trọng do các tác dụng sinh lí vàdược lí của chúng, như tác dụng kháng sinh, tác dụng diệt nấm, tác dụng ức chế hoặckích thích sinh trưởng và tác dụng dược lí, sinh lí khác Ngoài ra còn một số thành phần

2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất chính

2.1 PHENOL - AXÍT PHENOL VÀ DẪN XUẤT

* Đặc điểm và phân bô:

Phenol là nhóm các hợp chất hữu cơ trong phân tử có nhóm OH liên kết trực tiếpvới nhân thơm

Các hợp chất phenol nói chung dễ tan trong nước vì trong thiên nhiên chúngthường tồn tại ở dạng glycozit

Trong hàng ngàn hợp chất phenol trong thiên nhiên đã biết rõ cấu tạo thì hợp chấtflavonoit là nhóm hợp chất quan trọng nhất Ngoài hợp chất phenol đơn chức một vòng,các phenylpropanoit và quinon cũng chiếm một tỉ lệ đáng kể

Về các poliphenol trong cây có lignin, melanin, tanin

Các phenol và axit phenol thường được nghiên cứu chung vì chúng thường songsong tồn tại với nhau ở trong cây

Một số phenol có trong cây là: hydroquinon (1,4-dihidroxibenzen), rezocxinol(1,3-dihidroxibenzen), ocxinol (1,3-dihidroxi-5-metylbenzen), phlorogluxinol (1,3,5-trihidroxibenzen),catechol (1,2-dihidroxibenzen),pyrogalol (1,2,3-trihidroxibenzen),

Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic,axit protocatechic (axit dihidroxibenzoic), axit vanilic (axit 4-hidroxi-3-metoxi benzoic), axit syringic (axit 4-hidroxi-2,3-dimetoxi benzoic),…

3,4-Các axit phenol tồn tại ở dạng kết hợp với lignin tạo thành este hoặc với các oza

dưới dạng glycozit Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic, axit

pyrocatechic, axit vanilic, axit syringic, các axit ít gặp là axit salixylic, axit protocatechic (axit 2,3-dihydroxibenzoic),

o-Ngược với axit phenolic, các phenol tự do rất hiếm thấy trong cây Hydroquinon làchất thường gặp hơn cả, tiếp đến là catechol, ocxinol, phlorogluxinol, pyrogalol

Hợp chất phổ biến nhất là các axit hydroxyxinamic

R= H: axit p-cumaric R= H :axit ferulic

R= OH: axit cafeic R= OCH3: axit sinapic

Các axit hidroxixynamic tồn tại trong cây chủ yếu ở dạng este, dễ bị thủy phânbằng kiềm cho axit tự do

Axit cafeic thường tồn tại ở dạng este với axit quinic, gọi là axit clorogenic

Coumarin là nhóm hợp chất thiên nhiên được xem là dẫn xuất lacton của axit hydroxixynamic (I) Hầu hết các coumarin đã biết hiện nay (khoảng 600 chất) tồn tại chủyếu dưới dạng tự do, một số ít tồn tại ở dạng glycozit như các glycozit của psonolen (II).Coumarin phổ biến nhất trong cây là chất umbeliferin (III)

orto-Về phân bố: Coumarin có trong nhiều họ thực vật: Leguminosen, Umbeliferae,Ochidaceae, Rutaceae Chúng có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá, hoa, quả

Đặc tính vật lý: Coumarin là chất phát quang mạnh và rất nhạy với ánh sáng.Người ta lợi dụng tính chất này để tách các hợp chất coumarin

* Về tác dụng dược lý

Coumarin và dicoumarin dùng làm thuốc chống đông máu Tính chất này có liênquan đến nhóm OH ở vị trí C4 trong cấu trúc Tính chất chống đông máu biến mất hoặcgiảm khi nhóm OH ở vị trí này bị biến mất hoặc bị thay thế bởi nhóm khác

Ngoài ra một số coumarin có tác dụng làm giản động mạch vành và mạch ngoại

Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệtnấm và chống viêm.

Coumarin được dùng để làm thuốc chống đông máu Ngoài ra một số coumarin cótác dụng làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi Đồng thời có tác dụng chống cothắt Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệtnấm, chống viêm

Đã có thông báo về kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tố tế bào (in vitro) với

hai dòng ung thư gan người (Hep-2) và phổi (LU) với xeton đi từ

3-axetyl-4-hiđroxi-N-phenylquinolin-2-on với p-nitrobenzanđehit Kết quả cho thấy hợp chất này cho kết quả

dương tính với cả hai dòng ung thư Nghiên cứu hoạt tính kháng u của hợp chất này trênchuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcomal 80 cho thấy với liều lượng 4mg/kg và8mg/kg đều đạt hiệu lượng kháng u (++) theo thang đánh giá tiêu chuẩn hoạt tính củaH.Itokawa (1989) Xeton này với liều lượng 4mg/kg có tỉ số ức chế u (IR%) lên tới68.85%

2.2 FLAVONOIT

* Đặc điểm và phân bô

Flavonoit là những chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản như sau:

Tại các vòng có liên kết với một hay một vài nhóm hydroxyl tự do hay đã thay thếmột phần Vì vậy về bản chất chúng là những poliphenol có tính axit

Dựa vào sự oxy hóa của vòng pyran trung tâm, người ta phân flavonoit thành cácloại khác nhau

Phân bố: Nó là loại hợp chất phân bố rộng nhất ở trong thiên nhiên ( lớn hơn 2000chất) Nói chung nó không có mặt trong tảo và nấm Các loại thực vật bậc cao đều có mặtflavonoit, và nó có mặt liên kết các bộ phận của cây : thân, lá, rễ, gỗ… và khu trú ở thành

tế bào Flavonoit tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây (đặc biệt là hoa) đó là mộttrong những chức năng cơ bản của flavonoit đối với cây

O1 2

3 4 5

6 7

4' 5' 6'

O

* Hoạt tính sinh học của flavonoit

-Tác dụng chống oxi hóa

Các hợp chất phenol cũng như các flavonoid trong những điều kiện nhất định dễtạo ra các gốc tự do ArO (aryl bền vững) có khả năng thay thế các gốc tự do kém bềntrong phản ứng peroxy hóa lipit màng tế bào và dây chuyền sẽ bị cắt đứt Vì thế có thểgọi các gốc ArO là các tác nhân thu dọn và hủy diệt các gốc tự do có hại

Mặt khác, các flavonoid có thể ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do bằng cáchkết hợp với các ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là các tác nhân xúc tác nhiều quá trìnhsinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do

- Tác dụng của flavonoid đối với các enzym sinh học

Hạn chế biến chứng của bênh tiểu đường: trong cơ thể người bình thường,aldoreductaza khử glucoza thành dulcitol (D – galactitol) Flavonoid có thể kìm hãm hoạttính của enzym này

Các bệnh dị ứng, hen phế quản: flavonoid có khả năng kìm hãm hoạt tính củaenzym proton ATP.aza trong màng tế bào mastocyl làm cho các tác nhân histamin vàserotonin chứa trong tế bào không bị thoát ra ngoài

