PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH hàm LƯỢNG PROTEIN THEO BRADFORD

Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang d

1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1µg, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian Một ưu điểm lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất

là amoniumsufate

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thu ở bước sóng

596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo) Lấy giá trị ∆OD = ODX – ODO Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành

− Dung dịch albumine 0.1%

− Nước cất

− Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau

o Coomassie Brilliant Blue: 0.001g

o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g

o Phosphoric acid: 85%

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hoà tan trong ethnol trong một chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100 ml bằng nước cất Lắc đều và giữ lạnh dưới 4oC

 Dựng đường chuẩn albumine

Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40, 50,

60, 70, 80, 90, 100 µg/ml

Bảng 3.1 Dựng đường chuẩn albumine

Ống nghiệm Đối

Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch

albumin chuẩn

(µl)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Nước cất (µl) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Thuốc thử

Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất Tất cả các ống sau khi pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút

Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 595 nm

 Dựng đường chuẩn

Định lượng protein trong mẫu thí nghiệm

Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford Đem

đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm

Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm

Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn

Kết quả tính toán:

Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khoả sát ta suy ra hàm lượng protein của mẫu là X (µg/ml) có trong m (g) nguyên liệu

Vậy lượng protein có trong 1 gam nguyên liệu là:

Hình 3.2 Đường chuẩn albumine

2 Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Amano

 Nguyên tắc:

Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme

 Hoá chất:

− HCL 0.1 M

− Ma2CO3 0.4 M

− Dung dịch Trichloracetic 0.4 M

− Tyrosin tinh khiết

X

1000 m Hàm lượng protein (mg/g) =

− NaOH 0.1 M

− Thuốc thử Folin

− H3PO4 1/30 M

− Đệm phosphate (pH 7) 0.1 M

 Dụng cụ và thiết bị

− Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc

− Bể ổn nhiệt

− Máy đo quang phổ UV – Vis

− Máy đo pH

 Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Bảng 3.2 Đường chuẩn tyrosine

Ống số Đối

Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch tyrosine

chuẩn (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch HCl (µl) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Thuốc thử Folin

Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 100 µgtyrosine / mlHCl như bảng 3.3.2 Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37±0,50C trong 20 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50,

As60, As70, As80, As90 As100

Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso

Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị ∆OD1 đến ∆OD9 Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của ∆OD theo nồng độ protein Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine

 Xác định hoạt tính enzyme protease

Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7

Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 ± 0,50C trong 10 – 15 phút

Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều Đem ủ hỗn hợp này ở

37± 0,50C trong một giờ

Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme

Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc

Thêm 1 ml thuốc thử Folin

Trộn đều, để yên ở 37 ± 0,50C trong 20 phút

Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này là Am)

Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện Ghi nhận kết quả độ hấp thụ

là A0

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tínhprotease theo tính toán sau :

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm Ký hiệu là: U

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – A0).F.1/100.n.V

m

F = [10/∆As10 + 20/∆As20 + 30/∆As30 + 40/∆As40 + 50/∆As50 + 60/∆As60 + 70/∆As70 + 80/∆As80 + 90/∆As90+100/∆As100]/10

− Am : độ hấp thu của mẫu

− A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng

− F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước sóng 660

nm trên đường chuẩn

− n : Hệ số pha loãng của enzyme

− 1/100 : Hệ số chuyển đổi

− V : Thể tích của dung dịch enzyme

− m : khối lượng chế phẩm enzyme thô

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease: từ kết quả hàm lượng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (U/ml) tính hoạt tính riêng của enzyme

HTR (U/mg) =

Đường chuẩn tyrosine

Số đơn vị hoạt tính

mg protein enzyme