Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm vi hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

Trang 1

NGUYÍN THỊ SƠN - TRẦN LỆ MINH

TAI LIEU HUONG DAN THi NGHIEM VI - HOA SINH UNG DUNG

TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

|

Trang 2

PGS TS NGUYEN THI SON - THS TRAN LE MINH

TAI LIEU THi NGHIEM VI - HOA SINH UNG DUNG

TRONG CONG NGHE MOI TRUONG

Trang 4

LỜI MỞ ĐĂU

“Tai liệu thí nghiệm Vi - Húa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường” được biín soạn phù hợp với nội dung môn học tương ứng trong

chương trình khung được Bộ Giâo dục vă Đăo tạo thông qua cho ngănh Kỹ thuật môi trường Tăi liệu được sử dụng trong hướng dẫn thực hănh cho sinh viín đại học vă học viín cao học ngănh kỹ thuật môi trường

L Tăi liệu được biín soạn gồm 4 phần cơ bản

2 Thí nghiệm Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường 3 Thí nghiệm Vì sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

4 Thí nghiệm chuyền đề Xử lý sinh học nước thải

Phụ lục giới thiện một số dụng cụ, thiết bị cần thiết phục vụ cho câc thí nghiệm trín (hiện có tại Viện Khoa học vă công nghệ môi trường ~ Trường Đại học Bâch khoa Hă Nội)

Nội dung tăi liệu được viết nhằm củng có phđn lý thuyết của hai môn học:

- Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

- Ví sinh ứng dụng trong công nghệ mồi trường dong thời cung cấp cho sinh viín một số kỹ năng thực hănh trong nghiín cứu vẻ ví sinh vật cũng như

phương phâp phđn tích một số chỉ tiíu sinh học quan trọng trong xử lý vă đânh

giâ chất lượng môi trường

Phần thí nghiệm chuyín đề giúp sinh viín bước đầu lăm quen với câc phương phâp xử lý sinh hợc Trín cơ sở vận hănh, phđn tích vă tính tôn câc thơng

số kỹ thuật thu được, sinh viín có thể đânh giâ cũng như xử lý câc sự cô phât sình

trong quâ trình vận hănh hệ thống xử lý sinh học nước thải

Chúng tôi hy vọng cuỗn sâch năy cũng có thể dùng lăm tăi liệu tham

khảo bô ích cho công tâc đăo tạo vă nghiền cứu trong lĩnh vực công nghệ sình

học môi trường cũng như cho câc cân bộ kỹ thuật câc ngănh liín quan

Do được biín soạn lần đầu, cuốn tải liệu không trânh khỏi còn những

thiều sót Chúng tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của bạn đọc vă đồng

nghiệp để bổ sung vă chính sửa khi tăi liệu được tâi bản

Trang 5

PHAN I

HOA SINH UNG DUNG TRONG CONG NGHE MỖI TRƯỜNG

1.4 NUOI CAY VỊ SINH VAT THU CHE PHAM ENZYM VA XAC BINH HOẠT LỰC ENZYM TỪ VỊ SINH VẬT

Tĩ bao vi sinh vật tuy nho bĩ nhưng trao đôi chất không ngừng Sự sống

của vi sinh vật được đặc trưng bởi hăng loạt câc phản ứng chuyín hoâ vật chất,

trong đó có những phan ứng thực tế không xảy ra trong ống nghiệm o điíu kiện

bình thường nhưng trong tế bảo ví sinh vật câc phan ứng năy xảy ra với tộc đô nhanh gấp hăng triệu lần nhờ những chất xúc tâc đặc biệt: chất xúc tâc sinh học

hay còn gọt lă Enzym

I.1.1, Đặc trưng vă một số Enzym được ứng dụng trong công nghệ

môi trường

1⁄ Những đặc trưng của Envm tr vi sink vật

Hệ Enzym của vi sinh vật rất đa dạng, phong phú Từ vì sinh vật có thẻ

thu nhiều Enzym khâc nhau trong đó có những Enzym chi co 6 vi sinh vat như zenlulaza, razema7a

- Enzym tử ví sinh vật có hoạt lực cao hơn câc Enzym tương tự ở động vật vă thực vật

- Vị sinh vật nhạy căm với môi trường nín khi thay đổi điều kiện sòng hoặc tâc động bằng câc yíu tố khâc nhau có thí thay đổi hệ Enzvm vă huạt lực Enzvm của chúng Nhờ vậy có thể tạo được câc Enzym theo yíu cầu vơi hoạt lực cao

- So với câc sinh vật khâc, vi sinh vật phât triền nhanh hơn, tuy kích thước nhỏ nhưng hiệu suất sinh tòng hợp Enzym vă tý lệ Enzvm trong tế băo

tương đối lớn nín hiệu suất thu hỏi Enzym cao quy trình sản xuất đơn gian

- Nguyín liệu sử dụng nuôi cấy ví sinh vật để thu Enzym rất rẻ tiền dễ

kiểm thường lă câc loại phụ phđm, nhĩ liệu Do đó giâ thănh Enzym từ vi sinh

Trang 6

3⁄/Một số Enzym được ứng dụng rộng rêi trong công nghệ môi trường u⁄ Enaym Amyla:za

- Enzym Amylaza lă Enzym có ửng dụng rộng rêi nhất Amylaza lă tĩn chung chỉ một nhọm gỏm câc Enzym có khả năng xúc tâc thuy phđn tỉnh bột thanh dextrin duong maltoza va ghicoza nhu œ - amylaza, B - amvlaza, elucoams laza, dextrinaza

- Amylaza c6 trong mot sĩ nam mĩc:

+ Aspergillus: 43p oryzae dsp san, Asp niger, Asp awamori ‘Rhizopus: RA delemar Rb paponium

Nam men cĩ kha nang tng hop Amylaza: | Endomycopsis: F fthuliger, E species 1 Endomyces: Endonyces spe

Vi khuđn có kha năng tông hợp Amylaza; + Bacillus: Bacthius wihnlis, Buc macerans

+ Vikhuan wa nhiĩt co hoat luc amylaza manh: Bac diastilicus, Bac cHCHhINS

Lrzvm Army laza con cĩ trong thue vat (hat nay mam, thĩc mam, hat malt khoai lang) trong dang sat (nude bot)

b/ Enzym proteaza

Proteaza co nhiều ö động thực vật vă vi sinh vat Proteaza ở vị sinh vật t6n tại dưới dạng nội băo vă ngoại bảo phần hu\ câc liín kết peptit

Proteaza có ở vi khuđn, xạ khuản vă nam mĩc: -Vi khuan tong hop Proteaza:

+ Bacillus: Bac subtilis, Bac thermophilus

+ Clostridium: Clost perfringen Clost, histolyticum

-NẤm mộc:

~ Aspergillus: Asp oryzae Asp fumigatus, Asp flavus

+ Penicillum: Pen janthinellum

Trang 7

Œ⁄ Enzym Pectinaza

Pectin lă thănh phđn chính của lớp gian băo có chức năng kết dính câc tế băo tạo thănh mô thực vật

Pectin thực chất lă axit Polygalacturonic được tạo thănh nhờ liín kết œ - 1.4 — glycozit của axit D — Galacturonic, trong đó gốc cacboxyl ở vị trí C6 eó thể được metyl hóa Khi số lượng câc gốc cacboxyl được metyl hỏa vượt quâ 75%, pectin trở nín bín, không tan được gọi lă Protopectin

Enzym thuy phan pectin thue chat gm 2 nhóm: Enzym thúy phđn liín kết este (Esteraza) chuyín Pectin không tan thănh pectin tan vă Enzym thủy phđn liín kết œ 1.4 — glycozit (Depolymeraza) thủy phđn pectin tan thănh axit D - Galacturome

Enzym Pectinaza co y nghia rat lớn trong công nghệ môi trường đặc biệt trong xư lý chất thai răn (sinh hoạt vă công nghiệp) có nguồn goc thực vật như vo qua, cudng rau chat thai nông nghiệp (thđn lâ vỏ hạt ) chúng phđn hủy pectin giải phóng Xenllulo giúp quâ trình chuyển hóa Xenllulo vă quâ trình vô cơ hóa xâc thực vật xây ra nhanh hơn,

Pectinaza chỉ có ở ví sinh vật nhất lă Protopectinaza Hoạt lực Enzym

Pectinaza có thí được xâc định băng phương phâp đồng (Cu) pectat

Vi sinh vật có khả năng tổng họp Peetinaza gồm nhiều loăi nấm sợi vă vi

khuẩn Một s6 loai ky sinh ở thực vật chúng phđn giải pectin, phâ hủy mô thực vật

vă gđy hư hỏng sản phẩm chúng có nhiều trong đất (10° tĩ bao/g đất) Cac vi sinh vật có thĩ xđm nhập văo khối râc thải thực vật trong quả trình thu gom, vận chuyển lăm thay đỏi tính chất cơ lý của râc gđy khó khăn cho phần loại vă xử lý râc

Một sỐ chung điín hình có hoạt lực PectinazZa:

- Mat sĩ loai nam da bao nhu Borytis cinerea, Fusarium oxysporum ky sinh

trĩn hau hĩt thao moc Envinia carotovora gay hu hĩng rau xa lâch, carot cần

tay Enzym Pectinaza có thể được sản xuất nho Asp niger, Penicillum, Fusarium solani

- Một số vi khuẩn có hoạt lực Pectinaza mạnh như Bacillus macerams

Bacillus polymvxa mbt sĩ chung Pseudomonas (Pseud fluorescens), nhiĩu vi

khuđn dạ cỏ một số vĩ khuẩn ta nhiệt thuộc nhóm Clostridum (Clost pectinovorun

Trang 8

d/ Enzym Zenlulaza Hĩ Enzym zenlulaza g6m 3 Enzym chu yĩu: Lxo B 1.4 - glucanaza Endoglucanaza Zenlobiaza

thuy phan zenluloza thănh đường glucoza

Zenlulaza có trong xạ khuđn nắm mốc vă vì khuẩn:

Nấm mốc: Trichoderma reesei Tri lignoran Fusarium lini, Fus solani Xa khuan: Streptomyces flagrogrisens

Vi khuan: Clost thennicillum, Cellulomonas sp Bacillus thermmospoza spe Câc Enzym nói trín có vai trỏ rất lớn trong công nghệ xử lý nước thải vă chất thải răn giău câc chđt hữu cơ

Nhờ có hệ Enzym rất phong phú của vi sinh vật, câc chất hữu cơ dưới dạng protein gluxit pecfin vă ca zenlulo được chun hô góp phần ơn định chu trình

tuần hoăn vat chat trong tu nhiín đồng thời góp phđn lăm sạch mồi trường Câc Enzym nói trín có vai trỏ rat lớn trong xử ly yếm - hiểu khí câc chất

thải răn nước thải giău chđt hữu cơ

1.1.2 Phương phâp nuôi cđy thu chế phẩm Enzym

Câc vì sinh vật được sử dụng đẻ thu Enzym gồm nhiều loại nắm mốc, nắm

men vì khuđn vă xạ khuđn bằng phương phâp nuôi bí mặt hoặc nuôi chìm

Như trín đê trình bảy, nhiều ví sinh vật có khả năng tổng hợp Enzym,

thậm chí có những ví sinh vật có kha năng tông hợp câc Enzym khâc nhau

trong câc môi trường cỏ cơ chất khâc nhau

Đề thu được Enzym từ vi sinh vật cần tiễn hănh nuôi cấy chúng Hầu hết câc vt sinh vật sinh tông hợp Enzym trong điều kiện có oxy Vì vậy, về nguyín tắc có hai phương phâp nuôi cấy ví sinh vật thu Enzym lă:

- Nuôi cấy bẻ mặt - Nuôi cđy chìm

1⁄ Phương phâp nuôi bí mặt

Phương phâp năy sử dụng chú yếu với câc loăi nắm mốc, xạ khuẩn vă

nắm men có khuẩn ty thật hoặc khuđn ty giả Enzym tạo thănh dưới dạng

Trang 9

a) Nguyín tặc: Tạo môi truờng có hẻ mật riíng lớn (có độ xếp cao) vă du dinh dưỡng cho hệ sợi cua nắm phât triín vă sinh tông hợp Enzym

b) Nguyín liệu vă yíu cầu đôi với môi trường sinh tông hợp Enzym Một trong những yếu tế anh hương quyết định đến sự sinh trưởng phât triển cũng như khả năng sinh tông hợp Enzym cua vi sinh vật chính lă thănh phần môi trường Môi trường dình duỡng phải đam bao có đu câc thanh phản cđn thiết có chứa CN, H O câc nguyín tổ khoâng đa lượng như P, S Ca Mẹ K vă trong một số trường hop còn có ca một số nguyín tố vi lượng hoặc câc chất kích thích sinh trưởng vă sinh tông hợp enzvm như axit amm., vac bazo pyrin (Adenin Guanin) bazo Pyrimidin (Timin, Xytozin }

Trong thực tế, môi trường nuôi cấy bẻ mặt có thí lă môi trường tụ nhiín

hoặc môi trường bân tông hợp

Nguyín liệu co bạn đề phâ chế môi trường nuôi bề mặt lă câm gạo, cảm lua

mi vi chúng không chi chứa câc chất hữu cơ khâc nhau lă nguồn cung cấp C

N mă còn chứa nhiều ngun tơ không đa vi lượng vă câc yếu tổ sinh trương can thiết cho sự phât triển vă sinh tông hợp Enzym như câc axit amin vitamin

