Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp sers

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS Chuyên ngành: Vật lý chất rắn Mã số: 60440104 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HOÀNG NAM TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG Hà Nội - 2015 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Hoàng Nam Thầy giáo TS Nguyễn Đình Thắng Trong suốt trình học tập, nghiên cứu, thầy tận tình bảo giúp em định hướng để hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn NCS Lưu Mạnh Quỳnh, NCS Chu Tiến Dũng trực tiếp hướng dẫn đưa lời khuyên thực hữu ích cho luận văn Kết luận văn thành trình lao động trí tuệ tích cực nhóm nghiên cứu “Nghiên cứu chế tạo, chức hóa, tính chất hạt nano đa chức nhằm ứng dụng y sinh học” định hướng “Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano y sinh” TS Nguyễn Hoàng Nam chủ trì tài trợ đề tài “Nghiên cứu chế tạo hạt nano đa chức nhằm ứng dụng y sinh” mã số CA.14.11A Tôi xin cảm ơn sinh viên Bạch Thị Mai - K58 KHVL, Khoa Vật lý hỗ trợ nhiều trình nghiên cứu chế tạo vật liệu Tôi xin cám ơn học viên cao học K24 Nguyễn Thị Thơ Khoa Sinh học hỗ trợ luận văn trình nuôi cấy định lượng tế bào Tôi xin cảm ơn anh chị bạn sinh viên Trung tâm Khoa học Vật liệu Khoa Sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình làm nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, tập thể cán Trung tâm Khoa học Vật liệu – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN tạo điều kiện cho em suốt thời gian em làm thí nghiệm trường! Em xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý lãnh đạo Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị để em hoàn thành luận văn Bản luận văn thực Trung tâm Khoa học Vật liệu – Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội Luận văn sử dụng số phép đo thực hệ LABRAM3 hãng HORIBA Jobin Yvon, Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà NanoSEM NOVA NPE 119, kính hiển vi huỳnh quang – trường tối AXIO Scope A1, Zeiss đầu tư theo chương trình “Tăng cường lực nghiên cứu, đào tạo lĩnh vực khoa học, công nghệ nano ứng dụng y, dược, thực phẩm, sinh học, bảo vệ môi trường thích ứng biến đổi khí hậu theo hướng pháp triển bền vững” Cuối em xin chân thành cảm ơn tới gia đình tất bạn bè tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian học tập, nghiên cứu thực luận văn Hà nội, năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hà Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hạt nano Fe3O4 hạt nano kim loại Ag 1.1.1 Vật liệu sắt từ 1.1.2 Tính chất siêu thuận từ 1.1.3 Vật liệu oxit sắt từ Fe3O4 1.1.4 Ứng dụng hạt nano từ Fe3O4 .7 1.1.5 Hạt nano Bạc tính chất 1.1.6 Cộng hưởng Plasmon bề mặt [14] .8 1.1.7 Tán xạ Raman [10] 1.1.8 Hạt nano composite đa chức Fe3O4/Ag 13 1.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức đánh dấu tế bào 14 1.2.1 Bệnh ung thư 14 1.2.2 Các phương pháp phát bệnh ung thư .14 1.2.3 Các thụ thể tế bào (ErbB receptors) 15 1.2.4 EGFR- Epidermal growth factor receptor [49] .17 1.2.5 Kháng thể 18 1.2.6 Kháng thể anti-EGFR chế gắn kết kháng thể anti-EGFR với hạt nano đa chức Fe3O4/Ag-NH2 19 1.2.7 Tế bào HaCaT SK-Mel 28 20 CHƢƠNG – THỰC NGHIỆM 23 2.1 Chế tạo hạt nano chức Fe3O4/Ag……………………………… ……23 2.1.1 Hóa chất sử dụng .23 2.1.2 Chức hóa hạt nano Fe3O4 với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) tạo nhóm amine NH2 tự Fe3O4-NH2 .23 2.1.3 Chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag 24 2.1.4 Chức hóa bề mặt hạt nano composite Fe3O4/Ag 4-aminothiophenol (4-ATP) - Fe3O4/Ag-NH2 25 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà 2.