Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Sản Xuất Chao Bằng Bacillus Subtilis

Quy trình sản xuất chao đang sử dụng phổ biến hiện nay có thời gian sản xuất một đợt sản phẩm là từ 4-6 tháng, thời gian này kéo dài do đặc điểm của hệ enzyme của nấm mốc.. subtilis tron

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

*********

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

Giảng viên hướng dẫn: Ths BÙI ANH VÕ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ

TRÌNH SẢN XUẤT CHAO BẰNG BACILLUS SUBTILIS

TÓM TẮT

Chao là một thực phẩm được sản xuất từ đậu hũ Ở Việt Nam, chao là một thực phẩm rất quen thuộc Chao không những giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa mà còn là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng Quy trình sản xuất chao đang sử dụng phổ biến hiện nay có thời gian sản xuất một đợt sản phẩm là từ 4-6 tháng, thời gian này kéo dài

do đặc điểm của hệ enzyme của nấm mốc Bằng cách thay thế vai trò của nấm mốc

bằng vi khuẩn Bacillus subtilis ta có khả năng rút ngắn thời gian và chi phí sản xuất,

vì thế tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của B

subtilis trong giai đoạn cấy giống và ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự thay đổi cấu

trúc của đậu hủ trong giai đoạn làm chín, nhằm cung cấp thông tin xây dựng một quy

trình sản xuất chao bằng B subtilis

Những kết quả đạt được:

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự sinh trưởng và hoạt tính

enzyme proteae của Bacillus subtilis Dựa vào kết quả mật độ vi khuẩn và hoạt tính

enzyme protease của các mẫu đậu hủ (có pH từ 6 - 9) đã cấy giống và được ủ ở nhiệt

độ không đổi (từ nhiệt độ phòng đến 51oC) trong 3 ngày ta xác định được pH của đậu

hủ thích hợp sản xuất là tử 6-7 và nhiệt độ thích hợp sản xuất là nhiệt độ phòng

(khoảng 30oC)

- Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch ngâm đến thời gian làm chín chao Dựa vào kết quả quan sát những thay đổi về cấu trúc và đánh giá cảm quan của mẫu đậu hủ ngâm trong dung dịch muối có nồng độ từ 2 tới 11% ta xác định được mẫu nhâm trong dung dịch muối nồng độ 5% có thời gian ủ ngắn nhất là 18-23 ngày (nhỏ so với thời gian phổ biến là 4-6 tháng)

- Xác định thời gian bảo quản của thành phẩm Dựa vào giá trị pH và đánh giá cảm quan của các mẫu chao được đặt ở nhiệt độ phòng ta xác định được thời gian mẫu

chao bị biến chất không thể sử dụng là 22 ngày

MỤC LỤC

Trạng tựa

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách các hình vi

Danh sách các bảng vii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

1.3 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu vể chao 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Thành phần hóa học 5

2.1.3 Hệ vi sinh vật 5

2.2 Phương pháp sản xuất chao 7

2.2.1 Nguyên liệu 7

2.2.2 Quy trình sản xuất đậu hủ 10

2.2.3 Quy trình sản xuất chao 14

2.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 18

2.3.1 Phân loại 18

2.3.2 Đặc điểm 18

2.4 Enzyme Protease 20

2.4.1 Phân loại 20

2.4.2 Protease từ vi khuẩn B subtilis 20

2.4.3 Ứng dụng của subtilisin từ vi khuẩn B subtilis 22

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 23

3.2 Vật liệu 23

3.3 Phương pháp 27

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tăng trưởng của B subtilis 36

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease của B subtilis 40

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch muối lên thời gian làm chín chao 42

4.4 Kiểm nghiệm vi sinh mẫu chao 45

4.5 Xác định thời gian bảo quản của chao 46

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis Bacillus subtilis

CFU Colony Forming Unit

CDU Casein Digestion Unit

CDU/ml đơn vị đo hoạt tính enzyme protease

mg miligram

tphòng nhiệt độ phòng (khoảng 30oC)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của chao 5

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của hạt đậu nành 7

Bảng 2.3 Thành phần axit amin trong đậu nành 8

Bảng 2.4 Thành phần hydrat cacbon trong đậu nành 8

Bảng 2.5 Thành phần chất khoáng trong hạt đậu nành 9

Bảng 2.6 Thành phần vitamin trong hạt đậu nành 9

Bảng 3.1 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển 27 của B subtilis trên môi trường đậu hũ Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển 31

của B subtilis trên môi trường đậu hũ Bảng 3.3 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch muối đến 32 thời gian làm chín chao Bảng 3.4 Các nghiệm thức thời gian bảo quản chao 35

