Nghiên cứu ứng dụng phương pháp công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây Đan sâm tại Gia Lâm Hà Nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ TIẾN VINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG NHÂN GIỐNG, TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG TRỌT CÂY ĐAN SÂM (SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 62.62.01.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2016 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS NGUYỄN PHƢƠNG THẢO TS NINH THỊ PHÍP Phản biện 1: PGS.TS ĐOÀN THỊ THANH NHÀN Hội Sinh học Phản biện 2: PGS.TS PHAN HỮU TƠN Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS TRẦN NGỌC HÙNG Viện Nghiên cứu Rau Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) thuốc quý y học cổ truyền, dùng làm thuốc ghi sách "Bản kinh" Các nghiên cứu y học đại cho thấy Đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch Nhu cầu sử dụng dược liệu Đan sâm hai thập kỷ gần gia tăng nhanh chóng Nếu năm 1998, nhu cầu Đan sâm giới mức 4.500 tấn/năm số lên tới 15.000 tấn/năm (Qin, 2006) Mặc dù giá trị nhu cầu Đan sâm tăng cao diện tích trồng Đan sâm Việt Nam hạn chế, không đủ cung cấp cho nhu cầu dược liệu Đan sâm nước Để đáp ứng dược liệu Đan sâm, đẩy mạnh nhân nuôi đường tất yếu Bên cạnh phương pháp nhân giống truyền thống, ứng dụng công nghệ sinh học để nhân giống nhân nuôi sinh khối dược liệu hướng đắn nhằm khắc phục hạn chế sản xuất truyền thống Nhân giống vơ tính in vitro có nhiều ưu điểm hệ nhân giống cao, giống giữ nguyên đặc tính mẹ, đồng đều, bệnh, sức sống cao đưa trồng đất… nên ứng dụng rộng rãi vào sản xuất nhiều loại trồng, có dược liệu Phương pháp ni cấy rễ tơ với ưu điểm vượt bậc như rễ phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh, bền vững mặt di truyền tổng hợp hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao với mẹ, tạo sinh khối lớn Hơn nữa, gần phát triển hệ thống bioreactor mở nhiều triển vọng việc nuôi cấy rễ quy mô công nghiệp (Guillon et al., 2006) Tại Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất giống nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp Do vậy, đề tài tiến hành có ý nghĩa lớn mặt khoa học thực tiễn 1.2 MỤC TIÊU 1.2.1 Mục tiêu chung Đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro Đan sâm có hệ số nhân cao, chất lượng giống tốt biện pháp kỹ thuật tối ưu để trồng Đan sâm đồng ruộng Đồng thời, tạo dòng tế bào rễ tơ Đan sâm xác định số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc nhân nuôi rễ tơ in vitro làm tiền đề cho việc xây dựng qui trình sản xuất hợp chất thứ cấp phục vụ công nghiệp dược liệu Việt Nam 1.2.2 Mục tiêu cụ thể (1) Xác định thông số kỹ thuật quy trình nhân giống in vitro Đan sâm (2) Xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm tạo dòng rễ tơ Đan sâm số thơng số q trình nhân ni sinh khối rễ tơ Đan sâm (3) Xác định biện pháp kỹ thuật (thời vụ, mật độ trồng, dinh dưỡng) thích hợp cho sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng dược liệu rễ Đan sâm 1.3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu xác định yếu tổ ảnh hưởng đến trình nhân nhanh in vitro Đan sâm, từ xây dựng quy trình vi nhân giống Đan sâm có hệ số nhân giống cao, chất lượng giống tốt, đáp ứng nhu cầu giống Đan sâm thị trường Đồng thời, nghiên cứu thiết lập trình tạo nhân nuôi sinh khối rễ tơ Đan sâm điều kiện in vitro, góp phần chủ động tạo nguồn dược liệu Đan sâm sạch, chất lượng cao làm tiền đề cho quy trình sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học từ Đan sâm Đề tài cũng xác định số biện pháp kỹ thuật trồng trọt ảnh hưởng đến suất, chất lượng dược liệu Đan sâm, góp phần xây dựng quy trình trồng trọt Đan sâm cho hiệu kinh tế cao Do vậy, nói, nghiên cứu Việt Nam cách có hệ thống công phu nhân giống in vitro, in vivo Đan sâm, cảm ứng nhân nuôi rễ tơ Đan sâm 1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học nghiên cứu Đan sâm xây dựng sở lý luận cho việc nhân giống in vitro sản xuất sinh khối Đan sâm công nghệ sinh học cơng nghệ truyền thống Từ đó, góp phần giúp cho nhà khoa học dễ dàng tìm hiểu nghiên cứu loại tương lai 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài cho phép hình thành được: (1) Quy trình nhân giống in vitro; (2) Quy trình tạo, nhân ni sinh khối rễ tơ Đan sâm (3) Các biện pháp kỹ thuật trồng trọt Các quy trình, kỹ thuật có khả ứng dụng thực tiễn cao, góp phần chủ động di thực, bảo tồn, phát triển nguồn giống dược liệu quý Đan sâm Việt Nam Bên cạnh đó, sản phẩm đề tài tạo bao gồm nguồn giống chất lượng cao lượng sinh khối rễ lớn Như vậy, đóng góp thiết thực, góp phần quan trọng việc phát triển dược liệu Đan sâm cách chủ động, bền vững nước ta Chính vậy, đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐAN SÂM 2.1.1 Nguồn gốc Cây Đan sâm có tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc ngành Hạt kín – Angiospermae, lớp mầm - Dicotyledones, phân lớp Cúc - Asteridae, Hoa môi – Lamiales, họ Hoa môi – Lamiaceae, chi Salvia Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) biết đến với tên gọi Radix Salviae Miltiorrhizae, huyết sâm, huyết căn, xơn đ … lồi thực vật sống lâu năm, loài địa Trung Quốc Nhật Bản 2.1.2 Đặc điểm thực vật học Đan sâm thảo, lâu năm, cao khoảng 30 – 70 cm Thân phát triển thẳng đứng vng cạnh, phía thân phân nhánh Tồn thân bao phủ lớp lông mềm màu vàng lông tuyến Lá kép lông chim lẻ mọc đối, 3-5 chét, chét thường lớn Chùm hoa trịn, mọc đầu cành nách lá, gồm nhiều vòng chỗ dày, chỗ thưa xếp thành tầng dọc, dài 10 – 15 cm Đan sâm có 13 – 21 rễ đ , phát triển từ thân rễ Rễ Đan sâm nh dài hình trụ, dài 10 – 20 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm, ăn sâu xuống đất, cong queo, có phân nhánh có rễ dạng tua nh Rễ có màu đ tươi, mặt ngồi nhăn nheo tạo thành rãnh nh song song xuôi theo chiều dài rễ (Đỗ Tất Lợi, 2004) 2.1.3 Phân bố Tại Trung Quốc, Đan sâm trồng tỉnh Tứ Xuyên khoảng 100 năm trước (Wang et al., 2004) trồng phổ biến tỉnh Sơn Đông, Hà Nam, Hà Bắc, Liêu Ninh, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Quý Châu, Quảng Đông, Sơn Tây Đan sâm di