báo cáo SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS)

SNPs (đọc là snp) được viết tắt từ chữ Single Nucleotide Polymorphisms, có nghĩa là các dạng đa hình của nucleotide đơn. Marker này thường được dùng để phân tích genome người, hiện nay được áp dụng cho genome của nhiều sinh vật khác với số lượng lớn nhất từ trước đến nay, nhờ một đột biến điểm tại một nucleotide trên genome

SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS)

I GIỚI THIỆU VỀ SNP

- SNPs (đọc là snip) được viết tắt từ chữ Single Nucleotide Polymorphisms, có nghĩa là các dạng đa hình của nucleotide đơn Marker này

thường được dùng để phân tích genome người, hiện nay được áp dụng cho genome của nhiều sinh vật khác với số lượng lớn nhất từ trước đến nay, nhờ một đột biến điểm tại một nucleotide trên genome (hình 1)

Hình 1: Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G –

C bằng A – T hoặc ngược lại tạo ra một SNP

- Đa hình đơn nucleotide, hoặc SNPs là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi một đơn nucleotide (A, T, C, hoặc G) trong trình tự bộ gen bị thay đổi Ví dụ một SNP có thể thay đổi trình tự DNA GGCTAA A đến A GGCTAA T Đối với một biến thể được coi là một SNP, nó phải xảy ra trong ít nhất 1% dân số SNPs, tạo nên khoảng 90% của tất cả các biến thể di truyền của con người, xảy ra mỗi

100 đến 300 căn cứ dọc theo hệ gen của con người 3-tỷ-base Hai trong số ba mỗi

SNPs liên quan đến sự thay thế của cytosine (C) với thymine (T) SNPs có thể xảy

ra trong khu vực của bộ gen mã hóa (gen) và không mã hoá Nhiều người SNPs không có ảnh hưởng đến chức năng tế bào, nhưng các nhà khoa học tin rằng những người khác có thể predispose người bệnh hoặc ảnh hưởng đến phản ứng của

họ với một loại thuốc

- SNPs diễn ra bình thường trong suốt DNA của một người Trung bình xảy

ra một lần trong mỗi 300 nucleotide, có nghĩa là có khoảng 10 triệu SNPs trong hệ gen của con người Thông thường nhất, những biến thể này được tìm thấy trong DNA giữa các gen Nó được xem như là đánh dấu sinh học, các nhà khoa học giúp xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh Khi SNPs xảy ra trong gen hoặc trong một khu vực gần một gen quy định, nó có thể có vai trò trực tiếp đến sự xuất hiện bệnh bằng cách ảnh hưởng đến chức năng của gen

- Mặc dù hơn 99% trình tự ADN của con người đều giống nhau, sự thay đổi trong chuỗi DNA có thể có tác động lớn đến việc làm thế nào con người bệnh, các yếu tố môi trường, chẳng hạn như vi khuẩn, virus, độc tố, các hóa chất, các loại thuốc và các liệu pháp điều trị khác Điều này làm cho SNPs có giá trị cho nghiên cứu y sinh học và phát triển các sản phẩm dược phẩm hoặc chẩn đoán y khoa SNPs cũng tiến hóa ổn định, không thay đổi nhiều từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cho chúng ta dễ dàng hơn khi nghiên cứu dân số

- SNP là những biến dạng của chuỗi DNA được tìm thấy với tần suất cao trong genome người (Taillon – Miller và ctv 1998) Chúng ta có thể sử dụng SNP marker để phân lập các yếu tố di truyền có liên quan đến tính trạng bệnh lý vô cùng phức tạp (Taillon – Miller và ctv 1999) Người ta có thể dự đoán 100.000 hoặc nhiều hơn nữa SNP marker (trong quãng 30-kb, hoặc 5 marker cho một gen) trong genome người (Collins và ctv 1997) Những phương pháp đánh giá kiểu gen với kết quả cao đòi hỏi một kiến thức về chuỗi trình tự rất chính xác của SNP Do

đó, bất cứ công bố nào về SNP phải hàm chứa hai nội dung:

(1) Xác định chuỗi trình tự DNA

(2) Tần số alen

Đây là một kỹ thuật được áp dụng vào đầu những năm 2000, từ genome người

đến genome các loài sinh vật khác như cây Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa L.),

…

II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SNP

- Có hai phương pháp để tạo ra SNP, một là dùng trực tiếp mã trình tự di truyền và thứ hai là phân biệt các đột biến điểm thông qua dùng tách sắc ký lỏng (DHPLC) Thông thường dùng primer để thiết kế mã trình tự và các đoạn khuyết đại khoảng 500 cặp base Chúng ta có thể dùng phương pháp PCR tách hai cá thể

và trộn các cá thể này chung, sau đó đun nóng và lai để thành lập các dulex tương đồng và dị biệt Các bước để phân tích axit nucleic bằng SNP như sau:

+ Phân lập DNA nền

+ Chọn lựa primer và thiết kế primer để cho khuếch đại trong PCR

+ Tách SNP trên bước sóng tương thích (DHPLC)

+ Phối hợp số liệu, mã trình tự DNA và cloning

- Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong genome, những trình tự DNA này từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau, với số cặp base khác biệt nhau nằm trong khoảng cho phép 500 – 1000bp Một cặp base ở tại vị trí nào đó biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất rất phổ biến và một cặp base khác là “variant” ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí Nếu cặp base có tính chất ít phổ biến hơn xuất hiện xuất hiện với xác suất nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta định nghĩa vị trí của cặp base đó là vị trí một SNP Hiện nay, người ta công bố 3.000.000 SNP trong genome người (Rusell 2002), nhiều hơn bất cứ DNA marker đã được công bố trước đó Kiểu đa hình như vậy vô cùng quan trọng trong di truyền người vì chúng đại diện cho hơn 98% tất cả đa hình DNA Các alen của một SNP có thể dễ dàng được xem xét bởi phân tích lai với phân tử oligonucleotide nào đó

+ Trong quy trình này, một đoạn dò (probe) ngắn hay đoạn oligonucleotide (gọi là phân tử oligo) chứa khoảng 25bp được tổng hợp sao cho nó sẽ bổ sung vào alen phổ biến tại locus SNP Phân tử DNA này được trộn với DNA mục tiêu và

tiến trình lai được hoàn chỉnh ở mức độ cực kỳ chính xác (high stringency) Điều

này có nghĩa là mọi điều kiện ở đây phải thuận lợi cho sự lai giữa probe và DNA

+ Khi hiện tượng lai xảy ra, DNA mục tiêu sẽ có alen phổ biến (common

allene) Dưới những điều kiện cực kỳ chính xác trong sự kiện “matching” (cặp

base tương ứng bắt cặp với nhau, phân tử oligo sẽ không lai với DNA mục tiêu có một cặp base nào đó bị thay đổi – một SNP (hình 2)

Hình 2: Phân tích lai oligonucleotide tạo ra một SNP Một oligonucleotide

có tính chất bổ sung hoàn toàn đối với alen bình thường, nó được lai với DNA mục tiêu dưới điều kiện tối ưu có tính chất “fullmatch” (bắt cặp base hoàn toàn tương xứng) giữa probe và DNA Khi sự kiện lai xảy ra, DNA mục tiêu có alen bình thường, nhưng khi sự kiện lai không xảy ra, DNA mục tiêu có base trong tình trạng “mismatch”, người ta gọi đó là một đa hình của SNP

- Việc tạo ra phản ứng cùng một lúc hàng trăm SNP có thể được thực hiện

nhờ sử dụng “DNA microarray”, còn được gọi là DNA chips, GeneChips arrays (thương hiệu của Affmetrix, Inc) và oligonucleotide arrays Microarray có khả

năng đọc biết 100.000 hoặc nhiều hơn nữa phân tử DNA trên một diện tích 3,6cm2

(hình 3)