Bảng 4.1 Số lượng khuẩn lạc đếm được thí nghiệm 1 36

Bảng 4.2 Giá trị mật độ vi khuẩn (CFU/ml) thí nghiệm 1 37

Bảng 4.3 Số lượng khuẩn lạc đếm được thí nghiệm 2 38

Bảng 4.4 Giá trị mật độ vi khuẩn (CFU/ml) thí nghiệm 2 39

Bảng 4.5 Độ hấp thụ quang của dung dịch thử thật ở 275nm 40

Bảng 4.7 Thời gian làm chín chao(ngày) 41

Bảng 4.8 Số lượng khuẩn lạc đếm được thí nghiệm 3 45

Bảng 4.9 Giá trị mật độ vi khuẩn (CFU/ml) thí nghiệm 3 45

Bảng 4.10 Thời gian bảo quản chao(ngày) 46

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 1: Chao đỏ 4

Hình 2: Chao trắng 4

Hình 3: Chao nâu 4

Hình 4: Cọng mang bọc bào tử với 1 bọc bào tử nấm Mucor 6

Hình 5: B subtilis nhuộm gram 19

Hình 6: Đậu hủ 2 ngày say khi cấy giống 41

Hình 7: Đậu hủ 7 ngày say khi cấy giống 41

Hình 8 và 9: Chao sau 20 ngày làm chín 44

Chương 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề

Chao là một sản phẩm được sản xuất từ đậu hũ Ở Việt Nam, chao là một thực phẩm rất quen thuộc Chao thường được sử dụng trong ăn chay và đánh nhuyễn thành nước chấm dùng trong một số món nướng Chao không những giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa mà còn là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng vì thành phần chính

là các acid amin, peptit, các este chất béo…Đặc biệt chao là nguồn cung cấp vitamin B12 quan trọng cho những người ăn chay hòan toàn không ăn thực phẩm có nguồn gốc

từ động vật

Các quy trình sản xuất chao phổ biến hiện nay sử dụng giống vi sinh vật là nấm mốc Nấm mốc có hoạt tính enzyme ngoại bào không cao do phần lớn enzyme được liên kết với màng của sợi nấm, để giải phóng các enzyme này cần có các phân tử muối trong dung dịch ngâm làm yếu các liên kết giữa enzyme và màng sợi nấm Mà nồng độ muối của dung dịch ngâm có ảnh hưởng lớn đến quá trình thay đổi cấu trúc và quá trình thủy phân phân lipid và protein của đậu hũ

Nồng độ muối càng cao thì độ cứng và độ đàn hồi của đậu hũ càng cao Zhong Han,2003) do đó thời gian làm chín càng dài, chi phí dùng trong sản xuất cũng tăng lên Nồng độ muối còn ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Nồng độ muối quá cao (>14%) thì hoạt tính enzyme bắt đầu giảm làm tăng thời gian thực hiện quá trình thùy phân lipid và protein Do đó để giảm thời gian sản xuất nồng độ muối càng thấp càng tốt Nhưng nồng độ muối thấp (<8%) thì quá trình thủy phân xảy ra không đồng đều và gây ra vị đắng cho chao Nồng độ muối quá thấp (<5%) thì vi sinh vật có hại sẽ phát triển và làm chao có vị chua và mùi hôi không tạo ra sản phẩm

(Bei-Hai vấn đề trên xảy ra là do vi sinh vật hiện được sử dụng trong quá trình sản xuất chao là các họ nấm mốc Phần lớn enzyme của nấm mốc liên kết với màng của sợi nấm cần có các phân tử muối làm yếu liên kết và giải phóng vào trong dung dịch hơn nửa nấm mốc không có khả năng phát triển trong môi trường muối nên các vi sinh vật gây hại không bị cạnh tranh sinh trưởng

Do đó có thể nói thởi gian làm chín kéo dài là do đặc điểm của hệ enzyme nấm

mốc Bằng cách sử dụng B subtilis thay thế vai trò nấm mốc ta có thể rút ngắn thời gian sản xuất do B subtilis là vi sinh vật có các đặc điểm như không có khả năng sinh

độc tố cho người, trong điều kiện khống chế tốt quá trình lên men sẽ không sinh ra mùi hôi và vị lạ, hoạt tính protease ngoại bào mạnh (L Korsten1, 2008)

1.2 Mục đích

Do có sự khác nhau về đặc điểm sinh trưởng và phát triển nên quy trình sản

xuất chao bằng B subtilis có nhiều thay đổi đặc biệt là ở giai đoạn cấy giống Hai yếu

tố được xem xét ở đây là nhiệt độ và pH, chúng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của

vi sinh vật đồng thời dễ dàng điều khiển

Kiểm chứng giả thuyết về khả năng sử dụng dung dịch muối nồng độ thấp trong sản xuất (Bei-Zhong Han,2003) bằng cách làm một số mẫu chao bằng phương pháp thủ công Nếu có thể cho ra thành phẩm thì xác định thời gian bảo quản của chao

Trên cơ sở kết quả thu được xác định khả năng sản xuất thực tế và những thay đổi cần thiết để gia tăng quy mô sản xuất

