Cây thông đỏ và hợp chất taxol

Cây thông đỏ và hợp chất taxol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đồ án chuyên ngành CÂY THÔNG ĐỎ VÀ HỢP CHẤT TAXOL CBHD: TS LÊ THỊ THỦY TIÊN SVTH: NGUYỄN HÀ HOÀNG ANH MSSV: 60700056 BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp HCM, tháng 06 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đồ án môn học xin gửi lời cảm ơn đến:  Tiến Sĩ Lê Thị Thủy Tiên – Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM – hƣớng dẫn tận tình nhƣ cho lời khuyên bổ ích để hoàn thành tốt đồ án  Các thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học truyền đạt cho kiến thức hữu ích giúp có có định hƣớng rõ ràng thực đồ án  Các bạn sinh viên lớp HC07BSH học tập, trao đổi kinh nghiệm giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn ngƣời MỤC LỤC MỤC LỤC i CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC ẢNH vi DANH MỤC BẢNG vii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan Thông Đỏ 2.1.1 Giới thiệu chung họ Taxaceae 2.1.2 Giới thiệu chung chi Taxus 2.1.3 Một số loài Thông Đỏ giới 16 2.1.3.1 Taxus baccata 16 2.1.3.2 Taxus brevifolia 18 2.1.3.3 Taxus canadensis 19 2.1.3.4 Taxus cuspidata 21 2.1.3.5 Taxus floridana 23 2.1.3.6 Taxus globosa 25 2.1.3.7 Taxus chinensis 26 2.1.3.8 Taxus wallichiana 28 2.1.4 Tình trạng bảo tồn loài Thông Đỏ Việt Nam 29 2.1.4.1 Thông Đỏ Bắc (Taxus chinensis Pilg.) 30 2.1.4.2 Thông Đỏ Nam (Taxus wallichiana Zucc.) 33 2.2 Taxol 36 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu 36 2.2.2 Cấu tạo Taxol 39 2.2.3 Con đƣờng sinh tổng hợp Taxol 40 i 2.2.4 Cơ chế tác động Taxol 45 2.2.5 Một số phƣơng pháp tổng hợp hợp chất Taxol 49 2.2.6 Ứng dụng hợp chất Taxol điều trị bệnh ung thƣ 57 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS 64 3.1 Vi nhân giống Taxus baccata L 64 3.1.1 Môi trƣờng nuôi cấy 64 3.1.2 Các giai đoạn trình vi nhân giống 65 3.1.3 Kết luận 70 3.2 Vi nhân giống Taxus wallichiana Zucc 70 3.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 71 3.2.2 Các giai đoạn trình vi nhân giống 73 3.2.3 Kết luận 79 Chƣơng 4: KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 ii CÁC TỪ VIẾT TẮT FDA U.S Food and Drug Administration – Cục quản lý Thực Phẩm Dƣợc Phẩm Hoa Kỳ CITES Convention on International Trade in Endangered Species – Công ƣớc thƣơng mại quốc tế loài gặp nguy hiểm IUCN International Union for Conservation of Nature – Tổ chức bảo tồn thiên nhiên giới NCI U.S National Cancer Institute – Viện ung thƣ quốc gia Hoa Kỳ CRADA Cooperative Research and Development Agreement – Hiệp định hợp tác nghiên cứu phát triển BMS Bristol-Myers Squibb GGPP Geranylgeranyl pyrophosphate IPP Isopenthenyl diphosphate DMAPP Dimethylallyl diphosphate 10-DAB 10-deacetylbaccatin III DAB Baccatin III NAA α-naphthaleneacetic acid IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid BA 6-benzyladenine iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Amentotataxus argotaenia Pilger Hình 2.2: Austrotaxus spicata Compton Hình 2.3: Torreya nucifera (L.) Siebold & Zucc Hình 2.4: Pseudotaxus chjenii (Cheng) Cheng Hình 2.5: Taxus cuspidata Siebold & Zucc Hình 2.6: Phạm vi phân bố họ Taxaceae Hình 2.7: Phạm vi phân bố số loài thuộc chi Taxus 11 Hình 2.9: Phạm vi phân bố Taxus baccata khu vực Bắc Mỹ 17 Hình 2.11: Phạm vi phân bố Taxus brevifolia khu vực Bắc Mỹ 19 Hình 2.13: Phạm vi phân bố Taxus canadensis khu vực Bắc Mỹ 21 Hình 2.15: Phạm vi phân bố Taxus cuspidata khu vực Bắc Mỹ 23 Hình 2.17: Phạm vi phân bố Taxus floridana khu vực Bắc Mỹ 24 Hình 2.19: Phạm vi phân bố Taxus globosa 26 Hình 2.21: Phạm vi phân bố Taxus chinensis 27 Hình 2.23 : Thông Đỏ Bắc (Taxus chinensis Pilg.) 30 Hình 2.24: Phạm vi phân bố Thông Đỏ Bắc (Taxus chinensis Pilg.) Việt Nam 31 Hình 2.25: Thông Đỏ Nam (Taxus wallichiana Zucc.) 33 Hình 2.26: Phạm vi