Phân tử lai ổn định với từng

cặp base hoàn toàn tương ứng Oligonucleotide

DNA mục tiêu

SNP

Một cặp base không tương

ứng, hydrid không ổn định

C

Mismatch: làm cho cặp base không hình thành được

G

C

C

G

C G

A T

T A

T A

A T

A T

G C

T A

C G

T A

T A

C

G

A T

T A

C G

C G

C G

T A

A T

G

C

C

G

C G

A T

T A

T A

A T

A T

G C

T A

T A

T A

C G

A T

T A

C G

C G

C G

T A

A T

C

+ DNA microarray là kỹ thuật sắp xếp và phối hợp phân tử bao gồm các đoạn DNA và protein cho lai với những phân tử probe trong thư viện DNA được sắp xếp theo matrix Kỹ thuật DNA microarray nhằm mục đích tìm hiểu sự thể hiện gen, mức độ đa dạng nguồn di truyền, bản đồ gen, phân tích biến động trong gen

+ DNA microarray được hiểu một cách đơn giản là sắp xếp một cách thứ tự hàng nghìn đơn vị phân tử DNA probe với trình tự giống nhau Chúng được cố định trên một tấm kính hoặc trên màng nylon

Hình 3: Xác định đa hình nucleotide đơn bằng kỹ thuật microarray.

* Lịch sử ra đời của kỹ thuật microarray:

Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang, FISH Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979

Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra Với kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu) Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991) Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu

Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu

⇒ Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay

* Trình tự thực hiện microarray được mô tả như sau:

(1) Thực hiện công việc in các slide, chạy PCR, thiết lập chương trình đảm bảo chất lượng sản phẩm PCR, làm tinh khiết sản phẩm PCR

(2) Sao chép microarray thông qua hệ một thống tự động, tạo ra hồ sơ chi tiết và chuẩn bị gen

(3) Thực hiện lai DNA với probe, trong đó người ta cần phải ly trích RNA

để nhuộm với Cy3 và Cy5

(4) Thực hiện việc chụp hình thông qua máy “scanner” và phân tích số liệu Thí nghiệm trong DNA microarray cần có những probe và DNA mục tiêu, trong đó, probe là những phân tử DNA cố định trên chip bằng thủy tinh hoặc silicon, chúng chưa được đánh dấu, nhưng DNA mục tiêu đã được đánh dấu mà nồng độ của nó sẽ được phân tích Vì vậy, người ta sử dụng một chip tên gọi là

“probe array” Huỳnh quang được sử dụng để đánh dấu là “florescein” hoặc

“cyanine”, đó là phẩm màu Cy3 có màu xanh lá cây và phẩm màu Cy5 có màu đỏ.

Dấu hiệu đánh dấu bằng microarray chúng ta phải dùng hai chất màu nhuộm phổ biến là Cy3 và Cy5 Các chất nhuộm này thường là dUTP hoặc dCTP Cy3 cho màu vàng cam với ánh sáng hấp thu tối thiểu 50nm và tối đa 581nm Cy5 cho màu đỏ với ánh sáng hấp thu tối thiểu là 649nm và tối đa là 670nm

Kết quả hình ảnh sẽ thể hiện các gen mục tiêu được nhận biết trong matrix Nếu mã microarray biểu hiện có gen mục tiêu, kết quả dương tính Ngược lại, phản ứng sẽ âm tính (không có kết quả lai với probe)

Hình 4: Quy trình của microarray.

Nhiều kỹ thuật đã được nghiên cứu để tạo ra SNP theo kiểu tự động hóa với

sự giúp đỡ của computer (Wang và ctv 1998) Những kỹ thuật đó là: EST Sequence Data, EST Assembly với phần mềm chuyên trách, phương pháp đánh giá kiểu gen thông qua thiết kế mồi (primer) cho PCR và GBA theo phần mềm GBA-primer1.1, phương pháp xác định SNP bằng kỹ thuật đọc chuỗi trình tự pyrophosphate DNA vào thời điểm thích hợp (Alderborn và ctv 2000)

III TÍNH CHẤT CỦA SNP

- SNP có tính chất “diallelic” trong quần thể và tần số alen của nó có thể được ước đoán dễ dàng trong bất cứ quần thể nào, thông qua một loạt xét nghiệm

kỹ thuật (Kwor và ctv 1994)

