protein

Enzyme là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein.Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Sở dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzyme.Như vậy, enzyme là các protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), enzyme sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó.Hầu hết phản ứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4 000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym.Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Chất ức chế là các phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng hoạt tính của enzym.Mục lục• 1 Tính chất của enzym • 2 Trung tâm hoạt động của enzym • 3 Tính đặc hiệu của enzym • 4 Hoạt độ enzym Tính chất của enzym1. enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.2. tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực.3. không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môt trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.4. enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện.5. enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase . và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein)Trong phân tử enzym hai cấu tử có hai phần• apoenzym: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzym, quyết định tính đặc hiệu)• coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym), bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp. Trung tâm hoạt động của enzym1. Trong quá trình xúc tác của enzym chỉ có một phần tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động".2. Cấu tạo đặc biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của enzym.3. Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin thường phân bố trên những phần khác nhau của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thành trung tâm hoạt động. Sự kết hợp của các nhóm chức của các acid amin, thường gặp là -SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOH của aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch .4. Trong "enzym hai cấu tử" ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức kết hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm Ngư­êi­thùc­hiÖn­:­Phạm­Văn­Hải I Trạng thái tự nhiên: Prôtêin có thể người, động vật thực vật: Trứng, thịt, máu, sữa, tóc, sừng, móng, rễ, thân, lá, quả, hạt II Định nghĩa_Thành phần cấu tạo phân tử • Định nghĩa: polipeptit cao phân tử có phân tử khối từ vài chục ngàn đến vài chục triệu đvC α-aminoaxít protein đơn giản + (axít nucleic, lipit, gluxit) protein phức tạp • Thành phần nguyên tố chủ yếu protein C, H, O, N lượng nhỏ S, P, kim loại… • Cấu tạo : Protein có phân tử khối lớn, từ vài vạn đến vài triệu đơn vị cacbon có cấu tạo phức tạp Dạng rỗng Dạng đặc • • Protein Tạo thành liên kết peptit kết hợp amino axit chuỗi poli peptit Các protein khác khác thành phần amino axit trật tự xếp chúng LIÊN KẾT PEPTID Khi đun nóng protein dung dịch axit thu hỗn hợp amino axit, chất đơn giản axit aminoaxetic H2N-CH2-COOH Ngược lại, cách cho phân tử amino axit kết hợp với nhau, người ta tạo loại protein đơn giản Cấu trúc không gian prôtêin bao gồm có bậc cấu trúc? Cấu trúc protein gồm có bậc cấu trúc là: cấu trúc bậc 1, 2, Đặc điểm bậc cấu trúc prôtêin Loại cấu trúc Đặc điểm Bậc - Axit amin liên kết với nhờ liên kết peptit tạo chuỗi polypeptit có dạng mạch thẳng Bậc Chuỗi polypeptit xoắn lò xo hặc gấp nếp nhờ liên kết hiđrô nhóm peptit gần Bậc - Do cấu trúc bậc xoắn lại tạo thành cấu trúc không gian chiều Bậc - Được hình thành từ vài chuỗi pôlipeptit có dạng hình cầu đặc trưng Hình ảnh III Tính chất: Phản ứng thủy phân Khi đun nóng protein dung dịch axit bazơ, protein bị thủy phân sinh amino axit Protein + nước t0 Hỗn hợp amino axit axit bazơ – NH – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH – CO - + n HOH R R’ R” NH2– CH – COOH + NH2 –CH – COOH + NH2 – CH – COOH + R R’ R” tO H+ Thí dụ : gly-ala-glyxin NH2- CH2 – CO – NH -CH(CH3)- CO – NH -CH2-COOH + 2HOH → NH2-CH2-COOH + NH2-CH(CH3)- COOH NH2- CH2 – CO – NH -CH(CH3)- CO– NH -CH2-COOH + HOH + HCl → NH3Cl - CH2-COOH + NH3Cl - CH(CH3)- COOH NH2- CH2 – CO –NH -CH(CH3)- CO – NH -CH2-COOH + NaOH → NH2-CH2-COONa + NH2-CH(CH3)- COONa + H2O Sự phân hủy nhiệt Khi đun nóng mạnh nước, protein bị phân hủy tạo chất bay có mùi khét Sự đông tụ Khi đun nóng cho thêm hóa chất protein đông tụ vón cục IV Chức - Ứng dụng Protein Chức • • • • • • Cấu tạo nên tế bào thể Dự trữ acid amin Vận chuyển chất Bảo vệ thể Thu nhận thông tin Xúc tác cho phản ứng hoá sinh 2 Ứng dụng - Là thực phẩm quan trọng người động vật - Làm nguyên liệu công nghiệp dệt, da, mĩ nghệ… Phan Tuấn Hải – THCS Tây An – Tây Sơn – Bình Định HỆ THỐNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI GST (HỌ VECTOR pGEX)I. Đặc điểm của họ vector pGEX:• Có chứa promoter tac điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu được cảm ứng bằng IPTG hoặc các chất có cấu trúc tương tự.