thực vào Việt Nam khoảng năm 1960, trồng Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Văn Điển (Hà Nội), Bắc Hà (Lào Cai) số vườn thuốc khác Hiện nay, Đan sâm ý phát triển để nhân rộng Trại Tam Đảo, Sapa Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến thuốc Hà Nội 2.1.4 Yêu cầu điều kiện sinh thái Đan sâm Nhiệt độ thích hợp cho hạt Đan sâm nảy mầm 15 - 25oC, sinh trưởng, phát triển tốt nhiệt độ 20 - 26oC Cây ngừng sinh trưởng nhiệt độ khơng khí 10oC (Shu et al., 2004) Giống với thuộc họ hoa môi, Đan sâm ưa sáng thích hợp trồng có ánh nắng chiếu trực tiếp Nước đóng vai trị quan trọng phát triển Đan sâm, ảnh hưởng đến hấp thu sử dụng chất dinh dưỡng đất điều chỉnh phát triển rễ Các đặc tính nhu cầu nước hiệu sử dụng nước Đan sâm điều kiện đất đai khác nghiên cứu Nước cần thiết toàn chu kỳ tăng trưởng cây, nhu cầu nhiều thường xảy từ tháng sáu đến tháng tám độ ẩm đất nên trì mức tối đa khoảng 70% giai đoạn (Gao et al., 2004) Các nguyên tố vô rễ Đan sâm, thu thập từ khu vực sản xuất khác nhau, tính chất hóa lý đất vùng phân tích Các thuộc tính đất trồng Đan sâm khu vực sản xuất khác thịt pha cát sét, độ pH đất khoảng 6,0 - 8,7 Khơng có thành phần rõ ràng cho phát triển Đan sâm tìm thấy đất Do đó, Đan sâm có khả thích ứng tốt môi trường sinh thái đất khác (Zhao et al., 2004) 2.1.5 Giá trị dƣợc liệu Dịch chiết Đan sâm chiết xuất rượu đặc biệt có nhiều sắc tố diterpene phenanthrenequinones (Chang et al., 1990), khi chiết xuất nước dịch chiết thu chứa nhiều hợp chất phenolic (Lu and Foo, 2002) Các thành phần hóa học rễ Đan sâm gồm chất hòa tan lipid tanshinone I, tanshinone II, tanshinone II, cryptotanshinone Đây hợp chất có hoạt tính dược học có tác dụng chống thiếu máu cục bộ, kháng khuẩn, chống oxy hóa đặc tính kháng u (Gordon and Weng, 1992; Sze et al., 2005; Wang et al., 2005) 2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM 2.2.1 Trên giới Đan sâm có lịch sử 2000 năm sử dụng Trung Quốc, Đan sâm có nguồn gốc tự nhiên trồng trọt sử dụng phổ biến tỉnh Sơn Đông, An Huy, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Hồ Bắc, Tứ Xuyên, Quý Châu, Sơn Tây, Quảng Đơng… tỉnh Sơn Tây, Tứ Xun, Hà Bắc, Hà Nam Sơn Đông khu vực sản xuất Đan sâm chất lượng sản lượng cao Năm 1998, nhu cầu Đan sâm giới mức 4.500 tấn/năm năm 2002 10.000 toàn giới lên tới 80.000 tấn/năm thời gian gần (Hu et al, 2005) Một sản phẩm sử dụng phổ biến có chứa dược liệu Đan sâm Thiên Sứ Hộ Tâm Đan nhà khoa học Trung Quốc bào chế sở kết hợp hai loại thảo dược Đan sâm tam thất để phòng điều trị bệnh lý tim mạch đau thắt ngực, thiểu mạch vành, nhồi máu tim, tăng cholesterol máu… Có mặt thị trường từ năm 1993, tính đến có tỷ liều dùng kê đơn cho khoảng 10 triệu bệnh nhân điều trị thời gian ngắn kéo dài 34 Quốc gia toàn giới Mỹ, Nga, Canada, Singapo, Nam Phi, Việt Nam 2.2.2 Tại Việt Nam Đan sâm di thực sử dụng từ năm 1960 Việt Nam loại dược liệu trồng thử nghiệm Lào Cai (Sập, Bắc Hà), Vĩnh Phúc (Tam Đảo) Hà Nội (Văn Điển) số vườn thuốc khác (Ngô Quốc Luật cs., 2014) 2.3 CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT 2.3.1 Phƣơng pháp nhân giống Đan sâm Cây Đan sâm nhân giống hữu tính hạt vơ tính từ rễ củ, tách chồi phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Zhao et al., 1999; Wang et al., 2002; Zhang and Zhang, 2004) (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Các phƣơng pháp nhân giống Đan sâm Phƣơng pháp nhân giống Vật liệu Chuẩn bị chuyển Mùa đồng ruộng vụ Trồng trực tiếp Quy trình Chuẩn bị chuyển đồng ruộng Trồng trực tiếp Phƣơng Phƣơng pháp Phƣơng pháp nhân giống pháp nhân nhân giống từ rễ hữu tính giống củ tách chồi Hạt Chồi Rễ củ Gieo hạt: tháng 7-8 Khơng có Giâm củ: tháng 2-3 tháng 2-3 thông tin Chuyển Chuyển đồng ruộng: đồng ruộng: cuối tháng 10 cây đạt chiều cao đạt chiều cao 6-10 cm 6-10 cm Tháng tháng Cuối tháng Tháng 2-3 10 đến đầu tháng 11 Lượng hạt: 15,0-22,5 kg/ha Khơng có Mật độ trồng 33 x Mật độ gieo hạt: hàng cách thông tin 23 cm hàng 12 - 15 cm Mật độ trồng: 33 (30-35 cm) x 23 (20) Lượng hạt: 7,5 kg/ha Mật độ Mật độ trồng: 33 Gieo xạ: hàng cách hàng trồng: 33x23 x 23 cm 30-35 cm cm Mật độ cây: 30-35 x 20-25 cm Nguồn: Sheng (2007) 2.3.2 Khoảng cách trồng Trong yếu tố kỹ thuật để tăng suất trồng, ngồi phân bón cách bón phân mật độ quần thể ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển trồng Liu et al (2006) nghiên cứu ảnh hưởng khoảng cách trồng đến khả sinh trưởng phát triển Đan sâm trồng tỉnh Shanxi, Trung Quốc Bảy khoảng cách trồng khảo sát 20 × 20 cm, 25 × 20 cm, 25 × 25 cm, 25 × 30 cm, 30 × 25cm, 35 × 25 cm 35 × 30 cm Kết cho thấy khoảng cách trồng 20 x 20 cm, tỷ lệ sống thấp (47%) có đến 88% sống khoảng cách trồng 25 x 20 cm tiêu suất rễ, khoảng cách trồng 25 x 25 cm cho khối lượng rễ đạt cao nhất, cao 20% so với khối lượng rễ thu trồng khoảng cách 35 x 30 cm 60% so với khoảng cách 35 x 25 cm Hiện nay, quy trình trồng Đan sâm thường sử dụng khoảng cách trồng lớn với khoảng cách hàng 25 30 cm, khoảng cách 20 25 cm Khoảng cách trồng kích thích tổng hợp hoạt chất tanshione IIA (Wang et al., 2003c; Jiang et al., 2004) 2.3.3 Phân bón Bón phân định suất hoạt chất tích lũy rễ Đan sâm Chế độ phân bón hợp lý tạo điều kiện cho sinh trưởng phát triển thuận lợi, cho suất cao, chất lượng dược liệu tốt Đối với Đan sâm đất trồng cần chọn đất phù sa, đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều màu, cao ráo, thoát nước Sau cày bừa kỹ, cần lên luống cao 20 – 25cm, rộng 90 – 120 cm, rãnh phải dốc để thoát nước Dùng 15 – 20 phân chuồng ủ với 1,4 – 2,8 tro bếp, 270 kg supe lân để bón lót cho heta Tốt nhất, nên bón theo hốc để tiết kiệm phân hạn chế c dại Hốc chuẩn bị với khoảng cách 30x30 cm 2.4 KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 2.4.1 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro sản xuất dƣợc liệu Kỹ thuật nhân giống in vitro áp dụng thành công nhiều đối tượng dược liệu, cho phép cung cấp nguồn giống chất lượng cách chủ động cho sản xuất Việt Nam số tác giả tiến hành nhân giống in vitro thành công số dược liệu quan trọng khác, sử dụng chồi đỉnh lấy từ Lô