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức Fe3O4/Ag đánh dấu tế bào…………………………………………………………………………………26 2.2.1 Hóa chất sử dụng .26 2.2.2 Gắn hạt nano composite đa chức Fe3O4 /Ag-NH2 với kháng thể antiEGFR… ………………………………………………………………………… 26 2.2.3 Gắn hạt nano đa chức với hai dòng tế bào HaCaT SK-Mel 28 27 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Hạt nano composite đa chức Fe3O4/Ag………………………………33 3.1.1 Hạt nano Fe3O4 chức hóa với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)………………………………………………………………………… 33 3.1.2 Hạt nano composite Fe3O4/Ag 35 3.1.3 Chức hóa hạt nano composite Fe3O4/Ag với 4-aminothiophenol 40 3.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức Fe3O4/Ag đánh dấu tế bào………………………………………………………………………………….42 3.2.1 Hạt nano đa chức Fe3O4/Ag gắn với kháng thể anti-EGFR 42 3.2.2 Đưa hạt nano đa chức Fe3O4/Ag gắn kháng thể anti-EGFR lên hai dòng tế bào Hacat SK-Mel 28 .46 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Stt Hình vẽ Nội dung Trang Hình 1.1 Đường cong từ hoá sắt từ ( -) siêu thuận từ ( -) Hình 1.2 Hc phụ thuộc vào đường kính hạt Mô tả tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt Hình 1.3 hạt nano kim loại Hình 1.4 Mô hình tán xạ Raman phân tử CH4 10 Hình 1.5 Mô hoạt động loại ErbB 15 Hình vẽ mô cấu trúc loại ErbB Hình 1.6 phối tử chúng 16 Hình 1.7 Mô hình kháng thể điển hình 19 Hình 1.8 Cấu trúc chiều anti-EGFR 19 Mô hình liên kết hạt nano gắn kháng thể anti9 Hình 1.9 EFGR với thụ thể bề mặt tế bào 20 Mô hình tế bào Keratinocyte Melanocyte 10 Hình 1.10 11 Hình 1.11 Mô hình tóm tắt mục tiêu luận văn 22 12 Hình 2.1 Mô hình phản ứng chức hóa Fe3O4 với APTES 23 da 21 Quy trình chế tạo hạt nano composite đa chức 13 Hình 2.2 Fe3O4/Ag-NH2 25 Mô tả phương pháp phân tích cường độ sáng tế 14 Hình 2.3 15 16 bào phần mềm Image J 30 Hình 2.4 Đồ thị tính toán cường độ sáng tế bào 31 Hình 3.1 Nhiễu xạ tia X mẫu Fe3O4 34 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà 17 Hình 3.2 Ảnh TEM hạt nano Fe3O4 34 18 Hình 3.3 Đường cong từ trễ mẫu Fe3O4 35 19 Hình 3.4 Nhiễu xạ tia X mẫu Fe3O4/Ag 36 20 Hình 3.5 Phổ tán sắc lượng EDS mẫu Fe3O4/Ag 36 Phổ UV-Vis ảnh TEM hạt nano Ag kích 21 Hình 3.6 22 Hình 3.7 thước từ 15-25 nm 37 Phổ UV-Vis ảnh TEM hạt nano Ag kích thước từ 25-50 nm 38 Phổ hấp thụ UV-Vis ảnh TEM mẫu hạt nano 23 Hình 3.8 composite Fe3O4/Ag 39 Đường cong mômen từ phụ thuộc từ trường nhiệt 24 Hình 3.9 25 Hình 3.10 26 Hình 3.11 27 Hình 3.12 28 Hình 3.13 độ phòng Fe3O4 (a) Fe3O4/Ag (b) 40 Phổ Raman mẫu hạt nano đa chức Fe3O4/AgNH2 41 Sơ đồ phản ứng hạt nano Fe3O4/Ag-NH2 với kháng thể anti-EGFR 43 Phổ Raman mẫu hạt Fe3O4/Ag-NH2 trước sau gắn kháng thể anti-EGFR 44 Phổ Raman hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR phổ Raman Protein 45 Nguyên lý sử dụng phổ SERS chẩn đoán tế 29 Hình 3.14 bào mang bệnh 47 Phổ Raman tế bào HaCaT kháng thể anti30 Hình 3.15 31 Hình 3.16 32 Hình 3.17 EGFR 47 Phổ Raman tế bào SK-Mel 28 kháng thể anti-EGFR Phổ SERS tế bào HaCaT SK-Mel 28 với tỉ lệ 48 49 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà gắn hạt M1 M2 Ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào 33 Hình 3.18 HaCaT 50 Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình tế 34 Hình 3.19 bào HaCaT trước sau gắn hạt nano 51 composite đa chức Ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào 35 Hình 3.20 SK-Mel 28 52 Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình tế 36 Hình 3.21 bào SK-Mel 28 trước sau gắn hạt nano đa 53 chức So sánh cường độ sáng trung bình hai tế bào 37 Hình 3.22 HaCaT SK-Mel 28 54 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà DANH MỤC BẢNG BIỂU Stt Tên bảng Nội dung Trang Bảng loại HER receptor bệnh ung thư Bảng 1.1 Bảng 1.2 liền với chúng 16 Bảng so sánh % tế bào có đột biến số lượng Bảng 2.1 EGFR 17 Bảng tỉ lệ hạt nano Fe3O4/Ag-NH2-anti EGFR gắn với tế bào 27 Khoảng cách d tính ứng với mặt nhiễu