Nguyên tắc và ứng dụng phân tích trình tự của nucleic acid

Nguyên tắc và ứng dụng phân tích trình tự của nucleic acid

GVHD: GVHD:TS TS.NGUYỄN NGUYỄNVĂN VĂNDUY DUY NHÓM NHÓM::88 LỚP: LỚP:52CNSH 52CNSH TỔNG QUAN NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP A Khái niệm:  Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA trình xác định trật tự nucleotide đoạn DNA  Trình tự DNA mã hóa thông tin cần thiết thể sống tồn tái sản sinh  Giải mã trình tự nucleotit xem việc đánh dấu mẫu dò triệt để hệ gen với tính chọn lọc cao B Mục đích:  Xác định xác trật tự xếp cặp trọng đoạn DNA Phân tích trình tự đơn vị mang thông tin di truyền Lí giải cách mà thể tồn Hiểu biết trình tự DNA trở nên hữu ích với nghiên cứu sinh học ứng dụng So sánh tương đồng gen loài xác định đột biến  Là kĩ thuật xác định tất hợp phần nucleotide hình thành nên phân tử DNA  Các công trình “DNA sequencing” công bố Maxam va Gilbert (1977), Sanger cộng (1977)  Cấu trúc chuỗi DNA chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn liên kết với liên kết hidro Trên dãy có chuỗi base, tập hợp bốn nucleotide : A, T, C, G  Kĩ thuật DNA sequencing sử dụng kĩ thuật điện di với gel loại polyacrylamide có độ phân giải cao PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC TYPE PHƯƠNG PHÁP ENZYME PYROSEQUENCING  Dựa vào thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự phương pháp hóa học  Nguyên tắc phương pháp hoá học Allan Maxam Walter Gilbert sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ (P32), xử lí hoá học để phá huỷ nucleotit tạo hàng loạt đoạn ADN có kích thước khác STEPS Step Step Step Step DNA sợi kép biến tính thành dạng sợi đơn Đánh dấu phóng xạ (P32) đầu 5' Sử dụng hoá chất phá huỷ loại nucleotit định điện di gel poliacrylamid Hóa chất Dimethyl sulfate pH Base bị ảnh hưởng G Piperidine formate pH A+G Hydrazine A+ T Hydrazine + 1,5 M NaCl Nhiệt độ cao (900C), 1,2 M NaOH C A >C  Khi dNTP bắt cặp bổ sung, gắn với sợi DNA khuôn nhờ DNA polymerase kèm theo giải phóng PPi PPi biến đổi thành ATP nhờ enzyme ATP sulfyrelase với tham gia APS, sau phản ứng xúc tác licuferase biến đồi luciferin thành oxyluciferin - tạo ánh sánh nhìn thấy, có độ sáng tương ứng với lượng ATP tạo thành Ánh sáng nhận viết camera phân tích chương trình phần mềm  Ưu điểm kỹ thuật pyrosequencing tính linh hoạt cao kết cặp primer, phân tích nhiều đột biến, liệu thông tin trình tự tập hợp đầy đủ  Hệ thống giải trình tự 400-600 triệu bp 10 giá thành thấp giải trình tự lượng lớn DNA với thời gian định so với sử dụng phương pháp Sanger – nhiều ngày để giải trình tự lượng DNA tương đương  Các sợi khuôn đem giải trình tự chuẩn bị hai phương pháp là: chuẩn bị sợi khuôn pha rắn – solid phase template preparation (streptavidin-coated magnetic bead, hạt thủy tinh từ tính có bọc streptavidin) chuẩn bị sợi khuôn mang enzyme – enzymatic template preparation (apyrase exonuclease)       Phát đột biến Nghiên cứu trình tiến hoá phân tử Phục hồi gen tồn hàng triệu năm Chọn giống vật nuôi, trồng Lựa chọn cặp cha mẹ chủng thời gian ngắn Xác định loài mới, loài đặc hữu phưng pháp di truyền phân tử Y học – Khoa học hình     Chuẩn đoán xác bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus Chuẩn đoán sớm bệnh gây ung thư, bệnh di truyền Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm Là kỹ thuật cho kỹ thuật khác như: RAPD, SSR… Việt nam có 300.000 liệt sỹ vô danh Việc trả lại tên cho liệt vô danh đưa liệt sỹ với gia đình, người thân công việc toàn xã hội đặc biệt quan tâm  Ty thể bào quan quan trọng tế bào, nằm nguyên sinh chất tế bào  Trình tự DNA gen ty thể thường ổn định qua thời gian dài lịch sử tiến hoá khác biệt trình tự gen ty thể thành viên có quan hệ di truyền theo dòng mẹ  Ở người DNA ty thể có 16569 cặp bazơ (nucleotide) có chứa tổng cộng 37 gen mã hoá sản phẩm, có vùng không mã hoá gọi vùng kiểm soát hay vùng D-Loop có chứa nhiều đặc điểm cấu trúc DNA đặc trưng cho cá thể sử dụng cho mục đích giám định hình truy nguyên nguồn gốc cá thể xác định mối quan hệ huyết thống theo dòng mẹ Sơ đồ 1: Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ DNA ty thể inheritance (maternal) • Lấy lượng nhỏ xương hài cốt để tách chiết DNA ty thể Phòng thí nghiệm để tách DNA ty thể phải có môi trường DNA ty thể có khả nhiễm cao • Sau tách đươc DNA ty thể từ hài cốt tiến hành nhân bội DNA vùng D-loop máy PCR để thu lượng lớn DNA ty thể phục vụ cho việc giải trình tự • Giải trình tự DNA vùng D-loop Sau giải trình tự DNA ty thể mẫu cần giám định, trình tự so sánh với phần mềm SeqScape2.5, so sánh thông qua trình tự chuẩn Anderson để tìm mối quan hệ huyết thống chúng với http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1977_Gilbert.php http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Obenr ader/sanger_method_page.htm http://baigiang.violet.vn/present/same/entry_id/4791342 Phương pháp xác định trình tự DNA PGS.TS NÔNG VĂN HẢI ( Viện công nghệ sinh học ) Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương Một số tài liệu internet [...]