Các siêu vi trùng (virus) chỉ có thể gây bệnh khi lớp vỏ protein bị tiêu hủy bởi cáclysoxom với sự tham gia của enzym proton ATP.aza và có thể của cả phospholipaza A2.Các enzym này đều bị flavonoid kìm hãm

Flavonoid vô hoạt các enzym kinaza do vậy các tế bào ác tính gây ra bởi virus cóthể trở lại thành các tế bào bình thường (nghiên cứu in vitro)

Đã có nhiều thử nghiệm dùng flavonoid trong lâm sàng có kết quả tốt trong điềutrị ung thư vòm họng do thuốc lá,

- Tác dụng chống viêm

Hiện tượng viêm tấy, sưng, đau có liên quan đến sự giải phóng các prostaglandin,thu hút các bạch cầu đến nơi tổn thương, gây cảm giác đau và sau khi di chuyển từ máuđến não làm mất sự cân bằng của trung tâm điều tiết thân nhiệt và gây sốt Do cácflavonoid có khả năng kìm hãm hoạt tính của các enzym protaglandin (cyclooxygenaza

và lipoxyzenaza) Cơ chế này cũng giải thích tác dụng chống co thắt cơ trơn, hiện tượngcứng cơ bắp, đau đầu.

Điều trị bệnh thấp khớp: sử dụng flavonoid trong điều trị thấp khớp thì các tổ chứcliên kết không bị phá hủy mà còn được củng cố thêm Cơ chế có thể là do sự kết hợp giữaviệc ngăn chặn sinh tổng hợp prostaglandin với việc kích thích phản ứng hydroxyl hóapolin nghĩa là tạo ra những liên kết chéo trong collagen

Tác dụng gây tê tại chỗ của flavonoid đã được sử dụng trong các trường hợp bịcôn trùng đốt hoặc cắn, và đôi khi còn có hiệu lực hơn cả cocain Có nhiều loại nọc độc

có chứa phospholipaza A2 có khả năng giải phóng axit arachidonic, chất này lại chuyểntiếp thành prostaglandin

Đối với các màng tế bào, flavonoid tự nhiên có khả năng làm thay đổi tính thẩmthấu Tác dụng này có thể chính là cơ sở làm cho nhiều loại flavonoid có tính sát khuẩn

và diệt nấm

- Khả năng peroxy hóa lipit màng tế bào của flavonoid

Sự peroxy hóa các lipit sinh vật đều thông qua cơ chế của quá trình gốc tự do.Những gốc tự do sinh ra từ các quá trình chuyển hóa trong cơ thể không bền và rất dễphản ứng Trong khi đó, những gốc tự do tạo ra từ những chất flavonoid tự nhiên ArO lạirất bền vững, khó phản ứng Trong quá trình peroxy hóa lipit màng, những gốc này sẽloại bỏ và thay thế các gốc kém bền dẫn đến sự cắt đứt quá trình Đó chính là cơ chế giảithích sự chống peroxy hóa lipit của flavonoid dẫn tới làm chậm lại quá trình lão hóa củacon người

2.3 TINH DẦU

* Đặc điểm và phân bô

 Tinh dầu (còn có tên khác là chất thơm, hương thơm, tinh du…) là hỗn hợpcủa nhiều chất bay hơi, có mùi đặc biệt có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật,thu được bằng cách chưng cất hoặc chiết bằng dung môi hữu cơ

 Nó ít tan trong nước, dễ tan trong ete, dầu béo, dễ bay hơi,

 Về phân bố: Cây chứa tinh dầu phân bố khá rộng trong nhiều họ thực vật.Trong cây, tinh dầu có thể khu trú tại lá, hoa, quả, rễ,vỏ, thân gỗ…

 Thành phần tinh dầu của mỗi bộ phận của cây có thể giống hoặc khácnhau:

• Nó là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau: các hydrocacbon béo hoặcthơm, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehit, xeton, este , ete…

• Nhưng chung qui lại chúng có hai nhóm chính là tecpenoit và các dẫn xuấtcủa phenol Nhóm tecpenoit chủ yếu là monotecpen và sesquitecpen

• Loại một vòng

• Loại 2 vòng

• Sesquitecpen luôn có mặt cùng với monotecpen trong tinh dầu

• Sesquitepen trong tinh dầu có nhiệt độ sôi trên 200oC, do đó khi chưng cấtthì chúng có hàm lượng không cao

• Một số sesquitecpen thường gặp

* Hoạt tính sinh học

• Một số tinh dầu được dùng làm thuốc do tinh dầu có tác dụng trên đườngtiêu hóa: kích thích tiêu hóa, lợi mật, thông mật

• Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinhdầu bạc hà, bạch đàn, tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa Barosmabetulina

• Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinhdầu giàu anethol: đại hồi

OH

OH

O OH

• Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng: trị giun như: tinh dầu giun, santonin,trị sán như: thymol., diệt ký sinh trùng sốt rét như: artemisinin.

• Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ, khi sử dụng ngoài da

• Một số dược liệu vừa sử dụng dạng tinh dầu vừa sử dụng dạng dược liệunhư: quế, hồi, đinh hương, tiếu hồi, bạc hà, hạt mùi, bạch đàn để dùng làm thuốc,nhưng cũng có những dược liệu chỉ sử dụng tinh dầu: long não, tinh dầu giun Nhưngcũng có nhiều dược liệu chứa tinh dầu chỉ sử dụng làm thuốc mà ko sử dụng tinh dầunhư: đương qui, bạch truật, thương truật, phòng phong

• Một số tinh dầu được dùng làm thơm bánh kẹo, các loại mứt, đồ đóng hộp:vanilin, menthol

• Một số dùng để pha chế rượu mùi: tinh dầu hồi, tinh dầu đinh hương

• Một số được dùng trong pha chế đồ uống, sản xuất chè, thuốc lá: tinh dầu

vỏ cam, chanh, nhài, bạc hà

• Tinh dầu được ứng dụng lớn trong ngành kỹ nghệ pha chế nước hoa, xàphòng, mỹ phẩm

2.4 STEROIT

* Đặc điểm và phân bô

Steroit là những hợp chất dẫn xuất của xiclopentenophenantren.Chúng gồm nhiềuhợp chất thiên nhiên trong đó có sterol, axit mật, hocmon giới tính, vitamin D

Nhiều steroit có nhiều tính chất quan trọng được dùng trong điều trị bệnh (điềuhòa hệ thống nội tiết, chữa viêm khớp…) Hiện nay steroit còn dùng điều chế thuốc tránhthai Nhiều ứng dụng của steroit trong chăn nuôi và nông nghiệp