1.3 Yêu cầu

- Xác định nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của B.subtilis trên môi trường đậu

hũ

- Xác định pH tối ưu cho sự phát triển của B.subtilis trên môi trường đậu hũ

- Xác định nồng độ dung dịch muối có thể sử dụng để làm chín chao

- Đánh giá độ an toàn vệ sinh thực phẩm

- Xác định thời gian bảo quản của thành phẩm

Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu về chao

Chao là một sản phẩm được sản xuất từ đậu hũ Ở Việt Nam, chao là một thực phẩm rất quen thuộc Chao thường được sử dụng trong ăn chay và đánh nhuyễn thành nước chấm dùng trong một số món nướng Chao không những giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa mà còn là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng vì thành phần chính

là các acid amin, peptit, các este chất béo…Đặc biệt chao là nguồn cung cấp vitamin B12 quan trọng cho những người ăn chay hòan toàn không ăn thực phẩm có nguồn gốc

từ động vật

2.1.1 Phân loại

Do đã có lịch sử tồn tại lâu đời, chao ngày càng phổ biến và lan rộng nên cũng hình thành rất nhiều loại khác nhau

Phân loại theo phương pháp chế biến:

- Lên men tự nhiên: sử dụng một hỗn hợp nấm mốc và vi khuẩn hoang dại, thực hiện quá trình sản xuất ở điều kiện tự nhiên

- Lên men bằng nấm mốc: sử dụng một số hoặc một giống nấm mốc thuần

chủng (Actinomucor elegans và Rhizopus oligosporus) có kiểm soát một số yếu tố như

độ ẩm, nhiệt độ, pH …

- Lên men bằng vi khuẩn: sử dụng một giống vi khuẩn thuần chủng (vi khuẩn

lactic, Bacillus ) có kiểm soát một số yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ, pH …

- Lên men bằng enzyme: thu nhận enzyme từ nấm mốc sau đó sử dụng trực tiếp trên dậy hủ không cần cấy giống

Dựa vào màu sắc của chao có thể chia làm 3 loại:

- Chao đỏ: Chao được ngâm trong rượu, có thêm gạo đỏ Gạo đỏ được chế tạo bằng cách lên men gạo trắng với hồng khúc (Monascus purpureus – có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu), sau đó gạo đỏ được nghiền nát và cho vào nước ngâm Chao có hàm lượng glutamic acid và aspartic acid cao (30% tổng amino acid) tạo nên mùi thơm đặc trưng

- Chao trắng: là loại chao phổ biến nhất có hàm lượng muối ít nhất, nếu trong dung dịch ngâm có rượu thì gọi là chao trắng lên men ngâm rượu ngược lại gọi là chao

ngâm nước muối Trong dung dịch ngâm còn có gia vị (ớt mè, ngũ vị hương …) để tạo mùi vị khác nhau tùy theo tì lệ giữa các gia vị

- Chao nâu: dung dịch ngâm có chứa whey đậu nành, hàm lượng cystine and methionine thấp do sự phân hủy và tham gia tạo thành các hợp chất khác tạo nên mùi hắc, nồng

Ngoài ra còn có thể phân loại theo kích thước (lớn, nhỏ ,…), hình dạng (vuông , tròn …) và cấu trúc (chao nước, chao bánh, chao bột, …)

2.1.2 Thành phần hóa học

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của chao [Nguyễn Đức Lượng, 2008]

Các loại sản phẩm của chao Chao nước

Thành phần

Phần cái (%) Phần nước (%)

Chao bánh (%)

Độ Đạm toàn phần

Valin Tryptophan

Fenilalannin

Lơxin

73 – 75

2 – 2,9 0,70 – 0,85 0,3 – 0,4 4,5 – 5

8 – 8,5 110,0 – 120

2,84 – 2,9 3,3 – 3,5 1,70 – 1,75 0,15 – 0,20 1,55 – 1,60 1,55 – 1,6 1,80 – 1,90

12,5 – 13 7,5 – 7,8 2,5 – 3 6,0 – 6,2

2,8 – 2,9

0,4 – 0,45

65 – 70 2,3 – 2.6 0,8 – 0,9 0,3 – 0,4 6,0 – 6,5 9,0 – 10

Vi sinh vật được sử dụng để làm chao chủ yếu là các loại nấm mốc thuộc họ

Mucoraceae Những loài nấm thuộc họ này có những đặc tính chung là vỏ tế bào chứa

chitin, chitosan, nấm có túi bào tử lớn chứa cuống và bào tử tiếp hợp hiện diện hầu hết

các loài trong họ, Hesseltine và Ellis (1973) chia họ Mucoraceae thành 20 giống trong

đó chi Rhizopus và chi Mucor là quan trọng nhất

- Chi Rhizopus: giống này có ít nhất 120 loài Hầu hết những loài Rhizopus là

những loài sống hoại sinh, chúng phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài của cơ chất (ví dụ như bánh mì), khuẩn ty của có màu trắng, phân nhánh, đa nhân và không

có vách ngăn ngang Hầu hết các sợi khuẩn ty có dạng như sợi bông vải khi còn non ,

sau đó phát triển sâu vào cơ chất thì phân chia thành 3 dạng khuẩn ty : khuẩn căn, khuẩn ngang và cọng mang túi bào tử.