phân bố Thông Đỏ Nam (T wallichiana Zucc.) Việt Nam 34 Hình 2.27: Cấu trúc Taxol 39 Hình 2.28 : Con đƣờng sinh tổng hợp Taxol 43 Hình 2.29: Quá trình hình thành vòng oxetane sinh tổng hợp Taxol 44 Hình 2.30: Con đƣờng sinh tổng hợp Taxol từ tiền chất giả định đƣợc polyhydroxyl hóa 45 iv Hình 2.31: Cơ chế tác động Taxol tế bào gây ung thƣ 46 Hình 2.32: Cơ chế phản ứng Taxol hệ thống vi ống tế bào 48 Hình 2.33: Phƣơng pháp phân tích retrosynthetic Nicolaou 50 Hình 2.34: Bán tổng hợp Taxol từ DAB 57 Hình 3.4: Tỷ lệ mẫu cấy T wallichiana môi trƣờng MS khác 75 Hình 3.5: Chiều dài chồi trung bình (cm) mẫu cấy T wallichiana môi trƣờng MS sửa đổi khác 76 v DANH MỤC ẢNH Hình 2.8: Taxus baccata L 16 Hình 2.10: Taxus brevifolia Nutt 18 Hình 2.12: Taxus canadensis Marsh 20 Hình 2.14: Taxus cuspidata Siebold & Zucc 22 Hình 2.16: Taxus floridana Nutt 24 Hình 2.18: Taxus globosa 25 Hình 2.20: Taxus chinensis Rehd var mariei 27 Hình 2.22: Taxus wallichiana Zucc 29 Hình 3.1: Vi nhân giống T baccata 66 Hình 3.2: Kỹ thuật giâm cành đƣợc áp dụng cho Taxus wallichiana 71 Hình 3.3: Thu thập mẫu cấy T wallichiana 74 Hình 3.6: Vi nhân giống in vitro T wallichiana 78 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Tóm tắt lịch sử nghiên cứu hợp chất Taxol 38 Bảng 2.2: Các nghiên cứu gần khả thu nhận Taxol hợp chất có liên quan phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 52 Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc sử dụng cho trình vi nhân giống T baccata 65 Bảng 3.2: Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng than hoạt tính bổ sung vào môi trƣờng MS ½ đƣợc sử dụng cho trình tăng trƣởng kéo dài chồi 72 Bảng 3.3: Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng BA than hoạt tính đƣợc bổ sung vào môi trƣờng MS ½ để cảm ứng chồi bất định 72 Bảng 3.4: Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng, vitamin B1 than hoạt tính bổ sung vào môi trƣờng MS môi trƣờng MS ½ để cảm ứng hình thành rễ 73 Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm phụ thuộc vào loại mẫu cấy 75 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng chồi thân có nguồn gốc in vitro ex vitro chiều dài chồi bên phần trăm mẫu cấy có mang chồi 77 vii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Các loài Taxus đƣợc biết đến từ thời cổ đại, gần nhƣ tất phận (ngoại trừ áo hạt) chứa chất độc ngƣời động vật Trong y học, Thông Đỏ loại dƣợc liệu quí Từ lâu dân gian, Thông Đỏ đƣợc dùng để điều trị hen suyễn, viên phế quản, nấc, số bệnh tiêu hóa, cành vỏ dùng trị bệnh giun đũa, nƣớc sắc Thông Đỏ non trị bệnh đau đầu… Năm 1963, hợp chất đƣợc tách chiết từ vỏ Taxus brevifolia, có hiệu nghiên cứu tiền lâm sàng: chống lại khối u thể Năm 1971, Taxol (Paclitaxel) - diterpenoid alkaloid, đƣợc xác định thành phần hợp chất (Wall & Wani, 1971) [32] Taxol thúc đẩy chế lắp ráp tubulin ổn định hiệu vi ống Hiệu đƣợc kiểm định lâm sàng để điều trị ung thƣ vú, buồng trứng, thực quản, bàng quang, nội cổ tử cung… Taxol đƣợc chấp thuận lần Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (U.S Food Drug Administration) dùng điều trị ung thƣ buồng trứng vào năm 1992 ung thƣ vú di vào năm 1994 (Suffness Wall, 1995) (theo Croteau, 2006) [16] Taxol đƣợc tách chiết thành công từ loài khác chi Taxus, nhƣ phận khác bao gồm phấn hoa, hạt giống, lá, thân rễ (Vidensek cộng sự, 1990; Witherup cộng sự, 1990; Fett-Neto cộng sự, 1992; Wickremesinhe Arteca, 1994) (theo D.T Nhut, 2007) [15] Vấn đề khó khăn gặp phải sản xuất Taxol nguồn cung cấp hạn chế với hàm lƣợng thấp Ƣớc tính cần 7000 kg vỏ để sản xuất đƣợc 1kg Taxol (Cragg cộng sự, 1993) [13] Mặt khác, tăng trƣởng chậm điều kiện tự nhiên, thời gian ngủ hạt giống kéo dài từ 1.5 năm đến năm (Steinfeld, 1992) (theo D.T Nhut, 2007) [15] Ngoài ra, từ phận nhiều loài Taxus thu nhận đƣợc hợp chất thứ cấp khác