• Vùng gen lacIq là dạng đột biến của gen lacI tạo ra lượng lớn repressor của lac operon (lacO) trong tế bào chủ E.coli.• Điểm khởi đầu sao chép Ori: là vị trí DNA polymerase của tế bào vi khuẩn gắn vào và bắt đầu quá trình sao chép plasmid.• Gen kháng Ampicillin làm nhân tố sàng lọc các tế bào không có plasmid trong quá trình biến nạp khi trải lên môi trường chọn lọc có ampicillin. • Việc tách rửa cho phép thu nhận protein dung hợp ra khỏi cột ái lực trong điều kiện ôn hoà để đảm bảo tính kháng nguyên và hoạt tính chức năng của protein.• Có vị trí nhận biết cho enzyme protease PreScission™, thrombin, or factor Xa để cắt protein mục tiêu ra khỏi sản phẩm protein dung hợp.• Có vị trí kết thúc phiên mã nằm sau vùng MCS.Hệ thống pGEX có tất cả 13 vectors. Trong đó có 9 vectors là có vùng MCS mở rộng giúp dễ dàng trong việc dòng hoá, chứa 6 vị trí nhận biết cho enzyme cắt giới hạn:• pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, and pGEX-6P- mã hoá cho trình tự nhận biết vị trí cắt đặc hiệu của protease PreScission™ giữa domain GST và MCS. • pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, and pGEX-4T-3 bắt nguồn từ pGEX-2T và chứa vị trí nhận biết cho thrombin. • pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, and pGEX5X-3 là các dẫn xuất của pGEX-3X và có vị trí nhận biết cho factor Xa. II. Đặc tính của các vector pGEX:• Cảm ứng: promoter tac được cảm ứng bởi IPTG (1-5 mM).• Biểu hiện: protein được biểu hiện là protein dung hợp với protein GST (26 kDa). Gen GST chứa 1 codon khởi đầu ATG và vị trí kết hợp với ribosome, và chịu sự kiểm soát của promoter tac. Mỗi ORF đều có codon kết thúc quá trình dịch mã. Protein dung hợp được tinh sạch bởi kit tinh sạch protein dung hợp với GST.• Vị trí cắt của protease PreScission™: pGEX-6P-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi enzyme cắt PreScission™. Bởi vì PreScission™ đã được xử lý với tag GST. Tag GST sẽ được loại bỏ đồng thời với protein GST ra khỏi protein dung hợp.• Vị trí cắt của enzyme thrombin: pGEX-1λT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi thrombin. • Vị trí cắt cho fator Xa: pGEX-3X, pGEX-5X-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi factor Xa.• Đánh dấu trực tiếp trong điều kiện in vitro: pGEX-2TK cho phép đánh dấu P32 protein dung hợp trong điều kiện in vitro bởi tiểu phần xúc tác protein kinase phụ thuộc cAMP.• Tế bào chủ: E.coli. plasmid mang gen ức chế lacIq.• Marker chọn lọc: plasmid chứa gen kháng ampicillin 100 µg/ml.II.1. pGEX-2T:• Vùng gen GST: promoter tac:-10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết ribosome: 244; codon khởi đầu ATG: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935.• MCS:930-945.• Vùng gen cho beta-lactamase: Promoter: -10: 1309-1314; -35: 1286-1291; codon khởi đầu (ATG): 1356; codon kết thúc (TAA): 2214.• Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3297; codon kết thúc (TGA): 4377.• Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2974; vùng cấn thiết cho sao chép: 2281-2977.• Trình tự primer: 5’ pGEX trình tự primer kết hợp ở nucleotide 869-891; 3’ pGEX trình tự primer kết hợpơơ3 nucleotides 1020-998.II.2. pGEX-2TK:• Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome cho GST:244; codon khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935;• Vùng mã hoá cho vị trí cắt Enzyme là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein.Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Sở dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzyme.Như vậy, enzyme là các protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), enzyme sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó.Hầu hết phản ứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4 000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym.Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Chất ức chế là các phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng hoạt tính của enzym.Mục lục• 1 Tính chất của enzym • 2 Trung tâm hoạt động của enzym • 3 Tính đặc hiệu của enzym • 4 Hoạt độ enzym Tính chất của enzym1. enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.2. tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực.3. không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môt trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.4. enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện.5. enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase . và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein)Trong phân tử enzym hai cấu tử có hai phần• apoenzym: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzym, quyết định tính đặc hiệu)• coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym), bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp. Trung tâm hoạt động của enzym1. Trong quá trình xúc tác của enzym chỉ có một phần tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động".2. Cấu tạo đặc biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của enzym.3. Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin thường phân bố trên những phần khác nhau của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thành trung tâm hoạt động. Sự kết hợp của các nhóm chức của các acid amin, thường gặp là -SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOH của aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch .4. Trong "enzym hai cấu tử" ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức kết hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn Tinh sạch protein I. Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau: 1. Nhận biết protein mục tiêu 2. Ly trích protein từ tế bào 3. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực 4. Phân tách protein bằng điện di trên gel 5. Xác định trọng lượng và khối lượng của protein II. Nhận biết protein mục tiêu Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng. III. Ly trích Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein. Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein. 1. Tủa bằng muối Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out). Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel. Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch. Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa. Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đó S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối: Hình 1. Độ tan theo nồng độ muối Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế, khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu. Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. 2. Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi: ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D) Trong đó S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ Sw: độ hòa tan của protein trong nước D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào Dw: hằng số điện môi của nước R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối A: hằng số khí Công thức trên cho thấy: khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được [...]...III Tính chất: 1 Phản ứng thủy phân Khi đun nóng protein trong dung dịch axit hoặc bazơ, protein sẽ bị thủy phân sinh ra các amino axit Protein + nước t0 Hỗn hợp amino axit axit hoặc bazơ – NH – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH – CO - + n HOH R R’ R” NH2– CH – COOH + NH2 –CH – COOH + NH2 –... -CH2-COOH + 3 NaOH → 2 NH2-CH2-COONa + NH2-CH(CH3)- COONa + H2O 2 Sự phân hủy bởi nhiệt Khi đun nóng mạnh và không có nước, protein bị phân hủy tạo ra những chất bay hơi và có mùi khét 3 Sự đông tụ Khi đun nóng hoặc cho thêm hóa chất protein sẽ đông tụ và vón cục IV Chức năng - Ứng dụng của Protein 1 Chức năng • • • • • • Cấu tạo nên tế bào và cơ thể Dự trữ các acid amin Vận chuyển các chất Bảo vệ cơ thể Thu ... triệu đvC α-aminoaxít protein đơn giản + (axít nucleic, lipit, gluxit) protein phức tạp • Thành phần nguyên tố chủ yếu protein C, H, O, N lượng nhỏ S, P, kim loại… • Cấu tạo : Protein có phân tử... rỗng Dạng đặc • • Protein Tạo thành liên kết peptit kết hợp amino axit chuỗi poli peptit Các protein khác khác thành phần amino axit trật tự xếp chúng LIÊN KẾT PEPTID Khi đun nóng protein dung dịch... trưng Hình ảnh III Tính chất: Phản ứng thủy phân Khi đun nóng protein dung dịch axit bazơ, protein bị thủy phân sinh amino axit Protein + nước t0 Hỗn hợp amino axit axit bazơ – NH – CH – CO