- Chi Mucor: là nhóm nấm hoại sinh trên xác bã hữu cơ đặc biệt trong dạ dày của ngựa và trâu bò (Mucor mucedo), nhiều loài phát tán trong đất như Mucor

racemosus và Mucor spinosus, nấm này cũng có mặt trên bánh mì củ, thịt, phó mát,

nước trái cây nhiều loài gây ra bệnh mycormycosis trên người và gia súc; Tuy nhiên

nhiều loài nấm cũng có ích như Mucor rouxii phân hủy tinh bột thành đường; Đặc tính phát triển của Mucor giống như Rhizopus, ví dụ như chúng phát triển khuẩn ty trên

bánh mì trong 24 giờ

Đối với sản xuất bằng giống thuần chủng thì 2 giống thuộc chi Mucor là

Actinomucor elegant và Actinomucor taiwanecis được sử dụng phổ biến nhất

Hình 4 Cọng mang bọc bào tử với 1 bọc bào tử nấm Mucor

Ngoài ra trong chao còn có sự hiện diện một số loài vi khuẩn Những vi khuẩn

này có nguồn gốc chủ yếu từ đậu hũ dùng làm nguyên liệu như: E.coli, Bacillus

spp,… Trong môi trường muối nồng độ >8%, các vi khuẩn Bacillus spp bị ức chế tồn

tại dưới dạng bào tử số lượng không có sự thay đổi nhiều theo thời gian ít có khả năng gây ngộ độc hoặc hư hỏng chao Các vi khuẩn thuộc nhóm lactic cũng bị ức chế sinh trưởng nhưng số lượng tăng nhanh theo thời gian, là nguyên nhân chủ yếu gây hỏng chao làm chao bị chua và có mùi hôi

2.2 Quy trình sản xuất chao [1]

Bảng 2.2 : Thành phần hóa học của hạt đậu nành

Thành phần Tỷ lệ (%) Protein (%) Dầu (%) Tro (%) Hydratcacbon (%)

Trong protein đậu nành glubolin chiếm 85-95% ngoài ra còn có 1 lượng như albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin

Bảng 2.3 Thành phần axit amin trong đậu nành

Bảng 2.4 Thành phần hydrat cacbon trong đậu nành Hydratcacbon Hàm lượng (%)

Bảng 2.5 Thành phần chất khoáng trong hạt đậu nành

Thiamin 11,0 - 17,5 Riboflavin 3,4 - 3,6 Niaxin 21,4 - 23,0 Pirydoxin 7,1 - 12,0

Đậu nành là loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipit, gluxit, muối khoáng và vitamin Chính vì thế, đậu nành là 1 nguồn thực phẩm quan trọng và được trồng rộng rãi ở Trung Quốc, Mỹ, Braxin Ở Việt Nam, đậu nành được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc và Nam Trong công nghiệp thực phẩm đậu nành được coi là một nguyên liệu quan trọng, để sản xuất dầu thực vật và sản xuất các loại sản phẩm lên men

Trước khi sản xuất chao ta cần nguyên liệu là đậu hũ Đậu hũ là một sản phẩm được sản xuất từ đậu nành Đậu hũ có nhiều dạng khác nhau , chính vì thế mà cũng có tên gọi khác nhau, nhưng nói chung chia làm 3 loại: mềm, cứng và lụa Trong đó đậu

hũ mềm được sản xuất nhiều ở nước ta Trung Quốc sản xuất cả 3 loại, Nhật sản xuất nhiều loại đậu hũ lụa

2.2.2 Quy trình công nghệ sản xuất đậu hũ [1]

Quy trình công nghệ phương pháp xay ướt

Giải thích quy trình công nghệ

2.2.2.1 Giai đoạn ngâm hạt

Trong phương pháp xay ướt, hạt đậu phải qua giai đoạn ngâm Ngâm hạt nhằm mục đích làm hạt đậu hút nước và trương lên Khi đó các phân tử nước có tính lưỡng cực sẽ tác động lên các phân tử protein, lipit, gluxit Quá trình này xảy ra qua 2 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu xảy ra quá trình solvat hóa, ở giai đoạn này các liên kết trong hạt đậu chưa bị phá vỡ

- Giai đoạn 2 xảy ra khi các phân tử nước tiếp tục tác động và phá vỡ liên kết các phân tửtrong hạt đậu và chuyển chúng sang trạng thái dịch thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu

Có 3 yếu tố ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình ngâm là thời gian ngâm, lượng nước ngâm và nhiệt độ ngâm

- Thời gian ngâm: nhiệt độ ngoài trời từ 15 – 25oC ngâm trong 5 – 6 giờ, nếu nhiệt độ 25 -30oC thì ngâm trong 3-4 giờ Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đậu đạt 55 – 65% là tốt nhất

- Nhiệt độ ngâm: nếu ngâm ở nhiệt độ cao, tốc độ trương của hạt nhanh nhưng

độ trương của hạt nhỏ Nếu độ trương nhỏ thì các thành phần trong hạt đậu chỉ ở trạng thái keo đông, không phải dịch thể keo do đó khó hòa tan Nhiệt độ nước dùng để ngâm đậu tốt nhất là từ 20 – 25oC