hội (Aloe vera Linne.) tiến hành nhân giống vơ tính in vitro Kết cho thấy, môi trường nhân nhanh thích hợp MS + 2,5 mg/l BAP + 0,6 mg/l α- NAA cho hệ số nhân đạt 4,1 lần Một đối tượng khác ba kích (Morinda officinalis How) tái sinh thành công với vật liệu ban đầu đoạn thân mang chồi nách môi trường thích hợp MS + 0,25 mg/l kinetin + mg/l BA với tỷ lệ chồi tái sinh sau tuần ni cấy 96,6% Mơi trường nhân nhanh thích hợp MS + 3,0 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA+ 10 mg/l riboflavin, sau 45 ngày đạt hệ số nhân 10,13 lần (Hoàng Thị Thế cs., 2013) 2.4.2 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro Đan sâm Nhiều cơng trình nhân giống vơ tính Đan sâm với mục đích tạo giống chất lượng cao công bố bới số tác Feng et al (2004); Xu et al (2008); Cai et al (1991), Zhao et al (2003 Tại Việt Nam, trước nghiên cứu này, có nghiên cứu liên quan đến nhân nhanh in vitro Đan sâm thực Tạ Như Thục Anh cs (2014) Tác giả khảo sát ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến khả nhân in vitro Đan sâm sử dụng vật liệu chồi mầm từ củ giống Nghiên cứu loại chất điều tiết sinh trưởng nồng độ thích hợp cho q trình tái sinh chồi từ mầm ngủ, nhân nhanh kích thích rễ Đan sâm điều kiện in vitro 2.5 TẠO VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐAN SÂM Hu and Alfermann (1993) tạo dịng rễ tơ Đan sâm thơng qua lây nhiễm quan in vitro với năm chủng vi khuẩn A.rhizogenes Trong q trình nhân ni rễ tơ, nhóm tác giả tìm mơi trường bổ sung 3% đường ammonium nitrate có ảnh hưởng tích cực đến tăng sinh khối rễ tơ tích lũy hoạt chất diterpenes Sử dụng chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 lây nhiễm với Đan sâm in vitro, Chen et al (1999) thu dịng rễ tơ chuyển gen Nhóm tác giả nghiên cứu ảnh hưởng môi trường MS, MS-NH4 (môi trường MS không chứa ammonium nitrate) B5, WPM 6,7-V đến tốc độ tăng trưởng rễ tơ khả tích lũy hợp chất thứ cấp Kết cho thấy, tốc độ tăng trưởng rễ tơ hoạt chất thứ cấp tích lũy rễ tơ nuôi cấy môi trường MS-NH4 6,7-V cao so với nuôi cấy môi trường MS, B5 WPM Theo kết nghiên cứu Ge and Wu (2005), hàm lượng tanshinone tổng số tích lũy rễ tơ Đan sâm tăng 1,2 lần bổ sung 30 μM Ag+ 3,1 lần bổ sung 100 µg/ml YE vào mơi trường ni cấy so với công thức đối chứng không bổ sung Ag+ YE Yang et al (2012) tiến hành nghiên cứu tác động PEG, ABA methyl jasmonate (MJ) đến tổng hợp tanshinone rễ từ Đan sâm Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng loại tanshinone rễ tơ Đan sâm tăng lên rõ rệt bổ sung 2% PEG 200 µM ABA vào môi trường nuôi cấy Cheng et al (2013) nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp yếu tố elicitor gồm Ag+, YE MJ đến tích lũy hoạt chất tashinones Kết cho thấy, bổ sung kết hợp YE + Ag+, Ag+ + MJ YE + Ag+ + MJ làm tăng hàm lượng tanshinones, đặc biệt bổ sung Ag+ + MJ YE + Ag+ + MJ làm tăng hàm lượng tanshinone lên lần so với công thức đối chứng PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Hạt Đan sâm Salvia miltiorrhiza Bunge nhập từ tỉnh Tứ Xuyên – Trung Quốc - Chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 cung cấp Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh 3.2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Nội dung 1- Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến tỷ lệ nảy mầm hạt Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng kinetin đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BA kinetin đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BA α-NAA đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng α-NAA đến khả tạo rễ chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ chồi Đan sâm - Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Đan sâm in vitro môi trường rễ đến tỷ lệ sống vườn ươm - Thí nghiệm 10 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới sinh trưởng phát triển Đan sâm 3.2.2 Nội dung 2-Tạo dòng rễ tơ nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro Đan sâm - Thí nghiệm 11 Nghiên cứu ảnh hưởng vật liệu lây nhiễm đến khả tạo rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 12 Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ dịch khuẩn A.rhizogenes đến khả tạo rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 13 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tăng sinh khối rễ tơ - Thí nghiệm 14 Nghiên cứu ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng sinh khối rễ tơ - Thí nghiệm 15 Nghiên cứu ảnh hưởng loại bình ni cấy đến tăng sinh khối rễ tơ - Thí nghiệm 16 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 17 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến tăng sinh khối tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 18 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp TDZ, ABA BA đến tăng sinh khối tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 19 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố elicitor đến tăng sinh khối tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ Đan sâm 3.2.3 Nội dung 3-Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất nâng cao suất chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm - Thí nghiệm 20: Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ đến sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng dược liệu Đan sâm - Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ trồng đến sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng dược liệu Đan sâm - Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng số công thức phân bón đến sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng dược liệu Đan sâm 3.3 ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM 3.3.1 Nhóm thí nghiệm phịng Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS B5 + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar Môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH = 5,8 trước hấp khử trùng áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C 20 phút Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16 h sáng/8h tối, cường độ ánh sáng 2000 -2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C Các thí nghiệm thực phịng thí