Sterol phân bố rộng, nó thường có mặt cùng với ankaloit hoặc saponin steroit.Chúng có mặt trong tất cả các bộ phận của cây, nhưng chủ yếu là các hạt có dầu ở dạng

tự do hoặc este, một số ở dạng glycozit

* Hoạt tính sinh học

Ergosterol được tìm ra năm 1889 trong cựu lõa mạch, lại được tìm thấy ở men bia

và nhiều mốc – chất này có công thức thô C28H46O có 2 dãy nối đôi trong vòng B Bằngcách chiếu tia tử ngoại, nó biến thành canxiferol hoặc vitamin D2 có tác dụng trị còixương

Stigmasterol là nguồn nguyên liệu để tổng hợp hoocmon và chúng ta đã nói đếnviệc sử dụng với khối lượng lớn Vài genin của saponozit có nhân sterol (hecogenin,diosgenin) được dùng để bán tổng hợp các hoocmon sinh dục và vỏ thượng thận

Ngày nay, người ta dùng sitosterol của ngũ cốc là chất phòng xơ cứng động mạch,làm chất mềm thành mạch, một mặt nó phòng sự hấp thụ cholesterol ở ruột bằng cách tạo

ra một phức chất không tan, mặt khác nó có tác dụng trị xơ mỡ động mạch

2.5 SAPONIN

* Đặc điểm và phân bô

Saponin là thuật ngữ để chỉ một nhóm glucozit có đặc điểm chung là khi hoà tantrong nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt

Dưới tác dụng của enzym thực vật hay vi khuẩn, axit loãng saponin bị thuỷ phântạo thành genin (gọi là sapogenin) và phần đường

Phần đường có thể gồm một hay một số phân tử monosaccarit:phổ biến nhất là Glucoza, D-Galactoza, L-Arabioza, L-Rammoza

D-Dựa vào cấu trúc của sapogenin người ta chia thành 2 nhóm lớn

• Tác dụng bồi bổ, tăng cường sinh lực (nhân sâm)

• Tác dụng long đờm, dịu ho (cam thảo, cam thảo đất…)

• Giảm đau khớp xương (ngưu tất, cỏ xước)

• Hạ cholesterol trong máu (ngưu tất, cỏ xước)

• Riêng nhóm saponin steroit là nguồn nguyên liệu quan trọng bán tổng hợpcác thuốc cocticoit và thuốc hạn chế sinh đẻ

• Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Saponin là hoạt chất chính trongcác dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiênmôn, mạch môn,

• Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm

• Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể).Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid.Digitonin dùng để định lượng cholesterol

• Saponin trong đậu nành giống như phytate, hành xử như chất anti-oxidants

để bảo vệ tế bào cơ thể chúng ta khỏi bị hư hại do tác dụng các gốc tự do Nó cũngcòn có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng và đồng thời làmgiảm lượng cholesterol trong máu

• Saponin trong nhân sâm làm tăng chuyển hóa lipid, Theo các thí nghiệm,nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol cao ở thỏ, vì vậy mà ngăn ngừađược sự hình thành xơ vữa động mạch

2.6 GLYCOZIT TIM VÀ GLYCOZIT XIANOGEN

* Đặc điểm và phân bô

• Glycozit tim là nhóm glycozit có cấu trúc steroit, có tác dụng đặc hiệu đốivới tim Nhưng ở liều cao chúng trở nên gây độc, dẫn đến chết người

• Trong cây glycozit tim tồn tại ở dạng glycozit hòa tan trong dung dịch tếbào Dưới tác dụng của men hoặc axit loãng, các glycozit bị thủy phân tạo thànhgenin và các đường Là glycozit nên chúng dễ tan trong nước và cồn loãng, rất ít tantrong các dung môi không phân cực hoặc phân cực yếu như ete, ete dầu hỏa,benzen Trong dung dịch nước các glycozit tim làm giảm sức căng bề mặt của dungdịch và tạo bọt khi lắc mạnh

• Glycozit tim tồn tại trong khoảng 10 họ thực vật, đặc biệt là họ

Apocynaceae và họ Asclepiadaceae

* Tác dụng dược lý

Tác dụng của glycosid tim làm tăng sức co bóp của cơ tim cả ở người lành lẫnngười bệnh; làm tăng trương lực cơ tim: làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng,giãn do vậy làm tăng trương lực cơ tim, giảm thể tích và kích thước tim; làm chậm nhịptim: do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nútxoang; làm giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất; làm giảm tính kích thích của

cơ tâm nhĩ, nhưng trái lại, làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất; gây lợi tiểu nhẹ dogiảm tái hấp thu natri ở ống lượn gần

2.7 ALCALOIT

* Đặc điểm và phân bô

• Ankaloit là những hợp chất có chứa dị vòng nitơ,có tính bazơ, thường gặptrong nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật Ngoài hợpchất dị vòng, người ta còn thấy một số ít ankaloit có nguyên tử nitơ nằm ở ngoàivòng (như colchixin, hordenin…)

• Ankaloit có tính chất hoạt động sinh lý cao đối với cơ thể người và độngvật, nhất là đối với hệ thần kinh.Với một lượng nhỏ có thể là loại thuốc đặc hiệu,nhưng lượng tương đối lớn nó là chất độc gây chết người

N

• Có rất nhiều họ, loài thực vật chứa ankaloit trong đó đại đa số là cây 2 lámầm Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được coi là có ankaloit phải chứa ítnhất 0,05 % ankaloit so với nguyên liệu khô.

• Điều đáng lưu ý: Cây có chứa ankaloit đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại

Có ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm này đối với cỏ cây là như nhau

* Hoạt tính sinh học

• Tác dụng lên hệ thần kinh mạnh, có thể dùng lượng nhỏ chữa bệnh, nhưngdùng nhiều gây chết, gây nghiện…

• Các alcaloid như cocain, morphin là những chất ma túy nguy hiểm

• Ephedrin và các dẫn xuất của chúng là các chất thuộc nhóm doping

• Các alcaloid chủ yếu được dùng làm thuốc như:

- Các thuốc ức chế thần kinh trung ương như: morphin, scopolamin, tetrahydropalmatin

I Các thuốc kích thích thần kinh trung ương như: strychnin, caphein

- Các thuốc điều trị bệnh tim như: quinidin, ajmalin

- Các thuốc chống co thắt như: papaverin

- Các thuốc hạ huyết áp như: reserpin, vincamin

- Các thuốc trị hen suyễn như: atropin, theophylin, ephedrin

- Các thuốc chống sốt rét như: quinin

- Chống lỵ amip như: emetin

- Các thuốc chống ung thư như: vinblastin, vincristin, colchamin, elliptixin

- Các thuốc có tác dụng kháng sinh, chống viêm như: berberin

- Các thuốc bổ dương như: yohimbin

- Các thuốc trị ho như: codein trong cây thuôc phiện

Các alcaloid của thuốc lá, thuốc lào, của củ bách bộ và của lá na, hạt na cònđược sử dụng làm thuốc trừ sâu, bảo vệ mùa màng

Các alcaloid khác nhau có các hoạt tính sinh học khác nhau Cho đến nay, cókhoảng vài chục alcaloid được sử dụng rộng rãi trong y học và trong nông nghiệp