Trong nuôi cấy ví sinh vật tổng hợp mỗi Enzym cđn một tâc nhđn điều hòa sinh tông họp khâc nhau, đặc biệt lă câc chất cảm ứng ví dụ dĩ thu Amylaza can tình bội, dextrin, thu Proteaza 14 peptit, protein, Pectinaza la !íx dratnectic

protopectin va Xenllulaza [a Xenllulo, CMC (Cacboxyl Metyl Cenllulo)

Trong thực tế sản xuất để giam gia thanh san phẩm nguyín liệu thường, được sử dụng lă bột ngô pelatin bột carol cu cai vă bot giay hay CMC

Trong những trường hợp cần thiết eó thẻ bộ sung nguồn nitơ dudi dang hữu cơ (bột khô lạc khô đậu tương sữa bột ) hay về có như Amoônsunphat

(NH4)2SO4 NHyNO3 )

Câc nguyín tố khoâng, nhất lă P vă S lă những thănh phần trong cđu trúc

của nhiều hợp chất rất quan trọng trong trao đỏi chất cua vì sình vật như câc

Nucleotit, Protein Lipit phức tạp vă câc Vitamin có thể bộ sung thím dưới dạng câc muối photphat (KHaPO: K›LIPO ) muối sunphat (MgSO:

(N H,)›SO: )

Trang 10

c) Câc bước tiến hănh lảm môi trường Phỏi trộn nguyín liệu:

Thanh phan môi trường nuôi bề mặt gồm:

- Cam gao: 35 - 40%, ~ Trđu: 40 - S0°„

- Nguyĩn ligu cam ung: 10°

(bĩt ngd: 10 %, aeclatin: 10 % khĩ lac: 5%, CMC: 5 % bat carot: 5°} - Môi trường dinh dưỡng cđn có độ ầm khoang 65% Dĩ tao do am, co thĩ sw dung nước cat (rong phòng thí nghiệm), nước mây (trong sản xuất đại tră) bô sung văo mỗi trưởng va trộn dĩu

- Môi trường cần được khư trùng trong nỗi âp lực ở âp suất l atm trong

thời gian 30 phút

[tương hợp căn bô sung câc chất kích thích sinh trương dạng hữu cơ nhụ anit amin vitamin cde nguyĩn liĩu năy được khử trùng riíng ở âp suất 0.5 atm treng 45 phat, sau đó bỏ sung văo môi trưởng

- Sau khu trùng môi trưởng được đí nguội dến nhiệt độ thường đ) Cđy vă nuôi vì sinh vật

- Canh trường piíng phai lă cạnh trường thuận khiết có thẻ o dang ran

hoặc lòng

- Vói nđm mốc vă xạ khuẩn cạnh trường thuong dung lạ bao tụ được pha

loêng trong nước vô trùng với ty lệ 1% - 1900

- Sau khi cấy canh trường nuồi được trộn đỉu Nếu nuồi quy mô lớn, môi trưởng được phđn phối văo câc khay hoặc dăn nuôi với lớp dđy không quâ Š em

- Thời gian nuôi cđy thường từ 36 48 gid ty thude thoi gian tau Fozym cua mỗi loăi vi sinh vật

- Nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng từ 28 30°C dộ đm: $§ — 6% Irong LÔ - 14 giờ đđu, băo tú trường nở vă năy mầm, nhiệt độ môi trường nuôi ít

biến động Từ !§ 30 giờ tiếp theo hệ sợi nấm phât triền mạnh Quâ trình hô

hap giai phóng năng lượng vă nước lăm cho nhiệt độ vă độ đm môi trường tăng Nếu lớp môi trường dăy cần được đảo trộn vă lăm thoảng khí đề cụng cấp oxy tâ giải nhiệt Quả trình năy cũng lăm cho độ đm môi trường giảm, canh trường tời, XỐp

Trang 11

Chế phẩm thó có thể được sây khô ơ nhiệt độ 43 - 45°C đến độ đm 8 - 13%

dĩ bao quan va su dụng e) Tùnh chế Enzym

Dĩ thu chĩ phđm Enzym dạng tình khiết hơn, chẻ phầm Enzym tươi

(hoặc khỏ) duoc nghiín nhỏ để phâ võ cđu trúc sợi nđm giải phóng Enzym

Enzym được chiết trong môi trường nước với pH xâc định băng dung dịch đệm tương ứng với mỗi loại Enzvm tỉnh chế có thí ở dạng lòng hoặc dạng bột sau khi được lăm khô

Phương phâp nuôi bể mặt có ưu điểm lớn tă hoạt lực Enzym cao, công nghệ don gian có thẻ tự động hóa đễ triĩn khai Ỏ quy mô lớn: yíu cầu năng

lượng thập thiết bị đơn giăn, nguyín liệu rẻ tiín dễ kiím nẻn lăm giảm gia

thănh san phẩm Sản pham dễ bao quản vă vận chuyín phù hợp trong xử lý câc chât thai răn giău chất hữu cơ Tuy nhiín chí phđm Fnzym từ nuối cđy bí mat co do tinh khiết thập hơn nuôi cđy chím.,

Nuôi cay nam moc thu chĩ pham Enzm Amylaza va Proteaza bang Phuong phap nudi cay bí mêi

a) Chuẩn bị môi trường

+Can: - 8g câm gạo - 10g trấu

- 3u bột ngõ (cho môi trường thù chế phđm Enzym Amylaza) - 2ø gelatin (cho mỗi trường thu chế phảm Enzym Proteaza)

+ Trận đều chuyển hồn hợp văo binh tam giâc 250 mÌ, bố sung nước cất

đến độ đm 6Ô — 65%, Nút bông

+ Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ ]1 (°C trong 30 phút

+ Để nguội đến nhiệt độ phòng

h) Cay VSV

Cay 1inl địch chửa băo tủ cua nắm mốc: - Thu En⁄ym Amylaz2a: 214p "xanh - Thu Enzym Protea⁄a: Asp.orvzac

c) Nuôi cấy VSV thu Enzvm: ở nhiệt độ 28 — 30°C trong thai gian 36 giờ

2/ Phuong phap andi chim

Phuong phap nuoi chim thuong due su dung voi cac tac nhan như nắm men vì khuẩn tòng họp Enzym ngoại băo Cũng có thí sử dụng nam moc, xa khuđn đí thu hệ sợi chứa Enzvm nội bảo

Trang 12

a) Nguyín tắc: Vì sinh vật sinh trưởng phât triển vă tông hợp Enzym trong môi trường lỏng được cấp khi vă trong điều kiện vô trùng

b) Môi trường nuôi cấy

Khâc với nuôi cđy bề mặt môi trường nuối cấy chim thường lă môi trường bân tổng hợp Nguyền liệu cho nuôi cây chím thường ở dạng hỏa tan hoặc huyền phù

Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng lâ nước chiết ngỏ nước chiết nắm men Nguồn nitơ vô cơ vă câc ngun tơ không được sử dụng như ở phương phâp nuôi bề mặt Câc tâc nhđn cảm ứng thường được sư dụng ở dạng tỉnh

khiết hơn như tỉnh bột hỏ hóa, tỉnh bột tan pepton, casein CMC,

pH của môi trường được điều chình cho phù hợp vói mỗi loại Enzym vă mỗi lođi vị sinh vật

c) Câc bước tiền hănh

Câc cầu tử cúa môi trường được hòa văo nước vă được đưa văo thiết bị khử trùng 2 vỏ hoặc dạng ống xoăn ruột gả Môi trường được khử trùng trực

tiếp băng hơi quâ nhiệt ö nhiệt độ !18 — 125%°C trong thời gian 30 phút

Sau khư trùng, môi trường được chuyển sang thiết hị nuôi cđy Trong nhiều truông hợp để trảnh nhiễm trung người ta thường kết hợp khử trùng trực tiếp trong thiết bị nuôi cấy

d) Cđy vă nuôi ví sinh vat thu Enzym

Môi trường được lăm nguội đến nhiệt độ cần thiết (28 — 30°C) thì cay vi sinh vat Với nắm mốc vă xạ khuản có thí cấy bằng băo tứ nhiệt độ nuôi 28 -

30°C thời gian nuôi 36 — 48 giờ

Không khí được cấp liín tục trong quâ trình nuôi cấy Đề trânh tạo bọt thâi quâ có thể bỗ sung văo môi trường một chút dầu phâ bọt hoặc axit oleic đê khử trùng

Thiết bị khuấy lăm việc liín tục đí tạo độ động nhất, giúp cho Enzym khuy ếch tân tốt văo mỗi trường,

Trong nuôi cđy chìm Enzym tạo thănh trong suốt quả trình phât triển của ví sinh vật đạne ngoại hăo được khuxĩch tản văo môi trường Lượng Enzym trong tế

băo chỉ chiếm 10 - (5% Vì vậy chí cần ly tđm hoặc lọc tâch sinh khỏi lă thu được

dung dịch chứa Enzym

Câ biệt có một số nắm trrốc sinh tổng hợp Enzym nội bảo (Glucooxydaza

ở nđm móc Asp niger), Enzym tổn tại trong cấu trúc của sợi nấm Trong

trường hợp năy chi cần tâch lấy sinh khối (sợi nấm), sau đó nghiền phâ vỡ tế

băo đẻ chiết Enzvm như đối với canh trường bề mặt,

Trang 13

Phương phân nuồi chỉm có thể âp dụng trọng phòng thí nghiệm với bình tạm piâc vă mâv lắc hoặc với thiết bị nuôi hiểu khí quy mô nho, pilot như thiết bi Bin stât Ô quy mô công nghiệp có câc thiết bị lín men biểu khí với câc dung tich Khâc nhau,

Phương phâp nuôi chìm hiện đại hơn (để tự động hóa ở quy mô lớn) va cho chĩ pham Enzyim tinh khiết hơn Phương phản năy phai được tiến hănh trong điều kiện vô trùng nghiím ngặt nĩn tu được chế phẩm tỉnh khiết, hoạt lực cao hơn [uvx nhiín đó cũng lă khó khăn Không nhọ trong quâ trình nuôi Vì lý đo năo do như thiết bị không thật kín thiết bị không hoăn toăn vô trùng có thể dẫn đến nhiĩm tạp khuẩn toăn bộ môi truông gua winh bi aging hhoan toan

Nhôi cay nam men thu chĩ pham placoamylaca hang phương phâp nuôi cay chim

a) Chuđn bị môi trường

- Lấy ŠÚ mÌ mơi trương long văo binh tam giae 250 mi dĩ nudi cay Endomxecopsrs., Nút bong

- Thanh trùng ở LIIˆC trong 30 phút

- Lay ra dĩ ngudi đến nhiệt độ phòng, b) Cay nam men

Cas S mi canh tudng nam men Endomy copsis,

c) Nudi tren may leo nbiĩt dĩ 28 — 30"C trong thời gian 48 giờ

1.1.3 Xâc định hoạt lực Enzym 1⁄ Định tính hoạt lực Enzym

a) Nguyín tặc: Định tỉnh hoạt luc Lnzym dựa trín kết quả đânh giâ nhanh hiệu lục xúc tâc chuyín hóa cơ chất cua En2vm thông qua diện tích vòng thủy phản hoặc phan ứng hóa học (tạo mâu) của san phim với chất chỉ thị

b) Phương phâp tiín hănh

Đẻ định tính hoạt lực Enzvm ví sinh vật thường được niềi cđy trền môi trường thạch với co chật trong ưng, Sau một thời gian nuôi nhất định (24 - 36 gid), thir phan ung voi chat chi thi thích hop

Fnzym Ams taza: vot mat trường chứa tỉnh bột chỉ thị lă dung dich Jot hoặc dung địch Lugol (chưa lòU,

[nzym Xenllilaza: vỏi mỗi trường chứa CMC chỉ thị lă dụng địch Tot Enzym Proteaza: vôi môi truông chứa Gelatin hoặc sữa bột Hoạt lực Protein lă vòng dịch hóa Gclatin hoặc lăm mất mău đặc trưng cua sữa bột

Trang 14

Hoạt lục của Enzym Ams laza vă Xenllulaza the hiện qua d6 lon cua đường kinh vimg mat mau voi lot xung quanh khuẩn lạc € ũng có thẻ định tính hoạt lực Amylaza cua chế phảm thỏ bằng câch thực hiện phản ứng giữa dị :h chiết Enzym với dung địch tỉnh bội tạo 1% rồi thử phản ứng với dung dịch lọt Phan ứng cho trau xanh đen lă hoạt lực rat yeu, mau nau do thẻ hiện có hoạt lục ứ - amylaza Phan ứng mắt mău với lọt lă có hoại lục Maltaza vă Glucoamylaza mất mau

nhanh với tot thẻ hiện hoạt lực Amy laza cao (gồm œ — am laza vă Glucoamylaza)

Phương phâp định tính có ưu điểm lớn lă có thể phât hiện nhanh sự hiện diện cua [nzym nhưng chua cho phĩp đânh giâ chính xâc hoạt lực của Eazym

Chuẩn bị môi trường cho định tinh Enzym

+ Enzvm Amylaza: Mỗi trường Shapcc tỉnh bột L Enzvm Proteaza: Môi trường gelatin

+ En7vm Zenlulaza: Mỗi trường Hutchison

Gieo cay tă MỐI FSV sinh tiny hợp tbn>\wn

+ Cay VSV có kha năng sinh tông hợp Amylaza Proteaza 2enlulaza

+ Nuôi ở nhiệt độ 28 - 30C trone 18h,

Nhăn xĩt vă đânh giâ kết qua

- Đânh giâ chất lượng canh trường thu được bằng cảm quan: dịch hóa

tinh bĩt, gelatin

- Do đường kinh cua khuẩn lạc

- Đo vòng thủy phđn vă đânh giả kha nang sinh tông hợp FnZym của câc ví sinh vật:

t Độ lớn của đường kính vòng thuy phan tinh bot ! Độ lứn của đường kính vòng thuy phan gelatin + Độ lồn cua đường kính vòng thuy phần CMC