nhƣ lignan, flavonoid, steroid dẫn suất đƣờng Ngƣời ta tìm đƣợc khoảng 50 lignan, bao gồm neolignan vài terpenolignan Cụ thể T baccata (European yew), lignan đƣợc tìm thấy: lariciresinol, taxiresinol, 3’-demethylisolariciresinol-9’-hydroxyisopropylether, isolariciresinol Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS b Sự cảm ứng tạo rễ với Agrobacterium rhizogenes Chồi đƣợc chuẩn bị cách tƣơng tự nhƣ cảm ứng với auxin cho gốc chồi tiếp xúc với môi trƣờng, trình đƣợc thực 24h với dung dịch có chứa nhiều chủng Agrobacterium rhizogenes (OD = 0.6 600 nm - môi trƣờng dinh dƣỡng 20E; Werner cộng sự, 1975) có bổ sung 19.6 mg/l acetosyringone Sự hình thành rễ tỷ lệ sống sót môi trƣờng cảm ứng chủng A.r Marburg tốt so sánh với sử dụng IBA Mô sẹo hình thành nhƣ phân hủy gốc chồi giảm trình dài phát triển rễ sau cảm ứng Agrobacterium rhizogenes đặc biệt chủng A.r Marburg Sự đa dạng của chủng Agrobacterium có liên quan đến trạng thái chung chồi trình tạo rễ [17] Do đó, nhiều chủng Agrobacterium rhizogenes đƣợc sử dụng để cảm ứng tạo rễ, chất cảm ứng tự nhiên có khả hỗ trợ cho trình phát triển rễ, số trƣờng hợp kết tốt so với cảm ứng auxin c Sự phát triển rễ Sau thời gian cảm ứng, chồi đƣợc đặt trực tiếp miếng than bùn bão hòa nƣớc Những miếng than bùn đƣợc đặt vào nhữnh hộp kính nhỏ Trồng rêu miếng than bùn để ngăn cản công nấm Thời gian rễ phát triển kéo dài từ 5-7 tháng rễ thấy đƣợc bên miếng than bùn (hình 3.1 D) Vì lí này, hàm lƣợng ẩm miếng than bùn phải đƣợc kiểm tra hàng tuần (để tránh làm khô) 3.1.2.4 Trồng ruộng Sau rễ hình thành, đƣợc chuyển vào hộp huấn luyện rễ (RONAASH Ltd Scotlvà, 4.5 × 4.5 cm,cao 20 cm, có khoảng 40 con) đƣợc bón phân (EINHEITSERDE, mẫu VM) phun sƣơng áp lực cao (độ ẩm không khí 95%) Độ ẩm không khí đƣợc giảm dần thời gian tháng Giống nhƣ kim khác, có trạng thái khác quan sát trình tăng trƣởng chuyển đất, tăng trƣởng hƣớng thẳng hƣớng nghiêng Đối với tăng trƣởng Taxus, trạng thái có liên quan chặt chẽ đến cách xếp chồi kéo dài 69 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Lá đối xứng tỏa tròn số cho tăng trƣởng hƣớng thẳng, tƣơng tự nhƣ giống bình thƣờng Lá xếp thành hai hàng, số tăng trƣởng giống cành (branch-like) tăng trƣởng hƣớng nghiêng (Hình 3.1 E) Hai đặc điểm tăng trƣởng đƣợc quan sát chồi môi trƣờng nhân giống in vitro số dòng vô tính Chồi nhỏ (20mm) cho thấy tỉ lệ gần nhƣ (1:1) Số lƣợng chồi hình thành hình chữ V tăng lên suốt thời gian kéo dài Có liên quan chặt chẽ trình tăng trƣởng (hƣớng thẳng hƣớng nghiêng) cách xếp chồi (tỏa tròn hình chữ V) Chiều cao sau chuyển đất(>40 mm), chồi với đối xứng tỏa tròn thƣờng đƣợc hình thành đỉnh chồi xếp hình chữ V Tuy nhiên, mối quan hệ chồi với cách xếp chồi 1:1 [17] Quan sát thời gian tiếp theo, số biểu tăng trƣởng hƣớng thẳng thể trẻ hóa (rejuvenation) Kiểm tra rễ cắt từ trƣởng thành dẫn tới kết luận tăng trƣởng hƣớng thẳng chƣa đạt đƣợc kích thƣớc chuẩn sau thời gian năm đƣợc trồng đất Điều khác biệt sinh lý mô Taxus mẫu cấy ban đầu từ nhân giống giâm cành 3.1.3 Kết luận Vi nhân giống Taxus baccata từ cành giâm thực đƣợc Cảm ứng chồi bên bƣớc cần thiết bƣớc kéo dài chồi cảm ứng tạo rễ Sự cảm ứng kéo dài rễ đƣợc diễn môi trƣờng gần giống nhƣ đất Chủng Agrobacterium rhizogenes cải thiện hình thành rễ tỷ lệ sống 3.2 Vi nhân giống Taxus wallichiana Zucc Cho đến nay, hai loài Taxus đƣợc xác định Việt Nam T chinensis T wallichiana T chinensis phân bố tỉnh phía Bắc, T wallichiana mọc núi đá granite độ cao 1500m Lâm Đồng Chỉ có vài nghiên cứu tái sinh T wallichiana đƣợc báo cáo Kỹ thuật giâm cành đƣợc áp dụng thời gian 1994 - 1996 để bảo tồn T wallichiana Phân Viện Sinh Học Đà Lạt, với tỷ lệ rễ hình thành sau 90 ngày 38% (hình 3.2 A), chiều dài rễ trung bình - cm sau tháng [15] 70 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Đối với công tác bảo tồn nhân giống T wallichiana, loài có nguy tuyệt chủng cao có giá trị, phƣơng pháp nhân giống in vitro đƣợc phát triển thông qua cảm ứng chồi, tái sinh chồi rễ Hình 3.2: Kỹ thuật giâm cành đƣợc áp dụng cho Taxus wallichiana [15] A Sự rễ cành B Cành giâm đƣợc rễ sau tháng 3.