NGUYỄN THỊ LAN ANH KHẢO sát QUÁ TRÌNH sử DỤNG ALGINAT và PECTIN để tạo VI NANG ĐÔNG tụ CHỨA lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG ALGINAT VÀ PECTIN ĐỂ TẠO VI NANG ĐÔNG TỤ CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH Mã sinh viên: 1501020 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG ALGINAT VÀ PECTIN ĐỂ TẠO VI NANG ĐƠNG TỤ CHỨA Lactobacillus acidophilus KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiên Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hồn thành tổ Vi sinh – Bộ mơn Cơng nghiệp Dược Trong suốt thời gian thực khóa luận, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè, gia đình Với tất kính trọng lịng biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đàm Thanh Xuân Ths Lê Ngọc Khánh, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi từ ngày tơi hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chị kĩ thuật viên môn Công nghiệp Dƣợc, Bào chế Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, ủng hộ tơi q trình học tập sống Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CẤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN………………………………………………………2 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.3 Các hệ bào chế chế phẩm probiotic 1.2 Đại cương prebiotic 1.2.1 Khái niệm prebiotic 1.2.2 Tác dụng prebiotic với sức khỏe 1.3 Loài L acidophilus 1.3.1 Đặc điểm hình thái điều kiện ni cấy 1.3.2 Vai trò 1.4 Khái niệm vi nang vi nang hóa 1.4.1 Định nghĩa 1.4.2 Đặc điểm vi nang 1.4.3 Ưu điểm vi nang 1.4.4 Nhược điểm vi nang 1.4.5 Phương pháp vi nang hóa 1.4.6 Phương pháp tách pha đông tụ 1.5 Một số thành phần sử dụng vi nang probiotic 1.5.1 Pectin 1.5.2 Tinh bột 10 1.5.3 Alginat 11 1.6 Một số nghiên cứu sử dụng pectin bào chế thuốc 12 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………… .14 2.1 Nguyên liệu thiết bị 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.5 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Lựa chọn nồng độ nguyên liệu để tạo vi nang khảo sát số đặc tính vi nang tạo thành 16 2.2.2 Theo dõi số lượng VSV hàm ẩm vi nang Alg-Tb-Pec trình bảo quản 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp nhân giống 17 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3 Phương pháp vi nang hóa sử dụng kĩ thuật tách pha đông tụ 17 2.3.4 Phương pháp đông khô 18 2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm 18 2.3.6 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên tục 18 2.3.7 Phương pháp tiệt khuẩn 20 2.3.8 Phương pháp xác định hình ảnh bề mặt vi nang kính lúp soi Nikon 20 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 21 3.1 Lựa chọn nồng nguyên liệu tạo vi nang khảo sát số đặc tính vi nang tạo thành 21 3.1.1 Khảo sát nồng độ CaCl2 pectin để tạo vi nang 21 3.1.2 Phối hợp vi nang với alginat tinh bột 24 3.1.3 Khảo sát đặc tính vi nang pectin phối hợp với alginat tinh bột28 3.2 Theo dõi số lượng VSV hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 trình bảo quản 32 3.2.1 Đánh giá khả bao gói vi sinh vật vi nang P1A3Tb10 32 3.2.2 Đánh giá độ ẩm vi nang P1A3Tb10 trình bảo quản 35 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT… ………………………………….38 4.1 Kết luận 38 4.1.1 Nồng độ tạo vi nang đặc tính vi nang tạo thành 38 4.1.2 Theo dõi số lượng VSV hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 