- SNP là những marker có tính ổn định rất cao về mặt di truyền

- Là sản phẩm của PCR

- Được tìm thấy với tần suất cao nhất trong genome người

- Độ đa dạng cao

IV ỨNG DỤNG VÀ TRIỂN VỌNG CỦA SNPs

1 SNPs bản đồ

- Người ta đã phát hiện một chiến lược nghiên cứu giúp cho việc phát hiện nhanh chóng những SNP từ số liệu lưu trữ EST (Expressed Sequence Tag)

(Picuolt – Newberg và ctv 1999) Sự kiện phát triển in vitro nhằm khuếch đại

những trình tự ở vị trí đặc biệt, ví dụ như PCR và khám phá marker có tính đa hình

và có thông tin di truyền cao như microsatallite, STR (short tandem repeat), sự kiện như vậy đã và đang tạo điều kiện thuận lợi để chúng ta sáng tạo ra những bản

đồ di truyền có mật độ thấp (lom density maps) của người, ứng dụng có hiệu quả trong lĩnh vực y khoa, thí dụ xét nghiệm bệnh u xơ, bệnh Huntington, bệnh tiểu đường, … (Broman và ctv 1998)

- Các nhà khoa học tin rằng SNP bản đồ sẽ giúp họ xác định được nhiều gen liên quan với các bệnh phức tạp như ung thư, bệnh tiểu đường, bệnh mạch máu, và một số hình thức của bệnh tâm thần

- Một vài nhóm làm việc để tìm SNPs và cuối cùng tạo ra SNP bản đồ hệ gen của con người Trong số đó là Mỹ Human Genome Project (HGP) và một nhóm lớn của các công ty dược phẩm được gọi là SNP Consortium, dự án TSC Khả năng trùng lặp giữa các nhóm nhỏ là khó xảy ra vì có khoảng 3 triệu SNPs, và phần thưởng tiềm năng của một bản đồ SNP là cao

- Ngoài ý nghĩa nghiên cứu pharmacogenomic trong chẩn đoán, y sinh học, SNP bản đồ còn giúp để xác định hàng ngàn các dấu hiệu bổ sung trong bộ gen, do

đó hướng nghiên cứu của bản đồ bộ gen là rất lớn

2 Làm thế nào SNPs có thể được sử dụng như là yếu tố nguy cơ phát triển bệnh?

- SNPs không gây bệnh, nhưng nó có thể giúp xác định khả năng rằng ai đó

sẽ phát triển một căn bệnh cụ thể Một trong những gen liên quan với bệnh

Alzheimer, apolipoprotein E hoặc APOE, là một ví dụ tốt về cách SNPs ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh apoE chứa hai SNPs mà kết quả trong ba alen có thể

cho gen này: E2, E3, E4 Mỗi allele khác nhau bởi một cơ sở DNA, và các sản phẩm protein của mỗi gen sẽ khác bởi một amino axit

- Mỗi cá nhân được thừa hưởng một bản sao mẹ của APOE và một bản sao nội của APOE Nghiên cứu cho thấy rằng một người được thừa hưởng ít nhất một

E4 allele sẽ có một cơ hội lớn để phát triển bệnh Alzheimer Rõ ràng, sự thay đổi của một amino acid trong các protein E4 làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein và có nhiều khả năng để làm cho bệnh phát triển Nếu một người kế thừa allele E2 thì ít có khả năng phát triển bệnh Alzheimer

- Tất nhiên, SNPs không phải là chỉ số tuyệt đối của sự phát triển của bệnh Một người nào đó đã được thừa hưởng hai alen E4 không bao giờ có thể phát triển bệnh Alzheimer, trong khi một người đã được thừa hưởng hai alen E2 có thể

APOE chỉ là một gen có liên quan đến bệnh Alzheimer Giống như các rối loạn

mãn tính như bệnh tim, tiểu đường, hoặc ung thư phổ biến nhất, bệnh Alzheimer là một bệnh có thể được gây ra bởi các biến thể trong một vài gen

