NGUYÍN THỊ SƠN - TRẦN LỆ MINH
TAI LIEU HUONG DAN THi NGHIEM VI - HOA SINH UNG DUNG
TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG
|
Trang 2PGS TS NGUYEN THI SON - THS TRAN LE MINH
TAI LIEU THi NGHIEM VI - HOA SINH UNG DUNG
TRONG CONG NGHE MOI TRUONG
Trang 4LỜI MỞ ĐĂU
“Tai liệu thí nghiệm Vi - Húa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường” được biín soạn phù hợp với nội dung môn học tương ứng trong
chương trình khung được Bộ Giâo dục vă Đăo tạo thông qua cho ngănh Kỹ thuật môi trường Tăi liệu được sử dụng trong hướng dẫn thực hănh cho sinh viín đại học vă học viín cao học ngănh kỹ thuật môi trường
L Tăi liệu được biín soạn gồm 4 phần cơ bản
2 Thí nghiệm Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường 3 Thí nghiệm Vì sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường
4 Thí nghiệm chuyền đề Xử lý sinh học nước thải
Phụ lục giới thiện một số dụng cụ, thiết bị cần thiết phục vụ cho câc thí nghiệm trín (hiện có tại Viện Khoa học vă công nghệ môi trường ~ Trường Đại học Bâch khoa Hă Nội)
Nội dung tăi liệu được viết nhằm củng có phđn lý thuyết của hai môn học:
- Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường
- Ví sinh ứng dụng trong công nghệ mồi trường dong thời cung cấp cho sinh viín một số kỹ năng thực hănh trong nghiín cứu vẻ ví sinh vật cũng như
phương phâp phđn tích một số chỉ tiíu sinh học quan trọng trong xử lý vă đânh
giâ chất lượng môi trường
Phần thí nghiệm chuyín đề giúp sinh viín bước đầu lăm quen với câc phương phâp xử lý sinh hợc Trín cơ sở vận hănh, phđn tích vă tính tôn câc thơng
số kỹ thuật thu được, sinh viín có thể đânh giâ cũng như xử lý câc sự cô phât sình
trong quâ trình vận hănh hệ thống xử lý sinh học nước thải
Chúng tôi hy vọng cuỗn sâch năy cũng có thể dùng lăm tăi liệu tham
khảo bô ích cho công tâc đăo tạo vă nghiền cứu trong lĩnh vực công nghệ sình
học môi trường cũng như cho câc cân bộ kỹ thuật câc ngănh liín quan
Do được biín soạn lần đầu, cuốn tải liệu không trânh khỏi còn những
thiều sót Chúng tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của bạn đọc vă đồng
nghiệp để bổ sung vă chính sửa khi tăi liệu được tâi bản
Trang 5PHAN I
HOA SINH UNG DUNG TRONG CONG NGHE MỖI TRƯỜNG
1.4 NUOI CAY VỊ SINH VAT THU CHE PHAM ENZYM VA XAC BINH HOẠT LỰC ENZYM TỪ VỊ SINH VẬT
Tĩ bao vi sinh vật tuy nho bĩ nhưng trao đôi chất không ngừng Sự sống
của vi sinh vật được đặc trưng bởi hăng loạt câc phản ứng chuyín hoâ vật chất,
trong đó có những phan ứng thực tế không xảy ra trong ống nghiệm o điíu kiện
bình thường nhưng trong tế bảo ví sinh vật câc phan ứng năy xảy ra với tộc đô nhanh gấp hăng triệu lần nhờ những chất xúc tâc đặc biệt: chất xúc tâc sinh học
hay còn gọt lă Enzym
I.1.1, Đặc trưng vă một số Enzym được ứng dụng trong công nghệ
môi trường
1⁄ Những đặc trưng của Envm tr vi sink vật
Hệ Enzym của vi sinh vật rất đa dạng, phong phú Từ vì sinh vật có thẻ
thu nhiều Enzym khâc nhau trong đó có những Enzym chi co 6 vi sinh vat như zenlulaza, razema7a
- Enzym tử ví sinh vật có hoạt lực cao hơn câc Enzym tương tự ở động vật vă thực vật
- Vị sinh vật nhạy căm với môi trường nín khi thay đổi điều kiện sòng hoặc tâc động bằng câc yíu tố khâc nhau có thí thay đổi hệ Enzvm vă huạt lực Enzvm của chúng Nhờ vậy có thể tạo được câc Enzym theo yíu cầu vơi hoạt lực cao
- So với câc sinh vật khâc, vi sinh vật phât triền nhanh hơn, tuy kích thước nhỏ nhưng hiệu suất sinh tòng hợp Enzym vă tý lệ Enzvm trong tế băo
tương đối lớn nín hiệu suất thu hỏi Enzym cao quy trình sản xuất đơn gian
- Nguyín liệu sử dụng nuôi cấy ví sinh vật để thu Enzym rất rẻ tiền dễ
kiểm thường lă câc loại phụ phđm, nhĩ liệu Do đó giâ thănh Enzym từ vi sinh
Trang 63⁄/Một số Enzym được ứng dụng rộng rêi trong công nghệ môi trường u⁄ Enaym Amyla:za
- Enzym Amylaza lă Enzym có ửng dụng rộng rêi nhất Amylaza lă tĩn chung chỉ một nhọm gỏm câc Enzym có khả năng xúc tâc thuy phđn tỉnh bột thanh dextrin duong maltoza va ghicoza nhu œ - amylaza, B - amvlaza, elucoams laza, dextrinaza
- Amylaza c6 trong mot sĩ nam mĩc:
+ Aspergillus: 43p oryzae dsp san, Asp niger, Asp awamori ‘Rhizopus: RA delemar Rb paponium
© Mucor Af rout
Nam men cĩ kha nang tng hop Amylaza: | Endomycopsis: F fthuliger, E species 1 Endomyces: Endonyces spe
Vi khuđn có kha năng tông hợp Amylaza; + Bacillus: Bacthius wihnlis, Buc macerans
+ Vikhuan wa nhiĩt co hoat luc amylaza manh: Bac diastilicus, Bac cHCHhINS
Lrzvm Army laza con cĩ trong thue vat (hat nay mam, thĩc mam, hat malt khoai lang) trong dang sat (nude bot)
b/ Enzym proteaza
Proteaza co nhiều ö động thực vật vă vi sinh vat Proteaza ở vị sinh vật t6n tại dưới dạng nội băo vă ngoại bảo phần hu\ câc liín kết peptit
Proteaza có ở vi khuđn, xạ khuản vă nam mĩc: -Vi khuan tong hop Proteaza:
+ Bacillus: Bac subtilis, Bac thermophilus
+ Clostridium: Clost perfringen Clost, histolyticum
-NẤm mộc:
~ Aspergillus: Asp oryzae Asp fumigatus, Asp flavus
+ Penicillum: Pen janthinellum
Trang 7Œ⁄ Enzym Pectinaza
Pectin lă thănh phđn chính của lớp gian băo có chức năng kết dính câc tế băo tạo thănh mô thực vật
Pectin thực chất lă axit Polygalacturonic được tạo thănh nhờ liín kết œ - 1.4 — glycozit của axit D — Galacturonic, trong đó gốc cacboxyl ở vị trí C6 eó thể được metyl hóa Khi số lượng câc gốc cacboxyl được metyl hỏa vượt quâ 75%, pectin trở nín bín, không tan được gọi lă Protopectin
Enzym thuy phan pectin thue chat gm 2 nhóm: Enzym thúy phđn liín kết este (Esteraza) chuyín Pectin không tan thănh pectin tan vă Enzym thủy phđn liín kết œ 1.4 — glycozit (Depolymeraza) thủy phđn pectin tan thănh axit D - Galacturome
Enzym Pectinaza co y nghia rat lớn trong công nghệ môi trường đặc biệt trong xư lý chất thai răn (sinh hoạt vă công nghiệp) có nguồn goc thực vật như vo qua, cudng rau chat thai nông nghiệp (thđn lâ vỏ hạt ) chúng phđn hủy pectin giải phóng Xenllulo giúp quâ trình chuyển hóa Xenllulo vă quâ trình vô cơ hóa xâc thực vật xây ra nhanh hơn,
Pectinaza chỉ có ở ví sinh vật nhất lă Protopectinaza Hoạt lực Enzym
Pectinaza có thí được xâc định băng phương phâp đồng (Cu) pectat
Vi sinh vật có khả năng tổng họp Peetinaza gồm nhiều loăi nấm sợi vă vi
khuẩn Một s6 loai ky sinh ở thực vật chúng phđn giải pectin, phâ hủy mô thực vật
vă gđy hư hỏng sản phẩm chúng có nhiều trong đất (10° tĩ bao/g đất) Cac vi sinh vật có thĩ xđm nhập văo khối râc thải thực vật trong quả trình thu gom, vận chuyển lăm thay đỏi tính chất cơ lý của râc gđy khó khăn cho phần loại vă xử lý râc
Một sỐ chung điín hình có hoạt lực PectinazZa:
- Mat sĩ loai nam da bao nhu Borytis cinerea, Fusarium oxysporum ky sinh
trĩn hau hĩt thao moc Envinia carotovora gay hu hĩng rau xa lâch, carot cần
tay Enzym Pectinaza có thể được sản xuất nho Asp niger, Penicillum, Fusarium solani
- Một số vi khuẩn có hoạt lực Pectinaza mạnh như Bacillus macerams
Bacillus polymvxa mbt sĩ chung Pseudomonas (Pseud fluorescens), nhiĩu vi
khuđn dạ cỏ một số vĩ khuẩn ta nhiệt thuộc nhóm Clostridum (Clost pectinovorun
Trang 8d/ Enzym Zenlulaza Hĩ Enzym zenlulaza g6m 3 Enzym chu yĩu: Lxo B 1.4 - glucanaza Endoglucanaza Zenlobiaza
thuy phan zenluloza thănh đường glucoza
Zenlulaza có trong xạ khuđn nắm mốc vă vì khuẩn:
Nấm mốc: Trichoderma reesei Tri lignoran Fusarium lini, Fus solani Xa khuan: Streptomyces flagrogrisens
Vi khuan: Clost thennicillum, Cellulomonas sp Bacillus thermmospoza spe Câc Enzym nói trín có vai trỏ rất lớn trong công nghệ xử lý nước thải vă chất thải răn giău câc chđt hữu cơ
Nhờ có hệ Enzym rất phong phú của vi sinh vật, câc chất hữu cơ dưới dạng protein gluxit pecfin vă ca zenlulo được chun hô góp phần ơn định chu trình
tuần hoăn vat chat trong tu nhiín đồng thời góp phđn lăm sạch mồi trường Câc Enzym nói trín có vai trỏ rat lớn trong xử ly yếm - hiểu khí câc chất
thải răn nước thải giău chđt hữu cơ
1.1.2 Phương phâp nuôi cđy thu chế phẩm Enzym