nghiệm mơn CNSH Thực vật, Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, nhắc lại lần công thức, lần 30 mẫu với thí nghiệm nội dung xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro Đan sâm, 100 mẫu thí nghiệm chuyển gen mẫu thí nghiệm nhân ni sinh khối rễ Đan sâm 3.3.1.1 Phương pháp ni cấy mơ hành Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS B5 theo thí nghiệm + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar Môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH = 5,8 trước Bảng 4.1 Ảnh hƣởng GA3 đến khả nảy mầm hạt Đan sâm sau tuần nuôi cấy GA3 (mg/l) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 CV% LSD0,05 Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) 14,33 28,33 40,43 20,00 18,33 Chiều cao chồi (cm) 1,95 4,61 4,75 6,91 7,40 2,3 0,21 Số lá/chồi 5,43 7,35 6,20 6,00 6,09 1,9 0,21 GA3 có tác dụng làm tăng tỷ lệ nẩy mầm hạt Đan sâm môi trường MS Nồng độ bổ sung tối ưu 1,0 mg/l GA3, cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 40,43% 4.1.2 Nhân nhanh chồi Trong nhân giống trồng in vitro, để có hệ số nhân giống cao, số lượng giống lớn, đồng nhất, có sức sinh trưởng tốt việc xác định mơi trường nhân nhanh thích hợp có vai trị định Cytokinin nhóm chất điều tiết sinh trưởng đóng vai trị quan trọng việc điều khiển tái sinh mẫu cấy theo hướng tạo chồi làm tăng hệ số nhân Tuy nhiên, với loại chất kích thích sinh trưởng khác có hiệu khác lồi giai đoạn nuôi cấy Bổ sung BA làm tăng hệ số nhân chồi Đan sâm so với công thức đối chứng Trong đó, mơi trường MS+0,5mg/l BA cho hệ số nhân chồi (5,05 lần) chiều cao chồi (4,08 cm) đạt cao (Bảng 4.2) Bảng 4.2 Ảnh hƣởng BA đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy BA (mg/l) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 CV% LSD0,05 Hệ số nhân (lần) 1,08 5,05 4,63 3,77 3,53 7,3 0,32 Chiều cao chồi (cm) 3,13 4,08 3,67 3,59 2,92 2,6 0,31 Hệ số nhân chồi Đan sâm môi trường bổ sung kinetin dao động từ 2,58 đến 3,04 lần so với 1,08 lần môi trường đối chứng Tuy nhiên khác biệt chiều cao chồi Đan sâm công thức mơi trường có bổ sung kinetin khơng rõ rệt (Bảng 4.3) Bảng 4.3 Ảnh hƣởng kinetin đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy Kinetin (mg/l) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 CV% LSD0,05 Hệ số nhân (lần) 1,08 2,58 2,58 2,62 3,04 7,1 0,3 11 Chiều cao chồi (cm) 3,13 3,83 3,24 3,42 3,67 10,1 0,3 Bổ sung kinetin (từ 0,1 – 0,5 mg/l) vào môi trường MS + 0,5 mg/l BA làm giảm hệ số nhân chồi chiều cao chồi Đan sâm (Bảng 4.4) Bảng 4.4 Ảnh hƣởng tổ hợp BA kinetin đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy BA (mg/l) 0,5 Kinetin (mg/l) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 CV% LSD0,05 Hệ số nhân (lần) 5,05 3,17 2,73 2,77 2,57 2,57 3,0 0,15 Chiều cao chồi (cm) 4,08 3,56 3,15 2,67 3,11 3,36 5,2 0,11 Bổ sung kết hợp 0,5 mg/l BA α-NAA nồng độ 0,01 – 0,1 mg/l làm giảm hệ số nhân chồi chất lượng chồi Đan sâm Trong công thức kết hợp BA α-NAA, hệ số nhân chồi đạt cao 3,37 lần công thức bổ sung kết hợp 0,5 mg/l BA 0,01 mg/l α-NAA, nhiên, hệ số nhân thấp công thức đối chứng bổ sung 0,5 mg/l BA (5,05 lần) Tương tự trường hợp bổ sung kết hợp BA kinetin, bổ sung BA α-NAA làm giảm chiều cao chồi Đan sâm (Bảng 4.5) Bảng 4.5 Ảnh hƣởng tổ hợp BA α-NAA đến hiệu nhân nhanh chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy BA (mg/l) 0,5 α-NAA (mg/l) 0,00 0,01 0,025 0,05 0,075 0,10 CV% LSD0,05 Hệ số nhân (lần) 5,05 3,37 2,93 3,16 3,13 2,36 3,0 0,15 Chiều cao chồi (cm) 4,08 3,58 2,99 2,96 2,97 3,05 3,0 0,17 Như vậy, mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi Đan sâm MS + 0,5 mg/l BA, cho hệ số nhân chồi đạt 5,05 lần, chiều cao chồi đạt 4,08 cm, chồi sinh trưởng, phát triển tốt 4.1.3 Tạo hồn chỉnh Trong q trình ni cấy ống nghiệm, ngồi số chồi hình thành rễ, cịn lại hầu hết chưa có rễ Để thích nghi với điều kiện tự nhiên bên thuận lợi phải sử dụng biện pháp kích thích cho chồi rễ Một số nghiên cứu cho thấy số loài “khó” rễ in vitro “chậm” hình thành rễ mơi trường MS mơi trường giảm nửa (½ MS) kích thích hình thành rễ nhanh Ngồi ra, bổ sung vào mơi trường ni cấy chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin than hoạt tính giúp nâng cao hiệu rễ chồi in vitro Trong nghiên cứu này, chồi Đan sâm có chiều cao 2-3 cm, sinh trưởng phát triển bình thường cấy chuyển sang mơi trường ½ MS bổ sung α-NAA, IAA, IBA để cảm ứng tạo rễ 12 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng α-NAA tới khả rễ chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy α-NAA (mg/l) 0,00 0,10 0,25 0,50 0,75 1,00 CV% LSD0,05 Tỷ lệ chồi rễ (%) 100,00 79,17 79,17 92,31 76,92 73,08 Số rễ (rễ) 2,40 2,84 3,37 3,04 2,90 3,47 3,8 0,21 Chiều dài rễ (cm) 4,23 6,15 7,06 5,33 5,22 3,8 1,7 0,16 Ghi chú: mơi trường ½ MS Chồi Đan sâm tạo rễ môi trường MS với tỷ lệ 100% Tuy nhiên số rễ/cây thấp (2,4 rễ), rễ ngắn (4,23 cm) Bổ sung α-NAA vào môi trường nuôi cấy làm tăng số rễ/cây chiều dài rễ trung bình so với cơng thức đối chứng với số rễ/cây đạt dao động từ 2,84 (0,1 mg/l α-NAA) đến 3,47 rễ (1,0 mg/l α-NAA) chiều dài rễ TB đạt từ 3,8 (1,0 mg/l α-NAA) đến 7,06 cm (0,25 mg/l α-NAA) (Bảng 4.6) Bảng 4.7 Ảnh hƣởng IBA tới khả rễ chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy IBA (mg/l) 0,00 0,10 0,25 0,50 0,75 1,00 CV% LSD0,05 Tỷ lệ chồi rễ (%) 100,00 91,67 100,00 100,00 87,50 84,62 Số rễ TB (rễ) 2,40 3,50 3,88 3,65 3,45 3,10 4,2 0,25 Chiều dài TB rễ (cm) 4,23 6,30 5,26 7,24 4,16 6,30 2,0 0,2 Ghi chú: mơi trường ½ MS Bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy cải thiện chất lượng rễ Đan sâm So với công thức đối chứng, số rễ trung bình/cây mơi trường bổ sung IBA đạt cao (3,1-3,88) rễ rễ dài (từ 4,16-7,24 cm) So với α-NAA, bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ chồi rễ cao Tỷ lệ chồi rễ đạt cao (100%) môi trường bổ sung 0,25 0,5 mg/l IBA (Bảng 4.7) Bảng 4.8 Ảnh hƣởng IAA tới khả rễ chồi Đan sâm sau tuần nuôi cấy IAA (mg/l) 0,0 0,1 0,25 0,5 0,75 1,0 CV% LSD0,05 Tỷ lệ chồi rễ (%) 100 100 100 100 100 100 Số rễ TB (rễ) 2,40 3,71 3,69 4,25 6,19 5,62 2,8 0,22 Ghi chú: mơi