- Lượng nước ngâm thường được sử dụng Đậu/Nước = 1/2,5 lượng nước ngâm này sẽ giúp độ trương của hạt đậu đạt tương đối cao, độ chua thấp (khoảng 2,23 g axit acetic / 100 g đậu) và sự hao tổn chất khô nhỏ (0,6 g/100 g đậu)

2.2.2.2 Xay

Xay là một quá trình cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipit và gluxit … Nhờ có nước hòa tan các chất này và chuyển chúng sang dạng huyền phù Yếu tố quan trọng nhất trong giai đoạn này là lượng nước cần thiết cho vào trong khi xay Nếu ít nước thì việc hòa tan các chất sẽ kém và tạo ma sát mạnh gây nên hiện tượng tăng nhiệt làm protein biến tính, do đó khả năng tan của protein sẽ kém đi Nếu quá nhiều nước sẽ làm tang lượng hòa tan các chất nhưng lại khó khăn trong các giai đoạn chế biến sau

Lượng nước dùng để xay bột tốt nhất nên theo tỷ lệ: Đậu/Nước = 1/6

Trong khi xay phải cho nước chảy vào liên tục trong quá trình xay, saponin sẽ tạo bọt vì vậy phải cho chất phá bọt, chất phá bọt thường dùng với tỉ lệ 0,05% so với lượng đậu từ máng dẫn vào

2.2.2.3 Lọc

Sau khi xay ta có một dung dịch huyền phù gồm có dung dịch keo và những chất rắn không tan trong nước

Trong quá trình tách dung dịch keo khỏi các chất rắn xảy ra hiện tượng các chất rắn sẽ giữ trên bề mặt nó những tiểu phần keo vì vậy phải dùng nước rửa lại phần bã Lượng nước rửa bã không nên quá nhiều Trong giai đoạn lọc nên qua 2 bước: lọc tinh

và lọc thô Sữa khi lọc tinh xong cần phải đạt tiêu chuẩn sau: Nồng độ sữa 0,4 – 0,5oBe; pH = 6 – 6,5; lượng nước sữa thu được từ 1 kg đậu là 9 lít

Thành phần hóa học của dịch sữa: đạm tổng số 27 – 30 g/l; lipit 13 – 16 g/l; gluxit 3,2 – 4,5 g/l; chất khô 4,5 – 5 g/l

Sữa sau khi lọc xong thường có 15.000 – 20.000 vi khuẩn lactic/cm3 nếu để lau sữa sẽ có phản ứng hóa học xảy ra như sau:

C6H12O6 = CH3COCHO + 2H2O

2 CH3COCHO + H2O = 2 CH3CHOHCOOH

Lượng axit lactic tạo thành sẽ làm thay đổi pH dịch sữa Sự thay đổi pH sẽ làm thay đổi căn bản tính chất protein Khi pH dịch sữa tới gần điểm đẳng điện của protein đậu nành thì khôi sữa sẽ đông vón lại gây khó khăn cho quá trình ép sau này Do đó sữa kể từ khi xay đến khi lọc xong không nên kéo dài quá 30 phút về mùa hè và 50 phút về mùa đông

Bã lọc là phẩn rắn sau khi lọc có thành phần hóa học như sau: protein 3 – 4%; lipit 1-2%; gluxit 5 – 6%; độ ẩm 80 – 90 Bã lọc là thức ăn gia súc rất tốt, dễ gây thối,

vì thế bã phải được sử dụng ngay

2.2.2.4 Gia nhiệt, kết tủa

Dịch sữa sau khi lọc xong phải đem gia nhiệt ngay Gia nhiệt nhằm phá vỡ enzyme kháng trypxin và độc tố aflatoxin, diệt vi sinh vật, khử mùi tanh của đậu nành, phá vỡ lớp solvat (lớp nước bao quanh) tạo điều kiện cho các phần tử sữa gần nhau hơn và dễ keo tụ hơn

Thời gian gia nhiệt càng nhanh càng tốt Thời gian đun sôi 100 lít sữa trong 5 –

10 phút là tốt nhất, trong quá trình đun sôi khuấy đảo liên tục tránh cháy khét dung dịch sữa

Sau khi đun sữa phải kết tủa sữa ngay Sự kết tủa protein có nhiều nguyên nhân như do sự tác dụng của nhiệt, sự thay đổi pH về vùng đẳng điện, tác dụng của muối

Trong quá trình kết tủa, ta đun sữa đến 95 – 100oC để gây biến tính nhiệt và dùng tác dụng gây kết tủa protein Tác nhân gây kết tủa có nhiều loại như nước chua

tự nhiên, CaCl2, CaSO4, axit axetic, axit lactic, clohydric,… Trong các loại kết tủa

trên, nước chua tự nhiên thích hợp nhất, nhưng đòi hỏi người công nhân phải có kinh nghiệm nhiều

Điều kiện kết tủa sữa như sau:

- Nhiệt độ sữa khi kết tủa > 95oC

- pH của dịch sữa khi kết tủa >6

- pH của nước chua 4 -4,5

pH của nước chua có ý nghĩa rất lớn trong việc kết tủa, nếu pH cao thì lượng nước chua phải sử dụng nhiều, nếp pH thấp thì hiệu suất thu hồi đạm thấp Khi dịch sữa đạt 95oC ta cho nước chua vào từ từ Quá trình này được chia làm 3 giai đoạn

Giai đoạn đầu nên dùng ½ lượng nước chua cần dùng sau 3 phút cho ½ lượng nước chua còn lại Thường lượng nước chua đem kết quả chiếm 20-22% lượng sữa cần kết tủa

2.2.2.5 Ép định hình bánh đậu và ngâm nước

Sau khi kết tủa và chắt bã nước trong, ta có óc đậu, hay hoa đậu Đưa hoa đậu vào khuôn ép Nhiệt độ của hoa đậu đem ép tốt nhất là 70 – 80oC Nếu nhiệt độ dưới

60oC thì hoa đậu sẽ không kết dính được, bánh đậu bở và không định hình được Thời gian ép thường là 10 phút

Đối với phương pháp xay khô ta có một số công đoạn riêng như sau:

- Vo đậu và hong khô: phương pháp ngâm khô không qua giai đoạn ngâm, mà chỉ vo cho sạch loại bỏ các chất như rơm, rác sạn, cát … Quá trình vo này cũng nhằm làm cho hạt đậu ngấm một ít nước trở lại, sau đó hong khô ngoài không khí khoảng 30 phút Sau khi hong khô vỏ đậu sẽ nhăn nheo Sau đó đem hạt đậu đi nghiền

Ta có thể nghiền bột đậu bằng nhiều loại máy nghiền khác nhau Bột nghiền xong phải có độ mịn qua rây có 64 lỗ/cm2 Bột nghiền xong phải sử dụng ngay không

để quá 1 giờ, vì trong quá trình nghiền nhiệt độ sẽ tăng và sẽ làm tăng quá trình lên men Từ đó dẫn đến sự biến tính protein dẫn đến tổn thất sau này

- Hòa bột vào dung dịch NaOH

Đem bột đã nghiền ở trên hòa tan vào dung dịch NaOHcó pH=11-12, với tỷ lệ 1 đậu 7 nước ở nhiệt độ 65 – 68oC Khi cho bột vào pH sẽ giảm xuống 7 – 7,5 do tác dụng của các phần tự protein và các axit béo có trong hạt đậu với NaOH

Mục đích của quá trình này để hòa tan protein và các chất có trong hạt đậu vào nước Tử đó, tiến hành lọc tách dung dịch protein ra khỏi phần không hòa tan Sau đó kết tủa và ép thành bánh

2.2.3 Quy trình sản xuất chao [1]

Giải thích quy trình

2.2.3.1 Định hình bánh đậu làm chao

Trong sản xuất chao người ta sử dụng CaSO4 làm tác nhân đông tụ sữa CaSO4

có khả năng giúp ta thu hồi protein cao nhất

Tiêu chuẩn bánh đậu dùng để sản xuất chao có thành phần như sau:

2.2.3.2 Sản xuất giống vi sinh vật

Giống ống thạch

Môi trường thạch có thành phần sau:

- Agar: 18 – 20g

- Đường 20g

- Nước giá đậu 1000ml

Rửa sạch 300g giá đậu, cho vào 1000ml nước, đun sôi nửa giờ, chắt lấy nước,

bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml, cho thêm agar, đun sôi, lọc Điều chỉnh pH đến 4,5 – 5 bằng acid acetic hoặc acid citric Cân các thành phần ghi ở trên và tiến hành đun sôi, phân phối vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng

Giống trung gian

Môi trường được dùng có thành phần như sau:

- Bã đậu hũ 1kg

- Bột mì 0,5kg

Dùng nước đều chỉnh độ ẩm sao cho đạt 70 – 72%, pH của môi trường được điều chỉnh 5,5 – 6,0 bằng acid acetic hoặc acid citric Môi trường được phân phối vào các bình tam giác từ 50 – 60g Hấp 45 phút ở áp suất hơi 1,2kg/cm2

Làm nguội và cấy giống từ ống giống sang Nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC khoảng 18–24 giờ thấy xuất hiện khuẩn ty trắng Nuôi tiếp 3 – 4 ngày có giống trung gian

Giống bào tử

Cho giống trung gian vào bột mì đã rang chín với tỷ lệ một bột mì, một giống trung gian Dùng tay trộn đều, ray qua để lấy bột có bào tử và khuẩn ty Như vậy, ta có bột bào tử giống dùng trong sản xuất

Sau khi cấy mốc xong phải đảm bảo nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC hàm ẩm không khí là 90% ở những giờ đầu Sau 14-16 giớ nuôi trên bề mặt đậu xuất hiện những khuẩn ty màu trắng ta phải đưa hàm ẩm lên 95% ở những giờ cuối nuôi mốc cần phải làm giảm hàm ẩm xuống để hạn chế sự phát triển của nấm mốc Khi thấy mốc chuyển

từ màu trắng sang màu hung nâu là kết thúc giai đoạn nuôi mốc Lúc này khuẩn ty của mốc có thể đạt đến 2cm