2/ Định lượng ho tec Enzvm Ghicoamylaza

Amylaza lă tín chỉ nhóm enzym có kha nang phan cất câc liín kết

wlycozit trong mạch tỉnh bột Chúng gồm:

+ a-amylaza (Enzym dich hoa) phan cat câc liín kết a-1.4 - ølycosit trong mạch tính hột tao san pham [a cac Dextrin

! B-amvla2a (hay maltoza) phan cắt liín kết œ -1.‡ - glycosit trong mach amyloza tao maltoza B -amylaza thuy phan amylopectin tao maltoza va dextrin giới hạn

Trang 15

+ Glucoamylaza (v- amyiaza) phan cat liĩn kĩt a -1.4 - glycosit trong mạch amyloza thanh glucoza va thus phan amylopectin thanh glucoza va dextria gici han

+ 0 -1,6 - gÍycosidaza phđn cắt liín kĩt a -(.6 glycosit trong dextrin gidi hạn hoặc trong mạch Amhy lopectin

+ a-1.6- glycosidaza cùng với câc Enzym khâc thủy phđn tính bột hoăn toăn thănh glucoza

Amylaza nói chung vă Ghivoamylaza nói riíng lă những Enzym được

ứng dựng rộng rêi trong thực !ẻ, đặc biệt trong công nuhệ thực phđm trong săn xuất rượu, bía nước giải khât, trong sản xuất dextrin, đường glucoza Trong công nghệ môi trường câc vi sinh vật có hoạt lực Am laza được sứ dụng trong

xu ly chđt thai răn nước thâi chứa tình bột

a) Định nghĩa vă nguyễn tắc xâc định

- Định nghĩa hoạt độ Glucoamylaza: 7 đơn 9ị hoạt độ Glucoarnylaza lă lượng enzym can thiết xúc tâc thủy phản tính bội tạo thănh | mg Glucoza trong thời gian [ giờ ở điều kiện tiíu chuđn (môi trường đệm axctat với pH = 4.7 vă

nhiệt độ 30°C)

- Độ hoat động (hoạt lực) cua Enzwm lă đại lượng biểu thị khả năng xúc tac chux ĩn hóa có chất của mỗi Enzym

- Nguyín tắc định lượng: Dựa trín khả năng thủy phđn tính bột tạo thănh

đường glucoza của En7zvrtmn Glucoamylaza Lượng glucoza tạo thănh được định

luong bing phuong phap Luft - School cđi tiến

b) Câc bước tiến hănh

* Thu ln:ym từ caHh trường Vĩ sinh vật

Thu Lnzvm tu cạnh trường nuôi cấi: bề mặt nấm mốc Axp avamori hoặc

Asp usant:

- Nghiĩn nho che phẩm Enzym

- Can Sx chĩ pham đê nghiín nhỏ rồi chuyín văo bình định mức 50 mI - Thím Š ml đụng dịch đệm axctat, định mức băng nước cất đến vạch

- Giữ hỗn hợp ở 30°C trong 30 phút

- Lọc lấy dịch chiết băng giay loc băng văng thu chế phẩm Enzym tính khiết, Thu EH>ym từ canh trường nuôi cấy chìm nâm men Endomycopsis:

Lay 10 ml canh trường nudi nam men Endomycopsis ly tam 6 van toc

5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút dĩ loại sinh khối nắm men

Trang 16

Phan dịch thu được có chữa Glucaamylaza ngoai bao cua Endomycopsis

* Kae dink heat luce Encvm

Thuy phan tinh bat bang chĩ pham Enzym thu duoc: - Cho vao binh tam giac 100ml:

+ 1 ml dich chiĩt Enzym

+ 2 ml dung dich dĩm avetat pH = 4.7 + 10 ml dung dich tinh bat 1%

- Đặt bình văo thiết bị òn nhiệt Thực hiện qua trình xúc tâc thủy phđn

tinh bột ở nhiệt độ 30C trong thời gian ( giờ,

- Định tính hoạt lực Amylaza: thừ phản ứng với lột sau 3 phat, 5 phút, 15 phút - Lay mau sau | gid va định luong duong khu

- Song song tiĩn hanh thi nghiĩm kiím chứng trong cũng điều kiện (đun sôi địch chiết để vô hoạt Enzym)

- Định lượng Glucoza tạo thanh bang phuong phap Luff— School cai tiền

* Tinh hoạt lực Enaym

Từ lượng Thiosunfat tiíu tôn trong phđn tích tính được lượng Glucoza tạo thănh vă hoạt độ E.nzvm Glucoam+ laza theo biểu thức:

wih) f 33

Hil dv Harp

trong đó: ae thĩ tich NasS:O; 0.1N chuan kiím chứng mỉ b: thĩ tich NasS-O; 0.1N chuẩn mẫu thuy phan, ml

3.3: dương lượng đường khử tính theo Na›Sa2› (Ì mì NasS5O› 0.IN~3 3 mg ghicoZq)

# hệ số pha loêng

m lượng Enzym xúc tâc phan ứng (tính trơng ứng với mău khí chuđn dường khi) gam

(;: thời tiun phan ứng, giờ

3/ Xac dinh hout lac Proteaza theo Ansan

Enzym Proteaza lă nhóm Enzym xúc tâc cho quâ trình phđn cât liín kết

peptit trong câc mạch peptt hoặc protein (polypeptiÐ nhờ phản ứng thuy phđn theo co chí:

Trang 17

HO

-CH C -N-CH- a -CH COOH + HsN-CH-

I | | Proteaza |

R ©O ff Rs R, Rạ

Proteaza thường được dùng trong san xuđt nuớc chấm trong quâ trình chế hiển câc sản phẩm từ sữa trong thuộc đa v học Trong công nghệ môi trường, câc ví sinh vật sinh tông họp Proteaza vă câc chế phảm Proteaza được su dung trong su lý hoặc hỗ trợ vu Iv phan giai câc chất thải răn, nước thải giău protein như chất thai từ thuộc đa chế hiến thủy san phế liệu hoặc phụ phảm nòng nghiệp giảu protein (Khô lạc khô đậu tương khô bông .)