trường ½ MS 13 Chiều dài TB rễ (cm) 4,23 8,63 9,65 11,03 9,29 9,02 1,2 0,19 Trên môi trường bổ sung IAA, tỷ lệ chồi rễ đạt 100%, số rễ TB đạt 3,69 – 6,19 rễ chiều dài rễ dao động từ 8,63 đến 11,03 cm sau tuần nuôi cấy (Bảng 4.8) Như vậy, mơi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi MS bổ sung 0,75 mg/l IAA cho 100% với số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/chồi chiều dài rễ đạt 9,29 cm 4.1.4 Thích nghi ngồi vƣờn ƣơm Thời gian ni cấy mơi trường rễ có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống Đan sâm cấy mơ ngồi vườn ươm Cây in vitro nuôi cấy môi trường rễ 30 40 ngày có tỷ lệ sống 100%, non (20 ngày ni cấy mơi trường rễ) có tỷ lệ sống thấp (90%) (Bảng 4.9) Xét hiệu kinh tế quy trình ni cấy, in vitro mơi trường rễ 30 ngày tuổi thích hợp để đưa thích nghi ngồi vườn ươm Bảng 4.9 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy in vitro môi trƣờng rễ đến tỷ lệ sống vƣờn ƣơm giá thể xơ dừa: cát (1:1) sau tuần Thời gian nuôi cấy (ngày) Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số 20 90 4,18 7,07 30 100 4,32 9,33 40 100 5,93 9,40 3,4 0,38 3,6 0,89 CV% LSD0,05 Chất lượng Cây nh , màu xanh nhạt Cây mập, to, màu xanh đậm Cây cao, mập, to, màu xanh đậm Tỷ lệ sống Đan sâm dao động lớn giá thể khác Tỷ lệ sống đạt cao (100%) giá thể chứa 50% xơ dừa 50% cát Khi giảm lượng xơ dừa giá thể tỷ lệ sống giảm theo, đạt 93,33% giá thể xơ dừa: cát (3:7) 80% giá thể cát Đặc biệt, tỷ lệ sống giảm mạnh trồng giá thể có chứa đất (36,67 – 46,67%), sinh trưởng, phát triển chậm (Bảng 4.10) Bảng 4.10 Ảnh hƣởng giá thể đến khả sống sinh trƣởng Đan sâm 30 ngày tuổi Giá thể Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số Cát 80,00 3,65 7,97 Đất: cát (3:7) 46,67 3,42 3,40 Đất: cát (1:1) 36,67 3,33 2,87 3,34 9,27 5,31 9,07 3,0 4,0 Xơ dừa: cát 93,33 (3:7) Xơ dừa: cát 100 (1:1) CV% LSD0,05 14 Nhận xét Cây cao, mập, phát triển, phiến to, màu xanh đậm Cây phát triển trung bình, phiến to, màu xanh đậm Cây phát triển kém, phiến nh , màu xanh nhạt Cây cao, mập, phát triển, phiến to, màu xanh đậm Cây cao, mập, phát triển, phiến to, màu xanh đậm Như vậy, in vitro cần nuôi cấy môi trường rễ 30 ngày thích hợp để chuyển ngồi vườn ươm Giá thể thích hợp để ươm in vitro cát + xơ dừa (tỷ lệ 1:1), cho tỷ lệ sống đạt 100%, sinh trưởng, phát triển kh e mạnh 4.2 TẠO DỊNG RỄ TƠ VÀ NHÂN NI SINH KHỐI RỄ TƠ IN VITRO CÂY ĐAN SÂM 4.2.1 Ảnh hƣởng vật liệu lây nhiễm đến khả tạo rễ tơ Đan sâm Sau tuần lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes nồng độ dịch khuẩn tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2, đoạn thân cuống Đan sâm hồn tồn khơng tạo rễ, đó, mơ cho tỷ lệ tái sinh tạo rễ tơ với tỷ lệ 53,85%, số rễ trung bình đạt 8,54 rễ/mẫu (Bảng 4.11, Hình 4.1) Bảng 4.11 Ảnh hƣởng vật liệu lây nhiễm đến khả tạo rễ tơ Đan sâm sau tuần Vật liệu Mô Cuống Đoạn thân Tỷ mẫu tạo rễ (%) 53,85 0 Số rễ/mẫu (rễ) 8,54 0 A B C Hình 4.1 Ảnh hƣởng vật liệu lây nhiễm đến khả tạo rễ tơ Đan sâm: A: mô lá; B: cuống lá; C: đoạn thân 4.2.2 Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả tạo rễ tơ từ mô Đan sâm Có khác tỷ lệ mẫu tạo rễ số rễ/mẫu lây nhiễm mô Đan sâm với vi khuẩn mật độ khác tương ứng với giá trị OD600 = 0,05; 0,1; 0,2 0,3 Tỷ lệ mô tạo rễ (53,85%) số rễ/mẫu (8,54 rễ) đạt cao mật độ vi khuẩn giá trị OD600 = 0,2 (Bảng 4.12, Hình 4.2) Bảng 4.12 Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes đến khả tạo rễ tơ từ mô Đan sâm OD600 0,05 0,1 0,2 0,3 Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) 18,18 23,53 53,85 25,00 Số rễ/mẫu (rễ) 0,52 0,94 8,54 2,33 OD600 = 0,2 OD600 = 0,3 Hình 4.2 Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes đến khả tạo rễ tơ từ mô Đan sâm Nghiên cứu thu dòng rễ tơ chuyển gen sau kiểm tra có mặt gen rolA virD phương pháp PCR 10 dòng rễ thu nhận sau lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes Qua khảo sát nhận thấy, dòng rễ tơ tăng sinh khối nhanh, ổn định môi trường nuôi cấy không chứa chất điều tiết sinh trưởng 4.2.3 Ảnh hƣởng thành môi phần môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dịng A5.14 Trong hai mơi trường khảo sát MS B5, mơi trường B5 thích hợp để nhân nuôi rễ tơ Đan sâm, cho sinh khối rễ cao so với môi trường MS (Bảng 4.13) 15 Do B5 lựa chọn làm môi trường nên để nhân ni rễ tơ Đan sâm thí nghiệm sau Bảng 4.13 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 sau tuần nuôi cấy Môi trường MS B5 CV% LSD0,05 Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,55 0,57 Khối lượng rễ tươi sau tuần (g) 3,25 4,34 2,2 0,19 Khối lượng rễ tăng (lần) 5,90 7,61 Khối lượng rễ khô (g) 0,297 0,373 4,6 0,034 4.2.4 Ảnh hƣởng trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Tốc độ tăng trưởng rễ tơ môi trường rắn cao nhất, theo sau môi trường bán l ng; l ng, tĩnh trạng thái môi trường phân lớp với khối lượng rễ tăng 7,67; 3,67; 3,08 2,83 lần so với khối lượng rễ ban đầu sau tuần nuôi cấy (Bảng 4.14) Bảng 4.14 Ảnh hƣởng trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dịng A5.14 sau tuần ni cấy Trạng thái môi trường Rắn Bán l ng L ng, tĩnh Phân lớp CV% LSD0,05 Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,57 0,69 0,73 0,77 Khối lượng rễ tươi sau tuần (g) 4,34 2,53 2,25 2,18 4,2 0,33 Khối lượng rễ tăng (lần) 7,67 3,67 3,08 2,83 Khối lượng rễ khô (g) 0,37 0,14 0,11 0,11 3,7 0,02 Như vậy, môi trường đặc thích hợp cho nhân ni thu sinh khối rễ tơ Đan sâm 4.2.5 Ảnh hƣởng loại bình ni cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dịng A5.14 Trong loại bình ni cấy, khối lượng rễ tơ tăng đạt cao (15,90 lần) nuôi cấy bình tam giác 500 ml, theo sau túi nilon với khối lượng rễ tăng 14,70 lần sau 10 tuần nuôi cấy, khối lượng rễ tơ tăng đạt thấp (9,70 lần) ni cấy rễ bình chữ nhật 750 ml (Bảng 4.15) Bảng 4.15 Ảnh hƣởng loại bình ni đến tăng sinh khối rễ tơ dịng A5.14 sau 10 tuần ni cấy Loại bình Bình trụ 250 ml Bình tam giác 500 ml Bình chữ nhật 750 ml Túi nilon 13 x 25 cm CV% LSD0,05 Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,84 0,83 0,85 0,85 Khối lượng rễ tươi sau 10 tuần (g) 11,97 13,12 8,25 12,95 1,5 0,38 16 