xạ Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 tia X Tỉ phần nguyên tố mẫu Fe3O4/Ag 33 37 Vị trí đỉnh phổ SERS mẫu hạt nano đa chức Fe3O4/Ag-NH2 42 Vị trí đỉnh dao động hạt nano gắn kháng thể Bảng 3.4 anti-EGFR 45 Bảng khảo sát hiệu suất gắn kết tế bào với hạt Bảng 3.5 Bảng 3.6 nano Fe3O4/Ag-NH2 46 Vị trí đỉnh dao động tế bào gắn hạt nano đa chức 48 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà 3.2.2.2 Ứng dụng SERS đánh dấu tế bào Hình 3.14 Nguyên lý sử dụng phổ SERS chẩn đoán tế bào mang bệnh Hình 3.14 trình bày nguyên lý bước đưa hạt nano đa chức lên bề mặt tế bào nhờ chế bắt cặp thụ thể EGFR kháng thể anti-EGFR Phương pháp SERS sử dụng để nhận biết tín hiệu đặc trưng bề mặt hạt nano đa chức nhờ liên kết đặc trưng bề mặt hạt nano kim loại Ag qua nhận biết tế bào mang bệnh  Tế bào HaCaT Hình 3.15 3.16 phổ Raman tế bào HaCaT SK-Mel 28 có gắn hạt nano với tỉ lệ gắn hạt tương ứng M1 M2 dải phổ từ 900 - 1750 cm-1 Hình 3.15 Phổ Raman tế bào HaCaT (trái) kháng thể anti-EGFR (phải) 47 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Hình 3.16 Phổ Raman tế bào SK-Mel 28 (trái) kháng thể anti-EGFR (phải) Trong hình 3.15 3.16 ta nhận thấy số đỉnh dao động hạt nano đa chức Fe3O4/Ag gắn kháng thể anti-EGFR xuất sau gắn với tế bào Tuy nhiên, vị trí đỉnh sau gắn với tế bào bị dịch chuyển so với vị trí ban đầu hạt nano gắn kháng thể trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Vị trí đỉnh dao động tế bào gắn hạt nano đa chức Vị trí đỉnh dao động tế bào Vị trí đỉnh dao động hạt nano sau gắn hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR 1145 1129 1354 1338 1466 1452 Stt Bên cạnh vị trí đỉnh Raman đặc trưng hạt nano Fe3O4/AgantiEGFR xuất sau đưa lên bề mặt tế bào, số đỉnh bị sau: 1613 cm-1, 1668 cm-1 Tại vị trí dải phổ từ 1200-1300 cm-1 có phân tách thành hai đỉnh rõ ràng 1212 cm-1 1240 cm-1 Điều giải thích kháng thể anti-EGFR liên kết với thụ thể EGFR bề mặt tế bào làm số liên kết đặc trưng kháng thể anti-EGFR đồng thời làm xuất số dao động liên kết Các liên kết hình thành theo chế gắn kết đặc hiệu kháng thể antiEGFR với thụ thể tế bào 48 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Hình 3.17 Phổ SERS tế bào HaCaT (trái) SK-Mel 28 (phải) với tỉ lệ gắn hạt M1 (đường màu đen) M2 (đường màu đỏ) Nhìn vào phổ Raman hình 3.17 ta nhận thấy, tỉ lệ gắn hạt M1 cường độ đỉnh Raman tế bào SK-Mel 28 lớn so với tế bào HaCaT Tuy nhiên, tỉ lệ M2 cường độ Raman tế bào HaCaT lại lớn nhiều so với tế bào SKMel 28 Có thể với lượng hạt nano sử dụng, hiệu suất gắn kết tế bào SK-Mel 28 lớn nhiều so với tế bào HaCaT gần đạt tới giá trị bão hòa tỉ lệ gắn hạt M2 Do đó, hiệu suất gắn kết tăng lên, số lượng tế bào bám dính với hạt nano nhiều hơn, ảnh hưởng đến tín hiệu Raman bề mặt vật liệu làm cho cường độ đỉnh Raman bị yếu 3.2.2.3 Ứng dụng đánh dấu tế bào ảnh hiển vi trƣờng tối  Tế bào Hacat Hình 3.18 ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào HaCaT Hình 3.18 A1và A2 ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào HaCaT không gắn với hạt nano Hình B1 B2, C1 C2 ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào HaCaT-M1 HaCaT-M2 sau gắn hạt nano với tỉ lệ gắn hạt tương ứng 9x10-3 mg hạt/ 100.000 tế bào 27x10-3 mg hạt/ 100.000 tế bào 49 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Hình 3.18 Ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào Hacat Lần lượt từ trái qua phải là: - Tế bào Hacat không gắn hạt nano (A1, A2); - Tế bào Hacat-M1, Hacat-M2 gắn hạt nano với tỉ lệ 9x10-3mg/100.000 tế bào (B1,B2) - Tế bào Hacat-M2 gắn hạt nano với tỉ lệ 27x10-3 mg/ 100.000 tế bào (C1, C2) Sau tính toán cường độ sáng trung bình tế bào sử dụng phần mềm Image J mô tả chương 2, cường độ sáng trung bình tế bào trước sau gắn hạt nano mô tả theo biểu đồ hình 3.19 Nhìn