... viết bởi một camera và phân tích bởi một chương trình phần mềm  Ưu điểm của kỹ thuật pyrosequencing là tính linh hoạt cao khi kết cặp primer, phân tích được nhiều đột biến, dữ liệu và thông tin trình tự tập hợp được đầy đủ  Hệ thống giải trình tự được 400-600 triệu bp trong 10 giờ vì vậy giá thành thấp hơn khi giải trình tự lượng lớn DNA với thời gian nhất định so với khi sử dụng phương pháp Sanger... lại gắn vào DNA template tương ứng với nó và DNA polymerase III sẽ xúc tác cho quá trình sao chép và quá trình tổng hợp bắt đầu  Quá trình tổng hợp để tạo ra chuỗi DNA mới sẽ diễn ra cho tới khi có một ddNTP tới bổ sung vào chuỗi mới thì phản ứng lúc này cũng dừng lại  Tùy thuộc vào thời điểm ddNTP gắn vào mà đoạn DNA (DNA fragments) thu được sẽ có chiều dài ngắn khác nhau Xác định trình tự DNA template... tính  Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu DNA được điện di trong các ống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary)  Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ra trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra rất nhanh, kỹ thuật này cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ trong vòng 15 phút  Ngoài ra một kỹ thuật mới là sử dụng sắc ký khối phổ... thuât có độ phân giải cao trước đây dùng để phân tích protein  Sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionizatio n time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA trong vài phút Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự chú ý  Sáng tạo đầu tiên bởi Pal Nyrén và Mostafa Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996  Nguyên lý “giải trình tự bằng việc... template  Trình tự của chuỗi DNA template có thể xác định gián tiếp thông qua trình tự của chuỗi DNA mới tạo thành, dựa trên nguyên lí bổ sung cho nhau  Nung nóng ở mỗi lọ để tách các DNA fragments mới ra khỏi DNA template  DNA fragments sẽ được đưa riêng rẽ vào một môi trường gọi là polyacrylamide gel để điện di ĐIỆN DI .VÀ ĐỌC KẾT QUẢ Việc xác định trình tự Nucleotide đơn giản hơn khi xử dụng các... xử dụng các hệ thống tự động  Dựa trên phương pháp Sanger  Với kỹ thuật này thì primer hay các ddNTP được đánh dấu phóng xạ và các sản phẩm DNA được khuếch đại tương tự như trong kỹ thuật PCR Chỉ cần một phản ứng duy nhất và sản phẩm tạo ra là một dãy các phân tử DNA mà phân tử này dài hơn phân tử kia một nucleotide  Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị phóng xạ, thay vào đó là các hóa chất... Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng deoxynucleotit không có nhóm OH ở vị trí 3' do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polinucleotit enzyme polimerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotit thì quá trình tổng hợp bị dừng lại Kết quả tạo ra các đoạn DNA có kích thước hơn kém nhau một nucleotit, trên cơ sở đó xác định được trình tự nucleotit Frederick Sanger STEPS Step... một hạt thủy tinh, và sẽ được khuếch đại bằng PCR trong các giọt nhũ dầu-nước, tạo ra nhiều bản sao đoạn DNA trên mỗi hạt thủy tinh Sau đó các hạt thủy tinh được giữ trong các tấm picotiter trên một cơ chất dạng sợi, và giải trình tự  Sợi khuôn DNA đơn sau khi PCR, được lai với một primer giải trình tự và sau đó được ủ với các enzyme DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase cũng như... giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng ddNTP  Kỹ thuật này có tính nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp giải trình tự truyền thống với độ chính xác là 99,9% với các đoạn 200 bp và 99% với các đoạn 400 bp  Đầu tiên DNA được cắt thành các đoạn đầu bằng (blunt end), và được gắn các oligonucleotide adaptor vào cả hai đầu Từng đoạn... pháp Sanger – mất nhiều ngày để giải trình tự một lượng DNA tương đương  Các sợi khuôn đem giải trình tự có thể được chuẩn bị bằng cả hai phương pháp là: chuẩn bị sợi khuôn pha rắn – solid phase template preparation (streptavidin-coated magnetic bead, hạt thủy tinh từ tính có bọc streptavidin) và chuẩn bị sợi khuôn mang enzyme – enzymatic template preparation (apyrase và exonuclease) ...TỔNG QUAN NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP A Khái niệm:  Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA trình xác định trật tự nucleotide... vụ cho việc giải trình tự • Giải trình tự DNA vùng D-loop Sau giải trình tự DNA ty thể mẫu cần giám định, trình tự so sánh với phần mềm SeqScape2.5, so sánh thông qua trình tự chuẩn Anderson... primer, phân tích nhiều đột biến, liệu thông tin trình tự tập hợp đầy đủ  Hệ thống giải trình tự 400-600 triệu bp 10 giá thành thấp giải trình tự lượng lớn DNA với thời gian định so với sử dụng