Sự trợ giúp của các kỹ thuật này đối với các phương pháp chọn giống thực vật thông thường đã thúc đẩy quá trình tạo ra các giống cây trồng mới có nhiều đặc tính nông sinh học quí.. Các t
Trang 1MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 2PHẦN I: MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học đang là một khoa học mũi nhọn trong các khoa học sự sống nó góp phần tích cực trong sự phát triển mọi mặt của xã hội loài người Cách mạng công nghệ sinh học đã thực sự ra đời vào đầu thập niên 70 của thế kỷ XX
Những đóng góp của di truyền học vào việc nâng cao năng suất và sản lượng cây trồng được xếp vào hàng thứ 2, sau những tiến bộ đạt được về phân bón, thủy lợi và nông hóa Trong 2 thập kỷ cuối của thế kỷ XX và đầu thế kỷ XXI các kiến thức thức và kỹ thuật sinh học hiện đại đặc biệt trong các lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào, công nghệ sinh học và sinh học phân tử đã phát triển rất nhanh chóng Sự trợ giúp của các kỹ thuật này đối với các phương pháp chọn giống thực vật thông thường đã thúc đẩy quá trình tạo ra các giống cây trồng mới có nhiều đặc tính nông sinh học quí Và trong các kỹ thuật đó kỹ thuật chuyển gen nói chung và chuyển gen ở thực vật nói riêng là một kỹ thuật đóng vai trò vô cùng to lớn
Những bước phát triển của kỹ thuật chuyển gen thực vật đã bắt nguồn từ những thành công của các hệ thống chuyển gen ở động vật có vú và nấm men Qua một số thập kỷ nghiên cứu, kỹ thuật này đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể Trong bài viết này tôi xin phép được trình bày một số ít trong các thành tựu to lớn
và rực rỡ đó
Trang 3PHẦN II: TỔNG QUAN 2.1 Một số vấn đề chung nhẩt về chuyển gen ở thực vật [2].
Chuyển gen đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi cấy mô
và tế bào thực vật Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen Ngoài ra, nó mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa về kinh tế vào cây trồng
2.1.1 Khái niệm về cây chuyển gen.
Cây chuyển gen là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay
vì thông qua lai tạo
Những gen được đưa vào có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn
Thực vật được tạo ra như thế gọi là “cây chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất
cả các loài thực vật đều được chuyển gen từ các loài tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài
2.1.2 Các thao tác cơ bản của quá trình chuyển gen.
Chuyển gen được thực hiên qua các bước sau:
- Xác định được gen liên quan đến tính trạng quan tâm và nhân được gen đó
- Gắn gen vào vector biến nạp
- Biến nạp vào E coli để tạo dòng
- Thiết kế vector chuyển gen, chuyển gen vào tế bào vật chủ
- Nuôi cấy mô tế bào để tạo mô sẹo
- Tạo cây chuyển gen trong ống nghiệm
Trang 4- Mang cây chuyển gen ra thực tế.
- Đánh giá và chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh
2.1.3 Một số phương pháp chuyển gen cơ bản.
2.1.3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp.
* Chuyển gen bằng Agrobacterium.
* Phương pháp thông qua virus.
2.1.3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp.
* Phương pháp dùng súng bắn gen
* Phương pháp xung điện.
* Phương pháp siêu âm.
* Phương pháp sử dụng hóa chất.
* Phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm.
* Phương pháp chuyển gen qua ống phấn.
2.2 Một số thành tựu đã đạt được.
2.2.1 Cây trồng chuyển gen kháng sâu
* Sử dụng gen GNA trong phòng chống rầy mềm “aphid”.
Đối với loài côn trùng thuộc họ Homoptera như rầy nâu hoặc các loài khác truyền bệnh virus cho cây trồng, người ta ghi nhận hợp chất lectin có từ nguồn thực vật gây độc đối với chúng và nhóm lectin Galantus nivalis agglutinin – GNA có độc tính mạnh nhất [7] GNA làm giảm khả năng sinh sản làm chậm sự phát triển của rầy mềm Birch và Cs (1999) đã thành công trong việc chuyển nạp gen GNA
vào cây khoai tây (solanum tuberosum L.) Nhóm tác giả sử dụng clone LECGNA2
thể hiện kèm theo promoter CaMV35S để chuyển nạp Cây khoai tây chuyển gen
có tính kháng cao với rầy mềm Myrzu percicae và Adalia bipunctata Sự thể hiện
Trang 5GNA trên lá khoai tây đã được quan sát trên cây chuyển gen Các tác giả còn ghi nhận: mức độ tiêu thụ thức ăn của rầy mềm, tổng số trứng đẻ, tỉ lệ trứng hữu thụ, tuổi thọ của rầy trưởng thành, để kết luận về hiệu quả của gen GNA trong cây khoai tây với kết luận: lectin của GNA ảnh hưởng làm giảm tuổi thọ và khả năng sinh dục của rầy mềm, đặc biệt trên con cái; lectin của cây khoai tây chuyển gen
được tìm thấy gắn ở tế bào màng ruột rầy mềm vivo; sự biểu hiện gen điều khiển
lectin diệt rầy mềm trên cây khoai tây chuyển gen có thể có hiệu quả ngược đối với
thiên địch của cả 2 loại rầy mềm (M percicae và A bipunctata) thông qua chu
trình biến giải thức ăn của nó [3]