2.8 CAROTENOIT

* Đặc điểm và phân bô

• Carotenoit là những chất màu vàng,da cam, đỏ có nhiều trong nhiều loạiđộng thực vật

• Người ta còn gọi nó là chất màu lipocromic ( màu trong chất lipit) vì chúngtan trong dầu béo

• Trong cơ thể động vật, carotenoit được hòa tan trong mỡ hoặc hóa hợp vớiprotein ở pha nước

• Chúng là những chất màu chính trong một số hoa màu vàng, da cam, đỏcủa nhiều loại vi sinh vật

• Phổ biến là caroten có nhiều trong cà rốt

* Hoạt tính sinh học

Lutein có khả năng phản ứng với các gốc tự do, bảo vệ tế bào khỏi bị ôxi hoá,chống ung thư da, lão hoá da, lão hoá thuỷ tinh thể, làm giảm hiện tượng xơ vữa độngmạch

Lycopen có khả năng bảo vệ tế bào khỏi sự ôxi hoá, lycopen còn góp phần vàoquá trình hấp thụ ánh sáng khi quang hợp Một số nghiên cứu gần đây được xác định rằnglycopen có khả năng làm chậm quá trình phát triển của ung thư tuyến tiền liệt, ruột kết vàthực quản Lycopen phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên, thường gặp trong cà chua, ổi,dưa đỏ, đu đủ, nho…

Theo một nghiên cứu của Đại học Havard, Mỹ, những loại rau quả giàu chấtcarotenoit giúp giảm hiệu quả nguy cơ ung thư phổi Loại carotenoit quen thuộc nhấtchính là bêta caroten, chất này khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành vitamin A

Ngoài bêta caroten, còn có rất nhiều loại khác (khoảng 600) như anphacaroten, lutein, hay licopen, tất cả những chất này có vai trò quan trọng trong phòngbệnh ung thư

α -caroten

β -caroten

-caroten γ

Các chất dạng carotenoit có ảnh hưởng lớn tới các chứng bệnh như ung thư,bệnh tim mạch hay tiểu đường Các chất này chống lại quá trình ôxi hóa của các tếbào tự do, đây chính là các tế bào có vị trí quyết định đối với quá trình suy yếu hayphát triển các bệnh.

Carotenoid là chất chống oxy hóa tự nhiên có khả năng bắt giữ oxy đơn phân

Lycopene cũng là một carotenoid có tác dụng phòng chống nhiều căn bệnhung thư, đặc biệt đối với ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư dạ dày

Lycopene có khả năng ngăn chặn sự phát triển u ngực, có tác dụng ức chế sựtăng sinh tế bào ung thư màng trong dạ con

Ngoài ra, lycopene do tính chất bảo vệ quang hóa , nên có tác dụng bảo vệ,phòng chống ung thư da

β-carotene là tiền chất của vitamin A nên có tác dụng tăng cường thị lực,chống bệnh quáng gà, khô mắt Bảo vệ các protein của mắt khỏi sự oxy hóa

Carotenoid giảm nguy cơ mắc bệnh thoái hóa điểm đen do tuổi già, giảm nguy

cơ mắc bệnh đục thủy tinh thể

Carotenoid có tác dụng kích thích sự hình thành sắc tố melanin và chống lạicác gốc tự do, chúng kích thích miễn dịch và góp phần vào sự đổi mới tế bào

Carotenoid giúp tạo lập tế bào lympho làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể,

do đó hạn chế các bệnh nhiễm trùng, trong đó có nhiễm trùng da

Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng giảm viêm sưng của nhóm chấtcarotenoid Chủ yếu là hoạt tính của zeaxanthin và β-cryptoxanthin.

Phần 2 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học tại Việt Nam

và trên thế giới

A Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro

Mục đích của việc thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn in vitro là xác định thuốcnghiên cứu có tác dụng trên vi khuẩn nào và mức độ tác dụng in vitro như thế nào Có

nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro, cũng như có nhiều yếu tốảnh hưởng góp phần vào sự nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc nghiên cứu Nếu các yếu tốnày thay đổi sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả nghiên cứu Những yếu tố ảnh hưởngquan trọng nhất có thể kể đến là điều kiện vô trùng, tính tan của chất thử, môi trườngnuôi cấy, pH của môi trường, nhiệt độ, thời gian nghiên cứu, cách cấy chúng và kĩ thuậtnghiên cứu.

1 Những yếu tố ảnh hưởng

1.1 Điều kiện vô trùng

Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn phải tiến hành trong điều kiện vô trùng, tránhđưa vi khuẩn khác vào làm nhiễu kết quả nghiên cứu Tất cả các dụng cụ dùng trongphòng thí nghiệm, môi trường nuôi cấy, không khí làm việc đều phải tiệt trùng Mặt khác,trong các môi trường làm việc không được có chất kháng khuẩn nào có thể gây ra dươngtính giả, ngộ nhận là do thuốc nghiên cứu, mà thực ra do chất kháng sinh lẫn vào

1.2 Tính tan của chất thử

Chất thử phải tan thì kết quả mới chính xác Khi thí nghiệm, hòa chất thử vàotrong nước Nếu chất thử tan hoàn toàn trong nước là tốt nhất Nếu chất thử không tantrong nước thì phải hòa tan trong một dụng môi đặc biệt như dimethylformamid (DMF),dimethylsulfoxid (DMSO) hoặc polyethylenglycol (PEG) Sau đó, dùng nước pha loãng

ra Lúc này, nồng độ chất thử thấp nên có thể tan được Nếu chất thử không tan, kết quảnghiên cứu sẽ sai

1.3 Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu thử có thể là dược liệu khô, cao đã chiết từ dược liệu, hợp chất tinh khiết dotổng hợp, hoặc chiết từ dược liệu và kháng sinh chuẩn để tham chiếu

* Mẫu là dược liệu

Có thể chiết bằng cách sắc với nước, chiết bằng cồn hoặc một dung môi nào khácnhưng sau đó phải chuyển sang dạng cao lỏng trong nước theo tỉ lệ 1:1 (1 g dược liệuđược 1 ml cao lỏng)

* Mẫu là cao thô chiết từ dược liệu

Cân chính xác 200 mg cao hòa tan vào 2 ml nước Nếu dung dịch tan hoàn toàn,dung dịch này làm gốc (100 mg/ml) Nếu dung dịch có lẫn tạp chất thì ly tâm lấy dịchtrong làm dung dịch gốc (100 mg/ml) Nếu cao không tan trong nước thì thay nước bằngcác dung môi khác như DMSO, DMF hoặc PEG theo đúng cách làm như với nước, tađược dịch thử 100 mg/ml.