- Hầu hết các SNPs không có ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển Một số những khác biệt di truyền đã được chứng minh là rất quan trọng trong việc nghiên cứu về sức khỏe con người Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy SNPs có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân với một số loại thuốc nhất định, nhạy cảm với các yếu tố môi trường như chất độc, và nguy cơ phát triển các bệnh cụ thể SNPs cũng có thể được sử dụng để theo dõi các thừa kế của các gen bệnh trong gia đình Nghiên cứu trong tương lai sẽ làm việc để xác định SNPs liên kết với các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư

- Nhiều loại bệnh phổ biến ở người không được gây ra bởi một biến thể di truyền trong một gen duy nhất, nhưng bị ảnh hưởng bởi các tương tác phức tạp giữa nhiều gen cũng như các yếu tố môi trường và lối sống

- Mặc dù các yếu tố môi trường và lối sống có ảnh hưởng đến sự phát triển một căn bệnh, đây là khó khăn để đo lường và đánh giá hiệu quả tổng thể của họ

về quá trình bệnh Vì vậy, tiềm năng của một cá nhân để phát triển một bệnh dựa trên gen và các yếu tố di truyền

- Yếu tố di truyền cũng có thể trao nhạy cảm hoặc kháng bệnh và xác định mức độ nghiêm trọng hoặc tiến triển của bệnh Bởi vì chúng ta vẫn chưa biết được tất cả các yếu tố liên quan ở trong những đường phức tạp, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy nó khó khăn để phát triển các xét nghiệm sàng lọc cho hầu hết các bệnh

và các rối loạn Bằng cách nghiên cứu mối liên quan của SNP với một đặc điểm bệnh, các nhà nghiên cứu đã phát hiện các gen có liên quan với một căn bệnh Xác định và hiểu biết về vai trò của yếu tố di truyền trong bệnh cũng sẽ cho phép các

nhà nghiên cứu đánh giá tốt hơn vai trò của yếu tố di truyền, chẳng hạn như hành

vi, chế độ ăn uống, lối sống, và hoạt động thể chất có trên bệnh

- Bởi vì yếu tố di truyền cũng ảnh hưởng đến phản ứng của một người điều

trị bằng thuốc, đa hình DNA chẳng hạn như SNPs sẽ là hữu ích trong việc giúp

các nhà nghiên cứu xác định và hiểu lý do tại sao các cá nhân khác nhau trong khả năng của mình có thể hấp thụ các loại thuốc nhất định, cũng như để xác định lý do tại sao một cá nhân có thể trải nghiệm một tác dụng phụ bất lợi cho một loại thuốc

cụ thể Vì vậy, việc phát hiện gần đây của SNPs hứa hẹn mang đến một cuộc cách mạng không chỉ là quá trình phát hiện bệnh nhưng thực tế thuốc phòng ngừa và chữa bệnh

3 SNPs và chẩn đoán bệnh:

- Vật liệu di truyền của mỗi người có một mô hình SNP độc đáo được tạo thành nhiều biến thể di truyền khác nhau Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy rằng hầu hết các SNPs không chịu trách nhiệm cho một bệnh tật nào Thay vào đó, nó như

là các dấu hiệu sinh học để xác định chính xác một căn bệnh trên bản đồ hệ gen của con người, bởi vì nó thường nằm gần một gen được tìm thấy có liên quan đến một căn bệnh nào đó Thỉnh thoảng, một SNP thực sự có thể gây ra một căn bệnh,

và do đó, có thể được sử dụng để tìm kiếm và cô lập các gen gây bệnh

Để tạo một thử nghiệm di truyền, gen gây bệnh nào đó đã được xác định bởi các nhà khoa học thu thập mẫu máu từ một nhóm các cá nhân bị ảnh hưởng bởi căn bệnh này và phân tích DNA của họ cho các mẫu SNP Tiếp theo, các nhà nghiên cứu so sánh các mô hình với các mẫu thu được bằng cách phân tích ADN