trình bảo quản 38 4.2 Đề xuất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Alg : Alginat AP : Amidated pectin ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony Forming Units) FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) ISAPP : Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotic Prebiotic HMP : High methyl pectin kl/tt : Khối lượng/thể tích LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria) LMP : Low methyl pectin MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (De Man, Rosoga and Sharpe) MT : Môi trường Pec : Pectin SGF : Dịch dày mô (Stimulated Gastric Fluid) Tb : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus .5 Hình 1.2 Cấu trúc đơn vị Galacturoic acid phân tử pectin Hình 1.3 Mơ hình hộp trứng pectin .10 Hình 1.4 Cấu trúc acid β-D-mammuronic (M) acid α-L-guluronic (G) 12 Hình 3.1 Hình ảnh vi nang tạo thành với nồng độ CaCl2 pectin khác 22 Hình 3.2 Hình ảnh mẫu vi nang trước đông khô 25 Hình 3.3 Hình ảnh mẫu vi nang kính soi Nikon độ phóng đại 10 lần 25 Hình 3.4 Quá trình tạo thành gel calci alginat 26 Hình 3.5 Hình ảnh mẫu vi nang sau đông khô .27 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm mẫu vi nang sau đơng khơ 29 Hình 3.7 Độ rã mẫu vi nang môi trường mô dịch dày pH 1,231 Hình 3.8 Khuẩn lạc L acidophilus bao vi nang P1A3Tb10 môi trường MRS thạch trước bảo quản 32 Hình 3.9 Khuẩn lạc L acidophilus bao vi nang môi trường MRS thạch sau tháng bảo quản .33 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào L.acidophilus vi nang P1A3Tb10 sau đông khô trình bảo quản .34 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 sau đông khô trình bảo quản 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm pectin Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu .15 Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ CaCl2 pectin đến trình hình thành hạt 21 Bảng 3.2 Thể chất, hình dạng hạt vi nang trước đông khô 25 Bảng 3.3 Thể chất, hình dạng vi nang sau đông khô .27 Bảng 3.4 Hàm ẩm mẫu sau đông khô .28 Bảng 3.5 Số lượng tế bào L acidophilus vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ q trình bảo quản 33 Bảng 3.6 Hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ q trình bảo quản35 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện probiotic biết đến nhóm vi sinh vật sống có lợi tìm thấy hệ vi sinh đường ruột người, mang lại nhiều lợi ích cho người như: tăng cường miễn dịch, chống tác nhân bệnh tật [2] Tuy nhiên dùng theo đường uống, tỷ lệ sống sót probiotic thấp qua dày dễ bị tác động bất lợi yếu tố pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm [3] Vi nang hóa probiotic với polymer có nguồn gốc tự nhiên alginat, chitosan, carrageenan giúp bảo vệ probiotic khỏi tác động bất lợi di chuyển đường tiêu hóa Với lợi ích vượt trội đó, nhiều nghiên cứu tiến hành nước giới Mỗi loại probiotic định phù hợp với prebiotic định Nhiều nghiên cứu thực xác định synbiotic tiềm sở kết hợp prebiotic probiotic Một số nghiên cứu gần phối hợp alginat với số prebiotic inulin, pectin [59] q trình vi nang hóa với mục đích tăng cường số lượng vi sinh vật probiotic sống đại tràng Tiếp nối nghiên cứu probiotic, đề tài: “Khảo sát trình sử dụng alginat pectin để tạo vi nang đông tụ chứa Lactobacillus acidophilus” thực với mục tiêu sau: Lựa chọn nồng độ nguyên liệu