Khi thử, tùy theo hoạt tính mạnh hay yếu, ta hòa loãng với nước để được dịch thử

có nồng độ thấp hơn: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 mg/ml Kết quả về nồng độ ở đây nên tínhtheo mg cao trong 1 ml dung dịch

* Mẫu là hợp chất tinh khiết

(Chất tổng hợp hoặc chiết từ dược liệu Nếu là chất chiết từ dược liệu, cần biếthàm lượng hợp chất trong dược liệu là bao nhiêu %)

Cân chính xác 20 mg, hòa vào 2 ml nước cất Nếu hợp chất tan hoàn toàn dùngdung dịch này làm gốc (10 mg/ ml) Nếu hợp chất không tan hoặc khó tan trong nước,thay nước cất bằng DMSO, DMF hoặc PEG để hòa tan ta cũng được dung dịch gốc 10mg/ml

Khi thử, từ dung dịch gốc 10 mg/ml, pha thành dung dịch thử loãng gấp 10 lần,tức là 1 mg/ml Nếu hoạt tính mạnh quá, ta có thể pha loãng 2 lần liên tiếp với nước đểđược dịch thử có nồng độ thấp hơn như 500; 250; 125; 62,5…µg/ml

* Mẫu là thuốc kháng sinh để tham chiếu

Cân chính xác 100 mg thuốc kháng sinh cần thử, hòa tan vào 10 ml nước cất, hoặcnếu thuốc không tan trong nước thì hòa với DMSO, DMF hoặc PEG, ta sẽ được nồng độdung dịch mẹ 10 mg/ml Dung dịch mẹ này nếu để trong tủ lạnh thì hoạt tính khángkhuẩn vẫn không giảm sau khi bảo quản được nhiều tuần

1.4 Môi trường

Có nhiều loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Việc lựa chọn môi trường phụ thuộcvào loại vi khuẩn và bản chất của chất thử Có những trường hợp đòi hỏi những môitrường rất phức tạp Dưới đây là một số môi trường thường dùng cho đa số các vi khuẩnthử

* Môi trường thạch nền

Khi nghiên cứu dùng môi trường đặc (môi trường thạch) để tiết kiệm môi trườngchứa vi khuẩn, người ta trải trên tấm kính một lớp thạch nền sau đó mới trải một lớpthạch có vi khuẩn thử.

 pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 ± 0,2

* Môi trường lỏng dinh dưỡng cho vi khuẩn

Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, đa số các vi khuẩn thích hợp với môi trườngsau đây:

 Cao thịt bò: 10 g

 Pepton: 10 g

 NaCl: 5 g

 Nước cất vừa đủ: 1000 mlHòa tan bằng nhiệt Điều chỉnh pH 8,0 – 8,4 bằng NaOH 5M hoặc NaOH 1N vàđun sôi trong 10 phút Lọc Điều chỉnh đến pH 7,2 – 7,4 bằng NaOH 5M hoặc HCl 5M(hoặc HCl 1N) Tiệt trùng ở 115 °C trong 30 phút

Nếu không có cao thịt bò, dùng thịt bò 500 g, ninh lên, lấy nước cốt, được khoảnggần 1000 ml Thêm pepton 10 g, NaCl 5 g Khuấy cho tan đều, thêm nước cất vừa đủ

1000 ml, rồi tiến hành như trường hợp cao thịt bò

* Môi trường thạch dinh dưỡng cho vi khuẩn

Dùng môi trường lỏng dinh dưỡng, thêm thạch 1,2 – 2 % Đun đến tan đều.Trường hợp dùng thịt bò thì thạch phải dùng nhiều hơn, thường 1,5 – 2,5 % Có những vikhuẩn không phát triển trên môi trường thạch dinh dưỡng như một số loạiPneumonococcus, Streptococcus,…phải dùng môi trường thạch dinh dưỡng thạch đặcbiệt như thạch máu, huyết thanh, thạch canh thang glucose,…

1.5 Chuẩn bị chủng vi khuẩn

Từ chủng gốc, cấy trên mặt thạch dinh dưỡng Sau 24 giờ, tách các khuẩn lạc pháttriển trên mặt thạch, nghiền trong nước muối sinh lý cho đồng nhất rồi cho vào một ốngnghiệm để đo độ đục Thêm nước muối sinh lý để được hỗn dịch vi khuẩn có tỉ lệ số tếbào thích hợp, còn gọi là CFU (Colony Forming Unit: đơn vị tạo khuẩn lạc) trong 1 ml.Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml bằng cách đo độ đục do với một ống mẫu.Hỗn dịch vi khuẩn đã được chuẩn hóa số lượng vi khuẩn trong 1 ml (số cfu/ml) gọi làcanh khuẩn gốc.

Các vi khuẩn thử tùy theo yêu cầu của chất thử và điều kiện thử Nếu có điều kiệnnên thử 10 loại vi khuẩn, trong đó có 5 loại vi khuẩn Gram dương và 5 loại vi khuẩnGram âm

1.6 Nhiệt độ ủ và thời gian ủ

Đảm bảo nhiệt độ ủ đúng theo yêu cầu của từng vi khuẩn Trong đa số các trườnghợp đối với vi khuẩn, thường ủ ở nhiệt độ 37 ± 1°C Thời gian ủ cũng tùy loại vi khuẩnnhưng thông thường là 24 giờ

1.7 Các phương pháp thử in vitro

Có rất nhiều phương pháp thử kháng khuẩn in vitro, sau đây là một số phươngpháp chính:

 Kĩ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi khuẩn

 Kĩ thuật dùng môi trường đặc

 Kĩ thuật dùng môi trường lỏng

 Kĩ thuật sinh tự kí

2 Kĩ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi khuẩn

Giả thiết ta phải thử tác dụng kháng khuẩn của dược liệu A trên 10 loại vi khuẩn

Nếu tiến hành thử định lượng tác dụng của A trên tất cả 10 vi khuẩn trên sẽ mấtnhiều thời gian mà có khi cũng không thu được kết quả mong muốn Để giảm thiểu khốilượng công việc mà vẫn thu được kết quả, trước hết thử định tính tác dụng của A trên tất

 Nếu thử định tính mà thấy A có tác dụng trên nhiều trong số 10 loại

vi khuẩn thử thì có thể phân tích, đánh giá xem A có chiều hướng tác dụngtrên vi khuẩn Gram dương hay vi khuẩn Gram âm nhiều hơn, cũng nhưchiều hướng sử dụng A để làm thuốc tác dụng trên loại vi khuẩn gây bệnh

gì để đi sâu vào nghiên cứu có tính chất định lượng một số loại vi khuẩnnhất định

- Chuẩn bị mẫu thử đến khi được cao lỏng 1:1

- Chuẩn bị các ống canh khuẩn gốc của 10 loại vi khuẩn định thử

- Chuẩn bị môi trường thạch nền

- Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng

- Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng có thuốc: Lấy 100 ml môi trường thạchdinh dưỡng, thêm 1 ml dịch cao lỏng thuốc 1:1 Đun nóng chảy, khuấy cho thật đều, dùngống hút, hút môi trường đã có thuốc, láng đều trên mặt thạch nền của các đĩa petri, tạothành một lớp thạch có thuốc, dàn đều trên lớp thạch nệ dày 1 – 1,5 mm Nếu không cóthạch nền có thể dùng toàn bộ thạch có thuốc cho vào đĩa petri để có độ dày khoàn 2,5mm.