Câc vì sinh vật được sử dụng đẻ thu Enzym gồm nhiều loại nắm mốc, nắm
men vì khuđn vă xạ khuđn bằng phương phâp nuôi bí mặt hoặc nuôi chìm
Như trín đê trình bảy, nhiều ví sinh vật có khả năng tổng hợp Enzym,
thậm chí có những ví sinh vật có kha năng tông hợp câc Enzym khâc nhau
trong câc môi trường cỏ cơ chất khâc nhau
Đề thu được Enzym từ vi sinh vật cần tiễn hănh nuôi cấy chúng Hầu hết câc vt sinh vật sinh tông hợp Enzym trong điều kiện có oxy Vì vậy, về nguyín tắc có hai phương phâp nuôi cấy ví sinh vật thu Enzym lă:
- Nuôi cấy bẻ mặt - Nuôi cđy chìm
1⁄ Phương phâp nuôi bí mặt
Phương phâp năy sử dụng chú yếu với câc loăi nắm mốc, xạ khuẩn vă
nắm men có khuẩn ty thật hoặc khuđn ty giả Enzym tạo thănh dưới dạng
Trang 9a) Nguyín tặc: Tạo môi truờng có hẻ mật riíng lớn (có độ xếp cao) vă du dinh dưỡng cho hệ sợi cua nắm phât triín vă sinh tông hợp Enzym
b) Nguyín liệu vă yíu cầu đôi với môi trường sinh tông hợp Enzym Một trong những yếu tế anh hương quyết định đến sự sinh trưởng phât triển cũng như khả năng sinh tông hợp Enzym cua vi sinh vật chính lă thănh phần môi trường Môi trường dình duỡng phải đam bao có đu câc thanh phản cđn thiết có chứa CN, H O câc nguyín tổ khoâng đa lượng như P, S Ca Mẹ K vă trong một số trường hop còn có ca một số nguyín tố vi lượng hoặc câc chất kích thích sinh trưởng vă sinh tông hợp enzvm như axit amm., vac bazo pyrin (Adenin Guanin) bazo Pyrimidin (Timin, Xytozin }
Trong thực tế, môi trường nuôi cấy bẻ mặt có thí lă môi trường tụ nhiín
hoặc môi trường bân tông hợp
Nguyín liệu co bạn đề phâ chế môi trường nuôi bề mặt lă câm gạo, cảm lua
mi vi chúng không chi chứa câc chất hữu cơ khâc nhau lă nguồn cung cấp C
N mă còn chứa nhiều ngun tơ không đa vi lượng vă câc yếu tổ sinh trương can thiết cho sự phât triển vă sinh tông hợp Enzym như câc axit amin vitamin
Trong nuôi cấy ví sinh vật tổng hợp mỗi Enzym cđn một tâc nhđn điều hòa sinh tông họp khâc nhau, đặc biệt lă câc chất cảm ứng ví dụ dĩ thu Amylaza can tình bội, dextrin, thu Proteaza 14 peptit, protein, Pectinaza la !íx dratnectic
protopectin va Xenllulaza [a Xenllulo, CMC (Cacboxyl Metyl Cenllulo)
Trong thực tế sản xuất để giam gia thanh san phẩm nguyín liệu thường, được sử dụng lă bột ngô pelatin bột carol cu cai vă bot giay hay CMC
Trong những trường hợp cần thiết eó thẻ bộ sung nguồn nitơ dudi dang hữu cơ (bột khô lạc khô đậu tương sữa bột ) hay về có như Amoônsunphat
(NH4)2SO4 NHyNO3 )
Câc nguyín tố khoâng, nhất lă P vă S lă những thănh phần trong cđu trúc
của nhiều hợp chất rất quan trọng trong trao đỏi chất cua vì sình vật như câc
Nucleotit, Protein Lipit phức tạp vă câc Vitamin có thể bộ sung thím dưới dạng câc muối photphat (KHaPO: K›LIPO ) muối sunphat (MgSO:
(N H,)›SO: )
Trang 10c) Câc bước tiến hănh lảm môi trường Phỏi trộn nguyín liệu:
Thanh phan môi trường nuôi bề mặt gồm:
- Cam gao: 35 - 40%, ~ Trđu: 40 - S0°„
- Nguyĩn ligu cam ung: 10°
(bĩt ngd: 10 %, aeclatin: 10 % khĩ lac: 5%, CMC: 5 % bat carot: 5°} - Môi trường dinh dưỡng cđn có độ ầm khoang 65% Dĩ tao do am, co thĩ sw dung nước cat (rong phòng thí nghiệm), nước mây (trong sản xuất đại tră) bô sung văo mỗi trưởng va trộn dĩu
- Môi trường cần được khư trùng trong nỗi âp lực ở âp suất l atm trong
thời gian 30 phút
[tương hợp căn bô sung câc chất kích thích sinh trương dạng hữu cơ nhụ anit amin vitamin cde nguyĩn liĩu năy được khử trùng riíng ở âp suất 0.5 atm treng 45 phat, sau đó bỏ sung văo môi trưởng
- Sau khu trùng môi trưởng được đí nguội dến nhiệt độ thường đ) Cđy vă nuôi vì sinh vật
- Canh trường piíng phai lă cạnh trường thuận khiết có thẻ o dang ran
hoặc lòng
- Vói nđm mốc vă xạ khuẩn cạnh trường thuong dung lạ bao tụ được pha
loêng trong nước vô trùng với ty lệ 1% - 1900
- Sau khi cấy canh trường nuồi được trộn đỉu Nếu nuồi quy mô lớn, môi trưởng được phđn phối văo câc khay hoặc dăn nuôi với lớp dđy không quâ Š em
- Thời gian nuôi cđy thường từ 36 48 gid ty thude thoi gian tau Fozym cua mỗi loăi vi sinh vật
- Nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng từ 28 30°C dộ đm: $§ — 6% Irong LÔ - 14 giờ đđu, băo tú trường nở vă năy mầm, nhiệt độ môi trường nuôi ít
biến động Từ !§ 30 giờ tiếp theo hệ sợi nấm phât triền mạnh Quâ trình hô
hap giai phóng năng lượng vă nước lăm cho nhiệt độ vă độ đm môi trường tăng Nếu lớp môi trường dăy cần được đảo trộn vă lăm thoảng khí đề cụng cấp oxy tâ giải nhiệt Quả trình năy cũng lăm cho độ đm môi trường giảm, canh trường tời, XỐp
Trang 11Chế phẩm thó có thể được sây khô ơ nhiệt độ 43 - 45°C đến độ đm 8 - 13%
dĩ bao quan va su dụng e) Tùnh chế Enzym
Dĩ thu chĩ phđm Enzym dạng tình khiết hơn, chẻ phầm Enzym tươi
(hoặc khỏ) duoc nghiín nhỏ để phâ võ cđu trúc sợi nđm giải phóng Enzym
Enzym được chiết trong môi trường nước với pH xâc định băng dung dịch đệm tương ứng với mỗi loại Enzvm tỉnh chế có thí ở dạng lòng hoặc dạng bột sau khi được lăm khô
Phương phâp nuôi bể mặt có ưu điểm lớn tă hoạt lực Enzym cao, công nghệ don gian có thẻ tự động hóa đễ triĩn khai Ỏ quy mô lớn: yíu cầu năng
lượng thập thiết bị đơn giăn, nguyín liệu rẻ tiín dễ kiím nẻn lăm giảm gia
thănh san phẩm Sản pham dễ bao quản vă vận chuyín phù hợp trong xử lý câc chât thai răn giău chất hữu cơ Tuy nhiín chí phđm Fnzym từ nuối cđy bí mat co do tinh khiết thập hơn nuôi cđy chím.,
Nuôi cay nam moc thu chĩ pham Enzm Amylaza va Proteaza bang Phuong phap nudi cay bí mêi
a) Chuẩn bị môi trường
+Can: - 8g câm gạo - 10g trấu
- 3u bột ngõ (cho môi trường thù chế phđm Enzym Amylaza) - 2ø gelatin (cho mỗi trường thu chế phảm Enzym Proteaza)
+ Trận đều chuyển hồn hợp văo binh tam giâc 250 mÌ, bố sung nước cất
đến độ đm 6Ô — 65%, Nút bông
+ Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ ]1 (°C trong 30 phút
+ Để nguội đến nhiệt độ phòng
h) Cay VSV
Cay 1inl địch chửa băo tủ cua nắm mốc: - Thu En⁄ym Amylaz2a: 214p "xanh - Thu Enzym Protea⁄a: Asp.orvzac
c) Nuôi cấy VSV thu Enzvm: ở nhiệt độ 28 — 30°C trong thai gian 36 giờ
2/ Phuong phap andi chim
Phuong phap nuoi chim thuong due su dung voi cac tac nhan như nắm men vì khuẩn tòng họp Enzym ngoại băo Cũng có thí sử dụng nam moc, xa khuđn đí thu hệ sợi chứa Enzvm nội bảo
Trang 12a) Nguyín tắc: Vì sinh vật sinh trưởng phât triển vă tông hợp Enzym trong môi trường lỏng được cấp khi vă trong điều kiện vô trùng
b) Môi trường nuôi cấy
Khâc với nuôi cđy bề mặt môi trường nuối cấy chim thường lă môi trường bân tổng hợp Nguyền liệu cho nuôi cây chím thường ở dạng hỏa tan hoặc huyền phù
Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng lâ nước chiết ngỏ nước chiết nắm men Nguồn nitơ vô cơ vă câc ngun tơ không được sử dụng như ở phương phâp nuôi bề mặt Câc tâc nhđn cảm ứng thường được sư dụng ở dạng tỉnh
khiết hơn như tỉnh bột hỏ hóa, tỉnh bột tan pepton, casein CMC,
pH của môi trường được điều chình cho phù hợp vói mỗi loại Enzym vă mỗi lođi vị sinh vật
c) Câc bước tiền hănh
Câc cầu tử cúa môi trường được hòa văo nước vă được đưa văo thiết bị khử trùng 2 vỏ hoặc dạng ống xoăn ruột gả Môi trường được khử trùng trực
tiếp băng hơi quâ nhiệt ö nhiệt độ !18 — 125%°C trong thời gian 30 phút
Sau khư trùng, môi trường được chuyển sang thiết hị nuôi cđy Trong nhiều truông hợp để trảnh nhiễm trung người ta thường kết hợp khử trùng trực tiếp trong thiết bị nuôi cấy
d) Cđy vă nuôi ví sinh vat thu Enzym
Môi trường được lăm nguội đến nhiệt độ cần thiết (28 — 30°C) thì cay vi sinh vat Với nắm mốc vă xạ khuản có thí cấy bằng băo tứ nhiệt độ nuôi 28 -
30°C thời gian nuôi 36 — 48 giờ
Không khí được cấp liín tục trong quâ trình nuôi cấy Đề trânh tạo bọt thâi quâ có thể bỗ sung văo môi trường một chút dầu phâ bọt hoặc axit oleic đê khử trùng
Thiết bị khuấy lăm việc liín tục đí tạo độ động nhất, giúp cho Enzym khuy ếch tân tốt văo mỗi trường,
Trong nuôi cđy chìm Enzym tạo thănh trong suốt quả trình phât triển của ví sinh vật đạne ngoại hăo được khuxĩch tản văo môi trường Lượng Enzym trong tế