để tạo vi nang khảo sát số đặc tính vi nang tạo thành Theo dõi số lượng VSV hàm ẩm vi nang Pec-Alg-Tb trình bảo quản chứa alginat cao chế phẩm chứa pectin Cụ thể là, mẫu vi nang chứa pectin 3% tinh bột 10% có độ ẩm thấp 2,02 %, nồng độ tinh bột 10% thay pectin 3% alginat 3% độ ẩm tăng lên đáng kể (3,25 %) Độ ẩm cao hạt Ca - alginat chất ưa nước alginat Hàm ẩm mẫu chứa tinh bột nhỏ 5%, thỏa mãn yêu cầu độ ẩm chế phẩm probiotic đơng khơ Vì vậy, tiến hành tạo vi nang với nồng độ pectin 1%, alginat 3% tinh bột 10 % thích hợp vi nang thu có cảm quan, thể chất tốt so với dạng nguyên liệu khác Cụ thể là, hàm ẩm vi nang thấp (2,85 %) so với vi nang khác, vi nang sau đông khô giữ cấu trúc ban đầu, đồng đều, khơng méo mó, hạt khơng dính vào 3.1.3.2 Khảo sát độ rã vi nang môi trường mô dịch dày pH 1,2  Mục tiêu Đánh giá độ rã vi nang môi trường mô dịch dày pH 1,2  Tiến hành Tiến hành tạo vi nang, mẫu vi nang có chứa tá dược với tỉ lệ sau: P1A3; P1A3Tb10; P3Tb10; A3Tb10 (phương pháp nêu mục 2.3.3) Cho 1.00 g mẫu vào bình nón chứa 100 ml dung dịch HCl pH 1,2 Ủ bình tủ ấm 37ᵒC, lắc với tốc độ 75 vòng/phút h  Kết P1A3 P1A3Tb10 30 P3Tb10 A3Tb10 Hình 3.7 Độ rã mẫu vi nang môi trường mô dịch dày pH 1,2  Nhận xét & Bàn luận Sau lắc dịch dày mô pH 1,2 sau h, tất mẫu vi nang bị trương nở (trừ mẫu pectin 1%, alginat 3%) không bị rã Các mẫu vi nang trương nở tăng kích thước sau ủ dịch dày mơ Sự trương nở nguyên nhân sau: Thứ nhất, thành phần tinh bột vi nang tiếp xúc với nước dịch dày mơ nhanh chóng hấp thu nước tăng thể tích Thứ hai, ion hóa trị I dịch dày mô H+, Na+ thay ion Ca2+ có vi nang calci alginat, làm ion Ca2+ mơ hình “vỉ trứng”, độ bền gel calci alginat giảm [21] Dù vậy, thời gian ủ 60 phút, thay ion diễn với số lượng nhỏ, vi nang khơng xảy tượng rã theo chế hịa tan gel Bên cạnh đó, theo số nghiên cứu trước đó, [50] pectin khơng bị phân hủy enzyme có đường tiêu hóa điều kiện pH 1,2 mà bị phân hủy enzyme có đại tràng, vi nang pectin không bị rã môi trường mô dịch dày Vì vậy, lựa chọn nồng độ CaCl2 2% pectin 1% để tạo vi nang Phối hơp vi nang pectin 1% với alginat 3%, tinh bột 10% để cải thiện thể chất vi nang Vi nang P1A3Tb10 tạo thành có hình dạng cầu, thể chất dai, Hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 sau đông khô thấp (2,85 %), vi nang đồng đều, không méo mó, hạt khơng dính vào Kết đánh giá độ rã vi nang môi trường mô dịch dày (pH 1,2) cho thấy sau vi nang trương nở không rã 31 3.2 Theo dõi số lƣợng VSV hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 trình bảo quản 3.2.1 Đánh giá khả bao gói vi sinh vật vi nang P1A3Tb10  Mục tiêu Để phát huy tác dụng có lợi vật chủ, probiotic phải đạt số lượng đầy đủ sau uống Thí nghiệm thiết kế để xác định số lượng vi sinh vật bao gói vi nang  Tiến hành Tạo hạt vi nang P1A3Tb10 có chứa L acidophilus (phương pháp nêu mục 2.3.3) Tiến hành đông khô hạt thu (phương pháp nêu mục 2.3.4) Xác định số lượng vi sinh vật vi nang (phương pháp nêu mục 2.3.5)  Kết Hình 3.8 Khuẩn lạc L acidophilus bao vi nang P1A3Tb10 mơi trường MRS thạch trước bảo quản 32 Hình 3.9 Khuẩn lạc L acidophilus bao vi nang P1A3Tb10 môi trường MRS thạch sau tháng bảo quản Bảng 3.5 Số lượng tế bào L acidophilus vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ q trình bảo quản Số lƣợng VSV Mẫu CFU/ g Log CFU/ g Mẫu CFU/ g