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng MS có chứa khoáng vitamin đƣợc bổ sung với 20 g/l sucrose đƣợc sử dụng làm môi trƣờng mẹ suốt trình thí nghiệm Auxin NAA, IAA IBA, cytokinins BA đƣợc đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ khác (bảng 3.2, 3.3 3.4) Than hoạt tính đƣợc bổ sung để giảm tác động hợp chất phenolic đƣợc tạo từ mẫu cấy (Pan Staden, 1998) (theo D.T Nhut, 2007) [15] Môi trƣờng đƣợc làm đặc với 9g/l agar Giá trị pH môi trƣờng đƣợc điều chỉnh 5.8 - 5.9 cách thêm vào dung dịch NaOH 1N KCl 1N trƣớc khử trùng 121oC, atm (1.02 10 Pa) 71 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Bảng 3.2: Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng than hoạt tính bổ sung vào môi trƣờng MS ½ đƣợc sử dụng cho trình tăng trƣởng kéo dài chồi [15] Than hoạt tính Môi trƣờng NAA (mg/l) IAA (mg/l) IBA (mg/l) C1 - - - C2 - - - C3 - - - C4 - - - C5 - - - C6 - - - C7 - - - C8 - - - C9 - - - C10 - - 2.5 C11 2.5 - - (g/l) Bảng 3.3: Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng BA than hoạt tính đƣợc bổ sung vào môi trƣờng MS ½ để cảm ứng chồi bất định [15] Môi trƣờng Môi trƣờng BA (mg/l) Than hoạt tính (g/l) AB1 ½ MS - AB2 ½ MS - AB3 ½ MS - AB4 ½ MS 72 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Bảng 3.4: Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng, vitamin B1 than hoạt tính bổ sung vào môi trƣờng MS môi trƣờng MS ½ để cảm ứng hình thành rễ [15] Môi Môi trƣờng NAA IAA IBA Vitamin Than hoạt trƣờng (mg/l) (mg/l) (mg/l) B1 (mg/l) tính (g/l) R1 MS - - 10 - R2 MS - - 10 - R3 MS - - 10 - R4 ½ MS - - 10 - R5 ½ MS - - 10 - R6 ½ MS - - 10 - R7 ½ MS - - 10 - R8 ½ MS - - 10 - R9 ½ MS - - 10 - R10 ½ MS - - 2.5 - R11 ½ MS 2.5 - - - R12 ½ MS - 2.5 - - R13 ½ MS - - 2.5 - -  Điều kiện nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy phòng thí nghiệm 25 ± 2°C, độ ẩm tƣơng đối 7580%, cƣờng độ chiếu sáng từ 45–50 μmol.m–2.s–1, chu kỳ chiếu sáng 16h Mẫu cấy sử dụng thân non dài từ 1.5-2 cm và/hoặc chồi dài 2-2.5 cm 3.2.2 Các giai đoạn trình vi nhân giống 3.2.2.1 Chuẩn bị mẫu cấy Mẫu cấy đƣợc lựa chọn từ cành non mang nhiều chồi (hình 3.3) Sau 15 đến 25 ngày, thu mẫu cấy, lựa chọn mầm non, màu xanh, khỏe mạnh 73 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Hình 3.3: Thu thập mẫu cấy T wallichiana [15] A T wallichiana năm tuổi Phân Viện Sinh Học Đà Lạt B Cành có mang chồi ngủ C Chồi D Chồi non 3.2.2.2 Khử trùng mẫu cấy Sau thu thập, cành, thân non chồi đƣợc cắt thành đoạn dài cm rửa nhiều lần nƣớc cất vô trùng Nhúng mẫu cấy chất tẩy loãng từ 2530 ph, rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 1.5 đến 2h Khử trùng bề mặt với ethanol 70% 30s, 1/1000 HgCl2, đến giọt Tween-80 0.01% thời gian 10-12ph Sau đó, rửa bốn lần với nƣớc cất vô trùng 74 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm phụ thuộc vào loại mẫu cấy [15] Mẫu cấy Tỷ lệ nhiễm Cành 45 ngày tuổi 100% Thân non 25 ngày tuổi chồi 14 ngày tuổi 10% Mô tả Một số mẫu cấy bị nhiễm, hóa nâu chết Mẫu cấy không bị nhiễm, sống tăng trƣởng nhanh chóng Mẫu cấy lý tƣởng để thu thập khử trùng cành non 25 ngày tuổi chồi 14 ngày tuổi Sau khử trùng, mẫu đƣợc cắt thành đoạn dài - 2.5 cm, đặt dọc môi trƣờng nuôi cấy 3.2.2.3 Cảm ứng chồi Hầu hết mẫu cấy từ thân có màu xanh cho thấy phát triển bình thƣờng, mẫu cấy từ chồi có màu vàng, sau chuyển thành Mẫu cấy có tăng trƣởng chồi (%) màu nâu chết sau tuần nuôi cấy Môi trƣờng Hình 3.4: Tỷ lệ mẫu cấy T wallichiana môi trƣờng MS khác (không có có mặt than hoạt tính) cho thấy kéo dài chồi