băo chỉ chiếm 10 - (5% Vì vậy chí cần ly tđm hoặc lọc tâch sinh khỏi lă thu được
dung dịch chứa Enzym
Câ biệt có một số nắm trrốc sinh tổng hợp Enzym nội bảo (Glucooxydaza
ở nđm móc Asp niger), Enzym tổn tại trong cấu trúc của sợi nấm Trong
trường hợp năy chi cần tâch lấy sinh khối (sợi nấm), sau đó nghiền phâ vỡ tế
băo đẻ chiết Enzvm như đối với canh trường bề mặt,
Trang 13Phương phân nuồi chỉm có thể âp dụng trọng phòng thí nghiệm với bình tạm piâc vă mâv lắc hoặc với thiết bị nuôi hiểu khí quy mô nho, pilot như thiết bi Bin stât Ô quy mô công nghiệp có câc thiết bị lín men biểu khí với câc dung tich Khâc nhau,
Phương phâp nuôi chìm hiện đại hơn (để tự động hóa ở quy mô lớn) va cho chĩ pham Enzyim tinh khiết hơn Phương phản năy phai được tiến hănh trong điều kiện vô trùng nghiím ngặt nĩn tu được chế phẩm tỉnh khiết, hoạt lực cao hơn [uvx nhiín đó cũng lă khó khăn Không nhọ trong quâ trình nuôi Vì lý đo năo do như thiết bị không thật kín thiết bị không hoăn toăn vô trùng có thể dẫn đến nhiĩm tạp khuẩn toăn bộ môi truông gua winh bi aging hhoan toan
Nhôi cay nam men thu chĩ pham placoamylaca hang phương phâp nuôi cay chim
a) Chuđn bị môi trường
- Lấy ŠÚ mÌ mơi trương long văo binh tam giae 250 mi dĩ nudi cay Endomxecopsrs., Nút bong
- Thanh trùng ở LIIˆC trong 30 phút
- Lay ra dĩ ngudi đến nhiệt độ phòng, b) Cay nam men
Cas S mi canh tudng nam men Endomy copsis,
c) Nudi tren may leo nbiĩt dĩ 28 — 30"C trong thời gian 48 giờ
1.1.3 Xâc định hoạt lực Enzym 1⁄ Định tính hoạt lực Enzym
a) Nguyín tặc: Định tỉnh hoạt luc Lnzym dựa trín kết quả đânh giâ nhanh hiệu lục xúc tâc chuyín hóa cơ chất cua En2vm thông qua diện tích vòng thủy phản hoặc phan ứng hóa học (tạo mâu) của san phim với chất chỉ thị
b) Phương phâp tiín hănh
Đẻ định tính hoạt lực Enzvm ví sinh vật thường được niềi cđy trền môi trường thạch với co chật trong ưng, Sau một thời gian nuôi nhất định (24 - 36 gid), thir phan ung voi chat chi thi thích hop
Fnzym Ams taza: vot mat trường chứa tỉnh bột chỉ thị lă dung dich Jot hoặc dung địch Lugol (chưa lòU,
[nzym Xenllilaza: vỏi mỗi trường chứa CMC chỉ thị lă dụng địch Tot Enzym Proteaza: vôi môi truông chứa Gelatin hoặc sữa bột Hoạt lực Protein lă vòng dịch hóa Gclatin hoặc lăm mất mău đặc trưng cua sữa bột
Trang 14Hoạt lục của Enzym Ams laza vă Xenllulaza the hiện qua d6 lon cua đường kinh vimg mat mau voi lot xung quanh khuẩn lạc € ũng có thẻ định tính hoạt lực Amylaza cua chế phảm thỏ bằng câch thực hiện phản ứng giữa dị :h chiết Enzym với dung địch tỉnh bội tạo 1% rồi thử phản ứng với dung dịch lọt Phan ứng cho trau xanh đen lă hoạt lực rat yeu, mau nau do thẻ hiện có hoạt lục ứ - amylaza Phan ứng mắt mău với lọt lă có hoại lục Maltaza vă Glucoamylaza mất mau
nhanh với tot thẻ hiện hoạt lực Amy laza cao (gồm œ — am laza vă Glucoamylaza)
Phương phâp định tính có ưu điểm lớn lă có thể phât hiện nhanh sự hiện diện cua [nzym nhưng chua cho phĩp đânh giâ chính xâc hoạt lực của Eazym
Chuẩn bị môi trường cho định tinh Enzym
+ Enzvm Amylaza: Mỗi trường Shapcc tỉnh bột L Enzvm Proteaza: Môi trường gelatin
+ En7vm Zenlulaza: Mỗi trường Hutchison
Gieo cay tă MỐI FSV sinh tiny hợp tbn>\wn
+ Cay VSV có kha năng sinh tông hợp Amylaza Proteaza 2enlulaza
+ Nuôi ở nhiệt độ 28 - 30C trone 18h,
Nhăn xĩt vă đânh giâ kết qua
- Đânh giâ chất lượng canh trường thu được bằng cảm quan: dịch hóa
tinh bĩt, gelatin
- Do đường kinh cua khuẩn lạc
- Đo vòng thủy phđn vă đânh giả kha nang sinh tông hợp FnZym của câc ví sinh vật:
t Độ lớn của đường kính vòng thuy phan tinh bot ! Độ lứn của đường kính vòng thuy phan gelatin + Độ lồn cua đường kính vòng thuy phần CMC
2/ Định lượng ho tec Enzvm Ghicoamylaza
Amylaza lă tín chỉ nhóm enzym có kha nang phan cất câc liín kết
wlycozit trong mạch tỉnh bột Chúng gồm:
+ a-amylaza (Enzym dich hoa) phan cat câc liín kết a-1.4 - ølycosit trong mạch tính hột tao san pham [a cac Dextrin
! B-amvla2a (hay maltoza) phan cắt liín kết œ -1.‡ - glycosit trong mach amyloza tao maltoza B -amylaza thuy phan amylopectin tao maltoza va dextrin giới hạn
Trang 15+ Glucoamylaza (v- amyiaza) phan cat liĩn kĩt a -1.4 - glycosit trong mạch amyloza thanh glucoza va thus phan amylopectin thanh glucoza va dextria gici han
+ 0 -1,6 - gÍycosidaza phđn cắt liín kĩt a -(.6 glycosit trong dextrin gidi hạn hoặc trong mạch Amhy lopectin
+ a-1.6- glycosidaza cùng với câc Enzym khâc thủy phđn tính bột hoăn toăn thănh glucoza
Amylaza nói chung vă Ghivoamylaza nói riíng lă những Enzym được
ứng dựng rộng rêi trong thực !ẻ, đặc biệt trong công nuhệ thực phđm trong săn xuất rượu, bía nước giải khât, trong sản xuất dextrin, đường glucoza Trong công nghệ môi trường câc vi sinh vật có hoạt lực Am laza được sứ dụng trong
xu ly chđt thai răn nước thâi chứa tình bột
a) Định nghĩa vă nguyễn tắc xâc định
- Định nghĩa hoạt độ Glucoamylaza: 7 đơn 9ị hoạt độ Glucoarnylaza lă lượng enzym can thiết xúc tâc thủy phản tính bội tạo thănh | mg Glucoza trong thời gian [ giờ ở điều kiện tiíu chuđn (môi trường đệm axctat với pH = 4.7 vă
nhiệt độ 30°C)
- Độ hoat động (hoạt lực) cua Enzwm lă đại lượng biểu thị khả năng xúc tac chux ĩn hóa có chất của mỗi Enzym
- Nguyín tắc định lượng: Dựa trín khả năng thủy phđn tính bột tạo thănh
đường glucoza của En7zvrtmn Glucoamylaza Lượng glucoza tạo thănh được định
luong bing phuong phap Luft - School cđi tiến
b) Câc bước tiến hănh
* Thu ln:ym từ caHh trường Vĩ sinh vật
Thu Lnzvm tu cạnh trường nuôi cấi: bề mặt nấm mốc Axp avamori hoặc
Asp usant:
- Nghiĩn nho che phẩm Enzym
- Can Sx chĩ pham đê nghiín nhỏ rồi chuyín văo bình định mức 50 mI - Thím Š ml đụng dịch đệm axctat, định mức băng nước cất đến vạch
- Giữ hỗn hợp ở 30°C trong 30 phút
- Lọc lấy dịch chiết băng giay loc băng văng thu chế phẩm Enzym tính khiết, Thu EH>ym từ canh trường nuôi cấy chìm nâm men Endomycopsis:
Lay 10 ml canh trường nudi nam men Endomycopsis ly tam 6 van toc
5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút dĩ loại sinh khối nắm men
Trang 16Phan dịch thu được có chữa Glucaamylaza ngoai bao cua Endomycopsis
* Kae dink heat luce Encvm
Thuy phan tinh bat bang chĩ pham Enzym thu duoc: - Cho vao binh tam giac 100ml:
+ 1 ml dich chiĩt Enzym
+ 2 ml dung dich dĩm avetat pH = 4.7 + 10 ml dung dich tinh bat 1%
- Đặt bình văo thiết bị òn nhiệt Thực hiện qua trình xúc tâc thủy phđn
tinh bột ở nhiệt độ 30C trong thời gian ( giờ,
- Định tính hoạt lực Amylaza: thừ phản ứng với lột sau 3 phat, 5 phút, 15 phút - Lay mau sau | gid va định luong duong khu
- Song song tiĩn hanh thi nghiĩm kiím chứng trong cũng điều kiện (đun sôi địch chiết để vô hoạt Enzym)
- Định lượng Glucoza tạo thanh bang phuong phap Luff— School cai tiền
* Tinh hoạt lực Enaym
Từ lượng Thiosunfat tiíu tôn trong phđn tích tính được lượng Glucoza tạo thănh vă hoạt độ E.nzvm Glucoam+ laza theo biểu thức:
wih) f 33 mf
Hil dv Harp
trong đó: ae thĩ tich NasS:O; 0.1N chuan kiím chứng mỉ b: thĩ tich NasS-O; 0.1N chuẩn mẫu thuy phan, ml
3.3: dương lượng đường khử tính theo Na›Sa2› (Ì mì NasS5O› 0.IN~3 3 mg ghicoZq)
# hệ số pha loêng
m lượng Enzym xúc tâc phan ứng (tính trơng ứng với mău khí chuđn dường khi) gam
(;: thời tiun phan ứng, giờ
3/ Xac dinh hout lac Proteaza theo Ansan
Enzym Proteaza lă nhóm Enzym xúc tâc cho quâ trình phđn cât liín kết
peptit trong câc mạch peptt hoặc protein (polypeptiÐ nhờ phản ứng thuy phđn theo co chí:
Trang 17HO
-CH C -N-CH- a -CH COOH + HsN-CH-
I | | Proteaza |
R ©O ff Rs R, Rạ
Proteaza thường được dùng trong san xuđt nuớc chấm trong quâ trình chế hiển câc sản phẩm từ sữa trong thuộc đa v học Trong công nghệ môi trường, câc ví sinh vật sinh tông họp Proteaza vă câc chế phảm Proteaza được su dung trong su lý hoặc hỗ trợ vu Iv phan giai câc chất thải răn, nước thải giău protein như chất thai từ thuộc đa chế hiến thủy san phế liệu hoặc phụ phảm nòng nghiệp giảu protein (Khô lạc khô đậu tương khô bông .)