Khối lượng rễ tăng (lần) 14,25 15,90 9,70 14,70 Khối lượng rễ khô (g) 0,703 0,837 0,547 0,757 4,3 0,06 Do khác biệt không đáng kể khối lượng rễ ni cấy túi nilon, bình tam giác bình trụ, sử dụng túi nilon để ni cấy rễ tơ Đan sâm để nâng cao hiệu kinh tế sản xuất quy mô lớn 4.2.6 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng đến tăng trƣởng tích lũy hoạt chất mục tiêu dòng rễ tơ Đan sâm A5.14 Trong điều kiện chiếu sáng khác nhau, nuôi cấy rễ tơ điều kiện 16h sáng/8h tối tuần (CT2) cho sinh khối rễ tơ đạt cao (Bảng 4.16) Bảng 4.16 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ dịng A5.14 sau tuần ni cấy Điều kiện chiếu sáng tuần tối hoàn toàn (CT1) tuần 16h sáng - h tối (CT2) tuần CT2 - tuần CT1 (CT3) tuần CT2 - tuần CT1 (CT4) tuần CT2 - tuần CT1 (CT5) CV% LSD0,05 Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,73 0,72 0,71 0,73 0,72 Khối lượng Khối lượng rễ tươi (g) rễ tăng (lần) 8,61 11,80 10,67 14,82 7,55 10,63 9,62 13,19 8,61 11,96 3,6 0,58 Khối lượng rễ khô (g) 0,573 0,643 0,530 0,660 0,580 2,8 0,03 Tuy nhiên, hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone tanshinone I tích lũy rễ sau tuần nuôi cấy đạt thấp CT2, tương ứng 0,061% 0,056% chất khô Ngược lại, hàm lượng hoạt chất tích lũy cao nuôi cấy rễ điều kiện tuần 16h sáng/8h tối tuần tối hoàn toàn (CT3) với hàm lượng cryptotanshinone đạt 0,754% hàm lượng tanshinone I đạt 0,257% chất khơ Trong đó, hàm lượng tanshinone IIA đạt cao (0,145% chất khô) nuôi cấy điều kiện tuần 16h sáng/8h tối tuần tối hoàn toàn (CT4) đạt thấp (0,072% chất khô) nuôi cấy rễ tơ tuần tối hoàn toàn (CT1) (Bảng 4.17) Bảng 4.17 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng đến tích lũy hoạt chất mục tiêu dòng rễ tơ A5.14 sau tuần nuôi cấy Công thức tuần tối hoàn toàn (CT1) tuần 16h sáng - h tối (CT2) tuần CT2 - tuần CT1 tuần CT2 - tuần CT1 tuần CT2 - tuần CT1 Cryptotanshinone (% chất khô) 0,074 0,061 0,754 0,134 0,137 Tanshinone I (% chất khô) 0,132 0,056 0,257 0,210 0,172 Tanshinone IIA (% chất khô) 0,072 0,075 0,141 0,145 0,101 4.2.7 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm Khối lượng rễ tơ Đan sâm tăng tuyến tính từ tuần thứ đạt cực đại vào tuần thứ Sau tuần nuôi cấy, khối lượng rễ tươi tăng 13,96 lần Tuy nhiên, sau 10 tuần 17 nuôi cấy, sinh khối rễ tươi giảm so với tuần thứ 8, 12,40 lần (Bảng 4.18) Như vậy, thời điểm dừng ni cấy rễ tơ Đan sâm thích hợp tuần sau nuôi cấy Bảng 4.18 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dịng A5.14 Thời gian ni cấy tuần tuần tuần tuần 10 tuần CV% LSD0,05 Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,71 0,72 0,71 0,72 0,72 Khối lượng rễ tươi (g) 1,69 3,73 7,38 10,05 8,93 1,3 0,14 Khối lượng rễ tăng (lần) 2,38 5,18 10,40 13,96 12,40 Khối lượng rễ khô (g) 0,107 0,327 0,490 0,617 0,593 3,4 0,026 4.2.8 Ảnh hƣởng số chất điều tiết sinh trƣởng đến tăng trƣởng tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Kết sau tuần nuôi cấy, tốc độ tăng trưởng rễ Đan sâm môi trường bổ sung phối hợp BA TDZ/ABA thấp so với tốc độ tăng trưởng rễ Đan sâm môi trường đối chứng (B5) (Bảng 4.19) Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tổ hợp tổ hợp TDZ, ABA BA đến tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dịng A5.14 Mơi trường B5 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA CV% LSD0,05 Khối lượng Khối lượng rễ rễ ban đầu tươi sau tuần (g) nuôi cấy (g) 0,75 7,33 0,74 6,94 0,74 4,37 4,4 0,31 Khối Khối lượng rễ lượng rễ tăng (lần) khô (g) 9,77 0,51 9,38 0,50 5,90 0,41 3,9 0,033 Hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone, tanshinone I tanshinone IIA rễ tơ Đan sâm nuôi cấy mơi trường có bố sung tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng thấp so với công thức đối chứng không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng (Bảng 4.20) Bảng 4.20 Ảnh hƣởng tổ hợp TDZ, ABA BA đến tích lũy hoạt chất mục tiêu dịng A5.14 sau tuần ni cấy Môi trường B5 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA Cryptotanshinone (% chất khô) 0,466 0,039 0,072 18 Tanshinone I (% chất khô) 0,153 0,109 0,085 Tanshinone IIA (% chất khô) 0,203 0,125 0,158 4.2.9 Ảnh hƣởng số yếu tố elicitor đến tổng hợp hoạt chất mục tiêu rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Sinh khối rễ tơ đạt môi trường bổ sung elicitor cao so với môi trường đối chứng không bổ sung elicitor Cụ thể, sinh khối rễ tươi Đan sâm môi trường chứa elicitor tăng từ 7,37 đến 8,66 lần, sinh khối rễ Đan sâm môi trường đối chứng tăng 7,13 lần Sinh khối rễ Đan sâm đạt cao trường hợp bổ sung 100 mg/l YE + 0,1 mM ABA, tăng 8,66 lần sau 39 ngày nuôi cấy (Bảng 4.21) Bảng 4.21 Ảnh hƣởng số yếu tố elicitor đến tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 (sau ngày nuôi cấy) Khối lượng Khối lượng Khối Khối Công thức rễ ban đầu rễ tươi sau 39 lượng rễ lượng rễ (g) nuôi cấy (g) tăng (lần) khô (g) B5 0,70 4,99 7,13 0,35 B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol 0,69 5,09 7,37 0,36 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic 0,70 6,03 8,61 0,44 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate 0,70 5,89 8,42 0,43 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít abscisic 0,69 5,97 8,66 0,46 CV% 3,7 4,1 LSD0,05 0,26 0,013 Kết phân tích hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone, tanshinone I tanshinone IIA bảng 4.22 cho thấy, bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy làm tăng hàm lượng hoạt chất mục tiêu tích lũy rễ tơ Đan sâm so với môi trường đối chứng không bổ sung elicitor Bảng 4.22 Ảnh hƣởng elicitor đến tích lũy hoạt chất mục tiêu dịng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy Tanshinone Cryptotanshinone Tanshinone I IIA Môi trường (% chất khô) (% chất khô) (% chất khô) B5 0,126 0,082 0,113 B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol 0,227 0,106 0,141 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic 0,161 0,098 0,108 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate 0,549 0,230 0,213 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít abscisic 0,221 0,094 0,103 4.3 NGHIÊN CỨU CÁC