Mot yo vỉ xiHÍt vật có kha năng tổng hop manh Proteaza

- Câc vi khuẩn:

+ Bacillus subtilis, Bac thermophilus, Buc, mesentericus ' Clotridium perfringens Clost, histoltiun

+ Pseudomonas acruginoca

- Cúc Nắm mốc:

+ dypergillus oryzae Asp funticatus, Asp flavus | Penicillium ganthinellum, Pen Chrysogenum.,

Proteaza từ vi sinh vật tồn tại đưới dạng: Profeaza axit tỉnh trung tỉnh vă kiểm tính,

a⁄ Định nghĩa vă nguyín tắc xâc định HẠP

Hoạt độ Proreaza (HđP) lă đại lượng đặc trưng cho khả năng xúc tâc phần giaf DrOf€IN tỏi pePLT vă axit amin cua cac Enzym

HđP được biểu thị băng số đến vị profeaZa có trong Í g (hoặc Iml) chế phẩm Hoạt độ riíng cua chế phảm đuộc biểu thị bằng số đơn vị proteaZa trín Ime protein cua chế phẩm

Dịnh nghĩa: T đồn vị hoạt độ proteaza lă lượng Enzym xúc tâc thủy phđn

protein thănh câc sản phẩm hoa tan trong TCA cho phản ứng tạo mău với thuốc

thừ Folin (tường đương với L tunol Tyrozin) trong Í phút ở điều kiện tiíu

chuđn (pH = §,§ vă nhiệt dd 30°C)

Nguyín tắc xâc định hoạt độ Proteaza theo Anson: Enzym Proteaza có

kha nang thus phan Protein (Ciclatin, Casein, Hemoglobin ) tao thanh axit

amin Luong axit amin tao chanh trong phan ứng thủy phđn được xâc định bằng phan ứng tạo mâu với thuốc thu Folin

Trang 18

Dựa văo thang chuđn của Tyrozin đẻ tỉnh lượng axit amin thu được nhờ phan ung thus phan

b⁄/ Câc bước tiễn hanh

1¿ Hoâ chất dụng cụ

+ Dung dich NasCO; 0.5M

+ Dung địch đệm vạn năng pH — §,.5 + Dung dich Gelatin 2%

+ Thuốc thư Folin

- Dung địch Tyrozin chuôn 10” (1 nmol/m])

+ TCA (Triclo — axetat) 0.3M

2/ Thu Enzym Proteaza tir chĩ pham Enzym thĩ

+ Cđn 3g chĩ pham thu được đê nghiền nhò rồi chuyín văo bình định

mức 50 ml

+ Thím 5 ml dung dich dĩm van nang 0.1M pH = 5,5 vă định mức đến vạch

+ ]Ac dĩu giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30°C trong 30 phút

+ l.ọc thu địch chiết Fnzym

3/ [hực hiện phan ứng xúc tâc thuy phđn Protein

+ Cho văo bình tam giâc 100 ml: 2 mí địch chiết Enzym 2 ml dung dịch

velatin 2%

+ Cho con từ văo bình phản ứng vă đặt văo thiết bị điều nhiệt có khuấy từ

+ Thực hiện phđn ứng xúc tâc thủy phđn ở nhiệt độ 30°C trong thời gian

LŨ phút

| Dĩ dinh chi phan ứng thím 4 ml TCA 0,3M để kết tủa protèn dư vă

câc san pham thủy phđn phđn từ lượng lớn

+ Tiếp tục-giữ hỗn hợp ở 30°C trong 20 phút,

+ Lọc thu dịch thủy phan

Song song tiền hănh thí nghiệm kiím chứng trong cùng điều kiện + Cho văo bình tam giâc 100 ml:

2 ml dich chiĩt Enzym

4 ml TCA 0.3M khuay dĩu trong 10 phút

Trang 19

4/ Dựng đường chuđn TVr0zin

Từ dung dịch Tyrozin chuđn (1 ;ưnol/ml) chuẩn bị dêy mẫu chuđn có hăm lượng Tyrozin từ 0 0,3 kmol theo bảng sau: ———- — — ——-———¬~-

Ông nghiệm |3 |4 5 | ó |7 186 Ó

¡_ Thế tích HCI 0.2N (ml) 4 49 48 1 46 | 44 42 | 40 | 35 |

¡ Chuđn bị một dêy ống nghiệm gồm 8 dng:

+ Lay 1ml cua mỗi nồng độ chuẩn vă lần lượt cho văo từng ống nghiệm, ~ Thím văo mỗi ống nghiệm: § ml dung địch NazCO; 0.5M

| ml thudc thir Folin, tắc đều

+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°C

+ Đo cường độ mău của hỗn hợp bằng mây so mău quang điện ở bước sóng Ă = 670 nm vĩi cuvet day | cm

+ Dựng đường chuẩn từ kết quả đo được với trục hoănh lă hăm lượng

Tyrozin vă trục tung lă mật độ quang

5/ Định lượng axit amin có trong mẫu thủy phđn vă tính hoạt độ Proteaza + Lấy ] m] sản phẩm thúy phđn (dịch lọc) cho văo ống nghiệm

+ Thím văo mỗi ông nghiệm: 5 ml đung dịch NasCO: 0.5M,

1 ml thuốc thư Folin lắc đều

+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°C

+ Ðo độ chiết quang bằng mây so mău quang điện ơ bước sóng Ă = 670nm Hoạt độ Proteaza (HđP) cua chế phẩm duoc tinh bang biĩu thúc:

HdP = Đ/, dv/g im trong đó:

HP: hoạt độ Protedza của chế phđm Enzym don vi/g

Trang 20

I2 ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO LUFF — SCHOOL CAI TIEN

1) Nguyín tắc

Phan ứng oxy hóa khử giữa Sunfat đồng II (CuSOx) vă đường khử (Glucoza Fruetoza) tạo thănh oxyt đồng Í (Cu2O) kết tùa mău đỏ Sunfat đồng dư được định lượng giân tiếp băng KI trong môi trường axit mạnh

2) Hoa chat

-Dung dich Fehling | - Dung dich Fehbling I

- Dung dịch: — tinh bĩt tan 1% KI: 30% H›SO.: 25%

~ Dung dịch Na;S›O; 0.IN

3) Cúc bước tiền hănh

- Lđy văo bình tam giâc 50ml: + | ml dung dich Fehting I

+ 1 ml dung dich Fehling II + 2 mÏ nước cất

+ ] ml dung dịch mẫu cần phđn tích

- Đậy binh tam giâc bằng phếu thuỷ tỉnh Đặt bình lín bếp đun sôi nhẹ

tronp 2 phút (tính từ khi xuất hiện bọt khí đđu tiín) Sau khi đun sôi, nhắc bình

ra khỏi bíp để nguội đín nhiệt độ phòng Dung dịch hỗn hợp vẫn còn mău

xanh đặc trưng của Sunphat đông vă xuđt hiện kĩt tha mău đỏ của oxyt đồng Ï (Cu›©) (níu mẫu có đường khủ)

- Thím văo hỗn hợp I ml dung dich H2SO,; 25%, | ml dung dich KI 30%; lắc đều vă giữ trong 2 phút, hỗn hợp sẽ có mău văng nđu

