Các phương pháp phân tích và định tính Listeria Monocytogenes

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH Khoa CNSH & KTMT MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM Phương pháp phân tích vi khuẩn Listeria monocytogenes GVHD: THS TRẦN QUỐC HUY NHÓM Danh sách nhóm • Phạm thị mợng tùn • Lê hờng ngun • Hờ thị diễm sương • Ngũn thị ngọc cẩm • Phạm thị quỳnh • Nguyễn thị tường vi • Ngũn tùn • Hoàng thị hờng hạnh Nội dung Listeria monocytogenes Đặt vấn đề Giới thiệu Phương pháp phân tích Kết luận Tài liệu tham khảo ĐẶT VẤN ĐỀ • Tầm quan trọng của vi khuẩn Listeria monocytogenes – Tiêu thụ thực phẩm ăn tăng – Gây bệnh hội – Tỉ lệ tử vong cao (30 – 40)% – Sinh trưởng thực phẩm lạnh – Cơ chế kháng lại bệnh listeriosis  thực phẩm nhiễm ko đến được tay người tiêu dùng TỔNG QUAN Giới: Bacteria Ngành: Fitmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Listeriaceae Giống: Listeria Loài: Listeria Hình 1: Cấu trúc tế bào L monocytogenes monocytogenes Kích thước gen lồi L monocytogenes khoảng 3,0 Mb (Ganbank/EMBL_accession number AL591824) TỔNG QUAN • Đặc tính - Trực khuẩn nhỏ, Gram dương, kị khí không bắt buộc, không sinh bào tử, di động - Sinh trưởng – 44 oC (opt 25 – 37) oC - Được phân lập từ đất, nước cống, xác thực vật, ruột động vật, ruột người, - Yếu tố gây độc: từ listeriolysin O, tạo pha sinh trưởng số mũ của tế bào, tác nhân xâm nhập vào tế bào thể , giải phóng đợc tớ, gây nên sự chết của tế bào TỞNG QUAN • Bệnh và biện pháp phòng chữa • 1-7 ngày nhiễm listeriosis: – Người thường: sốt nhẹ, sôi bụng, tiêu chảy – Người mẫn cảm: nôn, đau đầu, sôi bụng, tiêu chảy, sốt – Phụ nữ có thai: nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm não, viêm màng tim  Biện pháp phòng tránh:  kiểm soát nguồn lây nhiễm từ nhà máy  Đảm bảo vệ sinh thực phẩm ăn uống  Không sử dụng các sản phẩm sữa cô đặc, phomai Phương pháp phân tích Truyền thống ELISA Hiện đại Lai phân tử PCR • Phương pháp trùn thớng Tăng sinh Ủ 37oC 24 48h Khuẩn lạc Listeria có màu sám hay nâu bao quanh vòng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm Đờng nhất 25 g mẫu + 225ml Mtr LBI, 30’ Ủ ở 30 o C , 24h Chuyển 0,1ml sang LBII, Ủ ở 30 o C , 24h ria Trãi môi trường thạch Oxford Agar • Xác định các chỉ tiêu Phân lập • Phương pháp hiện đại Phương pháp ELISA Chuẩn bị mẫu (tăng sinh lần 30tắ – c350C Nguyên 24h, tăng sinh lần 300C 22 – 24h) • Cho mẫu vật vào giếng để 30 Sử dụng kháng cấp phủ bên phút, ởthể 35 –sơ 370C giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ phép thu Thêm khángthể thể thứ có gắn giữ cách sửphức dụnghợp kháng tín enzyme enzyme phát hiệu Thêm chất, để khoảng 10 phút 20 – 250C Đọc kết Hình 3: Sơ đồ quy trình phát Listeria monocytogenes • Phương pháp hiện đại Phương pháp ELISA Cơ chế của ELISA • Phương pháp hiện đại Phương phápPCR Nguyên tắc -• Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đơi thành dạng - DNA mạchpolymerase đơn -• Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP) nồng độ Mg2+ - Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ - Dung sung.dịch đệm (buffer) - cặp mồi LM-F LM-R đoạn mồi (mỗi đoạn mồi dài 18-30 • - Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA giống DNA gốc bazơ) → Tất bỏ vào Eppendorf đưa vào giếng để khuếch đại máy chạy PCR DNA khuôn - tách làm DNA với chloroform / xử lý nhiệt tế bào 1000C 10 phút - Tối ưu hóa điều kiện PCR nồng độ MG2+ (1 5-4.0 mM), nồng độ mồi (0.1-0.5pmol/mồi) nồng độ dNTPs (100- 250Mm/mỗi loại) - Phản ứng PCR thực với thể tích hỡn hợp 25ml vói chu trình nhiệt gồm 940C/3 phút, ( 940C/ phút, 600C/1 phút , 720C/ phút)×30 trình tự, 720C/ phút 40C/5 phút - Đánh giá kết gel agarose 1% với 3ml sản phẩm Hình 6: Cơ chế khuếch đại Phương pháp phân tích Ưu điểm Nhược điểm -Dụng cụ thí nghiệm đơn giản, Thực qua nhiều bước nên thời thực phịng thí nghiệm gian