BIỆN PHÁP KỸ THUẬT TRONG SẢN XUẤT NÂNG CAO NĂNG SUẤT CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM Đan sâm di thực vào Việt Nam từ vài chục năm trước Viện Dược liệu trồng trại thuốc Sa Pa Sau đó, Đan sâm trồng thử nghiệm 19 nhiều vùng có điều kiện sính thái, khí hậu khác Phú Thọ, Thanh Hóa, Tam Đảo, Sapa, Hà Nội…sử dụng rễ củ làm vật liệu nhân giống Nghiên cứu tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng số biện pháp kỹ thuật thời vụ trồng, mật độ trồng, phân bón, thời điểm thu hoạch đến sinh trưởng, phát triển suất chất lượng dược liệu Đan sâm nguồn gốc nuôi cấy mô Các kết thu góp phần xây dựng quy trình kĩ thuật trồng Đan sâm Hà Nội nhằm đạt hiệu kinh tế cao, cho chất lượng dược liệu tốt 4.3.1 Ảnh hƣởng thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển suất, chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm Có sai khác có ý nghĩa tiêu cấu thành suất số củ/cây, chiều dài củ, đường kính củ khối lượng củ/cây thời vụ trồng Đan sâm thí nghiệm Trong thời vụ trồng, thời vụ tháng cho số củ có đường kính lớn mm /cây (12,2 củ), chiều dài củ (29,2 cm), đường kính củ (2,7 cm) khối lượng củ/cây (300 g) đạt cao mức có ý nghĩa so với cơng thức cịn lại Thời vụ tháng thời vụ cho suất thực thu đạt cao (3,35 tấn/ha) Theo sau thời vụ tháng 2, tháng 1, tháng 4, tháng thấp mức sai khác có ý nghĩa suất tháng đạt 1,92 tấn/ha Đặc biệt trồng vào tháng 6, tất tiêu cấu thành suất đạt thấp với 7,2 củ/cây, chiều dài củ 19,3 cm, đường kính củ 1,8 cm, khối lượng lượng củ/cây 177 g nên tạo suất thực thu thấp (Bảng 2.23) Về tỷ lệ tươi/khô, kết nghiên cứu cho thấy, đan sâm tỷ lệ tươi/khô biến động từ 3,4 - TV3 sinh trưởng tốt nên cho tỷ lệ tươi/khô cao đạt lần Bảng 4.23 Ảnh hƣởng thời vụ đến yếu tố cấu thành suất suất dƣợc liệu Đan sâm Thời vụ TV1 TV2 TV3 TV4 TV5 TV6 CV% LSD0,05 Số củ/cây Chiều dài (củ có đường củ kính> mm) (cm) 8,1 23,0 9,9 25,8 12,2 29,2 8,9 23,6 8,1 21,0 7,2 19,3 7,3 3,7 1,2 1,61 Đường kính củ (cm) 2,0 2,4 2,7 2,1 2,0 1,8 4,3 0,17 Khối lượng củ/cây (g) 254,0 275,0 300,0 234,0 215,0 177,0 4,0 17,5 Tỷ lệ Năng suất tươi/khô thực thu (%) (tấn/ha) 3,4 2,76 3,8 3,11 4,0 3,35 3,5 2,52 3,4 2,25 3,4 1,92 5,0 0,24 Cả ba hoạt chất phân tích tích lũy cao trồng thời vụ tháng Cụ thể, hàm lượng cryptotanshinone đạt 0,221%, hàm lượng tanshinone đạt 0,070% hàm lượng tanshinone IIA đạt 0,247% chất khô (Bảng 4.24) 20 Như vậy, sáu thời vụ trồng khảo sát, thời vụ trồng tháng 3/2014 cho Đan sâm sinh trưởng, phát triển, suất tích lũy hoạt chất mục tiêu cao Do vậy, sáu thời vụ khảo sát, tháng thời vụ trồng Đan sâm thích hợp Gia Lâm - Hà Nội 4.3.2 Ảnh hƣởng mật độ trồng đến suất yếu tố cấu thành suất dƣợc liệu Đan sâm Kết nghiên cứu ảnh hưởng mật độ trồng tới yếu tố cấu thành suất suất củ Đan sâm thể qua bảng 4.25 Bảng 4.25 Ảnh hƣởng mật độ trồng đến suất dƣợc liệu Đan sâm CT CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Số củ/cây (củ Chiều dài Mật độ có đường kính> củ (cây/m2) mm) (cm) 13 8,1 20,5 11 9,4 24,2 10,9 27,6 12,0 32,2 11,5 31,5 CV% 5,3 4,9 LSD0,05 1,0 2,5 Đường kính củ (cm) 1,9 2,2 2,5 2,7 2,6 4,2 0,19 Khối lượng củ/cây (g) 231,7 279,3 315,7 327,3 337,6 4,8 26,9 Năng suất (tấn/ha) 2,65 2,90 3,00 2,71 2,58 5,0 0,16 Số củ/cây, chiều dài củ, đường kính củ khối lượng củ/cây đạt cao trồng Đan sâm mật độ từ 7-9 cây/m2 Tăng thêm mật độ trồng (11 -13 cây/m2) tiêu số củ, chiều dài, đường kính khối lượng củ giảm Cụ thể, trồng Đan sâm mật độ 13 cây/m2 (30 x 25 cm), số củ có đường kính > mm đạt 8,1 củ, chiều dài củ đạt 20,5 cm, đường kính củ đạt 1,9 cm khối lượng củ/cây đạt 231,7 g Trong đó, tiêu đạt cao khoảng cách trồng thưa đạt cao mật độ trồng cây/m2 Các tiêu số củ/cây, đường kính củ hai mật độ cây/m2 khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Kết tính tốn suất thực thu cơng thức thí nghiệm cho thấy: Năng suất củ cơng thức trồng với mật độ trông 11 cây/m2 (30 x 30 cm), cây/m2 (30 x 35 cm) đạt cao (2,90 tấn/ha 3,00 tấn/ha), theo sau công thức trồng với mật độ cây/m2, đạt 2,71 tấn/ha tương đương với mật độ 13 cây/m2 cây/m2 mức sai khác (Bảng 4.27) Như mật độ cho suất dược liệu Đan sâm đạt cao trồng với mật độ 11 cây/m2 tương đương với khoảng cách từ 30 x 30 cm 30 x 35 cm 4.3.3 Ảnh hƣởng phân bón đến suất chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm Bón phân ảnh hưởng đến yếu tố cấu thành suất suất củ Đan sâm Kết nghiên cứu trình bày bảng 4.26 Số củ/cây (11,4 củ), chiều dài củ (25,4 cm), đường kính củ (2,3 cm) khối 21 lượng củ (282,7 g) đạt cao bón phân vi sinh, 90 kg N, 120 kg P2O5 90 kg K2O/ha (CT4) Đây cơng thức bón phân cho suất cao nhất, đạt 3,13 tấn/ha Trong đó, bón phân vi sinh mà khơng bón bổ sung phân NPK, suất củ Đan sâm đạt 1,91 tấn/ha (Bảng 4.26) Bảng 4.26 Ảnh hƣởng phân bón đến suất dƣợc liệu Đan sâm CT CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CV% LSD0,05 Số củ/cây (củ có Chiều dài củ Đường kính đường kính > mm) (cm) củ (cm) 6,7 8,4 9,6 11,4 9,8 7,1 1,22 18,6 21,0 23,5 25,4 23,6 4,0 1,68 1,7 2,0 2,2 2,3 2,1 5,6 0,22 Khối lượng củ/cây (g) Năng suất (tân/ha) 180,3 212,0 242,3 282,7 242,0 3,9 17,04 1,91 2,30 2,75 3,13 2,77 3,5 0,17 Từ kết thấy, Đan sâm khơng bón phân đầy đủ, không cung cấp đủ chất dinh dưỡng, sinh trưởng, phát triển dẫn đến rễ phát triển Trong đó, bón phân đầy đủ cho cây, phát triển cân đối, tạo điều kiện cho rễ phát triển hình thành củ, củ lớn nhanh Tuy nhiên, bón phân nhiều thúc đẩy phát triển mạnh thân lá, rễ ăn nông, mà ảnh hưởng đến suất củ Theo nghiên cứu Chen et al (1992), N, P, K đóng vai trị quan trọng sinh trưởng, phát triển, suất tích lũy hoạt chất mục tiêu Đan sâm Hai thời điểm hấp thụ N P cao Đan sâm 90-100 ngày 150-170 ngày sau trồng Thời điểm đầu Đan sâm phát triển mạnh phận sinh dưỡng, thời điểm thứ thời kỳ lan rộng rễ Đan sâm Theo Han et al (2005); Sheng (2006), Đan sâm dược liệu có nhu cầu photpho cao, khối lượng củ Đan sâm tăng tỷ lệ thuận với lượng phân bón chứa photpho hàm lượng photpho cao phân bón giúp hấp thu photpho từ đất Trong ảnh hưởng N đến yếu tố cấu thành suất suất dược liệu Đan sâm N có tác dụng kích thích q trình quang