2.2.2 Cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ.
Khi được hỏi, bất cứ người nông dân nào cũng trả lời rằng cỏ dại luôn là một vấn
đề gây lo lắng cho họ Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy nước, chất dinh dưỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để mọc mà còn là nơi cư trú cho côn trùng và các loại sâu bọ gây bệnh, gây tắc nghẽn hệ thống tưới tiêu, làm giảm sút chất lượng mùa màng, và còn đem theo cả hạt giống cỏ vào cây trồng được thu hoạch Nếu không được thu hoạch, nếu không được kiểm soát, cỏ dại sẽ làm giảm đáng kể năng suất cây trồng Nghiên cứu về cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ đang là vấn đề đáng được quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới
* Khoai lang chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ.
Khoai lang là cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới, với diện tích trên 10 triệu
ha trên thế giới Nó là cây lương thực được xếp hạng thứ 7 Khoai lang là cây trồng
ít cần sự đầu tư, năng suất ổn định, thích nghi với điều kiện khắc nghiệt mà cây lương thực khác không trồng được Nó có khả năng chống chịu khô hạn, trồng được trên đất kém dinh dưỡng và hạn chế khả năng đầu tư Trong ngân hàng gen
Trang 6khoai lang, không có mẫu giống nào thể hiện tính kháng thuốc cỏ Người ta tìm
cách đưa gen bar vào một loài nấm men (yeast) thông qua kỹ thuật cải biên di
truyền Các nhà khoa học Hàn Quốc đã thành công trong việc tạo ra giống khoai lang kháng được thuốc cỏ glufosinate Vấn đề đáng lo ngại là việc sử dụng gen bar như vậy sẽ có thể gây ra hiện tượng dòng chảy của gen do tạp giao, tạo ra vấn đề
mà người ta gọi đó là “siêu cỏ”, (super weeds) Nhưng khoai lang là cây trồng không có tính chất tạp giao như vậy trên đồng ruộng [13]
2.2.3 Cây trồng chuyển gen chống chịu stress.
* Cây cải Raphanus sativus chuyển gen tăng khả năng kháng mặn và hạn.
Park BJ và cs (2005) đã thành công trong việc chuyển một nhóm gen LEA
(Late Embryogenesis Abundant) gồm có 3 gen từ cây cải Brassica napus vào và làm tăng khả năng chịu hạn và mặn cho cây Raphanus sativus Tác giả sử dụng cả phương pháp siêu âm kết hợp với chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Dòng
vi khuẩn được sử dụng là dòng Agrobacterium LBA4404 với vector nhị thể PBI121
– LEA Nhóm gen này sau khi được chuyển vào được phân tích bằng PCR, lai Southern blot, Westhern blot Qua trồng thử nghiệm trong điều kiện hạn và mặn thì những cây được chuyển gen sinh trưởng vượt trội so với những cây không có nhóm
3 gen trên Như vậy nhóm protein của 3 gen LEA này làm tăng tính chịu hạn và
mặn trong cây cải Raphanus sativus [6].
* Thuốc lá chuyển gen kháng mặn.
Tiến sĩ Narendra Tuteja và các đồng nghiệp thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền Quốc tế tại New Delhi, Ân Độ đã công bố một kỹ thuật mới cho việc sản xuất cây trồng chịu mặn
Trang 7Hình 2.2.1: Thuốc lá chuyển gen kháng mặn
Tiến sĩ Tuteja và nhóm nghiên cứu của bà đã sử dụng gen mã hoá cho DNA helicases, loại enzim có tác dụng tách
DNA trong suốt quá trình sao chép
gen Một helicase tìm thấy trong cây
đậu Hà Lan cụ thể là chất PDH45 đã
tăng khả năng chống chịu với nồng độ
muối cao, sự khử nước và nhiệt độ
thấp Kết quả của nhóm nghiên cứu đã
cho thấy sau khi họ chuyển gen
PDH45 vào cây thuốc lá, thì cây này không chỉ tiếp tục tăng trưởng trong điều kiện
độ mặn cao, mà còn dẫn đến việc các thế hệ tiếp theo của cây này giữ được gen và tiếp tục chịu được độ mặn cao
Các nhà nghiên cứu phát hiện thấy việc thể hiện gen này trong cây thuốc lá tương tự như khả năng chịu mặn Tuy nhiên, mặc dù cây thuốc lá chuyển gen được thử nghiệm trong điều kiện sinh trưởng khó khăn, nhưng chúng vẫn tiếp tục lớn lên, ra hoa và tạo quả với số lượng hạt kích thước hạt, trọng lượng hạt và kích thước quả tương đương với những loại cây trồng hoang dại không phải chịu mặn [11]
RoyChoudhury và Cs (2007) cũng đã chuyển thành công một gen có tên là Rab16A từ cây lúa vào cây thuốc lá bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi
khuẩn Agrobacterium làm cho cây thuốc lá cũng tăng tính kháng mặn cao Các thí
nghiệm đã thành công và thấy rằng gen được chuyển vào được gắn và di truyền ổn định trong genome của cơ thể mới là cây thuốc lá chuyển gen [8]
Trang 8* Cây cải dầu chuyển gen kháng mặn và chịu hạn.