2.3 Tiến hành

Dùng các hộp petri có đường kính 90 mm hoặc 100 mm, 160 mm (cũng có thểthay bằng khay kính) Phía dưới là một lớp môi trường thạch nền dày khoảng 1,5 mm.Với loại hộp petri đường kính 90 mm, thể tích thạch nền cần 8 – 10 ml Đun chảy thạchnền Dùng ống hút, hút thạch nền, rồi lắng đều trên đĩa petri đã được đặt trên một mặtphẳng ngang Để ở nhiệt độ phòng 15 – 20 phút cho thạch nền trong đĩa petri đặc lại.Dùng ống hút, hút môi trường thạch dinh dưỡng có thuốc đang nóng chảy láng đều lêntrên mặt lớp thạch nền, tạo thành một lớp dày 1 – 1,5 mm Với hộp petri đường kính 90

mm, thể tích thạch có thuốc cần khoảng 6 – 9 ml Nếu không có lớp thạch nền thì phảidùng cho mỗi hộp petri khoảng 15 ml thạch có thuốc Để ở nhiệt độ phòng cho lớp thạch

có thuốc trong đĩa petri đặc lại Dùng que cấy bạch kim cấy vi khuẩn trên mặt thạch củahộp petri Mỗi đĩa petri có thể cấy 3 – 5 loại vi khuẩn Do đó, với mỗi nồng độ của thuốctrong môi trường thạch dinh dưỡng cần 2 – 3 đĩa petri Đánh dấu rõ vị trí của mỗi loại vikhuẩn ở mặt ngoài của đáy đĩa petri

Đậy nắp các hộp petri lại, cho các hộp petri vào tủ ấm và ủ ở 37 °C Sau 24 giờ,lấy các hộp petri ra để đọc kết quả Nếu vi khuẩn mọc chưa rõ, thì cho các hộp petri vào

tủ ấm và tiếp tục ủ ở 37 °C trong 24 giờ nữa Lấy các hộp petri ra và đọc kết quả

2.4 Đọc kết quả

- Vi khuẩn nào không mọc được thì thuốc có tác dụng trên vi khuẩn đó

- Vi khuẩn nào mọc được thì thuốc không có tác dụng trên vi khuẩn đó Nếu vikhuẩn mọc càng mạnh thì thuốc càng không có tác dụng

Đến đây, ta có thể kết luận về mặt định tính là thuốc A không có tác dụng trên vikhuẩn nào và có tác dụng trên vi khuẩn nào Chọn các vi khuẩn mà thuốc có tác dụng đểnghiên cứu tiếp.

2.5 Chọn kháng sinh làm thuôc tham chiếu

Sau bước thăm dò, ta đã xác định được thuốc A có tác dụng ức chế sự phát triểncủa vi khuẩn nào thì khi chọn kháng sinh làm thuốc tham chiếu trong thí nghiệm tiếp theophải phù hợp

Mỗi loại vi khuẩn thường nhạy cảm, chịu tác dụng của một hoặc một số thuốckháng sinh nhất định Vì thế không nên dùng một kháng sinh bất kì để tham chiếu chomột vi khuẩn, mà đối với một vi khuẩn nhất định nên chọn kháng sinh nào có tác dụng ứcchế mạnh vi khuẩn đó để tham chiếu Ví dụ:

- Nếu thử trên S aureus có thể dùng kháng sinh tham chiếu là một trong các

cephlosporin, các cyclin hoặc ampicilin, oxacilin, penicilin

- Nếu thử trên B cereus có thể dùng kháng sinh tham chiếu là một trong các

Ví dụ nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của cao thuốc B chiết từ một dược liệu

mà hàm lượng cao là 10 % (100 g dược liệu được 10 g cao) Sau khi thử định tính trên 10loại vi khuẩn, thấy thuốc không có tác dụng trên 7 loại và có tác dụng trên 3 loại là

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Klebsiella pneumoniae Như vậy, ta chọn kháng sinh để tham chiếu khi nghiên cứu tác dụng trên Staphylococcus aureus hoặc

Bacillus subtilis là ampicilin, còn khi nghiên cứu tác dụng trên Klebsiella pneumoniae

thì phải dùng kháng sinh tham chiếu là streptomycin

Bước tiếp theo là phải xác định mức độ tác dụng (nghiên cứu có tính chất địnhlượng) của cao B trên 3 loại vi khuẩn này Có nhiều cách đánh giá:

Đánh giá định lượng sơ bộ: ở Việt Nam vẫn dùng cách này Pha cao B thành dungdịch có nồng độ nhất định, tẩm khoanh giấy lọc vào dung dịch thuốc rồi đặt nhanh lênmặt thạch Ủ ở nhiệt độ thích hợp, ví dụ 37 °C trong 24 giờ Sau đó lấy ra và đọc kết quả.Nếu vòng vô khuẩn càng lớn thì thuốc có tác dụng càng mạnh

Đánh giá định lượng sơ bộ có so sánh với kháng sinh chuẩn để tham chiếu Cáchtiến hành cũng như trên, nhưng ngoài thử với dung dịch thuốc B, lại thử với một dungdịch kháng sinh để tham chiếu Kết quả, ta có thể so sánh tác dụng của thuốc nghiên cứuvới kháng sinh dùng để tham chiếu

Có nhiều phương pháp nghiên cứu:

 Phương pháp đánh giá định lượng về tác dụng kháng khuẩn

 Phương pháp đánh giá định lượng sơ bộ có so sánh

 Phương pháp đánh giá định lượng sơ bộ không có so sánh

 Phương pháp đánh giá tác dụng kháng khuẩn của các chất chiết khác nhau từ một dược liệu

5 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dùng kĩ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng

Nguyên tắc: dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng có chất dinh dưỡngthích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu Thêm những nồng độ khácnhau của thuốc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống Xác định nồng độ thấp

nhất của thuốc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nồng độ này được gọi là nồng độ ứcchế tối thiểu (MIC: Minimal Inhibitory Concentration) Phương pháp này còn được gọi là

kĩ thuật hòa loãng 2 lần liên tiếp (Two – fold serial dilution) hoặc phương pháp hệ nồngđộ

Ví dụ xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) của hợp chất tinh khiết Hchiết được từ dược liệu A với hàm lượng 0,2 % trên 10 loại vi khuẩn gồm:

5 vi khuẩn Gram dương:

Trước hết, định tính thăm dò xem H có tác dụng trên vi khuẩn nào trong số 10 loại

vi khuẩn trên Sau khi xác định được, ví dụ H không có tác dụng trên 7 loại vi khuẩn mà

chỉ có tác dụng trên 3 loại vi khuẩn: S aureus, B subtilis, K pneumoniae Như thế, ta chỉ

còn cần nghiên cứu tác dụng của H trên 3 loại vi khuẩn, dùng kĩ thuật hệ nồng độ môitrường lỏng

Dưới đây xin giới thiệu phương pháp xác định MIC của H trên S aureus, còn cách xác định MIC của H trên B subtilis và trên K pneumoniae cũng được tiến hành tương tự.