vào biểu đồ ta thấy, cường độ sáng trung bình ảnh hiển vi trường tối tế bào trước sau gắn hạt nano Fe3O4/Ag thay đổi tỉ lệ thuận với lượng hạt nano bám dính bề mặt tế bào Kết cho thấy hàm lượng hạt bám dính tế bào lớn cường độ sáng tế bào ảnh hiển vi trường tối lớn Điều khẳng định xuất hạt nano làm tăng độ tán xạ ánh sáng tế bào ảnh hiển vi trường tối Như vậy, phương pháp đánh dấu tế bào dùng để so sánh đối chứng với phương pháp dùng phổ SERS 50 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình tế bào HaCaT trước sau gắn hạt nano composite đa chức Phương pháp so sánh cường độ sáng trung bình tế bào HaCaT M1 M2 sau: - Gọi IH0 cường độ sáng trung bình (TB) tế bào gốc Hacat - IH-M1 cường độ sáng TB mẫu tế bào Hacat-M1 - IH-M2 cường độ sáng TB mẫu tế bào Hacat-M2 Cường độ sáng TB tế bào HaCaT-M2 so với tế bào HaCaT-M1 tính sau: Như vậy, cường độ sáng TB tế bào HaCaT-M2 lớn cường độ sáng TB tế bào HaCaT-M1 6,6 lần Kết cho thấy, tăng tỉ lệ hạt bám tế bào cường độ sáng trung bình tế bào ảnh hiển vi trường tối tăng lên Khi đó, cường độ sáng trung bình tế bào gián tiếp cho ta biết tỉ lệ hạt gắn bề mặt tế bào  Tế bào SK-Mel 28 Tương tự tế bào HaCaT, hình 3.20 ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào SK-Mel 28 Hình A1 A2 ảnh 51 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà hiển vi trường sáng trường tối tế bào HaCaT không gắn với hạt nano Hình B1 B2, C1 C2 ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào SK-Mel 28 gắn hạt nano với tỉ lệ 9x10-3 mg/100.000 tế bào 27x10-3 mg/100.000 tế bào Hình 3.20 Ảnh hiển vi trường sáng trường tối tế bào SK-Mel 28 Lần lượt từ trái qua phải tế bào SK-Mel 28 trước gắn với hạt nano (A1, A2); Tế bào SK-Mel28-M1 (hình 3.20 B1 B2); Tế bào SK-Mel28-M2 (hình 3.20 C1 C2) Biểu đồ cường độ sáng trung bình tế bào trước sau gắn hạt nano hiển thị biểu đồ hình 3.21 Biểu đồ cho thấy, cường độ sáng tế bào SK-Mel 28 thay đổi đáng kể so với tế bào không gắn kết với hạt nano 52 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình tế bào SK-Mel28 trước sau gắn hạt nano đa chức Tương tự, cường độ sáng TB tế bào SK-Mel28-M2 so với tế bào SKMel 28-M1 là: Trong đó: Is0 cường độ sáng trung bình (TB) tế bào gốc SK-Mel28 Is-M1 cường độ sáng TB mẫu tế bào SK-Mel28-M1 Is-M2 cường độ sáng TB mẫu tế bào SK-Mel28-M2 So sánh cường độ sáng trung bình hai dòng tế bào da HaCaT tế bào SK-Mel 28 hình 3.22 ta nhận thấy Với tỉ lệ gắn hạt M1 (9x10-3 mg/ 100.000 tb) M2 (27x10-3 mg/100.000 tb) tương ứng, cường độ sáng trung bình tế bào SK-Mel 28 lớn nhiều so với tế bào Hacat cụ thể sau: Tỉ lệ M1: (3.1) Tỉ lệ M2: (3.2) Kết luận: Cường độ sáng trung bình tế bào tỉ lệ với số hạt nano bám dính bề mặt chúng Ở hai loạt mẫu M1 M2 tế bào SK-Mel 28 có cường độ sáng trung bình lớn tế bào HaCaT 9,6 4,3 lần 53 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Điều giải thích SK-Mel 28 dòng tế bào ung thư da, tế bào có mức độ biểu EGFR cao, trội hẳn so với tế bào thông thường [13,44] Do đó, mức độ biểu EGFR tế bào SK-Mel 28 cao hơn, dẫn đến khả bắt cặp tế bào hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR lớn so với tế bào HaCaT Hình 3.22 cho ta biểu đồ so sánh cường độ sáng trung bình hai tế bào HaCaT SK-Mel 28 Hình 3.22 So sánh cường độ sáng trung bình hai tế bào HaCaT SK-Mel28 Tóm lại, việc sử dụng hai phương pháp chụp ảnh hiển vi trường tối tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) để đánh dấu tế bào bước đầu đưa phương pháp thử nghiệm đánh dấu tế bào sinh học Mở định hướng nghiên cứu ứng dụng y sinh học tế bào, đặc biệt việc chẩn đoán sớm tế bào mang bệnh 54 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà KẾT LUẬN Chế tạo thành công hạt nano composite Fe3O4/Ag phương pháp hóa ướt mang đầy đủ tính chất hai loại hạt nano từ Fe3O4 (tính