hợp (Han and Liang, 2005) kéo dài rễ (Sheng, 2007) 4.3.3.1 Ảnh hưởng phân bón đến chất lượng dược liệu đan sâm Hàm lượng cryptotanshinone đạt cao (0,191%) bón phân liều lượng 90 N, 120 P 90 K cho Đan sâm tích lũy hai hoạt chất tanshinone I tanshinone IIA có xu hướng tương tự Hàm lượng tanshinone I (0,065%) tanshinone IIA (0,245%) đạt cao cơng thức bón phân CT4 (Bảng 4.27) 22 Bảng 4.27 Ảnh hƣởng phân bón đến tích lũy ba hoạt chất mục tiêu Đan sâm sau trồng 10 tháng Cryptotanshinone (%) 0,091 0,080 0,098 0,191 0,178 CT CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Tanshinone I (%) 0,045 0,027 0,033 0,065 0,050 Tanshinone IIA (%) 0,199 0,183 0,191 0,245 0,218 4.3.3.2 Ảnh hưởng phân bón đến hiệu kinh tế trồng đan sâm Kết tính tốn cho thấy, cơng thức bón phân N, P, K cho lãi thu sau 10 tháng trồng cao công thức đối chứng Cụ thể, cơng thức bón phân vi sinh, thu nhập 123,245 triệu đồng, cơng thức bón phân N, P, K, thu nhập dao động từ 148,478 triệu đồng (CT2) đến 240,810 triệu đồng (CT4) Từ cho thấy việc sử dụng phân bón q trình sản xuất dược liệu Đan sâm giúp nâng cao hiệu kinh tế cách rõ rệt liều lượng phân bón ảnh hưởng nhiều đến hiệu kinh tế trồng Đan sâm Trong cơng thức bón phân, cơng thức bón phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha (CT4) cho thu nhập đạt cao (240,810 triệu đồng) Như vậy, phân bón có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển suất dược liệu Đan sâm Xét hiệu kinh tế, việc bón phân giúp làm tăng thu nhập thuẩn so với công thức khơng bón phân Trong cơng thức bón phân, cơng thức bón phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha phù hợp cho Đan sâm điều kiện Hà Nội Bảng 4.28 Ảnh hƣởng liều lƣợng phân bón đến hiệu kinh tế trồng Đan sâm Đơn vị: 1000 đồng Phân bón CT Giống CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 55.555 55.555 300 55.555 600 55.555 900 55.555 1.200 N P K Chi phí Tổng chi Vi sinh khác 0 16.000 50.000 121.555 240 427.5 16.000 55.000 127.522 480 855 16.000 58.000 131.490 480 855 16.000 61.000 134.790 600 1.140 16.000 64.000 138.495 Năng suất thực thu (tấn/ha) 1,91 2,30 2,75 3,13 2,77 Giá bán kg khô 120 120 120 120 120 Tổng thu Thu nhập 229.200 276.000 330.000 375.600 332.400 107.645 148.478 198.510 240.810 193.905 Ghi chú: Cây giống (cây nuôi cấy mô): 5.000 đồng/cây; Phân vi sinh Sông Gianh: 8.000 đồng/kg; Phân đạm Phú Mỹ: 10.000 đồng/kg; Phân lân Phú Mỹ: 4.000 đồng/kg; Phân Kali Phú Mỹ: 9.500 đồng/kg; Giá kg đan sâm khô tương đương 120.000 đ/kg Như vậy, phân bón có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển suất dược liệu Đan sâm Xét hiệu kinh tế, việc bón phân giúp làm tăng thu nhập so với công thức khơng bón phân Trong cơng thức bón phân, 23 cơng thức bón phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha phù hợp cho Đan sâm PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng thành cơng quy trình nhân giống in vitro Đan sâm cho hệ số nhân cao, chất lượng tốt, có khả ứng dụng rộng rãi với thông số sau: Sử dụng môi trường gieo hạt Đan sâm MS + 1,0 mg/l GA, sau nhân nhanh chồi Đan sâm mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA đạt hệ số nhân chồi 5,05 lần Tạo Đan sâm hoàn chỉnh thích hợp mơi trường ½ MS + 0,75 mg/l IAA Giá thể thích hợp để tiếp nhận Đan sâm vườn ươm giá thể xơ dừa: cát (1:1) thời gian 30 ngày đạt tiêu chuẩn giống cao > cm, có sinh trưởng phát triển tốt tỷ lệ sống 100% Nghiên cứu xác định vật liệu điều kiện thích hợp để tạo ni cấy rễ tơ Đan sâm: Xác định mô vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ Đan sâm Trong nồng độ dịch khuẩn cho tỷ lệ mô cảm ứng tạo rễ đạt cao tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2 Môi trường điều kiện nuôi cấy nuôi cấy rễ tơ Đan sâm thích hợp B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate, điều kiện 16h sáng/8h tối, cho tốc độ tăng trưởng rễ thời gian nuôi cấy tuần khối lượng rễ tăng lên 13,96 lần so với khối lượng ban đầu, tích lũy hoạt chất mục tiêu cao Nghiên cứu xác định số biện pháp kỹ thuật phù hợp cho sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng dược liệu Đan sâm trồng đồng ruộng Hà Nội sử dụng giống có nguồn gốc ni cấy mơ Trồng Đan sâm vào tháng với khoảng cách 30 cm x 35 cm, liều lượng phân bón phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha cho sinh trưởng, phát triển tốt, suất dược liệu cao 5.2 ĐỀ NGHỊ Ứng dụng quy trình nhân nhanh in vitro Đan sâm vào sản xuất giống Đan sâm chất lượng cao sở sản xuất giống góp phần chủ động nguồn giống dược liệu Đan sâm nước Đồng thời, tiến hành trồng sản xuất thử nghiệm Đan sâm có nguồn gốc ni cấy mơ Hà Nội tỉnh lân cận Các dòng rễ tơ Đan sâm nguồn vật liệu quý phục vụ nghiên cứu khoa học sản xuất hợp chất thứ cấp Cần tiếp tục nghiên cứu sâu chế phân tử liên quan đến tích lũy hoạt chất mục tiêu, từ có phương thức tác động để nâng cao hoạt chất mục tiêu hiệu Đồng thời, thiết lập q trình nhân ni sinh khối rễ Đan sâm quy mô lớn nhằm sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ đan sâm phục vụ công nghiệp dược liệu Việt Nam 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Tiến Vinh, Ninh Thị Thảo, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy Nguyễn Thị Phương Thảo (2014) Quy trình nhân giống in vitro Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 12, số 5, trang 744-752 Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy Nguyễn Thị Phương Thảo (2015) Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 2, trang 251-258 ... liệu khoa học nghiên cứu Đan sâm xây dựng sở lý luận cho việc nhân giống in vitro sản xuất sinh khối Đan sâm công nghệ sinh học cơng nghệ truyền thống Từ đó, góp phần giúp cho nhà khoa học dễ dàng... yếu Bên cạnh phương pháp nhân giống truyền thống, ứng dụng công nghệ sinh học để nhân giống nhân nuôi sinh khối dược liệu hướng đắn nhằm khắc phục hạn chế sản xuất truyền thống Nhân giống vơ tính... - Thí nghiệm 10 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới sinh trưởng phát triển Đan sâm 3.2.2 Nội dung 2 -Tạo dịng rễ tơ nhân ni sinh khối rễ tơ in vitro Đan sâm - Thí nghiệm 11 Nghiên cứu ảnh hưởng vật