Để việc nuôi mốc tốt cần lưu ý phòng nuôi mốc phải có thiết bị điều chỉnh nhiệt

độ, giữ được ẩm và nền phòng phải có khả năng thoát nước Thông thường đối với phòng thông gió tự nhiên 100kg bánh đậu dùng để nuôi mốc cần có dung tích 6-7m3khí trên diện tích 2m3

2.2.3.4 Ướp muối

Lượng muối thích hợp để ngâm là 130 – 150 g/kg bánh đậu sau lên men, muối dùng để ướp phải sạch Thời gian ướp muối là 24 giờ Khi ướp muối nên xếp 1 lượt bánh đậu đã lên men một lớp muối Cứ như vậy cho đến lớp đậu cuối cùng thì phủ một lớp muối kín bề mặt đậu

Ngoài ra còn có phương pháp nhúng muối Chuẩn bị dung dịch muối có nồng

độ 200 – 220 g/l và nhúng bánh đậu đã lên men liên tục 6 – 7 giờ thì nhấc lên để khô

24 giờ cho vào thiềt bị lên men

2.2.3.4 Làm chín

Sau nuôi mốc, lên men là giai đoạn rất quan trọng, nó quyết định chất lượng sản phẩm, trong giai đoạn này các enzyme của mốc sẽ tham gia hàng loạt các phản ứng sinh hóa tạo ra chao

Để tạo điều kiện cho các enzyme hoạt động, ta phải tạo điều kiện tối ưu cho chúng hoạt động Trong đó có độ ẩm, nhiệt độ và pH môi trường Chính vì thế sau khi ướp muối xong phải rũ sạch muối ở bánh đậu Cho bánh đậu vào các dụng cụ lên men

có rượu 12oV theo tỷ lệ 1kg bánh đậu cho 0,5 – 0,6l, sao cho dung dịch ngập bánh đậu

là vừa Đậy nắp kín cho vào phòng lên men

Nhiệt độ lên men khoảng 35 – 36oC, ở bánh đậu và 37 – 38oC ở phòng Nếu nhiệt độ lên men lớn hơn 40oC thì thời gian lên men rút ngắn, sản phẩm rất dễ bị hư Nhiệt độ lên men nhỏ hơn 35oC thì thời gian lên men kéo dài tốn kém thiết bị và diện tích phòng lên men Thời gian lên men khoảng 9 -10 ngày

Sau đó còn có giai đoạn lên men phụ đây là giai đoạn ổn định sản phẩm Nhiệt

độ lên men thích hợp là 25 – 30oC

2.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.1 Phân loại khoa học

2.3.2 Đặc điểm

Hình 5: B subtilis nhuộm gram

Bacillus subtilis là vi khuẩn có hình que (trực khuẩn), gam dương và catalase

dương tính phân bố rộng rãi trong đất, nhiệt độ sinh trưởng là từ 25 – 35oC, cò màng cấu tạo từ peptidoglycan, hiếu khí tùy ý, có khả năng sinh bào tử

B subtilis có một DNA mạch có kích thước 4,2 Mbs, có 4200 gen quy định

tổng hợp protein trong đó có 79 gen quy định các protein thiết yếu tham gia vào quá trình biến dưỡng Một nửa số gen quy định các protein tham gia vào quá trình chuyển tải thông tin, một phần năm chịu trách nhiệm tổng hợp vách tế vào và phân chia tế bào, một phần mười tham gia quá trình trao đổi chất

Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt về nhiệt độ, pH, thiếu chất dinh dưỡng

B subtilis có khả năng hình thành bào tử có khả năng tồn tại trong môi trường khắc

nghiệt trong thời gian dài, một số bào tử có tiêm mao có khả năng di động

B subtiilis là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện Trong điều kiện hiếu khí, B subtilis

dùng O2 làm chất nhận điện tử cuối cùng Trong điều kiện kỵ khí, B subtilis có thể sử

dụng nitrite hoặc nitrate làm chất nhận điện tử cuối cùng

B subtilis có chứa enzyme catalse KatA và MrgA, là enzyme xúc tác cho phản

ứng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxygen [O]

B subtilis được cho là không có khả năng gây bệnh cho người nhưng là nguyên

chính gây hư hỏng thực phẩm đặc biệt là bánh mì … B subtilis có khả năng sinh ra

một số kháng sinh nhu: polymyxin, difficidin, subtilin và mycobacilin cạnh tranh sinh trưởng với các vi isnh vật khác

2.4 Enzyme protease

Protease còn được gọi là các proteolytic enzym, là các enzym có khả nǎng thủy phân các liên kết peptid của chuỗi peptid, protein thành các đoạn peptid ngắn hơn và các acid amin