bên [15] 75 Chiều dài chồi (cm) Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Môi trƣờng Hình 3.5: Chiều dài chồi trung bình (cm) mẫu cấy T wallichiana môi trƣờng MS sửa đổi khác (không có than hoạt tính)[15] Môi trƣờng C4 tốt cho kéo dài chồi, môi trƣờng C7 thích hợp cho phát triển chồi bên Nồng độ auxin cao ức chế phát triển của chồi chồi nách dẫn tới hình thành mô sẹo Chồi kéo dài tốt môi trƣờng có chứa nồng độ thấp chất điều hòa tăng trƣởng (PRGs) (Chang cộng sự, 2001) [12] Hầu hết mẫu cấy nồng độ auxin mg/l mg/l cho thấy tốc độ tăng trƣởng chậm hơn, sản xuất hợp chất phenolic tạo thành mô sẹo Để khắc phục tình trạng này, bổ sung thêm than hoạt tính (2 g/l) vào môi trƣờng nuôi cấy đề giảm hình thành hợp chất phenolic thúc đẩy kéo dài chồi Nhƣ vậy, môi trƣờng tốt để cảm ứng chồi môi trƣờng có mg/l auxin có bổ sung thêm 2g/l than hoạt tính Chồi đƣợc tiệt trùng tăng trƣởng điều kiện in vitro Sau đó, chồi từ nguyên liệu ban đầu (ex vitro) chồi phát triển điều kiện in vitro sau tuần tuổi đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy 76 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Sau 10 tuần nuôi cấy, tất mẫu cấy ex vitro tăng trƣởng tốt, có màu xanh, mẫu cấy từ chồi in vitro tuần tuổi tăng trƣởng có màu vàng Bảng 3.6: Ảnh hƣởng chồi thân có nguồn gốc in vitro ex vitro chiều dài chồi bên (cm) tỷ lệ mẫu cấy có mang chồi [15] Môi trƣờng Mẫu cấy Chiều dài Mẫu cấy có chồi chồi bên (cm) (%) Ghi C10 Thân e 3.00 ± 0.15 100 Lá xanh C11 Thân e 6.25 ± 1.25 85.7 Lá xanh C10 Thân i 1.93 ± 0.92 52.9 Lá xanh C11 Thân i 2.29 ± 1.04 56.3 Lá xanh, 15.6 % C10 Chồi e 4.24 ± 1.69* 2.21 ± 1.59 100 36.8% có chồi bên 52.6 % có vàng C11 Chồi e 3.92 ± 1.69* 3.75 ± 2.25 85.7 Chồi dài 9.5 cm 28.6 % có vàng, theo sau tăng trƣởng chồi bên C10 Chồi i 0 Không có tăng trƣởng Lá hóa nâu chết C11 Chồi i 0 Không có tăng trƣởng Lá hóa nâu chết Ghi chú: Thân chồi e: nguồn gốc thân từ ex vitro (thân chồi đƣợc khử trùng) Thân chồi i: thân chồi in vitro *: chiều dài đỉnh chồi Đặt cành non từ nguyên liệu ban đầu, dài 1.5 - 2cm môi trƣờng nuôi cấy Theo nghiên cứu trƣớc đó, cytokinin cần thiết cho cảm ứng tạo chồi kim BA cho hiệu tốt Taxus mairei (Chang cộng sự, 2001) [12] Cảm ứng nhân chồi bất định từ cành non cho hiệu môi trƣờng có nồng độ thấp cytokinin (1 mg/l) 22.4 % mẫu cấy hình thành chồi bất định môi trƣờng sau tuần nuôi cấy, với chiều dài trung bình 0.75 cm Tỷ lệ tăng lên 87.5% sau 12 tuần nuôi cấy [15] 77 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS Trong môi trƣờng (1 mg/l BA) có bổ sung than hoạt tính (2g/l), tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi bất định 18% nhƣng chiều dài trung bình 1.3 cm Sau 12 tuần nuôi cấy, có 41.9% mẫu cấy tạo chồi bất định, 54.2% mẫu cấy hình thành mô sẹo [15] Hình 3.6: Vi nhân giống in vitro T wallichiana [15] A Chồi tái sinh môi trƣờng có chứa mg/l IAA B1 Chồi kéo dài môi trƣờng có chứa mg/l IAA B2 Cây non C1 C2 Cảm ứng chồi môi trƣờng bổ sung mg/l BA Nhƣ vậy, có mặt than hoạt tính chồi tăng kéo dài nhƣng số lƣợng chồi giảm Webb cộng (1988) chứng minh kéo dài chồi đƣợc kích thích than hoạt tính nhƣng than hoạt tính ức chế cảm ứng chồi có BA (theo D.T Nhut, 2007) [15] Điều giải thích tỷ lệ cảm ứng 78 Chƣơng 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG TAXUS chồi môi trƣờng than hoạt tính lại cao hẳn so với môi trƣờng có than hoạt tính sau 12 tuần nuôi cấy Nhƣ vậy, mẫu cấy T wallichiana, cảm ứng chồi môi trƣờng có BA bổ sung không bổ sung than hoạt tính Môi trƣờng than hoạt tính số lƣợng mẫu cấy nhiều nhƣng chiều dài chồi lại ngắn so với môi trƣờng có bổ sung than hoạt tính 3.2.2.4 Sự tạo rễ in vi tro Chọn cắt chồi (dài 1.5 - cm) để cảm ứng tạo rễ đặt môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung auxin với nồng độ khác Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trƣờng