siêu thuận từ) hạt nano kim loại Ag (hiệu ứng Plasmon bề mặt cho phổ Tán xạ Raman đặc trưng), hạt nano sau chức hóa với phân tử 4aminothiophenol (4-ATP) nhằm tạo cầu nối gốc amin NH2 tự (Fe3O4/Ag-NH2) tương thích với phân tử sinh học phù hợp với mục đích ứng dụng y sinh học Sản phẩm thu hạt nano composite đa chức Fe3O4/Ag-NH2 Gắn kết thành công hạt nano đa chức Fe3O4/Ag-NH2 với kháng thể antiEGFR (NPs-anti EGFR) làm cầu nối liên kết với kháng nguyên hai dòng tế bào da HaCaT tế bào ung thư da SK-Mel 28 Thử nghiệm thành công việc đưa hạt nano đa chức gắn kháng thể antiEGFR lên hai dòng tế bào da HaCaT tế bào ung thư da SK-Mel 28 với tỉ lệ hạt khác Sử dụng hai phương pháp đánh dấu tế bào chụp ảnh hiển vi trường tối Phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) để so sánh mức độ biểu EGFR hai dòng tế bào 55 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Hoàng Hải, Cấn Văn Thạch, Nguyễn Hoàng Lương, Nguyễn Châu, Khuất Thị Thu Nga, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa, (2008), “Sử dụng hạt nano từ tính mang thuốc để tăng cường khả ức chế vi khuẩn thuốc kháng sinh Chloramphenicol”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, pp 192-204 Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Châu, Nguyễn Hoàng Lương, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa, Mai Anh Tuấn, (2007) “Ứng dụng hạt nano oxit sắt từ để tách chiết DNA, đếm tế bào bạch cầu, cải tiến trình xử lý nước nhiễm bẩn”, Hat nano sinh hoc va moi truong, Dạ Trạch’s Page Nguyễn Hoàng Hải, (2005), “Chế tạo ứng dụng hạt nano từ tính sinh học”, Hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ 6, thư viện học liệu mở Việt Nam, pp 1-6 Phạm Hoài Linh (2014), Nghiên cứu chế tạo chất lỏng từ hạt nano Fe3O4 ứng dụng diệt tế bào ung thư, luận án tiến sĩ Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam Nguyễn Ngọc Long, (2007), Vật lý chất rắn, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Nguyễn Thị Thùy, (2012), “Nghiên cứu chế tạo hạt nano cấu trúc lõi vỏ nhằm ứng dụng y – sinh”, luận văn thạc sĩ, Đại học Công nghệ, Hà Nội Anand P, Kunnumakkara AB, Kunnumakara AB, et al, (2008), “Cancer is a preventable disease that requires major lifestyle changes”, Pharm Res; pp 2097-2116 Balmain A., Gray J., Ponder B., (2003), “The genetics and genomics of cancer”, Nature Genetics, pp 238-244 56 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Buschow K H J and De Boer, (2004), Physics of Magnetism and Magnetic Materials, Kluwer Academic, London 10 Can K., Ozmen M., Ersoz M (2009), "Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization", Colloids Surf B Biointerfaces, pp 71(1):154-9 11 Carpenter, G.; Cohen S., ed.Lefiowitz, R.L., (1981), “Receptors and recognition”, Chapman and Hall, pp 41-66 12 David W Ball, (2001), “Theory of Raman Spectroscopy”, Spie Press as The Basics of Spectroscopy, 360, pp 32-34 13 Chu Tien Dung , Nguyen Quang Loc, Phi Thi Huong, Dinh Thi Thuy Duong, Tran Thi Hong, Luu Manh Quynh, Nguyen Hoang Nam, (2014), “Combination of 4-ATP Coated Silver Nanoparticles and Magnetic Fe3O4 Nanoparticles by Inverse Emulsion Method”, VNU Journal of Science: Mathematics – Physics, pp 1-9 14 Fabricant, R N.; De Larco, J E.; Todaro, (1977), “Nerve growth factor receptors on their cell surfaces”, Proc Natl Acad Sci USA, pp 1288-1292 15 Francisco X Real,2 Wolfgang J Retig,3 Pilar Garin Chesa,4 Myron R Melamed, Lloyd J Old, and John Mendelsohn, (1986), "Expresion of Epidermal Growth Factor Receptor in Human Cultured Cels and Tisues: Relationship to Cel Lineage and Stage of Diferentiation", Cancer Research 46, pp 4726-4731 16 Greg Emmerich, (2012), “Surface Plasmon Resonance: Technology Overview and Practical Applications”, Biotechnology Program, Early Drug