xác định hàm lượng axitamin

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8764 : 2010 ISO 13903 : 2005 Xuất lần THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN Animal feeding stuffs – Determination of amino acids content HÀ NỘI – 2011 TCVN 8764 : 2011 Lời nói đầu TCVN 8764 : 2011 hoàn toàn tương đương với ISO 13903:2005 TCVN 8764 : 2011 Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8764 : 2011 Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng axit amin Animal feeding stuffs – Determination of amino acids content Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định axit amin tự (tổng hợp tự nhiên) axit amin tổng số (liên kết peptit tự do) thức ăn chăn nuôi với việc sử dụng thiết bị phân tích axit amin thiết bị HPLC Áp dụng cho axit amin sau: – tổng cystin cystein; – methionin; – lysin; – threonin; – alanin; – arginin; – axit aspartic; – axit glutamic; – glycin; – histidin; – iso leucin; – leucin; – phenylalanin; – prolin; – serin; – tyrosin; – valin Phương pháp không phân biệt muối axit amin, không phân biệt dạng đồng phân D L axit amin Phương pháp không cho phép xác định tryptophan chất tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl TCVN 8764 : 2011 Giới hạn định lượng phương pháp phụ thuộc vào thiết bị sắc ký, đạt mức thấp tới: 0,3 g/kg cho tổng lysin; 0,25 g/kg cho tổng methionin, 0,35 g/kg cho tổng cystin cystein; 0,2 g/kg cho tổng threonin; 0,035 g/kg cho lysin tự do; 0,035 g/kg cho methionin tự 0,03 g/kg cho threonin tự CHÚ THÍCH: Có thể đạt giới hạn định lượng thấp điều phải thẩm định người sử dụng Nguyên tắc 2.1 Các axit amin tự Các axit amin tự chiết với dung dịch axit clohydric loãng Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ kết tủa với axit sulfosalicylic loại cách lọc Dịch lọc điều chỉnh pH tới 2,20 Axit amin tách sắc ký trao đổi ion xác định phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo bước sóng 570 nm 2.2 Tổng số axit amin Quá trình lựa chọn phụ thuộc vào axit amin cần xác định Cyst(e)in methionin bị oxy hóa tạo thành axit cysteic methion sulphon tương ứng, trước giai đoạn thủy phân Tyrosin xác định dịch thủy phân mẫu không oxy hóa Tất axit amin khác nêu Điều xác định dạng mẫu bị oxy hóa không bị oxy hóa Quá trình oxy hóa thực oC với hỗn hợp axit performic phenol Thuốc thử oxy hóa dư loại bỏ natri đisulfit Mẫu oxy hóa không oxy hóa thủy phân axit clohydric (c=6mol/l) 23 h Dịch thủy phân điều chỉnh pH tới 2,20 Các axit amin tách sắc ký trao đổi ion xác định phản ứng với ninhydrin, sử dụng detector quang bước sóng 570 nm (bước sóng 440 nm prolin) Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích trừ có định khác 3.1 Nước, sử dụng nước cất hai lần nước có chất lượng tương tự (độ dẫn điện [...]... hiệu chuẩn; M là khối lượng phân tử của axit amin được xác định; C là nồng độ của chất chuẩn, µmol/ml; m là khối lượng mẫu, tính bằng g (tính về khối lượng ban đầu nếu mẫu được làm khô hoặc loại chất béo); Ve là thể tích của tổng dịch thủy phân (5.3.4), tính bằng mililit, được tính theo tổng thể tích pha loãng của dịch chiết (6.1) được tính bằng mililit Cả cystin và cystein được xác định giống như axit... (= 0,5 x 240,30) (C6H12N2O4S2, M=240,30) Methionin được xác định như methionin sulfon trong thủy phân mẫu đã được oxy hóa, nhưng tính toán bằng cách sử dụng M của methionin = 149,21 Methionin tự do thêm vào được xác định sau khi chiết tách như methionin; tính toán tương tự sử dụng cùng chung M Tổng thể tích dịch chiết pha loãng (Ve) dùng