thực kéo dài Truyền Phương pháp nhỏ Tỉ lệ phân lập xác khơng cao, thống đếm - Hóa chất dễ tìm, khơng địi hỏi chun dễ bị nhiễm q trình phân mơn cao lập Tỉ lệ xác cao, thời gian ngắn, dễ Địi hỏi tính tỉ mỉ cao, người thực Phương pháp thực hiện, tiến hành đồng thời cần có chun mơn, cần có Elisa nhiều mẫu mẫu đối chứng thực Thời gian cho kết nhanh, Khơng phân biệt tế bào sống phát vi sinh vật khó ni với tế bào chết cấy Sự ức chế hoạt tính DNA Hiện đại Việc ni tăng sinh đơn giản, hóa chất polymerase mẫu thương phẩm dễ tìm dễ tồn trữ Khơng cần dụng cụ Khơng phân tích với mẫu có Phương pháp ni cấy mơi trường phân tích phức mật độ vi sinh vật gây bệnh PCR tạp, thực diện mẫu thực phẩm thường Ít tốn nhân sự, tự thấp động hóa để làm giảm chi phí phân tích phát vi khuẩn gây bệnh Kết ḷn • Lm là mợt loại vi khuẩn tồn tại thực phẩm, gây hại cho sức khỏe người • Khi bị nhiễm Lm thời gian ủ bệnh khá lâu và nhiều triệu chứng khác • Việc tìm hiểu các pp xét nghiệm nhanh để hạn chế sự lây lan của vi khuẩn này đã thu được kết quả nhận định rằng PCR vẫn là phương pháp hiệu quả để xác định Lm • Tương lai, hi vọng với những biện pháp hiện đại mới hoặc được cải tiến sẽ giúp giải quyết được những nhược điểm của pp hiện tại The end! TỞNG QUAN • Cơ chế lây nhiễm_ thơng qua đường thực bào internalin A (inlA) internalin B (inlB) E-Carherin Clq-R (hoặc Met) Vào tế bào vật chủ Lm phân giải không bào  lỗ màng tế bào , hoạt giải độc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PC-PLC, giúp LLO phân giải không bào Tiếp đến Lm được nhân lên nhờ protein bề mặt ActA để di chuyển từ tế bào sang tế bào khác tổng hợp actin Đuôi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, phụ thuộc vào hoạt động PC-PLC Mpl TỔNG QUAN Con đường lây nhiễm • Qua đường tiêu hóa  qua dày  mô ruột non vật chủ (tế bào biểu mô đại thực bào • Trong suốt q trình di chuyển chúng không gây thương tổn mô học liều lượng không đủ lớn Trong dịch lympho/ máu Lm di chuyển nhanh đến hạch bạch huyết, lách gan nhanh chóng sâu vào khơng bào Hầu hết vi khuẩn xâm nhập phá hủy không bào nhờ kết hợp với pH thấp, enzyme thủy phân oxy hóa khơng bào Từ khơng bào  tế bào chất nhân lên vòng 30 phút sau xâm nhiễm, từ 40 – 60 phút tế bào gan đại thực bào Quá trình xâm nhiễm vào quan hoàn thành sau -7 ngày Giải pháp phòng ngừa • - Giữ thức ăn giới hạn vùng nhiệt độ nguy hiểm từ 4oC đến 60oC • - Thức ăn cần giữ lạnh phải giữ nhiệt độ 40C thấp hơn, cịn thức ăn nóng phải giữ nhiệt độ 600C trở lên • - Nấu chín tồn thức ăn tươi có nguồn gốc từ động vật • - Giữ vệ sinh tối đa lúc nấu nướng hay chuẩn bị bữa ăn Chà rửa dụng cụ, dao, thớt dung dịch Javel pha loãng nước • - Cẩn thận với loại cá đồ biển hun khói • - Rửa tay savon Giải pháp phòng ngừa - Thường xuyên chùi rửa, tẩy trùng tủ lạnh - Khơng nên dùng thực phẩm có mùi lạ - Không dùng thực phẩm thời hạn sử dụng - Không để thực phẩm tươi sống chung với thức ăn nấu chín - Thức ăn nấu chín dùng không để lâu ngày tủ lạnh - Rữa kỹ thức ăn trước sử dụng - Giữ thức ăn nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm chưa chế biến TỞNG QUAN • Tiêu chảy, sốt 38oC (100,4oF) cao hơn, đau cơ, có ớn lạnh rung mình, b̀ng nơn • Có thay đổi tâm thần Có xáo trộn mặt nhận thức tinh thần, có co giật, kiểm sóat vận động chi Dấu hiệu ... khuếch đại Phương pháp phân tích Ưu điểm Nhược điểm -Dụng cụ thí nghiệm đơn giản, Thực qua nhiều bước nên thời thực phịng thí nghiệm gian thực kéo dài Truyền Phương pháp nhỏ Tỉ lệ phân lập xác... Khơng phân tích với mẫu có Phương pháp ni cấy mơi trường phân tích phức mật độ vi sinh vật gây bệnh PCR tạp, thực diện mẫu thực phẩm thường Ít tốn nhân sự, tự thấp động hóa để làm giảm chi phí phân. .. • Phương pháp hiện đại Phương phápPCR Nguyên tắc -• Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đơi thành dạng - DNA mạchpolymerase đơn -• Các