có than hoạt tính cho thấy tăng trƣởng mạnh mẽ, có màu xanh hình thành mô sẹo Tuy nhiên, hình thành rễ xảy môi trƣờng có bổ sung IBA (5 mg/l) với tỷ lệ 1-2 rễ/ mẫu cấy cho thấy IBA hiệu so với NAA 3.2.3 Kết luận Cảm ứng tạo chồi, kéo dài chồi tái sinh rễ mở khả cho nuôi cấy tế bào T wallichiana quy mô lớn đƣợc sử dụng cho khai thác Taxol 10deacetyl baccatin III Cũng nhƣ vi nhân giống Taxus baccata, vi nhân giống T wallichiana thực đƣợc từ cành giâm Thông qua phƣơng pháp vi nhân giống in vitro sản xuất số lƣợng lớn trồng phục vụ cho công tác bảo tồn nhân giống T wallichiana 79 Chƣơng 4: KẾT LUẬN Chƣơng 4: KẾT LUẬN Cây Thông Đỏ loại dƣợc liệu quý đƣợc ứng dụng nhiều y học, đặc biệt điều trị ung thƣ Thông Đỏ có phạm vi phân bố rộng giới trải dài từ vùng ôn đới đến vùng cận nhiệt đới, nhƣng phạm vi ngày bị thu hẹp tình trạng khai thác mức, nhƣ điều kiện sinh trƣởng khó khăn loài Một số loài loài đặc hữu tự nhiên phân bố khu vực định nhƣ Taxus floridana, Taxus globosa Hiện tại, hầu nhƣ tất loài Thông Đỏ chủ yếu đƣợc dùng làm cảnh, số loài nhƣ Taxus brevifolia đƣợc trồng theo quy mô lớn làm nguyên liệu dƣợc phẩm Ở Việt Nam xác định đƣợc hai loài Thông Đỏ Bắc Thông Đỏ Nam, quần thể đƣợc phát hai loài nhỏ, phân bố rải rác Đây loài có nguy tuyệt chủng cao cần có biện pháp bảo tồn nhƣ nhân giống loài thực vật có giá trị Taxol hợp chất Thông Đỏ, tính chất hóa học, cấu tạo, chế tác động bệnh ung thƣ nhƣ đƣờng sinh tổng hợp đƣợc nghiên cứu Taxol đƣợc phê chuẩn điều trị ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú di căn, Taxol đƣợc tiến hành thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thƣ phổi, ung thƣ đầu cổ…Hợp chất Taxol đƣợc thu nhận nhiều phƣơng pháp nhƣ tách chiết từ vỏ Thông Đỏ, tổng hợp phƣơng pháp hóa học, bán tổng hợp từ DAB, hay gần thu nhận phƣơng pháp nuôi cấy tế bào Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào để thu nhận hợp chất Taxol thay phƣơng pháp khác, góp phần phát triển bền vững môi trƣờng tự nhiên, mở rộng quy mô sản xuất lớn đáp ứng đƣợc nhu cầu điều trị ung thƣ ngày cao Vi nhân giống Thông Đỏ đƣợc thực thành công Taxus baccata, Taxus wallichiana mở bƣớc phát triển quan trọng công tác bảo tồn nhân giống Thông Đỏ, đặc biệt Việt Nam 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nƣớc Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc, Nguyễn Đức Tố Lƣu, Philip Ian Thomas, Aljos Farjon, Leonid Averyanov, Jacinto Regalado Jr, 2004 Thông Việt Nam: Nghiên cứu trạng bảo tồn Fauna & Flora International 129 trang Đỗ Đình Hồ, Đông Thị Hoài An, Nguyễn Thị Hảo, Phạm Thị Mai, Trần Thanh Lan Hƣơng, Đỗ Thị Thanh Thủy, Lê Xuân Trƣờng, 2008 Hóa sinh y học NXB Y học TP Hồ Chí Minh 477 trang Nguyễn Hoàng Lộc, 2006 Giáo trình công nghệ tế bào NXB Đại học Huế 200 trang Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006 Công nghệ tế bào NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 376 trang Nguyễn Đức Lƣợng, Nguyễn Thúy Hƣơng, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, 2006 Sinh học đại cương – Tập 1: Sinh học tế bào, sở di truyền học học thuyết tiến hóa NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 403 trang Nguyễn Đức Lƣợng, Nguyễn Thúy Hƣơng, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, 2006 Sinh học đại cương – Tập 2: Sinh học thực vật, sinh học động vật hệ sinh thái NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 391 trang Dƣơng Tấn Nhựt, 2007 Công nghệ sinh học thực vật – Tập NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998 Giáo trình Sinh hóa đại NXB Giáo Dục 488 trang Bùi Thị Tƣờng Thu, Trần Văn Minh, 2007 “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣơng bảo tồn phát triển Thông Đỏ Taxus wallichiana Zucc” Hội nghị Khoa học Công nghệ Phần IV: Công nghệ tế bào: 546 – 549 10 Mai Xuân Lƣơng, 2005 Giáo