Mot yo vỉ xiHÍt vật có kha năng tổng hop manh Proteaza
- Câc vi khuẩn:
+ Bacillus subtilis, Bac thermophilus, Buc, mesentericus ' Clotridium perfringens Clost, histoltiun
+ Pseudomonas acruginoca
- Cúc Nắm mốc:
+ dypergillus oryzae Asp funticatus, Asp flavus | Penicillium ganthinellum, Pen Chrysogenum.,
Proteaza từ vi sinh vật tồn tại đưới dạng: Profeaza axit tỉnh trung tỉnh vă kiểm tính,
a⁄ Định nghĩa vă nguyín tắc xâc định HẠP
Hoạt độ Proreaza (HđP) lă đại lượng đặc trưng cho khả năng xúc tâc phần giaf DrOf€IN tỏi pePLT vă axit amin cua cac Enzym
HđP được biểu thị băng số đến vị profeaZa có trong Í g (hoặc Iml) chế phẩm Hoạt độ riíng cua chế phảm đuộc biểu thị bằng số đơn vị proteaZa trín Ime protein cua chế phẩm
Dịnh nghĩa: T đồn vị hoạt độ proteaza lă lượng Enzym xúc tâc thủy phđn
protein thănh câc sản phẩm hoa tan trong TCA cho phản ứng tạo mău với thuốc
thừ Folin (tường đương với L tunol Tyrozin) trong Í phút ở điều kiện tiíu
chuđn (pH = §,§ vă nhiệt dd 30°C)
Nguyín tắc xâc định hoạt độ Proteaza theo Anson: Enzym Proteaza có
kha nang thus phan Protein (Ciclatin, Casein, Hemoglobin ) tao thanh axit
amin Luong axit amin tao chanh trong phan ứng thủy phđn được xâc định bằng phan ứng tạo mâu với thuốc thu Folin
Trang 18Dựa văo thang chuđn của Tyrozin đẻ tỉnh lượng axit amin thu được nhờ phan ung thus phan
b⁄/ Câc bước tiễn hanh
1¿ Hoâ chất dụng cụ
+ Dung dich NasCO; 0.5M
+ Dung địch đệm vạn năng pH — §,.5 + Dung dich Gelatin 2%
+ Thuốc thư Folin
- Dung địch Tyrozin chuôn 10” (1 nmol/m])
+ TCA (Triclo — axetat) 0.3M
2/ Thu Enzym Proteaza tir chĩ pham Enzym thĩ
+ Cđn 3g chĩ pham thu được đê nghiền nhò rồi chuyín văo bình định
mức 50 ml
+ Thím 5 ml dung dich dĩm van nang 0.1M pH = 5,5 vă định mức đến vạch
+ ]Ac dĩu giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30°C trong 30 phút
+ l.ọc thu địch chiết Fnzym
3/ [hực hiện phan ứng xúc tâc thuy phđn Protein
+ Cho văo bình tam giâc 100 ml: 2 mí địch chiết Enzym 2 ml dung dịch
velatin 2%
+ Cho con từ văo bình phản ứng vă đặt văo thiết bị điều nhiệt có khuấy từ
+ Thực hiện phđn ứng xúc tâc thủy phđn ở nhiệt độ 30°C trong thời gian
LŨ phút
| Dĩ dinh chi phan ứng thím 4 ml TCA 0,3M để kết tủa protèn dư vă
câc san pham thủy phđn phđn từ lượng lớn
+ Tiếp tục-giữ hỗn hợp ở 30°C trong 20 phút,
+ Lọc thu dịch thủy phan
Song song tiền hănh thí nghiệm kiím chứng trong cùng điều kiện + Cho văo bình tam giâc 100 ml:
2 ml dich chiĩt Enzym
4 ml TCA 0.3M khuay dĩu trong 10 phút
Trang 194/ Dựng đường chuđn TVr0zin
Từ dung dịch Tyrozin chuđn (1 ;ưnol/ml) chuẩn bị dêy mẫu chuđn có hăm lượng Tyrozin từ 0 0,3 kmol theo bảng sau: ———- — — ——-———¬~- Ông nghiệm |3 |4 5 | ó |7 186 Ó Nẵng độ Iyrozin ( mol) - — 0 0.02 0.04 | 0.08 " 0.12 | 01ó | 02 03 Thẻ tích lvroztin ImlHaiO - 0L - 02 0.4 0.6 0.8 ] l5 j Tpmol nv (mb | ¡_ Thế tích HCI 0.2N (ml) 4 49 48 1 46 | 44 42 | 40 | 35 |
¡ Chuđn bị một dêy ống nghiệm gồm 8 dng:
+ Lay 1ml cua mỗi nồng độ chuẩn vă lần lượt cho văo từng ống nghiệm, ~ Thím văo mỗi ống nghiệm: § ml dung địch NazCO; 0.5M
| ml thudc thir Folin, tắc đều
+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°C
+ Đo cường độ mău của hỗn hợp bằng mây so mău quang điện ở bước sóng Ă = 670 nm vĩi cuvet day | cm
+ Dựng đường chuẩn từ kết quả đo được với trục hoănh lă hăm lượng
Tyrozin vă trục tung lă mật độ quang
5/ Định lượng axit amin có trong mẫu thủy phđn vă tính hoạt độ Proteaza + Lấy ] m] sản phẩm thúy phđn (dịch lọc) cho văo ống nghiệm
+ Thím văo mỗi ông nghiệm: 5 ml đung dịch NasCO: 0.5M,
1 ml thuốc thư Folin lắc đều
+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°C
+ Ðo độ chiết quang bằng mây so mău quang điện ơ bước sóng Ă = 670nm Hoạt độ Proteaza (HđP) cua chế phẩm duoc tinh bang biĩu thúc:
HdP = Đ/, dv/g im trong đó:
HP: hoạt độ Protedza của chế phđm Enzym don vi/g
Trang 20I2 ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO LUFF — SCHOOL CAI TIEN
1) Nguyín tắc
Phan ứng oxy hóa khử giữa Sunfat đồng II (CuSOx) vă đường khử (Glucoza Fruetoza) tạo thănh oxyt đồng Í (Cu2O) kết tùa mău đỏ Sunfat đồng dư được định lượng giân tiếp băng KI trong môi trường axit mạnh
2) Hoa chat
-Dung dich Fehling | - Dung dich Fehbling I
- Dung dịch: — tinh bĩt tan 1% KI: 30% H›SO.: 25%
~ Dung dịch Na;S›O; 0.IN
3) Cúc bước tiền hănh
- Lđy văo bình tam giâc 50ml: + | ml dung dich Fehting I
+ 1 ml dung dich Fehling II + 2 mÏ nước cất
+ ] ml dung dịch mẫu cần phđn tích
- Đậy binh tam giâc bằng phếu thuỷ tỉnh Đặt bình lín bếp đun sôi nhẹ
tronp 2 phút (tính từ khi xuất hiện bọt khí đđu tiín) Sau khi đun sôi, nhắc bình
ra khỏi bíp để nguội đín nhiệt độ phòng Dung dịch hỗn hợp vẫn còn mău
xanh đặc trưng của Sunphat đông vă xuđt hiện kĩt tha mău đỏ của oxyt đồng Ï (Cu›©) (níu mẫu có đường khủ)
- Thím văo hỗn hợp I ml dung dich H2SO,; 25%, | ml dung dich KI 30%; lắc đều vă giữ trong 2 phút, hỗn hợp sẽ có mău văng nđu
- Chuẩn iôt dư bang dung dich Thiosunfat chudn (Na7$203 0,1N) voi chi
thi hồ tỉnh bột 1%, sao cho hỗn hợp dung dịch chuyển từ mảu đen sang mău trăng sữa
- Lăm mẫu đối chứng: tương tự mẫu phđn tích nhưng thay văo Im] mẫu cđn phđn tích lă Iml nước cắt
Chú ý:
- Nếu sau khi đun, hỗn hợp dung dịch có mău đỏ, như vậy lă sunphat
đồng đê được sử dụng hết do lượng đường khử quâ lớn Muốn định lượng
Trang 21- Nếu sau khi đun không thấy kết tủa oxyt đồng [ (Cu;O) mău đó thì cần
tăng lượng mẫu giảm lượng nước cải
4) Tinh ket qua
(ab) f.33
V"
.V= .1000 mg/I trong do:
X: dường khư, mgi
da: thí tích NasSsQOš U.TN chuẩn Điều trăng, mỉ
b: thí tích NaaS3Q; Ú,ÌN chuản mau phan tich, ml L; thẻ tích mău phản tích, nH
F: hệ xó pha loêng (Hẻu có)
3,3; đương lượng đường khư tính theo Na;Š›Öy
I3 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÂP LOWRY
Nitơ amin lă thảnh phần không thể thiểu được trong cấu trúc cua axit
amin, peptit vă protein
Nito amin co trong cac san pham có nguồn gốc từ động vật, thực vật vă vị sinh vật
Nitơ amin trong liín kết peptit lă thănh phần chậm chuyín hóa vă thường chiếm khoảng 16% protein thô
Nitơ amin có frong nước thai giau chat hữu CƠ CÓ nguồn gốc từ quâ trình
chế biến thịt câ, trừng sữa, san xuất câc loại mắm nước chấm, đồ hộp thịt câ, thuộc da nước thải lò mỏ nước thai chăn nuôi gia súc Trong phần giai vếm khi, nito amin được khư đề tạo thănh NH; từ đó hình thănh NH trong môi
trường long Trong phđn giải hiểu khí xử lý nìtơ amin đòi hỏi lượng oxy cho
quâ trình oxy hỏa rất lớn
Qua trinh phan giai nito amin lă quâ trình rat quan trọng trong vu Iv nude thai chat thai ran gidu axit amin va protein
I/ Neuyĩn tắc địnH lượng H7 GHÌH bằng phương phâp Lowry a Nguyen tặc
Hăm lượng nito amin ty lệ thuận với hăm lượng protein có trong mẫu phđn tích
Nitơ amin được định lượng giân tiếp qua phản Ứng tạo mău giữa pre?ein
vă thuốc thir Folin
Trang 22Cưởng độ mău cua hồn hợp phan ứng được đo bằng mật độ quang ớ bước sóng 2 = 750 nm
Hăm lượng nito min được tính dựa văo đường chuan cua protein tinh
khiết với thuốc thir Folin
bh Hod chat
- Dung dịch protein chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml
- Dung dich A: dung dich Na;CO; 2% pha trong NaOH 0,1N
- Dung dịch B: dung dich CuSO, 0.5% pha trong Natrixitrat [34 hoặc hali-natritactrat 1%
- Dung dich C: Hĩn hop dung dịch A vă B theo ty lệ thí tích 50 : 1 (chỉ pha truọc khi dùng)
- Thuốc thư Folin
2/ Củúch tiễn hănh a Dime dione chinin
- Chuan bi day mau chuan (8 mau) voi nĩng dĩ tang dan tir 0 + 0.3 mg theo bang sau: lòng nghiệm Po» 2 1 3 4 5 6 7 8 |
“Luong Protein ang) o | 603 | 003 | a1 | 015 | 02 | 025 | 03
thĩ vich dung dich Protein | ñ 0.3 0.5 | 1.5 2 2.5 3
, chuam Ð.]Ìmp Ứ (nD | ị
Hoan So lă |} “as | 3 | 25 | 2 | 15 DỊ |
- Thím văo mỗi ông nghiệm:
+ 2 ml dung dịch C, lắc đều thực hiện phân ứng trong L0 phút, t Sau 10 phút, thím 0.2 ml thuốc thir Folin, lắc đều đề yín 30 phút
- Ðo độ chiết quang băng mây so mău ở bước sóng 2= 750 nm
- Dung đồ thị chuẩn từ kết quả đo được:
+ Trục tung biểu thị mật độ quang (ABS) ~ [ruc hoanh biĩu thi luong Protein (mg)
Trang 23b Xâc định lượng protein có trong mau cun phan tích
- Pha loêng mẫu phản tích sao cho hăm lượng protein trong khoảng 0.01 + 0,075 mg/ml
- Lay vao ống nghiệm 4 ml dung dịch mẫu cần phđn tích
- Thím văo ơng nghiệm:
+ 2 mÌ dung dịch C lắc đíu thực hiện phản ứng trong LŨ phút
+ Sau 10 phút, thím 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều để yín 30 phút
- Mau văng của hỗn hợp sẽ chuyín sang mău xanh da trời vă đạt cường độ mău cực đại sau 30 phút
- Đo độ chiết quang của hỗn hợp trín mây so mău ớ bước sóng Ă = 750 nm - Lượng Protein cua mẫu phđn tích được tra theo đường chuẩn
* Chụ ý Phan ứng xay ra ở nhiệt ôo phòng
c Tinh ham lương nito amin - Đụựng đường chuđn vă xâc định k B - Tính lượng nitơ amin trong mẫu đê phđn tích P N =——.j mưựmi on 6,25.a J 8 trong đó: P- lượng protein, mg £ hệ số pha lodng
a: thẻ tích mâu dùng trong phan tich (a = 4 mil)
6,25: hĩ so quy chuẩn nite amin theo Protein
1.4 BINH LUONG TONG NITO BANG PHƯƠNG PHÂP KJELDAHL
Nitơ tồn tại trong câc hợp chat him co dudi dang Nito amin (- NH) va
imin (- NH - ) duoe goi 14 nito hitu cơ Nitơ hữu cơ gồm nito trong axit amin, amin, amit imit cdc peptit va protein
Phương phâp Kjeldahi được sử dụng để xâc định N ở trạng thâi oxi hoâ - 3
Trang 24I.4.1 Nguyín tắc định lượng vă câc yíu cđu
1⁄ Nguyín tắc: Trong môi trường axit dic (H2SO,) vă có mặt hỗn hợp
xúc tâc (K:SOx CuSO¡ Se) nito hữu cơ vă nitơ amoniac dược chuyền hod
thanh nita amon (NH, )
Giải phóng amoniac từ amonsunphat trong môi trường kiệm mạnh va hap
thụ bằng dung dịch axit boric
Lượng mon được định phđn bằng axit chuđn hoặc bằng phương phâp
trắc quang
2⁄ Lấy mẫu vă bảo quan
Mẫu cần được phđn tích căng sớm căng tốt Thời gian lưu mẫu tốt nhất không quâ một ngăy vă trânh đẻ mẫu hấp thụ aneoniac từ môi trường Có thí sử dung bình polyetylen hoặc bình thuy tỉnh dĩ đựng mẫu
Trong trường hợp khong thĩ phan tích ngay, cần axit hoâ mẫu bằng HạSO,
đặc tới pH = 2 vă bâo quđn ở 4”C,
3⁄ Những điều cần lưu ý
Nitrat (NOs): nĩng độ > 10 mg/l cd thĩ gay sai số đm do sy oxi hoa amoni trong quâ trinh pha mau tao thanh N3O va gay ton that nito amon Nitrat cũng có thí bị khư thănh amoni khi mẫu có chứa nhiều chất hữu cơ ở trạng thâi oAí hoâ thấp vă gđy sai số duong
Câc muỗi vò cơ cũng cỏ thí ảnh hướng tới kết quả do có thí ảnh hưởng
tới nhiệt độ cua quâ trình phâ mẫu, Quâ trỉnh amon hóa xảy ra hoăn toăn vă hiệu qua o nhiĩt dd 380°C
khi mẫu có ham lượng muỗi vă chat rin cao, nhiệt độ của dung địch hỗn
hợp có thí lín đến 400°C, gđy tôn thất nitơ Đề hạn chế ảnh hưởng năy cần bổ
sung HsSQO, dace voi tilĩ thĩng thudng khoang | ml/g mudi
I.4.2 Câc bước tiền hănh I/ Hod chat
Su dụng hoâ chất tỉnh khiết phđn tích vă nước cất không chứa amoni dĩ chuẩn bị thuốc thứ
- Dụng dịch H›SO¿ đậm đặc (98%, d = I,84 g/em”)
Trang 25Dung dịch NaOH 40%: hoă tan 400 g NaOH phđn tích bằng nước cất không amon định mức tới 1 lit
- Chỉ thị Taxiro: trộn 100+nÍ dụng dịch metyl do (0.2 gam metyl do trong 100
ml cĩn 95") vai 50 ml dung dich metyl xanh (0.1 g metyl xanh trong S0 ml cản 959)
- Dung dich axit boric/chi thi: hoa tan 20 g axit boric H:BO): trong nước,
Thím 10 ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp rồi pha loêng thănh J li
- Dung địch HCI tiíu chuđn: 0.1 mol/l Chuẩn bị từ dung dich HCI
dac (d = 1.18 g/cm’) hoặc pha từ ông chuđn
- Dung địch HCI tiíu chuẩn 0.02 mol/I Pha loêng từ dung dịch chuẩn 0.! mol/l va dinh chudn bang phương phâp thông thường
Chuđn bị nước cất không amoni: có thí sử dụng ] trong 2 phương phâp sau: - Cho nước đê cất (2 lđn) chảy qua cột nhựa cationit axit mạnh vă chứa
nước thu được trong bình thuy tỉnh có nút nhâm Thím văo bình 10 g cationit cùng loại cho mỗi lít nước
- Phương phâp chưng cất: thím 0.10 + 0.01 m1 H;ạSO¿ đặc văo 1 lít nước cất vă cât lại trong mây hoăn toăn băng thuy tỉnh Bỏ §0 mÍ nước hứng đầu tiín
vă chứa nước văo bình thuỷ tính có nút nhâm Thím khoảng TÚ g cationit axit
mạnh cho mỗi lít nước thu được 2/ Câc bước tiễn hănh Thể tích mẫu được lẫy theo hăm lượng nitơ: Nẵng độ niợ Kieldahl (mg Cho dĩn 10 280 | 10 - 20 | 100 20 - 50 50 50 - 100 35
Vô cơ hỏa mẫu phđn tích:
+ Lay thể tích mẫu thích hợp cho vao binh Kjeldahl, thím 10 ml axit
H›;SO¿ đặc, 5 g hỗn hợp xúc tâc
+ Thím văi hạt đâ bọt vă đun nhẹ cho nước bay hơi hết, khi đó thấy khói trăng bat dau xuật hiện,
! Khí hết khỏi trắng dung dịch trở nín trong suối Tiếp tục đun thím 60 phủt nữa
+ Sau khi võ cơ hoâ đí nguội mẫu đến nhiệt độ phòng
Trang 26Thiết bị phâ mẫu (DK 6 DK8§S, DK20 ) trong hệ thiết bị phđn tích Nitơ tự động hoặc bân tự động VEI.P được trang bị hệ thống tâch vă hấp thụ khí ô nhiễm
- Chung cat va hap thụ NH::
Chuan bi binh hap thu: Lay 50 ml dung dich axit boric thím văi giọt chi
thị văo bình hứng của mây chưng cất Í ưu ý; đđu mút của ống dẫn ra từ sinh hăn phai nhúng ngập văo dụng dịch Trone bình hứng vây ra quâ trình phđn ly
cua H;BO; > HBO- + H-O
Chung cat va hap thụ NH::
+ Thím cần thận khoảng 250 mÌ nước cất văo bình đê vơ cơ hô cùng văi hạt đâ bọt lắp bình văo mây chưng cắt
+ Thĩm 3 giot chi thi phenoiphtalein
+ Thím 50 ml dung dich NaOH vao binh chung va khoa phĩu nhanh dĩ tranh NH; thoat ra ngoăi Chú ý; Sau khi thím NaOH dung dich trong binh phải có mău hồng (để đảm bảo dư xút)
| Chay nude lăm lạnh vă đun nóng bình cất
+ Dừng cất khi đê thu được khoảng 200 ml ở bình hứng Kiểm tra 1 vai giọt cuối cùng băng T - 2 giọt thuốc thư Nessler nếu vẫn có mâu văng thì quâ
trình cất chưa kết thúc
Khi cất dam NH; bi kiĩm day ra khoi (NH4)2SO4 sĩ phan tng voi HBO:
NH,OH + HBO: > Nifty + BOs + 10 - Dinh phan Nito:
| Chuan dĩ phan hime dược băng dung dịch chuđn HCI hoặc !ạSO, 0.02 N
cho đến khi đụng dịch chuyín từ mđu xanh lâ mạ sang mâu xanh tím
+ Có thể chuđn độ bằng dung địch HC1 0.1N đối với mẫu có nông độ nít0 cao BOy + H > HBO;
Bộ chưng cất vă chuẩn độ tự dĩng (UDK 126, UDK 132 UDK 142, .) có hệ thông chưng cất tự động an toăn vă độ tin cậy cao Hệ thống cĩ thĩ dĩ dăng kết nỗi với chuđn độ tự động vă cho kết quả trực tiếp Câc thông số cua quâ trình chưng cất vă chuđn độ tự động được căi đặt chương trình