Development 17 Harari P.M., Huang S.M., Herbst R., Quon H., (2003), “Moleculartargeting of the epidermal growth factor receptor in head and neck cancer”, In Head And Neck Cancer: a Multidisciplinary Approach, pp 1001-1016 18 Hayat, M A., (1989) “Colloidal gold: principles, methods and applications”, Academic Press, San Diego 57 Luận văn thạc sỹ 19 Nguyễn Thị Hà Hu B., Pan J., Yu H.L., Liu J.W., Xu J.H, (2009), "Immobilization of Serratia marcescens lipase onto amino-functionalized magnetic nanoparticles for repeated use in enzymatic synthesis of Diltiazem intermediate", Process Biochemistry, pp 1019-1024 20 Hui Wang, et al, (2013), "Multifunctional PEG encapsulated Fe3O4@silver hybrid nanoparticles: antibacterial activity, cell imaging and combined photothermo/chemo-therapy," J Mater Chem B, no 1, pp 6225–6234 21 Iglesias-Silva E., Rivas J , Leo´ n Isidro L.M , Lo´ pez-Quintela M.A., (2007), "Synthesis of silver-coated magnetite nanoparticles", Journal of Non-Crystalline Solids 353, pp 829–831 22 Ioan Notingher, (2007), “Raman Spectroscopy Cell-based Biosensors”, Sensors, pp 1343-1358 23 Kazumasa Uetsuki S K., (2010) "Experimental Identification of Chemical Effects in Surface Enhanced Raman Scattering of 4-Aminothiophenol", J Phys Chem., no 114, pp 7515–7520 24 Kooti M., Saiahi S., Motamedi H., (2013), "Fabrication of silver-coated cobalt ferrite nanocomposite and the study of its antibacterial activity", Journal of Magnetism and Magnetic Materials, no 333, pp 138-143 25 Le Ru E C , E Blackie, M Meyer, P G Etchegoin, (2007), “Surface Enhanced Raman Scattering Enhancement Factors: A Comprehensive Study”, J Phys Chem, pp 13794-13803 26 Li T., Moon J., Morrone A., Mecholsky J J., Talhman, D R and Adair, J H (1999), "Preparation of Ag/SiO2 nanosize composites by a reverse micelle and solgel technique." Langmuir, pp 4328–4334 27 Lian-sheng JIAO, Zhijuan WANG, Li NIU, Jing SHEN, Tian-yan YOU, Shao-jun DONG, Ari IVASKA, (2006), "In situ electrochemical SERS studies on electrodeposition of aniline on 4-ATP/Au surface", J Solid State Electrochem, pp 886-893 58 Luận văn thạc sỹ 28 Nguyễn Thị Hà Ling-Yan Zhang, Ting Chu, (2013), "Synthesis of Composite Particles with Fe3O4 core and Ag Shell for the Development of Fingerprints", Bull Korean Chem Soc Vol 34, No 5, pp 1457-1461 29 Michael J Pitkethly, (2003), "Nanoparticles as building block?", Nano today, pp 36-42 30 Michal Cichocki, Hanna Szaefer, Violetta Krajka-Kuz´niak, Wanda BaerDubowska, (2014),"The effect of resveratrol and its methylthio-derivatives on EGFR and Stat3 activation in human HaCaT and A431 cells", Mol Cell Biochem , 396, pp 221–228 31 Miha Marolt, (2014), “Superparamagnetic materials”, University of Ljubljana Faculty of Mathematics and Physics, Kranj, pp 2-5 32 Mornet S., Vekris A., Bonnet J., Duguet E., Grasxset F., Choy J.H., Portier J., (2000), "DNA–magnetite nanocomposite materials", Materials Letters, pp 183–188 33 Nakamura, R M.; Grody, W W.; Wu, J T.; Nagle, R B (2004), "Cancer diagnostics, current and future trend", Humana Press 34 Petra Boukamp, Rule T Petrussevska, Dirk Breitkreutz, Jiirgen Hornung, Alex Markham,* and Norbert E Fusenig, (1988) "Normal Keratinization in a Spontaneously Immortalized Aneuploid Human Keratinocyte Cell Line", The Journal of Cell Biology, pp 761-771 35 Luu Manh Quynh , Nguyen Hoang Nam, K Kong., Nguyen Thi Nhung, Pham Ba Duy, Nguyen Thuy Trang, I Notingher, M Henini, Nguyen Hoang Luong, "Surface-enhanced Raman spectroscopy study of 4-ATP on gold nanoparticles for diagnosis of basal cell carcinoma" 36 Luu Manh Quynh , Tran Quoc Tuan, Nguyen Hoang Luong, Nguyen Ngoc Long, and Nguyen Hoang Hai, (2011), “Application of Gold Nanoparticles for Early Detection of Breast Cancer Cells”, e-Journal