trình công nghệ sinh học thực vật Đại học Đà Lạt 76 trang Tài liệu tham khảo nƣớc 11 Hideji Itokawa, Kuo-Hsiung Lee, 2003 Taxus: The genus Taxus Taylor & Francis Inc 12 Chang S.H., Ho C.K., Chen Z.Z., Tsay J.Y., 2001 “Micropropagation of Taxus mairei from mature trees” Plant Cell Reports, 20: 496 – 502 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 Cragg M., Saul A Schepartz, Matthew Suffness, Michael R Grever, 1993 “The taxol supply crisis New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV agents” Journal of Natural Product, 56(10):1657 – 1668 14 Croteau R., Raymond E B Ketchum, Robert M Long, Rudiger Kaspera, Mark R Wildung, 2006 “Taxol biosynthesis and molecular genetics” Phytochemistry Reviews, 5: 75 – 97 15 D.T Nhut, N.T.T Hien, N.T Don, D.V Khiem, 2007 “In vitro shoot development of Taxus wallichiana Zucc., a valuable medicinal plant” Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, 107–116 16 Edward A Cope, 1998 “Taxaceae: The Genera and Cultivated Species” The Botanical review, 64 (4): 291 – 232 17 Ewald D., 2007 “Micropropagation of yew (Taxus baccata L.)” Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, 117–123 18 Expósito O., Bonfill M., Moyano E., Onrubia M., Mirjalili M.H., Cusidó1 R.M., Palazón J., 2009 “Biotechnological Production of Taxol and Related Taxoids: Current State and Prospects” Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 9: 109-121 19 Eric K Rowinsky, Ross C Donehower, 1995 “Review article: Paclitaxel (Taxol)” The New England Journal Of Medicine, 332 (15): 1004 – 1014 20 Frense D, 2007 “Taxanes: perspectives for biotechnological production” Applied Microbiology and Biotechnology, 73: 1233 – 1240 21 Guo B.H., Kai G.Y., Jin H.B., Tang K.X., 2006 “Taxol synthesis” African Journal of Biotechnology, (1): 015 – 020 22 Gordon M Cragg, David G.I Kingston, David J Newman, 2005 Anticancer agents from natural products Taylor & Francis Inc 23 Homare Tabata, 2004 “Paclitaxel Production by Plant-Cell-Culture Technology” Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 7: – 23 24 Matthew H Hils, 1993 “Taxaceae Gray Yew family” Flora of North America North of Mexico, 2:423 – 427 25 Priti Maheshwari, Sarika Garg, Anil Kumar, 2008 “Taxoids: Biosynthesis and in vitro production” Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 3(4): 071 – 087 26 Richard W Spjut, 2007 “Taxonomy and nomenclature of Taxus (Taxaceae)” Journal of the Botanical Research Institute of Texas, (1): 203 – 289 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 Sonia Malik, Rosa M Cusido, Mohammad Hossein Mirjalili, Elisabeth Moyano, Javier Palazon, Mercedes Bonfill, 2011 “Production of the anticancer drug Taxol in Taxus baccata suspension cultures: A review” Process Biochemistry, 46: 23 – 34 28 Walker K., Croteau R., 2001 “Taxol biosynthetic genes” Phytochemistry, 58: – 29 Wani M., Taylor H., Wall M., Coggon P., McPhail A., 1971 “Plant antitumor agents VI The isolation and structure of Taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia” Journal of the American Chemical Society, 93: 2325 – 2327 Website tham khảo 30 http://zipcodezoo.com/Plants/T/Taxus_wallichiana/ 31 http://www.conifers.org/ta/Taxaceae.php 32 http://plants.usda.gov/java/ 33 http://www.paigntonpictures.com/PathToSynthesis/Scheme.html 34 http://www.discoverlife.org/ 35 http://en.wikipedia.org/wiki/Taxus_wallichiana 83 [...]