Lap lai quâ trình đối với mẫu trắng trong đỏ mẫu thử được thay băng nước cât không chứa amoni
Trang 273⁄ Tỉnh kết quả Nông độ nito K)eldàh /X mg/1) được tỉnh theo công thức: VY ry tò TT =, 14.00.1000 mel trong đó:
V4: thĩ tich mau lay phan neh, ml
Ly: thẻ tích HCI tiíu chuẩn chăng đẻ chuản dĩ mau, nil: E?: thí tích HC tiíu chuẩn chóng đề chuẩn ch) nấu trang, mỉ: Cnr nong do axu HC) chudn dime dĩ chuan do, mol/l:
14.01: khoi heong neuven ne cua nite Lưu ý:
- Trong quả trình vò cơ hoâ câc khi độc như SOa, Ha§, HCN có thể sinh ra vì vậy cần tiễn hănh vô cơ hoâ mẫu tronp tủ hút hoặc phải lắp đặt bộ phận xu lý khi
- Bộ cất ni phai đam bao kín đí không gđy that thoat NH; trong qua trình chưng
- Phần cặn còn lại sau khi chưng chứa selen (tắt độc) cần thu gam va chứa vao bình riíng đề có biện phâp vụ lý thích hợp
1.5 ĐỊNH LƯỢNG TỎNG PHOTPHO BĂNG PHƯƠNG PHÂP TRÂC QUANG
I 5.1 Nguyín tắc yíu cầu lấy mẫu
1 Nguyín tặc
Định lượng tông Photpho hêng phương nhâp trắc quang dựa trín phản
ứng tạo phức antimonx photphomolipdat giữa octophotphat với molipdat va
anfimony trong mỗi trường axIt
Khu phire antimony photphomolipdat bằng axi ascobic thănh phức
molipden có mău xanh đậm Đo độ chiết quang của dung dịch sẽ xâc định được nồng độ ocfophorphat
Trước khi phđn tích toăn bộ photpho hữu cơ vă vô cơ trong mẫu được
chuyín về dạng octophorphat,
Trang 282⁄ Lấy mẫu vă bảo quản mẫu
- Dụng cụ chứa mẫu:
+ Tốt nhất lă chai thuy tỉnh đặc biệt khi hăm lượng photpho thấp nhất
thiết phải dùng chai thuy tinh,
+ Cĩ thí sử dụng chat PE, PVC
+ Chai chứa mẫu phải được rừa sạch bằng axit HC] 2M (nóng) sau đỏ trắng nhiều lđn băng nước cất Tuyệt đôi không sử dụng chđt tđy giặt chứa
photpho đí rưa chai đựng mẫu
- Xu ly va bao quan mẫu:
Loc mau:
- Mẫu dùng đí xâc định photphat hoả tan phải lọc ngay sau khi lắv mẫu
+ Măng lọc có cỡ lỗ 0.45 tưn được rưa băng 200 mÍ nước ẩm để loại bo
photphat trín giấy lọc,
+ Loc mau qua mang da xu ly bo 10 ml mau loc dau tiĩn va thy phan con lại văo lọ thuy tính sạch, khô
Bảo quản mẫu:
+ Mẫu được bảo quđn ở 4°C vă tốt nhất nín tiến hănh phđn tích trong
thời gian không quâ 4 giờ sau khi lẫy mẫu
+ Đối với mẫu xâc định tông P: thím 1 mI ÍICI đậm đặc/1 lít mẫu, bảo
quản lạnh trước khi phđn tịch
I.5.2 Hóa chất vă thiết bị ly Hod chat - H:SO, đặc (98% d— 1.81 g/em `) - HNO: đặc (68% d 1.4 g/cm’) - Dung dich NaOH 0.1N: hoa tan 4 g@ NaOH bằng nước cat va dịnh rnức tới 1000 ml
- Chị thị phenolphthalein: hoa tan 0.5 g phenolphtalein trong 50 ml cĩn 95%, sau dĩ thĩm 50 mi nude cat
- Dung dich photphat gĩc 50.0 tự PO,” : hoa tan 219,5 mg KH¿PO¿ bằng
nước cất vă định mức tới I Lit
- Dung địch photphat chuẩn: pha loêng 50.0 ml dung dịch photphat pac thanh Lit băng nước cất | mÍ dụng địch năy chứa 2,50 ng P
- Tâc nhđn khư (E)
Trang 29- Dung dich 11:80, 5 N (A}: Pha lodng 70 ml H-SO, dam đặc bang nước
cât vă dịnh mức tới S00 mỊ
- Dung dich Amoni molipdat 40 ø/l (H): hoă tan 20 ø (NH:}»Mo;O;¿.4H2O
vă dinh muc tdi 500 ml bang nude cat Bao quan dung dich trong chai sam mau - Dune dich Kali antimon tartrat 2.743 g/l (C): hoa tan 1.3715 g
K(SbOJC HO«.1/2H2O băng nước cất va dinh mirc thanh 500 ml Bao quan
dung dich trong chat sam mau
- Dung dich axit ascorbic 0.1 M (D): hoa tan 1.76 g axit ascorbic trong
100 ml nuĩe cat Dung dich nay dn dinh khoang | tudn o 4°C,
- Dụng dich hĩn hop (t:): on SO ml dung dich A, 15 ml dung dich B 5 ml dung dich C va 30 ml dung dịch D Dung dịch năy ôn định trong khoang 4 h
Lim Ý- Đề câc chng dịch trín đạt đến nhiệt độ phòng trước khi trộn Nếu
dụng cụịch hồn hợp đục, lắc đều vă đề vín văi phút đến khi trong trước khi dùng 2/ Thiết bị
- Quang pho kế
- Dụng cụ thuy tỉnh thông thường trong phòng thí nghiệm - Bếp phâ mẫu
Dụng cụ thuy tỉnh dùng cho phđn tích photpho cđn rửa băng dung dịch HỚI 2 Mi nóng sau đó trâng kỹ bảng nước cất Tuyệt đôi không sử dụng chất tđy rửa chứa photpho
3/ Chu ÿ
- Asenat phan ứng với molipdat tạo phức mău xanh giống như phức của photphat gđy sai số đương Ở nông độ Asen lă 0.1 mg/1 bắt đđu có ảnh hưởng
tới việc xâc định photphat
- Nông độ Fe`” > I5 ppm sẽ cân trở đến quâ trình khử tạo thănh mău xanh níu nôns độ lín đín 30 ppm thì mău xanh không xuđt hiện
- NÓ+ Cí”” gđy sai số đm: khoang 3% ở nồng độ ! mg/l vă giảm tới 15% a nĩng dĩ 10 mg/l.” - Sunfua (S”) vă silicat (SiO:”) không gđy ảnh hướng ơ nông độ tương img 1,0 mg/l va 10 mg/l I.5.3 Câc bước tiín hănh 1⁄Lập dường chuan
Lập dêy mẫu chuđn gồm it nhất 6 mẫu theo bảng chỉ dan Lay vao binh
định mức 50 ml lần lượt câc dung dịch theo chỉ dẫn ở bảng sau:
Trang 30i | TT Mau | I 2 ì 4 5 6 7 8 } hí tich ml | Dung dich Ợ l 2! 4 6 ¬¬- 16 Photphat chuan ; Tae nhan Khir (12) 8 8-8 +! 8 8 ơ § 8 Nude cat 42 4l 40 38 36 34 30 26 Lượng P (te) 0 2.5 Š 10 15 20 30 40
Để 10 phút ơ nhiệt độ phòng dung dịch sẽ có mău xanh đậm Đo mật độ quang của mẫu trăng vă mẫu ở bước sóng 2 — 880 nm
Dựng đường chuẩn quan hệ ølữa mật độ quang (ABS) vă lượng photpho (ug) trong mỗi bình
2⁄/ Tiến hănh phan ich
- Lay 100 ml mau da lac dĩu
- Thím | mf H2SO, dae va 5 m! HNO; dac Dun nhe mau toi thĩ tich khoang | ml, sau dĩ dun tiĩp dĩn khi mat mau dĩ dudi hĩt HNO3
- Lăm lạnh vă thím khoang 20 ml nude cat, | giot phenolphthalein, sau đó trung hoă băng NaOH |N dĩn mau hĩng nhat Dinh mire dĩn 100 ml, lọc bỏ
can (nĩu có)
- Hút thí tích mẫu văo bình định mức 50 ml sao cho nồng độ photpho nằm trong đường chuẩn (tôi đa lă 40 ml) thím 8 ml tâc nhđn khử E Định mức
bang nước cất tới vạch Đề yín 10 phút
- Do độ hấp thụ cua mẫu ở bước song 2 ~ 880 nm
- Song song tiền hănh với mẫu trắng trong đó phần mẫu thử được thay
bằng nước cất
Đôi với mẫu có độ đục vă độ mâu cao, cần hiệu chính bằng câch sử dụng
mẫu trăng thím tất câ câc tâc nhđn trừ (C) vă (Ð) Độ hap thu cua dung dich
nay phai duoc trir di trong phan tinh toân
3/ Tinh kĩt qua
Từ mật độ quang của mẫu vă mẫu trăng dựa văo đường chuẩn tính được lượng P ứng với thể tích dung dịch đê hút
Trang 31ye , ne
}
trong đô:
Ă- hăm lương P có trong mâu phản tích, mg/l
mụ lương P cả trong bình tương ứng với thẻ tích đê hút g L2 thẻ tích mâu lấi trong phản tích mỈ
1.6 DINH LU'ONG LIPIT BANG SOXHLET
Lipit lă thuật ngữ chung đẻ chị dầu mỡ nguồn gốc động thực vật Về cấu trúc hóa học lipit lă este của axit bẻo no hoặc không no với rượu đơn hoặc đa chức
Câc axI bĩo nọ có công thức chúng CnHxO; như axit Palmitic C;¢6H320.,
axit Steric C¡sÍ 13C»: "` axit bĩo không no có công thức chung CaHsn,mO; (m lă số nối đôi trong liín kết) như axit Oleic €¿sH:O› (1 nối đôi) axit Linoleic
€CayH2O› (2 nối đôi), axit Linolĩnie CịgH:eO» (3 nội đội)
Rượu đơn chức, rượu mạch thăng phđn tư lượng lơn mạch vòng nhu Cholesterol Estradiol Testosterol vă đa chức như G]yxerin
Lipit tồn tại đưới hai dạng:
- Lipit đơn giản:
+ Cac Triglyxerit: Este cua Glyxerin vă 3 axit bĩo
+ Câc Sterit (sâp): liín kết este giữa rượn phđn từ lượng lớn với axit bĩo
+ Câc Steroit: liín kết giữa Sterol vă axit bĩo
~ Photpholipit: giữa Glyxerin với 2 axit bĩo vă photpho
- Lipit phire tap: gam Lipoprotein, Glycolipit