5.1 Dụng cụ

- Ống nghiệm có đường kính 10 mm và dài 100 mm

- Ống hút chia độ, ống đong chia độ

5.2 Chuẩn bị

- Chuẩn bị mẫu thử: Vì đây là chất thử tinh khiết nên ta pha loãng dung dịch gốc là

10 mg/ml

- Chuẩn bị canh khuẩn gốc

- Chuẩn bị môi trường lỏng dinh dưỡng

- Chuẩn bị môi trường lỏng dinh dưỡng có vi khuẩn Mv: Ngay trước khi thínghiệm mới pha môi trường Mv Cho canh khuẩn gốc vào môi trường lỏng dinh dưỡng Msao cho 1 ml môi trường lỏng dinh dưỡng Mv chứa 500.000 tế bào vi khuẩn Ví dụ, nếu ta

có canh khuẩn gốc 100 triệu vi khuẩn trong 1 ml, lấy 250 µl canh khuẩn gốc (có 25 triệu

tế bào vi khuẩn) cho vào bình đã có 49 ml môi trường lỏng M Khuấy đều

5.3 Tiến hành

Chuẩn bị hàng loạt ống nghiệm Ở ống 1 cho vào 1,8 ml Từ ống thứ 2 trở đi, mỗiống 1 ml môi trường lỏng dinh dưỡng M Thêm vào ống 1 là 0,2 ml dung dịch mẫu thử(10 mg/ml) Lắc đều, ta sẽ được môi trường lỏng có nồng độ chất H là 1 mg/ml Lấy 1 ml

từ ống 1 sang ống 2 Lắc đều, ta sẽ được môi trường lỏng có nồng độ chất H là 500µg/ml Cứ tiếp tục làm như vậy cho đến ống thứ 6 thì thôi chẳng hạn Lúc này, ống 6 có 2

ml Hút lấy 1 ml bỏ đi Như vậy, ta được 6 ống, mỗi ống có 1 ml

mỗi ống đều có 250.000 tế bào vi khuẩn Cho tất cả các ống vào tủ ấm 37 °C và ủ trong

24 giờ Cứ 2 – 3 giờ lại lắc một lần, trừ buổi tối

5.4 Đọc kết quả

Sau khi ủ được 24 giờ, lấy các ống nghiệm ra và đọc kết quả Ống có nồng độthuốc thấp nhất mà vi khuẩn không phát triển được thì đó là MIC của chất H

Nhìn chung, có thể nhìn bằng mắt thường cũng có thể nhận định được Tuy nhiên,

để có thể phát hiện rõ hơn sự phát triển của vi khuẩn, ta nhỏ vào mỗi ống 1 giọt màu chỉthị TTC (Triphenyl Tetrazolium Chloride) Lắc đều rồi quan sát

Ví dụ, ở các ống số 6 và 7, vi khuẩn phát triển được, còn từ ống số 5 trở lên, vi

khuẩn không phát triển được thì MIC của H trên S aureus là 62,5 µg/ml.

5.5 Kết luận

Đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chất H được chiết từ dược liệu A, dùng

kĩ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng, thấy MIC của H trên S aureus là 62,5 µg/ml.

6 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dùng kĩ thuật vi định lượng trong môi trường lỏng

Nguyên tắc: chủ yếu cũng như kĩ thuật hòa loãng 2 lần liên tiếp nhưng phải có dànmáy ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: Thử nghiệm miễn dịch gắnenzyme) nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và có tính định lượngcao hơn so với kĩ thuật hệ nồng độ thông thường ở những điểm sau:

 Kĩ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc một vài dãy thí nghiệm,trong khi ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm

 Kĩ thuật thông thường chỉ dùng 6 – 8 độ pha loãng khác nhau củachất thử, còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng

 Kĩ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể đo themchỉ thị TTC), nhưng ở đây được xác định bằng cách mật độ quang học ởbước sóng 492 nm của dàn máy ELISA

6.1 Dụng cụ

Phải có dàn máy ELISA Trong dàn máy ELISA đã có một số dụng cụ nên khôngcần phải có một số thứ như các ống nghiệm dùng cho hệ pha loãng, vì ở đây đã có khay

96 giếng; có máy ủ nên không cần phải có tủ ấm…

6.2 Chuẩn bị

- Chuẩn bị mẫu thử: dung dịch gốc H 10 mg/ml (nếu phán đoán thuốc có tác dụngyếu thì pha dung dịch gốc 20 mg/ml)

- Chuẩn bị canh khuẩn gốc

- Chuẩn bị môi trường lỏng dinh dưỡng M Cần khoảng 40 ml

- Chuẩn bị môi trường lỏng có vi khuẩn Mv Cần khoảng 4 ml Mỗi ml môi trường

Mv có 500.000 tế bào vi khuẩn Tùy trường hợp, có khi phải dùng đến 1 triệu tế bào vikhuẩn trong 1 ml hoặc hơn

6.3 Tiến hành

Lấy khay 96 giếng (12 x 8) ở dàn máy ELISA, ta thấy có 8 dãy và 12 hàng Ở 8giếng của hàng 1, lấy micropipet 8 răng hút lấy ở mỗi răng 270 µl môi trường lỏng M chovào mỗi giếng

Cũng dùng micropipet 8 răng nhưng chỉ hút mỗi răng 150 µl môi trường M chovào tất cả 88 giếng còn lại

Sau đó, lấy micropipet 8 răng hút mỗi răng 30 µl dung dịch mẫu thử gốc của H (ví

dụ 10 mg/ml) cho vào trong mỗi giếng của hàng 1 đã có sẵn 270 µl môi trường M Trộnđều bằng cách lấy micropipet hút vào rồi lại đẩy ra vài lần Như vậy, nồng độ của H trongcác giếng của hàng 1 là 1 mg/ml

Lấy micropipet 8 răng hút 150 µl ở mỗi giếng của hàng 1 chuyển sang hàng 2.Trộn đều như trên Như vậy, nồng độ của H trong 8 giếng ở hàng 2 là 500 µg/ml Tiếptục làm như vậy cho đến hàng 11 Trộn đều Dùng micropipet 8 răng hút ở mỗi giếnghàng 11 là 150 µl rồi bỏ đi Như vậy, ta có 8 dãy và 12 hàng giếng, mỗi giếng đều có 150µl

Hàng Nồng độ của H (µg/ml)

12 Các giếng làm chứng, không có thuốc H

Thên vào tất cả 96 giếng, mỗi giếng 20 µl môi trường dinh dưỡng có vi khuẩn Mv

(105 cfu trong 1 ml) Cho khay ELISA vào máy ủ - lắc model: IEMS Incubator; hãngThermo – Lab – Systems, Phần Lan Trước hết, cài đặt nhiệt độ ủ ở 37 °C, thời gian ủ là