... loại, đặc điểm, phạm vi phân bố … cũng nhƣ về hợp chất Taxol, tính chất lý hóa, con đƣờng sinh tổng hợp, cơ chế và ứng dụng của Taxol trong điều trị ung thƣ Cuối cùng, trình bày một số kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro trên một số loài Thông Đỏ nhƣ Taxus baccata L và Taxus wallichiana Zucc 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cây Thông đỏ 2.1.1 Giới thiệu chung về họ Taxaceae... cảnh Các nghiên cứu đã chứng minh, Taxus baccata có chứa hợp chất Taxol, một hợp chất dùng trong điều trị ung thƣ Lá và hạt có chứa nhiều alkaloid, đặc biệt là taxine, cực độc, dễ bị thủy phân thành hydrotaxine, ngoài ra cũng chứa các hợp chất glucoside và taxicatine Lá già và khô độc hơn so với lá còn non, thƣờng xuyên gây độc cho động vật, ngựa và lừa có thể bị chết trong vòng một giờ sau khi ăn Đối... [26] Taxus brevifolia là cây đơn tính khác gốc, cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, chiều cao từ 15(- 25) m, đƣờng kính 50(- 140) cm Thân cây thẳng, tán có hình nón Vỏ cây có vảy, vảy bên ngoài màu nâu tím hoặc nâu tía, vảy bên trong màu đỏ hoặc đỏ tím, vảy có kích thƣớc khác nhau (20 - 50 mm) Năm đầu tiên, chồi non có màu xanh đƣợc bao phủ bởi lá vảy, cành cây có màu nâu đỏ giống vỏ cây vào năm thứ 3 Lá xanh,... lại đây và từng bƣớc đạt đƣợc một số thành công bƣớc đầu chủ yếu trên lĩnh vực nhân giống in vitro Hiện nay đã xác định đƣợc 2 loại Thông Đỏ là Thông Đỏ Bắc (Taxus chinensis Pilg.), phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng cao nhƣ Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang và Thông Đỏ Nam (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố rải rác ở một số tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dƣơng) [1] Tuy nhiên, quần thể Thông Đỏ này trong... dụng Taxus floridana có chứa hợp chất Taxol, có hoạt tính giống nhƣ hợp chất Taxol đƣợc tìm thấy trong Taxus brevifolia và T canadensis Tuy nhiên, vì đây là loài quý hiếm nên nó không đƣợc khai thác làm nguồn dƣợc liệu 2.1.3.6 Taxus globosa a Tên thƣờng gặp Mexican yew (Hartzell, 1991) b Mô tả đặc điểm Cây thân gỗ hoặc cây bụi, cao khoảng 4 - 6 m Lá có màu xanh nhạt, lớn và sắc nhọn hơn so với Taxus... taxoid đƣợc biết đến và một số có khả năng làm tiền chất để sản xuất Taxol, một số khác có tác dụng tƣơng tự thậm chí vƣợt trội hơn so với Taxol Điều này cho thấy tiềm năng của nhiều loài Taxus vẫn chƣa đƣợc khai thác hết, nó hứa hẹn sẽ là nguồn cung cấp dƣợc liệu quan trọng cho điều trị ung thƣ và nhiều loại bệnh khác trong hiện tại và tƣơng lai Việc nghiên cứu trên cây Thông Đỏ ở Việt Nam còn rất... của cây (ngoại trừ áo hạt) có độc tính nhẹ, cây đƣợc sử dụng rộng rãi bởi ngƣời dân bản xứ Họ sử dụng các bộ phận của cây nhƣ lá cành làm thuốc trị bệnh thấp khớp, viêm khớp, một số bệnh liên quan tới đƣờng tiêu hóa, và sử dụng làm dƣợc liệu xông để điều trị cảm sốt Taxus canadensis đã đƣợc chứng minh là một nguồn cung cấp hợp chất Taxol cũng nhƣ có chứa 2 loại taxane có thể sử dụng để tổng hợp Taxol. .. lƣợng cao hợp chất taxane trong Taxus canadensis, nó trở thành một trong những nguồn cung cấp hợp chất taxane có giá trị nhất trong ngành công nghiệp dƣợc phẩm 2.1.3.4 Taxus cuspidata a Tên thƣờng gặp Japanese yew, Ichii, Onko (Japanese) (Hartzell, 1991) [31] 21 Chƣơng 2: TỔNG QUAN b Mô tả đặc điểm Cây cao khoảng 20 m, tán cây hình kim tự tháp, trong canh tác chủ yếu là cây bụi Vỏ cây có vảy, màu đỏ nâu... nếu dùng để chiết xuất Taxol thì số liều thuốc chữa trị ung thƣ cũng chỉ là một con số rất nhỏ (D.T Nhut, 2007) Từ thực trạng này, cho thấy việc nhân giống cây Thông Đỏ bằng các phƣơng pháp in vitro và đƣa ra trồng đại trà là cần thiết để cung ứng cho nhu cầu điều trị ở trong nƣớc Đồ án này đƣợc thực hiện với mục đích đƣa ra một cái nhìn tổng quan về cây Thông Đỏ ở trên thế giới và Việt Nam, phân loại,... 2.14: Taxus cuspidata Siebold & Zucc [32] A Bụi cây B Nón đực C Áo hạt trƣởng thành và chƣa trƣởng thành D.Hạt giống E Vỏ và thân cây c Phạm vi phân bố: Bắc Hàn Quốc; Trung Quốc: Heilonjiang, Cát Lâm, Nei Mongol, Liêu Ninh, Hà Bắc, Thiểm Tây, và Sơn Tây; Nga: Đông và Nam lƣu vực sông Amur (bao gồm Sakhalin và Kurile) [26] Nhật Bản: Hokkaido, Honshu, Shikoku và Kyushu (Hartzell, 1991; Farjon, 1998) [31]