- Chuẩn iôt dư bang dung dich Thiosunfat chudn (Na7$203 0,1N) voi chi

thi hồ tỉnh bột 1%, sao cho hỗn hợp dung dịch chuyển từ mảu đen sang mău trăng sữa

- Lăm mẫu đối chứng: tương tự mẫu phđn tích nhưng thay văo Im] mẫu cđn phđn tích lă Iml nước cắt

Chú ý:

- Nếu sau khi đun, hỗn hợp dung dịch có mău đỏ, như vậy lă sunphat

đồng đê được sử dụng hết do lượng đường khử quâ lớn Muốn định lượng

Trang 21

- Nếu sau khi đun không thấy kết tủa oxyt đồng [ (Cu;O) mău đó thì cần

tăng lượng mẫu giảm lượng nước cải

4) Tinh ket qua

(ab) f.33

V"

.V= .1000 mg/I trong do:

X: dường khư, mgi

da: thí tích NasSsQOš U.TN chuẩn Điều trăng, mỉ

b: thí tích NaaS3Q; Ú,ÌN chuản mau phan tich, ml L; thẻ tích mău phản tích, nH

F: hệ xó pha loêng (Hẻu có)

3,3; đương lượng đường khư tính theo Na;Š›Öy

I3 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÂP LOWRY

Nitơ amin lă thảnh phần không thể thiểu được trong cấu trúc cua axit

amin, peptit vă protein

Nito amin co trong cac san pham có nguồn gốc từ động vật, thực vật vă vị sinh vật

Nitơ amin trong liín kết peptit lă thănh phần chậm chuyín hóa vă thường chiếm khoảng 16% protein thô

Nitơ amin có frong nước thai giau chat hữu CƠ CÓ nguồn gốc từ quâ trình

chế biến thịt câ, trừng sữa, san xuất câc loại mắm nước chấm, đồ hộp thịt câ, thuộc da nước thải lò mỏ nước thai chăn nuôi gia súc Trong phần giai vếm khi, nito amin được khư đề tạo thănh NH; từ đó hình thănh NH trong môi

trường long Trong phđn giải hiểu khí xử lý nìtơ amin đòi hỏi lượng oxy cho

quâ trình oxy hỏa rất lớn

Qua trinh phan giai nito amin lă quâ trình rat quan trọng trong vu Iv nude thai chat thai ran gidu axit amin va protein

I/ Neuyĩn tắc địnH lượng H7 GHÌH bằng phương phâp Lowry a Nguyen tặc

Hăm lượng nito amin ty lệ thuận với hăm lượng protein có trong mẫu phđn tích

Nitơ amin được định lượng giân tiếp qua phản Ứng tạo mău giữa pre?ein

vă thuốc thir Folin

Trang 22

Cưởng độ mău cua hồn hợp phan ứng được đo bằng mật độ quang ớ bước sóng 2 = 750 nm

Hăm lượng nito min được tính dựa văo đường chuan cua protein tinh

khiết với thuốc thir Folin

bh Hod chat

- Dung dịch protein chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml

- Dung dich A: dung dich Na;CO; 2% pha trong NaOH 0,1N

- Dung dịch B: dung dich CuSO, 0.5% pha trong Natrixitrat [34 hoặc hali-natritactrat 1%

- Dung dich C: Hĩn hop dung dịch A vă B theo ty lệ thí tích 50 : 1 (chỉ pha truọc khi dùng)

- Thuốc thư Folin

2/ Củúch tiễn hănh a Dime dione chinin

- Chuan bi day mau chuan (8 mau) voi nĩng dĩ tang dan tir 0 + 0.3 mg theo bang sau:

“Luong Protein ang) o | 603 | 003 | a1 | 015 | 02 | 025 | 03

thĩ vich dung dich Protein | ñ 0.3 0.5 | 1.5 2 2.5 3

, chuam Ð.]Ìmp Ứ (nD | ị

Hoan So lă |} “as | 3 | 25 | 2 | 15 DỊ |

- Thím văo mỗi ông nghiệm:

+ 2 ml dung dịch C, lắc đều thực hiện phân ứng trong L0 phút, t Sau 10 phút, thím 0.2 ml thuốc thir Folin, lắc đều đề yín 30 phút

- Ðo độ chiết quang băng mây so mău ở bước sóng 2= 750 nm

- Dung đồ thị chuẩn từ kết quả đo được:

+ Trục tung biểu thị mật độ quang (ABS) ~ [ruc hoanh biĩu thi luong Protein (mg)

Trang 23

b Xâc định lượng protein có trong mau cun phan tích

- Pha loêng mẫu phản tích sao cho hăm lượng protein trong khoảng 0.01 + 0,075 mg/ml

- Lay vao ống nghiệm 4 ml dung dịch mẫu cần phđn tích

- Thím văo ơng nghiệm:

+ 2 mÌ dung dịch C lắc đíu thực hiện phản ứng trong LŨ phút

+ Sau 10 phút, thím 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều để yín 30 phút

- Mau văng của hỗn hợp sẽ chuyín sang mău xanh da trời vă đạt cường độ mău cực đại sau 30 phút

- Đo độ chiết quang của hỗn hợp trín mây so mău ớ bước sóng Ă = 750 nm - Lượng Protein cua mẫu phđn tích được tra theo đường chuẩn

* Chụ ý Phan ứng xay ra ở nhiệt ôo phòng

c Tinh ham lương nito amin - Đụựng đường chuđn vă xâc định k B - Tính lượng nitơ amin trong mẫu đê phđn tích P N =——.j mưựmi on 6,25.a J 8 trong đó: P- lượng protein, mg £ hệ số pha lodng

a: thẻ tích mâu dùng trong phan tich (a = 4 mil)

6,25: hĩ so quy chuẩn nite amin theo Protein

1.4 BINH LUONG TONG NITO BANG PHƯƠNG PHÂP KJELDAHL

Nitơ tồn tại trong câc hợp chat him co dudi dang Nito amin (- NH) va

imin (- NH - ) duoe goi 14 nito hitu cơ Nitơ hữu cơ gồm nito trong axit amin, amin, amit imit cdc peptit va protein

Phương phâp Kjeldahi được sử dụng để xâc định N ở trạng thâi oxi hoâ - 3

Trang 24

I.4.1 Nguyín tắc định lượng vă câc yíu cđu

1⁄ Nguyín tắc: Trong môi trường axit dic (H2SO,) vă có mặt hỗn hợp

xúc tâc (K:SOx CuSO¡ Se) nito hữu cơ vă nitơ amoniac dược chuyền hod

thanh nita amon (NH, )

Giải phóng amoniac từ amonsunphat trong môi trường kiệm mạnh va hap

thụ bằng dung dịch axit boric

Lượng mon được định phđn bằng axit chuđn hoặc bằng phương phâp

trắc quang

2⁄ Lấy mẫu vă bảo quan

Mẫu cần được phđn tích căng sớm căng tốt Thời gian lưu mẫu tốt nhất không quâ một ngăy vă trânh đẻ mẫu hấp thụ aneoniac từ môi trường Có thí sử dung bình polyetylen hoặc bình thuy tỉnh dĩ đựng mẫu