24 giờ, cứ mỗi giờ lắc 30 giây Sauk hi đã cài đặt xong, ấn nút Start để bắt đầu

Đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chất H được chiết từ dược liệu A dùng

kĩ thuật vi định lượng trong môi trường lỏng dùng máy ELISA của hãng Thermo – Lab –Systems, Phần Lan thấy MIC của H trên S aureus là 43 µg/ml

7 Phương pháp sinh tự kí

Khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu A có tác dụng khángkhuẩn trên một loại vi khuẩn V nào đó Muốn xác định xem thành phần nào trong dượcliệu A có tác dụng thì có thể phân lập ra một dạng chiết khác nhau rồi đem thử với vikhuẩn V đó, ta sẽ biết được thành phần nào không có tác dụng, thành phần nào có tácdụng và mức độ tác dụng Nhưng để thăm dò nhanh hơn, ta có thể dùng phương phápsinh tự kí

7.1 Dụng cụ

- Tấm kính 10 x 25 cm có tráng sẵn lớp mỏng silicagel Nếu không, phải có tấmkính và silicagel để tự tráng

7.3 Tiến hành

Dùng tấm kính 10 x 25 cm có tráng sẵn lớp mỏng silicagel Hoạt hóa tấm kính ở tủsấy 125 °C trong 30 phút hoặc 105 °C trong 1 giờ Chấm dịch chiết của A trên tấm kính,rồi sắc kí trên hệ dung môi đã chuẩn bị Sau khi sắc kí xong, để bay hết dung môi ở nhiệt

độ trong phòng Nếu không đuổi hết dung môi có thể gây ra hiện tượng dương tính giảsau này

Trên bản sắc kí, sẽ được các vết chất ở các vị trí khác nhau tùy theo tính chất củacác chất có trong dịch chiết Để phát hiện các chất rõ hơn, soi bản mỏng dưới đèn tửngoại ở bước song 254 nm hoặc 366 nm Đánh dấu các vết trên bản mỏng, thường đánh

số vết ở mặt sau lớp mỏng ở mép tấm kính chiếu tương ứng với các vết

Dùng ống hút hút môi trường thạch có vi khuẩn Mv và láng đều trên lớp…

Chloride) Vùng có màu đỏ là vùng có vi khuẩn phát triển Vùng vết chất nào đã đánhdấu trên tấm kính mà không bắt màu thì chất đó có tác dụng kháng khuẩn.

1.1 Về tính tan của chất thử nghiệm

Trong môi trường nuôi cấy vi nấm, pH tốt nhất cho sự phát triển của vi nấm là 5,5

- 6,0 chứ không phải pH trung tính Vì thế khi hòa tan chất thử trong nước hoặc nướcmuối sinh lý, nếu chất thử khó tan, trước hết ta acid hóa đến pH 5,5 - 6,0 bằng acid HCl.Chỉ khi acid hóa mà chất thử vẫn không tan thì mới cần đến các dung môi đặc biệt nhưDMSO, DMF, PEG

1.2 Chuẩn bị mẫu thử

Tương tự như trên, nếu chất thử khó tan, trước hết ta acid hóa đến pH 5,5 - 6,0bằng acid HCl Chỉ khi acid hóa mà chất thử vẫn không tan thì mới cần đến các dung môiđặc biệt như DMSO, DMF, PEG

1.3 Môi trường

Môi trường nuôi cấy vi nấm khác với môi trường nuôi cấy vi khuẩn Có nhiềuloại môi trường nuôi cấy vi nấm Việc lựa chọn môi trường nào là tùy thuộc vào loại nấmthử và bản chất của chất thử Có những trường hợp đòi hỏi môi trường rất phức tạp sauđây là môi trường thông dụng nhất, dùng cho đa số các loại nấm

* Môi trường lỏng Sabouraud

* Môi trường thạch Sabouraud

Thành phần cũng như trên, nhưng them thạch 15g Đun đến sôi vừa để hòa tan,vừa để tiệt trùng Dùng NaOH H hoặc HCl N để điều chỉnh pH, sao cho sau tiệt trùng pH

là 5,6 ± 0,2

1.4 Chuẩn bị chủng vi nấm để thử

Từ ống chủng gốc, cấy vi nấm trên mặt thạch dinh dưỡng Để ủ nhiệt độ 28 oC chonấm phát triển Đối với nấm là bào tử chồi (blastospore), thường phải ủ 48 giờ; còn đốivới sợi nấm (mycelia fungi), loại bào tử đính (conidiospore) thì phải ủ 4 - 5 ngày Lấy cácbào tử trên mặt thạch, nghiền trong nước muối sinh lý cho đồng nhất, rồi cho vào ốngnghiệm đo độ đục Thếm nước muối sinh lý để được hỗn dịch bào tử nấm, mà mỗi ml cómột lượng nhất định c.f.u dựa vào đo độ đục so với một ống mẫu (ví dụ 500.000 cfu).Hỗn dịch nấm đã được chuẩn hóa số lượng cfu trong 1 ml gọi là canh nấm gốc

Các vi nấm cần thử, tùy theo yêu cầu của chất thử và điều kiện thử Theo một tàiliệu của Ấn Độ, người ta dùng 5 loại vi nấm sau:

1.5 Nhiệt độ ủ và thời gian ủ

Phải đảm bảo nhiệt độ ủ theo đúng yêu cầu của từng loại nấm Trong đa số trườnghợp, thường ủ ở nhiệt độ 28 ± 1oC Về thời gian ủ, nếu là bào tử chồi thì ủ trong 24 - 48giờ, còn sợi nấm thì thời gian ủ từ 72 - 96 giờ

2 Nghiên cứu tác dụng kháng vi nấm in vivo

Sau khi nghiên cứu, đã xác định thấy một chất nào đó (dịch chiết, cao, phân đoạn

chết hoặc hợp chất tinh khiết) có tác dụng kháng vi nấm in vitro, cần nghiên cứu in vivo trước khi dung cho người Thử in vivo, vừa để xác định tác dụng kháng vi nấm trên vật

thí nghiệm, vừa xác định độc tính khi ta thử trên con vật với các kiểu dạng nhiễm vi nấmkhác nhau Các động vật thử thường dung những loại động vật sau:

- Chuột nhắt trắng 18 - 20 g, 4 - 6 tuần tuổi.

- Chuột lang 300 - 350 g

- Thỏ 2,0 - 2,5 kg

- Khỉ rhesus 3 – 5 kg

Động vật được nhốt trong chuồng vô trùng, đúng quy cách, và nuôi bằng thức ăn

vô trùng và nước uống vô trùng để không đưa them các loại nấm khác vào

Sau đây là một số mô hình thử tác dụng kháng vi nấm (bảng dưới) Tùy theochủng vi nấm gây ra các bệnh vi nấm gì mà ta dùng động vật thí nghiệm cho phù hợp

CAAFHC

CNCN

CA

CA, CN, TM

CNAF

Chuột langChuột langChuột langChuột lang

Chuột nhắtChuột nhắtChuột nhắt

Chuột nhắtKhỉ Rhesus

Chuột nhắt

Chuột nhắt

Chuột nhắtChuột nhắt