để xác định các axit amin tự do (5.2) được tính theo công thức... thêm 5 ml hỗn hợp chất oxi hóa ở 5.3.1, thêm tiếp 12,5 ml nước và khuấy đều mẫu trên máy khuấy từ trong 15 min Sau đó lại tiếp tục thực hiện quy trình thông thường Qui trình này không dùng để định lượng xác định hàm lượng tổng số của cystein và cystin 15 TCVN 8764 : 2011 Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả thử nghiệm liên phòng thí nghiệm A.1 Phép thử lần thứ nhất Phương pháp được sử dụng trong thử nghiệm liên... được tối ưu hóa phù hợp với các yêu cầu của nhà cung cấp thiết bị 9.3 Với việc sử dụng phương pháp để phân tích các mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa hơn 1 % hàm lượng clo (thức ăn đậm đặc, thức bổ sung khoáng, thức ăn bổ sung ) thì việc ước lượng thiếu hàm lượng methionin có thể xảy ra và cần có phương pháp xử lý đặc biệt theo cách dưới đây (phương 14 TCVN 8764 : 2011 pháp Slump) Sau khi thêm 5 ml hỗn hợp... tuyến tính với các thay đổi về lượng axit amin đưa vào cột Trong suốt quá trình chạy sắc ký, tỷ số giữa chiều cao lõm : pic đề cập ở dưới đây được áp dụng khi dung dịch có cùng nồng độ mol (của các axit amin đang xác định) được phân tích Dung dịch axit amin cùng nồng độ mol này chứa ít nhất 30 % của lượng axit amin tải tối đa của mỗi axit amin mà có thể đo được chính xác với hệ thống máy phân tích... Tiếp tục thực hiện theo 5.3.4 5.3.4 Dung dịch mẫu thử cho chạy sắc ký Chuyển toàn bộ lượng dịch thủy phân đã điều chỉnh pH (5.3.3.2 hoặc 5.3.3.3) cùng dung dịch đệm citrat (3.17) vào bình định mức 200 ml và định mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm Nếu chất nội chuẩn không có sẵn, thêm 2 ml chất nội chuẩn (3.20.3) và định mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm xitrat (3.17) Trộn đều cẩn thận Thực hiện bước... đều hỗn hợp và lọc một lượng phù hợp qua màng lọc cỡ 0,2 µm (4.5) Đưa dịch lọc sạch vào sắc ký trao đổi ion, sử dụng máy phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC (4.9) Bơm mẫu có thể thực hiện bằng tay hoặc tự động Điều quan trọng là đưa lên cột phân tích cùng một lượng dung dịch chất chuẩn và mẫu thử không sai khác quá 0,5 % trừ khi chất nội chuẩn được sử dụng, và tỷ lệ giữa lượng natri: axit amin trong... (nếu chỉ cystein, methionin và lysin được xác định, 12 TCVN 8764 : 2011 sự tách không rõ ràng giữa các pic liền kề sẽ gây sai số đến phép đo) Đối với tất cả các axit amin tỷ số tách tốt hơn nên là 1: 10 Hệ thống nên đảm bảo rằng lysin được tách khỏi “lysin nhân tạo” và ornithin 6 Tính toán kết quả Diện tích pic của mẫu và chất chuẩn được đo cho mỗi axit amin và lượng mẫu được tính theo gam axit amin /kilogam... trong Bảng A.1 Độ lặp lại biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn nội bộ trong phòng thử nghiệm đưa ra ở Bảng A.2 và A.3 Kết quả độ lệch chuẩn giữa các phòng thử nghiệm chỉ ra trong Bảng A.4 và A.5 Bảng A.1 – Hàm lượng axit amin Axit amin Chất chuẩn Threonin (g/kg) Tổng cystin và cystein (g/kg) Methionin (g/kg) Lysin (g/kg) Thức ăn hỗn hợp cho lợn 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Thức ăn hỗn hợp... hai lần tới hai mươi ba phòng thử nghiệm Kết quả được đưa ra trong các bảng A.6 đến A.10 Bảng A.6 – Hiệu năng của phương pháp phân tích axit amin trong bột phụ phẩm gia cầm Axit amin 18 Alanin Số lần xác định đơn lẻ 42 Giá trị trung bình 4,26 Arginin 46 Axit aspartic sr 0,087 Độ lệch chuẩn lặp lại (%) 2,04 sR 0,210 Độ lệch chuẩn tái lập (%) 4,93 4,35 0,144 3,31 0,420 9,66 44 4,92 0,132 2,68 0,376 7,64