Protease của vi sinh vật rất phong phú chúng khác nhau về mức tối ưu của pH, nhiệt độ và hoạt tính xúc tác, độ bền cũng như tác động của chất kiềm hãm

2.4.1 Phân loại

Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease ngưới ta chia

ra các nhóm

- Protease kiềm: Hoạt động mạnh ở pH từ 7- 11

- Protease acid: Hoạt động mạnh ở pH từ 2 - 6

- Protease trung tính: enzyme thuộc nhóm metalloenzyme Hoạt động mạnh ở

pH 6-9 Khai thác từ B subtilis, B thermoprteolyticus, …

Phân loại theo cấu trúc trung tâm

- Protease nhóm 1: bao gồm các loại protease có serin trong trung tâm hoạt động như: trypsin, kimotrypsin, elasubtililizi …

- Protease nhóm 2: bao gồm các loại protease có SH trong trung tâm hoạt động như: bromelin, papain, ficin …

- Protease nhóm 3: bao gồm các loại protease có kim loại trong trung tâm hoạt

động và trực tiếp than gia quá trình xúc tác như: protease trung tính của Bacillus hoặc

colagenase …

- Protease nhóm 4: bao gồm các loại protease có 2-cacboxyl trong trung tâm hoạt động như: pepsin, renin, protease acid của vi sinh vật …

2.4.2 Protease từ vi khuẩn Bacillus (Subtilisin):

Subtilisin là một protease kiềm (International Union of Biochemitry and Molecular Biology 1992) chia thành hai nhóm chính là: subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN (Phadatare et al 1997)

- Subtilisin Carlsberg Enzyme này được tìm thấy khi nuôi cấy B

licheniformis vào năm 1947 bởi Linderstrom, Lang, and Ottesen tại phòng thí nghiệm

Carlsberg Protein được thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng, được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa Hoạt tính của enzyme Carlsberg bị kìm hãm bởi các chất phản ứng, 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI), L-3-carboxytrans 2,3-epoxypropyl-leucylamido (4-guanidiXE) butaXE (E.64), di-isopropylfluorophosphate (DFP), phenylmethysulfonyl fluoride (PMSF) và tosyl-L-lysiXE chloromethyl ketoXE (TLCK) Một số khác lại bị kìm hãm bởi thuốc thử thiol ví dụ như p-chloromercuribenzoate (PCMB), đặc trưng đối với tất cả các seriXE protease Subtilisin Carlsberg có tính đặc hiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết peptide, cũng như các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ các amino acid thơm Dưới tác dụng của enzyme này, một số triglyxeride cũng có thể bị thủy phân như tripropionin và tributirin Subtilisin Carlsberg thủy phân từ 30 đến 40% liên kết peptide của cazein Giống như các seriXE protease khác, enzyme này không cần Ca2+,

có pH tối ưu là 8,0-9,0 và bền trong phạm vi pH rộng từ 5,0 đến 11,0

- Subtilisin BPN Enzyme này đã được làm sạch và thu được ở trạng thái kết

tinh từ chế phẩm công nghiệp BPN' (bacterial protease Nagase) Từ chế phẩm BP Novo (bacterial protease Novo) đã tách được enzyme có thành phần amino acid tương

tự subtilisin Novo So với subtilisin Carlsberg thì protease này có ý nghĩa công nghiệp không lớn Subtilisin BPN' được tổng hợp từ các loài B.amiloliquefaciens, B.subtilis

và B stearothermophilus

- Cơ chế xúc tác của subtilisin : Trung tâm hoạt động xúc tác sự phân giải cơ

chất của enzyme này chứa bộ ba Ser-His-Asp giống như của seriXE protease do vậy

mà cơ chế xúc tác tương tự như của seriXE protease Sự thủy phân diễn ra theo hai bước bao gồm: Bước một: hình thành liên kiết cộng hóa trị giữa enzyme tự do và cơ chất tạo thành phức chất trung gian Tiếp theo đó là sự acyl hóa và giải phóng ra sản

phẩm đầu tiên là R’-NH2 Bước hai: diễn ra quá trình khử acyl hóa, phức chất trung gian enzyme-cơ chất phản ứng với phân tử H2O giải phóng ra sản phẩm thứ hai cùng với sự tái sinh trở lại của enzyme tự do

2.4.3 Ứng dụng của subtilisin từ vi khuẩn Bacillus :

Với sự đa dạng về chủng loại, subtilisin đã và đang được nghiên cứu ứng dụng vào nhiều lĩnh vực công nghiệp với những tính năng phù hợp Rất nhiều sản phẩm thương mại của subtilisin được đưa ra thị trường , chúng chủ yếu được sử dụng trong ngành công nghiệp các chất tẩy rửa, thuộc da và cả trong y dược học do subtilisin có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng và nhiệt độ cao

Một số thương phẩm subtilisin trên thị trường ( Rao et al 1998, R Gupta et al 2002): Bột giặt và chất tẩy rửa BIOTEX (Novo Industry A/S), Sữa tắm Kem tắm làm trắng da NA (Công ty TNHH Sản xuất và Thương Mại Nhân Lộc), …