Tháng 11/ 2007 vừa rồi, một nhóm các nhà khoa học đứng đầu là Brini F và các Cs đã nghiên cứu và chuyển thành công một gen liên quan đến tính chịu mặn là
DHN – 5 (thuộc nhóm gen kháng mặn - dehhydrin) từ cây lúa mì Triticum durum vào cây cải dầu Arabidopsis thaliana tạo cây cải dầu chuyển gen có tính kháng mặn
và chịu hạn cao Các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi thử nghiệm cây chuyển gen
trong môi trường chọn lọc và thấy rằng cây cải Arabidopsis thaliana sinh trưởng
mạnh trong điều kiện nồng độ muối NaCl và khô hạn cao, mặt khác thử nghiệm còn thấy rằng hàm lượng prolin tăng một cách đáng kể trong những cây này [4] Prolin là một yếu tố có thể kích hoạt sự điều tiết gen đối với hiện tượng co nguyên sinh trong cây lúa trong điều kiện bị mặn hay khô hạn Trong điều kiện như vậy thì hàm lượng prolin ra tăng rất nhanh [1] Sự tích lũy prolin trong cây cải dầu chuyển gen được coi như là kết quả của sự thể hiện gen thành công trong cây cải dầu – một minh chứng cho việc thành công trong thí nghiệm này
2.2.4 Cây trồng chuyển gen chống vi sinh vật gây bệnh.
* Cây chuyển gen kháng nấm.
Bệnh đốm vằn trên cây lúa do nấm Rhizoctonia sonali gây ra là một loại
bệnh chưa có giống kháng tuyệt đối Người ta đã nghiên cứu ứng dụng việc chuyển nạp gen chitinase vào cây lúa để kiểm soát bệnh này Lin và Cs (1995) đã sử dụng một đoạn phân tử của genome cây lúa có kích thước 1.1kb chứa gen chitinase và promoter CaMV35S Sau đó chúng được clone hóa trong vector pGL2, các tác giả
đã sử dụng phương pháp chuyển nạp gen bằng PEG qua tế bào trần thu được 202 cây tái sinh, từ 61 cây trồng trong nhà kính có 28 cây hữu thụ được ghi nhận Phân tích protein từ lá của những cây ở thế hệ T1 gen chitinase đều có thể hiện trong
Trang 9những cây này Con lai của những cây có chitinase đã được thanh lọc bệnh đốm vằn cho thấy mức độ kháng bệnh tương quan với mức độ thể hiện gen chitinase trong cây lúa [5]
* Cây chuyển gen kháng vi khuẩn.
Bệnh bạc lá lúa (BB) do vi khuẩn Xanthomonas orvzae pv oryzae là một
trong những bệnh quan trọng trong sản xuất lúa gạo Một gen trội kiểm soát tính
kháng BB đã được tìm thấy ở một loài lúa hoang ở Châu Phi được kí hiệu là Xa –
21 có phổ kháng rất rộng đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh bạc lá, do vậy nó có
tính kháng ổn định hơn so với những gen khác đã được phân lập trước đây Tu và
Cs (1998) đã sử dụng phương pháp chuyển nạp gen Xa – 21 vào giống lúa indica IT72 Các tác giả thực hiện chuyển nạp gen Xa – 21 với 2 plasmit pC822 và
pROB5 có gắn promoter CaMV35S Sau khi tiến hành chuyển gen và phân tích di
truyền các tác giả đã đi đến kết luận locus gen Xa – 21 đã được cài vào trong hệ
gen của cây lúa, điều khiển tính kháng BB và phân ly theo tỷ lệ 3:1 [9]
2.2.5 Cây trồng chuyển gen sản xuất protein.
* Cây lúa chuyển gen sản xuất vaccine chống dị ứng.