Photnholipit vă câc lipit phức tạp đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc
cua câc mô liín kết ö cơ thể động vật
Lipit không tan trong nuộc, chúng có phđn tử lượng rất lớn, đặc biệt lă
câc lpn phức tạp nín rất khó phđn huy, kí cả phđn húy hiểu khí nhờ câc vị
sinh vat co hoạt lực Lipaza
Dầu mỡ động thực vật có trong chất thải răn, nước thải sinh hoạt, một số
loại nước thai công nghiệp nhờ nước thai lò mô chế biến thủy hải sản, chế biến
thịt, sữa câc hạt có dấu
Việc nhđn tích vâc định hăm lượng lipit trong nước thải vă chất thai ran
có ý nghĩa quan trọng đẻ quyết định phương ân công nghệ trong tiền xử lý vă
trong quâ trình xư lý câc chất thải Phương phâp phô biín để định lượng dau
mở động thục vật lô phương phâp Soxhlet
Trang 321.6.1 Nguyín tắc
~- Dựa văo khả năng đễ tan của Lipit trong dung môi hữu cơ như etanol, benzen, metanol, elorofooc, toluen, diclometan, axeton, (Dung môi yíu cầu
có nhiệt độ sôi thấp, trọng lượng nhỏ)
- Lipit được định lượng trín cơ sở xâc định khói lượng mẫu phđn tích
trước vă sau khi chiết lipit bằng dung môi hữu cơ,
Một số vitamin vă tạp chất tan trong chất bĩo cũng được chiết cùng với
lipit nhưng trong đa số trường hợp lă không đâng kể
1.6.2 Hóa chất vă thiết bị
~ Dung môi hữu cơ: Etanol
~ Mây chiết Soxhlet
Hệ thống tự động Soxtherm (S 306 AK/S 306 A) được thể hiện trín hình
II.1 Hệ thống năy đơn giản vă tiết kiệm thời gian so với mây Soxhlet truyền thống (Hinh II.2) Hình I.1 Hệ thống tự động Soxtherm
1 Van thâo dung mĩi 6 Vỏ bọc hình trụ có thẻ chịu âp
2 Cốc chiết bằng thủy tỉnh, 54x30 mm 7 Bình ngưng bằng thủy tỉnh
3 Ong chiết đựng mẫu, 33x80 mm 8 Kẹp hình trụ 4 Kẹp giữ cốc chiết 9 Cấp khi nĩn
5 Công tắc kiểm tra khí nẻn, thu hỗi dung môi 10 Công tắc kiím tra khí nĩn, nđng
Trang 331.6.3 Câc bước tiền hănh
- Chuđn bị cốc chiết Cốc chiết (2) được sđy ở 103°C trong tu say Sau đó được
lăm nguộ
đến nhiệt độ phòng trong binh hút đm vă cần trín cđn phđn tích (mi g)
- Câc bước tiền hănh: + Cđn khoảng Š
tích (m g) cho văo ĩr sam mẫu cđn phđn chiết, Mẫu có thể
được lăm khỏ nếu cần thiết Da khoang 140 ml dung mai văo cốc chiết (2) ống chiết văo cốc chiết vă thím
Đối với hệ thống Soxthcrm quâ trình
chiĩt được cải đặt bởi chương trình vă gồm
5 giai đoạn đí đđm băo mầu được chiết
hoản toản Quả trình năy được thực hiện tự
động hoản toăn vă đặc biệt higu qua dĩ
phđn tích chất bĩo vă phđn bê còn lại
Giai đoạn 1 f Giai đoạn2 ' Giai đoạn 3 Dung môi đườc thua hồi a) b) c)
Hinh 1.3 Qua tinh chiĩt nhứ hệ thông Soxtherm
Giai đoạn }: Mẫu được đặt ngập hoăn toăn trong dung môi đang sỏi vă
chất bĩo được tâch khỏi mẫu (hình II.3.a)
Dung môi bay hơi đi lín, được lăm lạnh ngưng tụ lại
Giai đoạn
chảy văo ông chiết Khi mức dung môi bắt dau thập hơn ông chiết đựng mẫu
Trang 34Giai đoạn 3: Chất bĩo được chiết vă gom bởi dụng môi ngưng tụ (hình H1.3.c) Giải đoạn 4: Phần dụng môi thừa được chưng cất vă gom trong thùng chứa đí tâi sử dụng (hình II.3.đ)
Giải đoạn 5: Cốc chiết được tự động nđng khỏi bếp (hình II.3.€) Nước lăm lạnh vă bếp đun nóng được tất sau 5 giai đoạn
Sau khi kết thúc chương trinh cốc chiết được lăm khô ở 103°C đến khối
lượng không đôi (ít nhất | gid), gid trong bình hút đm, lăm nguội đến nhiệt độ phòng vă cđn (m> g) Linh kết quả: (77, my, X === 100 (%) 4? Trong đó:
X: Hăm lượng chât bĩo cỏ trong mâu phđn tích, % mị: khối lượng cóc khi chưa chiết lipk, g
Trang 35PHAN If
VI SINH UNG DUNG TRONG CONG NGHE MỖI TRƯỜNG
11.1 PHAN LAP VĂ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẠT
(1.1.4 Mĩi trường dinh dưỡng
!⁄ Yíu cđu đâi với môi trường dinh đường
Môi trường dinh dưỡng lă hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự tồn tại vă phât triĩn cua vi sinh vật Đđy lă yíu tổ đầu tiín quan trọng thậm chí quyết định sự thănh công trong nghiín cứu về Vĩ sinh vat
Trong dinh đưỡng, câc loăi vị sinh vật đều cần một sô nguyín tô hóa học
cơ bản như C.N P vă một số nguyễn tổ khoâng khâc Tuy nhiín mỗi loăi vi
sinh vật có khả năng hấp thụ nhù cđu dính dưỡng cũng như cơ chế trao đồi
chất khâc nhau Vì vậy, không có môi trường dinh dưỡng năo lă vạn năng Tùy
mục đích thỉ nghiệm tùy chúng loại vi sinh vật mă cung cấp một môi trường cần thiết thích hợp đề chúng phât triển
Câc vi sinh vật tự dưỡng cacbon có khả năng sử dụng cacbon dưới dạng
vô cơ (CO; hoặc câc muỗi cacbonat) lăm nguồn Cacbon duy nhất Vì vậy,
chúng được gọi lă nhóm vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ Chúng gốm câc vi sinh
vật có sắc tố như tăo vi khuđn lưu huỳnh dồng hóa cacbon băng nêng lượng mặt trời (tụ dưỡng quang năng } Một số vì sinh vật khâc không có sắc tổ như
vi khuđn nitrùt, nữrat hóa thực hiện quâ trình đồng hóa cacbon nhở năng lượng
hóa năng tù câc quâ trình oxy hỏa
Khâc với câc vi sinh vật tự đưỡng, câc vì sinh vật dị dưỡng cacbon cần
môi trường chứa câc hợp chất caehon dưới dạng câc chất hữu cơ như axit hữu
cơ rượu hydratcacbon hoặc hydrocacbua
Tuy nhiín, câc môi trường dinh dưỡng đều phải đâp ứng được những víu cđu sau:
Trang 36- Cung cấp đđy đu chất định dưỡng cho ví sinh vật, trong đó chủ yếu lă
nguồn C N P câc nguyín tỏ khoang đa lượng (Ca K Na, S, Mg ) vă vi lượng (Mo Co Zn Cu ) câc chất kich thích sinh trưởng (axit amin,
vitamin ) trong trường hợp cần thiết,
- Môi trường dinh dưỡng cđn có pH thích hợp (câc loại nắm ưa môi trường
axit nhẹ vì khuđn ưa kiềm hoặc trung tính tăo ưa môi trường kiềm ) Có thí điều
chính pH của mồi trường bang axit (HCI, H2SQa, .), kiĩm (NaOH, KOH ) hoặc câc muỗi có phan ứng kiểm như bicacbonat (NaHCO?) hoặc cacbonat (Na;CO;), Khi khử trùng pH cua môi trường có thí thay đổi Vì vậy, cần kiểm tra lại pH của
môi trường sau khi khử trùng vă điều chỉnh lại khi cần thiết
- Môi trường cần có đệ ẫm độ nhớt vă âp suất thđm thấu thích hợp
- Môi trường phải đăm bảo tuyệt đối vô trùng Phương phâp khử trùng
thông dụng đói với câc loại môi trường định dưỡng lă dùng hơi nước bêo hòa ö nhiệt độ cao vă âp suất lớn hơn âp suất của khí quyín bằng câch sử dụng nỗi bâp âp lục (xem phản câc thiết bị)
Trang 37€ hú Y-
Thời gian vă nhiệt độ khư trùng phụ thuộc văo thănh phản môi trường Câc chất hữu có dễ bị biến tính do nhiệt như ax(t amin, vitamin câc loại đường khư dịch chiết nắm men sữa cần được khư trùng ở 0.5 atm Câc chất
kích thích sinh trưởng như avít amin, vitamin nín được khư trùng riíng a
chế độ thích họp vă bỏ sung văo môi trường sau khi đê khử trùng
- Khí môi trường có phản ứng kiềm hoặc axit khí khư trùng sẽ xuất hiện kết tủa câc sản phẩm caramen hóa vă bị biến tỉnh trở nín không hoặc khó hấp
thụ đối với ví sinh vật Đề trảnh hiện tượng nđy, môi trường để nuôi cđy vi
Sinh vật ưa axit hoặc kiềm nẻn khử trùng ở pH trung tính, sau đó kiếm hỏa hoặc axit hóa môi trường bằng dung địch tương ứng đê vô trùng
- Sau khủ trùng, môi trường được bảo quản ở nhiệt độ 0 — 5°C,
- Truce Khi sur dung cần kiím tra độ tình khiết của môi trường bằng câch để
trong tủ âm ở nhiệt độ 30 32%C trong 24 siờ, nếu thấy môi trường vđn đục có vâng hoặc xuđt hiện khuđn lạc lạ thì cđn loại bỏ
2/ Phĩn logi moi trường
Vĩ sinh vật lă nhóm sinh vật gồm nhiều chúng loại vò cùng đa dạng,