Log CFU/ g Mẫu CFU/ g Log CFU/ g Sau đông khô Sau tháng Sau tháng 3,58x108 2,02 x108 7,88 x107 8,55 8,31 2,68x108 1,63 x108 8,43 8,21 3,32x108 8,52 1,33 x108 8,12 7,59 6,68x107 7,57 6,47x107 7,5 Trung bình CFU/ g Log CFU/ g 3,19x108 8,5 1,66 x108 8,22 33 7,01x107 7,85 Số lƣợng VSV (log CFU/g) 8.6 8.4 8.2 7.8 7.6 7.4 Ngay sau đông khô Sau tháng Sau tháng Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào L acidophilus vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ q trình bảo quản  Nhận xét & Bàn luận Sự bao gói VSV vi nang giúp bảo vệ VSV khỏi điều kiện bất lợi đường tiêu hóa Tuy nhiên bao gói cần đảm bảo VSV phải giải phóng vào đến ruột với lượng tối thiểu 106-107 CFU/g (theo tiêu chuẩn FAO/WHO chế phẩm probiotic) Vi nang P1A3Tb10 bước đầu bao gói L acidophilus với số lượng 3,19x108 Nhìn chung, mật độ vi sinh vật bao gói thời điểm khảo sát mức cao (> 107CFU/g) Do vi nang P1A3Tb10 tạo thành theo phương pháp tách pha đông tụ đáp ứng yêu cầu chế phẩm probiotic số lượng vi sinh vật nhốt giữ Về số lượng VSV bao gói, từ kết bảng 3.5 cho thấy số lượng VSV vi nang giảm dần trình bảo quản Lượng VSV sau đông khô đạt 3,19x108 Sau 12 tuần, số lượng VSV vi nang giảm xuống 7,01x107, đạt 107 cfu/g Như vậy, việc phối hợp alginat 3% với tinh bột 10% pectin 1% tạo thành công nguyên liệu đông khô dạng vi nang với thể chất thích hợp lượng vi sinh vật phù hợp Sau tháng, nguyên liệu giữ độ ổn định đạt yêu cầu nguyên liệu probiotic 34 Lượng vi sinh vật giảm dần q trình bảo quản giải thích sau: Khả sống sót L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố pH, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, mơi trường ni cấy, bảo quản), nhiệt độ, độ ẩm [2], [25] Trong đó, L acidophilus vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc (vi hiếu khí) nên nồng độ oxy hịa tan đóng vai trị đáng kể việc hạn chế sống sót vi khuẩn [28] Trong q trình bảo quản, oxy ẩm từ môi trường khuếch tán qua bao bì nên thời gian bảo quản dài lượng vi sinh vật giảm 3.2.2 Đánh giá độ ẩm vi nang P1A3Tb10 trình bảo quản Một yêu cầu quan trọng nguyên liệu probiotic phải giữ thể chất trình bảo quản Hàm ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến vi khuẩn lactic, cần thiết phải tiến hành đánh giá hàm ẩm thời gian bảo quản  Mục tiêu Theo dõi hàm ẩm nguyên liệu probiotic thời gian bảo quản  Tiến hành Tạo mẫu nguyên liệu vi nang từ sinh khối 100 ml dịch lên men với thành phần tá dược dịch tạo hạt là: alginat 3%, pectin 1%, tinh bột 10% (phương pháp nêu mục 2.3.3) Tiến hành đông khô mẫu (phương pháp nêu mục 2.3.4) Nguyên liệu sau lấy khỏi đĩa petri bảo quản túi polyme đựng lọ nhựa PE kín 4ᵒC Tiến hành đo hàm ẩm thời điểm: sau đông khô, sau tuần, 12 tuần (làm lần để lấy kết trung bình)  Kết Bảng 3.6 Hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 sau đông khơ q trình bảo quản Hàm ẩm (%) Ngay sau đông khô Sau tháng Sau tháng Lần 2,67 2,63 3,02 Lần 2,45 2,81 3,09 Lần 2,53 2,78 3,13 Trung bình 2,85 2,91 3,03 35 Hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 (%) 3.5 2.5 1.5 0.5 Ngay sau đông khô Sau tháng Sau tháng Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 sau đông khô trình bảo quản  Nhật xét & Bàn luận Hàm ẩm vi nang P1A3Tb10 tương đối ổn định theo thời gian, sau 12 tuần, điều kiện bảo quản, hàm ẩm mẫu tăng từ 2,85% lên 3,03% (