Hạt phấn của cây Cryptomeria japonica( cây thông liễu Nhật Bản) là tác
nhân gây dị ứng viêm mũi, hen suyễn và viêm màng kết cho người và chó, bệnh này còn gọi là bệnh sốt mùa hè đang tồn tại ở Nhật Bản Biện pháp rẻ tiền nhất để phòng bệnh này kiểm soát môi trường không khí, làm giảm ô nhiễm, tăng cường sức khỏe, tăng cường sức chống chịu của cơ thể Vaccin cũng là biện pháp đã được
đề cập
Nhóm các nhà khoa học Nhật Bản là Yang và Cs (2007) đã nghiên cứu và
phân lập gen cryJ1 từ cây Cryptomeria japonica và cho dung hợp với glutelin của
Trang 10Hình 2.2.2 : Một cánh đồng thuốc lá
cây lúa có trong phôi mầm sau đó cho thể tái tổ hợp này biểu hiện trong cây lúa Những allergens CryJ1 như thế này sẽ tạo ra hoạt tính rất thấp của “IgE-binding” nhưng nó chứa đựng tất cả những dạng epitopes của “T-cell” thuộc về tác nhân dị ứng này Có khoảng 15% protein hạt của cây lúa chuyển gen có gluteline ở dạng dung hợp – CryJ1 protein Các tác giả tiến hành thử nghiệm trên chuột, họ cho một nhóm chuột ăn lúa hàng ngày, trong khoảng vài tuần rồi cho chúng phơi nhiễm với phấn hoa của cây thông liễu Kết quả là chúng tạo ra ít histamine hơn - hóa chất gây các triệu chứng sốt mùa hè và hắt hơi ít hơn so với nhóm chuột đối chứng [10], [12]
Sản phẩm của protein tái tổ hợp này có thể được sử dụng phổ biến, an toàn
và hiệu quả
2.2.6 Cây chuyển gen có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và cây có hợp chất đặc biệt.
* Cây thuốc lá chuyển gen làm sạch đất nhiễm độc.
Chất nổ TNT không những có sức công phá mạnh mà còn khiến đất bị nhiễm độc, gây nguy hiểm cho động vật và cây
trồng Đến nay, người ta vẫn chưa tìm ra
cách tự nhiên và rẻ tiền để làm sạch các
vùng đất đó Trong hoàn cảnh này, trồng
cây thuốc lá chuyển gene sẽ là giải pháp
kỳ diệu, vì nông dân vừa có thu hoạch,
vừa cải tạo được đất
Nhóm khoa học của Neil Bruce, Đại học Cambridge (Anh) đã cấy gene của
vi khuẩn enterobacter cloacae vào cây thuốc lá sau đó trồng cây thuốc lá chuyển
gene trong một dung dịch có nồng độ TNT rất cao (các cây trồng khác sẽ chết sau vài ngày) Sau khoảng hai tuần, nhóm khoa học thấy rằng nồng độ TNT giảm đi
Trang 11một nửa Quá trình này xảy ra là do gen của vi khuẩn được cấy vào đã sản sinh ra một loại enzym ở rễ cây, hấp thụ và chuyển đổi TNT qua một chuỗi các phản ứng hóa học Trong thời gian này, cây thuốc lá vẫn phát triển bình thường Như vậy bằng phương này người ta có thể khử các chất độc trong đất thành những chất không độc hại mà chỉ bằng phương pháp trồng cây
Theo nhóm khoa học, bên cạnh cây thuốc lá, người ta cũng có thể biến đổi gene của một số cây to và lớn nhanh khác, ví dụ cây dương, để làm sạch đất [14]
* Cà chua mang gen tạo độc chất của ếch giúp kháng bệnh
Các nhà khoa học Canada đã khám phá ra rằng trên da của một số loài ếch sống ở vùng Nam Mỹ có chứa một số loại độc chất giúp chúng chống lại các loại bệnh tật do vi sinh vật gây ra Một họ các chất độc này có tên là demarseptin Các độc chất này ngoài việc giúp ếch chống lại các tác nhân gây hại trên da mà còn chống lại các tác nhân gây hại khác Thành viên có độc lực cao nhất trong họ demarseptin này là demarseptin B1 Các nhà nghiên cứu đã tách gen mã hóa cho
loại độc chất này từ da của loài ếch Phyllomedusa bicolo sống trên cây ở rừng mưa
vùng Nam Mỹ, nơi mà điều kiện độ ẩm và nhiệt độ cao thích hợp cho các loại nấm
mốc và vi khuẩn sinh sôi nảy nở và chuyển vào cây cà chua (Sonalum tuberosum
L) làm cho cà chua cũng có khả năng tạo ra loại độc chất này Và kết quả cho thấy cây cà chua biến đổi gen có thể kháng lại sự xâm nhiễm của nhiều lọai nấm mốc và
vi khuẩn gây bệnh, như bệnh thối rễ, trụi cây, …