of Surface Science and Nanotechnology, Vol 9, pp 544-547 59 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà 37 Released news,6/6/05,National Cancer Institute 38 See K H., Mullins M E., Mills O P and Heiden P A (2005), "A reactive core-shell nanoparticle approach to prepare hybrid nanocomposites: Effects of processing variables", Nanotechnology, pp 1950–1959 39 Shen X.C., Fang X.Z., Zhou Y.H., Liang H (2004), "Synthesis and characterization of -amino propyl triethoxy silane - modified super paramagnetic magnetite Nanoparticles", Chemistry Letters, pp 1468-1469 40 Silvia Liong, (2005), "A multifunctional approach to development, fabrication, and charactierization of Fe3O4 composite”, Georga Institute of Technology 41 Stein,G.S.; Pardee, A.B (2004), "Cell cycle and growth control; biomolecular regulation and cancer", Hoboken,NJ: Wily-Liss 42 Sujit Kumar Ghosh, Tarasankar Pal, (2007) " Interparticle Coupling Effect on the Surface Plasmon Resonance of Gold Nanoparticles: From Theory to Applications", Chem Rev 107, pp 4797−4862 43 Thomas Boenisch MS, (2009), “Immunohistochemical (IHC) Staining Methods”, Dako North America, California 44 Ujjal Kumar Sur, (2010), “Surface-Enhanced Raman Spectroscopy”, Research Gate, pp 154-164 45 Walker F, Orchard SG, Jorissen RN, Hall NE, Zhang HH, Hoyne PA, Adams TE, Johns TG, Ward C, Garrett TP, Zhu HJ, Nerrie M, Scott AM, Nice EC, Burgess AW, (2004), “CR1/CR2 interactions modulate the functions of the cell surface epidermal growth factor receptor”, J Biol Chem., pp 279(21):22387-98 46 Wang X., Zhou G., Zhang H., Du S., Xu Y., Wang C., (2011), “Immobilization and catalytic activity of lipase on mesoporous silica prepared from biocompatible gelatin organic template”, Journal of NonCrystalline Solids, pp 3027-3032 60 Luận văn thạc sỹ 47 Nguyễn Thị Hà Wansong Yu, Yiqun Huang, Lu Pei, Yuxia Fan, Xiaohui Wang, and Keqiang Lai, (2014), Magnetic Fe3O4/Ag Hybrid Nanoparticles as, Journal of Nanomaterials, China 48 World Health Organization, (2014), “Global battle against cancer won’t be won with treatment alone Effective prevention measures urgently needed to prevent cancer crisis”, International Agency Research on Cancer, London 49 World Health Organization, (2014), Cancer Country Profiles, Vietnam 50 Xiaohua Huang, (2006), Gold nanoparticles used in Cancer Cell Diagnostics, Selective Photothemal Therapy and Catalysis of NADH Oxidation Reaction, Georgia Institute of Technology 51 Xue X., Wang J., Mei L., Wang Z., Qi K., Yang B (2013), "Recognition and enrichment specificity of Fe3O4 magnetic nanoparticles surface modified by chitosan and Staphylococcus aureus enterotoxins A antiserum", Colloids Surf B Biointerfaces, pp 103:107-13 52 Zhang Xueping, Jiang Wanquan, Gong Xinglong, Zhang Zhong, (2010), "Sonochemical synthesis and characterization of magnetic separable Fe3O4/Ag composites and its catalytic properties", Journal of Alloys and Compounds 508, pp 400–405 61 [...]... tế bào HaCaT và tế bào ung thư da SK-Mel 28 để nhận biết và đánh giá mức độ biểu hiện EGFR của hai dòng tế bào bằng hai phương pháp vật lý là chụp ảnh hiển vi trường tối và đo phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) Đề tài luận văn: Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp SERS có bố cục như sau: Mở đầu Mục lục Chƣơng 1 - Tổng quan: Trình bày sơ lược về hạt. .. loạn như trong chất thuận từ 1.1.4 Ứng dụng của hạt nano từ Fe3O4 Ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng trong cơ thể và ngoài cơ thể Các ứng dụng trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác [3] Đây cũng chính là ứng dụng. .. Trình bày sơ lược về hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2, hạt nano có cấu trúc lõi vỏ và ứng dụng của hạt nano trong y sinh