phong phú Mỗi loăi thậm chí mỗi chúng lại có nhu cầu dinh đưỡng rđt khâc
nhau, Vị vậy môi trường đề nuôi cảy giữ giống vă nghiín cứu chúng cũng rất
đa dạng vă khâc biệt
Có thể phđn biết câc loại môi trường theo nhiều câch khâc nhau: 4) Phản loại thes thanh phan:
Căn cứ văo nguôn nguyín liệu đề chẻ tạo môi trường người ta phần biệt: Môi trường tự nhiín đuộc chế tạo từ nguyín liệu tự nhiín có nguồn gốc
động thực vật (canh thang thịt nước ĩp khoai tđy carot, nước rnalt nước chiết đđt nước suối khoang ) Môi trường tự nhiín có thănh nhđn không xâc định thường đuợc sư dụng nuôi cấy, gift giống vă phđn lập vi sinh vật
Môi trường tự nhiín thường có một số thanh phần đễ bị biến tính: axit amir vitamin đường khư , Vì vậy, cần khử trùng ở chế độ thích hop
Ví dụ:
+ Mỗi trường canh thang thit - pepton: | atm trong 20 — 30 phút:
+ Moi truong malt: 0.5 atm trong 30 - 30 phút:
x Mỗi trường dịch chiết nắm men: 0.5 atm trong 20 30 phút; † Môi trường nước ĩp carolt, khoai tđy: 1 atm trong 30 phut
Trang 38- Mói trường tòng họp: được pha chế từ hóa chât thănh phần môi trường
được xâc định cụ thí
Nguyín liệu chứa CN ÐP vă câc khoảng khâc được hòa tan trong nước mây vă khi không cần thiết thì không cần bô sung thím câc nguyín tô ví lượng
- A467 trưởng bân tổng hợp lă loại trung pian giữa 2 loại trín Míi
trường ban tông hợp được chế từ hóa chất (câc loại đường muối chứa nito photpho ) vă câc nguyín liệu tự nhiín chưa biết chính xâc thănh phần như
dịch chiết nắm men dịch thuy phản casein cao ngô chúng được bỏ sung chú
yếu lăm nguồn bô suns vỉ lượng vitamin arinoaxit vă câc chất kích thích sinh trưởng khâc
b) Phđn loại theo mục địch sự dụng môi trường dinh dưỡng gồm
-_ Âöi trường cơ so (đa năng): thích hợp cho nhiều loại vì sinh vật như môi
trường thạch mạch nha thạch thịt pepton, môi trường Shacpec
Mới nướng riíng biệt chỉ thích hợp cho một loăi nhất định không chứa chất ức chế hoặc kim hăm câc vì sinh vật phât triển Tỉnh riẻng biệt thường đuộc đâp ứng qua thănh phđn dinh dưỡng đặc thù (nguồn cacbon nitơ độ nH hoặc câc chất bỏ sung khâc)
-_ Mi trường phản lấp vă Huyễn chọn: chỉ thịch hợp cho mội loăi nhất định đóng thời ức chế sự phât triển của câc loăi khâc như những chất có độc
tinh ma chi vi sinh vat nav chia được,
Ví dụ: Môi trường Endo có chúa Fuchsin kiểm vă Natrisunphit ức chế
mạnh câc vị khuẩn Gram (1) Như vậy có thẻ tâch được câc ví khuẩn
Gram (-) như E coli Shatmonella
- Modi trường xâc dịnh vă chđn đoân: Môi trường được bô sung một số hóa
chđt ch: thị đặc thủ cho phĩp phât hiện một câch khâ chính xâc đặc điểm
cua một loăi năo đó nh phản ứng của môi trường như sự đổi mđu sự tạo thănh câc chất khi đặc trưng Một số chất chỉ thị điển hình như đó trung tinh (5 ppm) da phenol (50 ppm)
- Moi trvong chu thi: duge su dung trong phan lập định tín trong nghiín cứu tính
chât sinh lý sinh hỏa đi truyền vă phđn loại vi sinh vật
cy Phan loai theo tinh chat lý học
Trang 39- Mi trường (địch thể: tă môi trường dung dịch đướt dạng lỏng: nguyín liệu được hòa tan trọng nHớc
Môi trường dịch thẻ được sư dụng để nghiín cứu đặc tính sinh lý sinh hóa, đặc tính nuòi cấy, quả trình trao đôi chất của vì sinh vật
- Môi trường đặc: lă môi trường lông được bộ sung thím câc tâc nhđn đông đặc ở nhiệt độ cao như thach (agar agar) gelatin
Môi trường đặc được dùng đề phđn lập định lượng xac định đặc tính
nuôi cđy giữ giống vi sinh vật
+ Thạch (agar agar) được sản xuất từ tăo biín thuộc họ Hồng tảo (chu yếu lă Gelidium) Bân chất hóa học của agar lă Polysaccarit được tạo thănh chu yĩu tir D- galactoza vă 3.6-anhvdrogalactoza Hđu hết câc vi sinh vật không cỏ khả nđng phản giải Agar đồng đặc ở nhiệt độ 40 - 43°C vă được sử dụng ở nỏng độ 2-3%
Agar có phản ứng trung tỉnh vă không lăm thay đổi pH của môi trường Đâng chú ý lă agar hín trong môi trường trung tính axit nhẹ kiềm nhẹ Tuy
nhiín ở môi trường axit pH < Ấ.5 agar sẽ bị phđn hủy một phần trong quâ trình khư trùng ở nhiệt độ cao dẫn đến khă năng tạo gel kĩm Mỗi trường sẽ bị nhêo
sau nhiều lần thanh trùng
Đề trânh hiện tượng năy, khi cần nuôi cay vi sinh vat trín môi trường có tinh axit agar can duoc khủ trùng riíng sau đó bố sung văo môi trường đê
được khử trùng
+ Gelatin (có bản chất lă protein) được san xuất từ đa động vật, Gelatin
nóng chay ở nhiệt độ 23 - 26°C, thấp hơn so voi nhiệt độ nuôi cđy câc ví sinh
vật ưa âm Mặt khâc gelatin con dĩ bi thay phan boi Enzym Proteaza Vi vay, gelatin được sử dụng chủ yếu để phât hiện hoạt lực Proteaza của vì sình vat
Gelatin thường được bồ sunp với nồng độ 10 — 15%, pH = 6.8 — 7,0 Môi trường có chứa Gelatin được khử trùng ở 0.5 atm trong 15 phút - Mĩi trường rấn: lă môi trường bân tổng hợp được chế từ một số nguyín
liệu tự nhiín như câm, trđu, bột ngô bột xenllulo khô lạc khô bông có thẻ bố
sung thím nguồn nitơ photpho va khoảng khâc bằng hóa chất khi cần thiết
Môi trường tắn được sử dụng trong phỏng thí nghiệm, trong công nghiệp
đề nuôi cấy vi sinh vat thu chế pham sinh hoc
3⁄/ Một số môi trường thông dung được sử dụng trong công nghệ môi trường
d) Câch chế mội số nghiện hiệu đề pha chế mới trường dinh dưỡng
Canh thang thịt: Dùng nuồi cđy câc vì khuẩn đị dưỡng,
Trang 40500 g thịt thăn bò tưới nghiền nhỏ thím văo 1 lít nước giữ ở nhiệt độ
50°C trong thời gian I giờ khuấy thường xuyín sau đó đun sôi trong 3 - 5 phút lọc qua giấy lọc vă định mực đến ! lít
Dịch chiết nắm men
Dịch chiết nằm men được sư dụng nuôi cấy nhiều nhóm ví sinh vật khâc nhau đặc biết môi trường nuôi cđy câc loại nấm có nguồn nitợ lă địch chiết nắm men sẽ hạn chế đâng kĩ kha nang bi ahiĩm khuẩn
Nguyín liệu để thu dịch chiết co thĩ lă nắm men bia dưới dạng men lòng, men ĩp hoặc nđm men khô
Lấy 100 ø năm men khơ (hay 200 ¢ nam men bânh, 400 8 nắm men bía
tươi) trộn văo Í ljt nước đun sơi để nguội đến 60%C Điều chỉnh pH đến 4.5 -
4.7 băng axit sunphuric (ElsSO, IN), Thím văo 2 — 3 giọt Clorofooc gìữ hỗn hop o nhiĩt do 48 50°C trong 48 gid Sau đỏ đun sôi, lọc lay dich chiĩt, phan
phói văo bình vă khư trừng ở nhiệt độ LI5°C trong 15 phút Dịch ehiết giău axit
amin va peptit: có thể cô đặc thănh cao nắm rnen hoặc sấy khô thănh bột Có thí kiểm tra bằng cam quan: nước chiết có mău vă mùi đặc trưng như
nưoc mắm từ câ,
Nước chiết malt
Căn 250 g đại mạch nảy mầm đê nghiền nhỏ trộn văo | lit nước vă đun nóng đến 45 š0°C vă duy trì trong Khoảng | gid
Dĩ trânh vón cục bỗn hợp được khuđy liín tục, sau đó nang nhiệt độ lín
SS 58°€ vă giữ đến khi đường hóa hoăn toăn (mất mâu với iot) Lọc qua giđy
lọc thu được dịch chiết malt
\Đjch chiết được sử dụng lăm môi trường mạch nha trong nuôi cđy giữ
giếng va phđn lập hđu hết câc loại năm đặc biệt lă năm men Kiểm tra nồng đệ
đường bằng ty trọng kế Balling (B) hoặc hăm lượng chất khô bằng khúc xạ kế
cam tav
Nong đệ đường trong nước nha thường đạt i6 - 18°B Hăm lượng chất khô có thể đạt 18 — 20%,
khử trùng nước nha ở 0.5 atm trong 20 - 30 phút trước khí băo quản
hy) Mot so midi trong thong dung
Môi trường canh thang thịt: dùng phđn lập nhiều loăi vi khuđn + Pepton: l0
~NaCh 5 g (khuấy cho tan hết)
Điều chnhpH: 74 76