học Chƣơng 2 - Thực nghiệm: Trình bày phương pháp chế tạo mẫu, các thiết bị thực nghiệm được sử dụng để nghiên cứu các tính chất và ứng dụng của vật liệu nano 3 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 trong đánh dấu tế bào HaCaT và SK-Mel 28... để đánh dấu chẳng hạn đánh dấu tế bào ung thư vú [36] , tế bào ung thư da [6] và nhận biết các tế bào mang bệnh trong y sinh [38] Bên cạnh đó, phương pháp tán xạ Raman tăng cường bề mặt còn được ứng dụng để nghiên cứu quá trình động học trên bề mặt hạt nano kim loại, trong đó hạt nano kim loại quý như vàng, bạc được ưu tiên nhờ khả năng tăng cường hiệu ứng rất mạnh Ngoài những ứng dụng kể trên, thì phương. .. sĩ và các nhà nghiên cứu tìm ra một phương pháp để có thể phát hiện sớm các tế bào mang bệnh giúp hỗ trợ điều trị hiệu quả hơn Hiện nay, đã có các phương pháp giúp chẩn đoán sớm các tế bào ung thư như: phương pháp thử sinh học, phép thử nội soi tế bào, và đặc biệt là phương pháp đánh dấu bằng lý sinh học nano [50] Trong vài thập niên trở lại đây, công nghệ nano đang là một hướng nghiên cứu dành được... Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà Nhằm mục tiêu ứng dụng các tính năng đặc biệt của nhiều loại hạt nano cùng một lúc, nhóm nghiên cứu đã kết hợp cả hai loại hạt nano từ Fe3O4 và hạt nano kim loại Ag được chức năng hóa với các phân tử 4-ATP tạo thành hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2 Thông qua nhóm chức năng (-NH2), các hạt nano composite đa chức năng này có thể liên kết đồng hóa trị với các... lọc tế bào, tính chất quang của hạt nano kim loại nói chung và hạt bạc nói riêng có khả năng ứng dụng để đánh dấu tế bào [13, 32] Hiện nay, việc nghiên cứu các hạt nano có cấu trúc lõi-vỏ đang được rất nhiều nhóm nghiên cứu trong nước và trên thế giới quan tâm, đồng thời đã đạt được những thành tựu nhất định có thể kể đến như: - Nhóm nghiên cứu Xueping Zhang đã chế tạo thành công hạt nano composite bằng. .. lên tế bào 1.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào 1.2.1 Bệnh ung thƣ Bệnh ung thư khởi nguồn từ sự biến đổi đột ngột DNA của các tế bào bình thường Khi phát hiện lỗi trên DNA, lập tức cơ thể sẽ có phản ứng sửa chữa, phá hủy, hoặc ngăn chặn quá trình phát triển của tế bào mang mầm DNA lỗi đó Nhưng trong các tế bào bị ung thư cơ chế sửa lỗi hoặc hạn chế phát triển của tế bào. .. tế bào Keratinocyte và Melanocyte trong da 1.3 Mục tiêu của luận văn Với mục tiêu chế tạo vật liệu nano đa chức năng nhằm định hướng ứng dụng trong phân tách và đánh dấu tế bào, kết hợp nhiều tính năng ưu việt của các hạt nano đơn chức năng, trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi định hướng dùng phương pháp hóa ướt để chế tạo vật liệu nano composite Fe3O4/Ag Hạt nano 21 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị... sử dụng phương pháp hoá ướt để chế tạo hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag Hạt nano đa chức năng này mang đầy đủ tính chất kim loại quý của hạt nano Ag gắn 4ATP cho tín hiệu Raman và tính chất từ của vật liệu Fe3O4 nên vừa có thể sử dụng tìn hiệu Raman để đánh dấu vừa có thể khắc phục được khả năng tập trung hạt theo mong muốn, giảm thời gian lọc rửa Nhóm chức –NH2 được gắn trên bề mặt hạt nano Ag có tính ... văn: Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức đánh dấu tế bào phương pháp SERS có bố cục sau: Mở đầu Mục lục Chƣơng - Tổng quan: Trình bày sơ lược hạt nano composite đa chức Fe3O4 /Ag-NH2, hạt nano. .. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS Chuyên ngành: Vật lý chất rắn Mã số: 60440104 LUẬN... tách chọn lọc tế bào ứng dụng thể nhằm tách tế bào cần nghiên cứu khỏi tế bào khác [3] Đây ứng dụng nghiên cứu sử dụng luận văn Giống hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt bề mặt tế bào kháng thể