Trong trường hợp khong thĩ phan tích ngay, cần axit hoâ mẫu bằng HạSO,

đặc tới pH = 2 vă bâo quđn ở 4”C,

3⁄ Những điều cần lưu ý

Nitrat (NOs): nĩng độ > 10 mg/l cd thĩ gay sai số đm do sy oxi hoa amoni trong quâ trinh pha mau tao thanh N3O va gay ton that nito amon Nitrat cũng có thí bị khư thănh amoni khi mẫu có chứa nhiều chất hữu cơ ở trạng thâi oAí hoâ thấp vă gđy sai số duong

Câc muỗi vò cơ cũng cỏ thí ảnh hướng tới kết quả do có thí ảnh hưởng

tới nhiệt độ cua quâ trình phâ mẫu, Quâ trỉnh amon hóa xảy ra hoăn toăn vă hiệu qua o nhiĩt dd 380°C

khi mẫu có ham lượng muỗi vă chat rin cao, nhiệt độ của dung địch hỗn

hợp có thí lín đến 400°C, gđy tôn thất nitơ Đề hạn chế ảnh hưởng năy cần bổ

sung HsSQO, dace voi tilĩ thĩng thudng khoang | ml/g mudi

I.4.2 Câc bước tiền hănh I/ Hod chat

Su dụng hoâ chất tỉnh khiết phđn tích vă nước cất không chứa amoni dĩ chuẩn bị thuốc thứ

- Dụng dịch H›SO¿ đậm đặc (98%, d = I,84 g/em”)

Trang 25

Dung dịch NaOH 40%: hoă tan 400 g NaOH phđn tích bằng nước cất không amon định mức tới 1 lit

- Chỉ thị Taxiro: trộn 100+nÍ dụng dịch metyl do (0.2 gam metyl do trong 100

ml cĩn 95") vai 50 ml dung dich metyl xanh (0.1 g metyl xanh trong S0 ml cản 959)

- Dung dich axit boric/chi thi: hoa tan 20 g axit boric H:BO): trong nước,

Thím 10 ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp rồi pha loêng thănh J li

- Dung địch HCI tiíu chuđn: 0.1 mol/l Chuẩn bị từ dung dich HCI

dac (d = 1.18 g/cm’) hoặc pha từ ông chuđn

- Dung địch HCI tiíu chuẩn 0.02 mol/I Pha loêng từ dung dịch chuẩn 0.! mol/l va dinh chudn bang phương phâp thông thường

Chuđn bị nước cất không amoni: có thí sử dụng ] trong 2 phương phâp sau: - Cho nước đê cất (2 lđn) chảy qua cột nhựa cationit axit mạnh vă chứa

nước thu được trong bình thuy tỉnh có nút nhâm Thím văo bình 10 g cationit cùng loại cho mỗi lít nước

- Phương phâp chưng cất: thím 0.10 + 0.01 m1 H;ạSO¿ đặc văo 1 lít nước cất vă cât lại trong mây hoăn toăn băng thuy tỉnh Bỏ §0 mÍ nước hứng đầu tiín

vă chứa nước văo bình thuỷ tính có nút nhâm Thím khoảng TÚ g cationit axit

mạnh cho mỗi lít nước thu được 2/ Câc bước tiễn hănh

Thể tích mẫu được lẫy theo hăm lượng nitơ:

Vô cơ hỏa mẫu phđn tích:

+ Lay thể tích mẫu thích hợp cho vao binh Kjeldahl, thím 10 ml axit

H›;SO¿ đặc, 5 g hỗn hợp xúc tâc

+ Thím văi hạt đâ bọt vă đun nhẹ cho nước bay hơi hết, khi đó thấy khói trăng bat dau xuật hiện,

! Khí hết khỏi trắng dung dịch trở nín trong suối Tiếp tục đun thím 60 phủt nữa

+ Sau khi võ cơ hoâ đí nguội mẫu đến nhiệt độ phòng

Trang 26

Thiết bị phâ mẫu (DK 6 DK8§S, DK20 ) trong hệ thiết bị phđn tích Nitơ tự động hoặc bân tự động VEI.P được trang bị hệ thống tâch vă hấp thụ khí ô nhiễm

- Chung cat va hap thụ NH::

Chuan bi binh hap thu: Lay 50 ml dung dich axit boric thím văi giọt chi

thị văo bình hứng của mây chưng cất Í ưu ý; đđu mút của ống dẫn ra từ sinh hăn phai nhúng ngập văo dụng dịch Trone bình hứng vây ra quâ trình phđn ly

cua H;BO; > HBO- + H-O

Chung cat va hap thụ NH::

+ Thím cần thận khoảng 250 mÌ nước cất văo bình đê vơ cơ hô cùng văi hạt đâ bọt lắp bình văo mây chưng cắt

+ Thĩm 3 giot chi thi phenoiphtalein

+ Thím 50 ml dung dich NaOH vao binh chung va khoa phĩu nhanh dĩ tranh NH; thoat ra ngoăi Chú ý; Sau khi thím NaOH dung dich trong binh phải có mău hồng (để đảm bảo dư xút)

| Chay nude lăm lạnh vă đun nóng bình cất

+ Dừng cất khi đê thu được khoảng 200 ml ở bình hứng Kiểm tra 1 vai giọt cuối cùng băng T - 2 giọt thuốc thư Nessler nếu vẫn có mâu văng thì quâ

trình cất chưa kết thúc

Khi cất dam NH; bi kiĩm day ra khoi (NH4)2SO4 sĩ phan tng voi HBO:

NH,OH + HBO: > Nifty + BOs + 10 - Dinh phan Nito:

| Chuan dĩ phan hime dược băng dung dịch chuđn HCI hoặc !ạSO, 0.02 N

cho đến khi đụng dịch chuyín từ mđu xanh lâ mạ sang mâu xanh tím

+ Có thể chuđn độ bằng dung địch HC1 0.1N đối với mẫu có nông độ nít0 cao BOy + H > HBO;

Bộ chưng cất vă chuẩn độ tự dĩng (UDK 126, UDK 132 UDK 142, .) có hệ thông chưng cất tự động an toăn vă độ tin cậy cao Hệ thống cĩ thĩ dĩ dăng kết nỗi với chuđn độ tự động vă cho kết quả trực tiếp Câc thông số cua quâ trình chưng cất vă chuđn độ tự động được căi đặt chương trình

Lap lai quâ trình đối với mẫu trắng trong đỏ mẫu thử được thay băng nước cât không chứa amoni

Trang 27

3⁄ Tỉnh kết quả

Nông độ nito K)eldàh /X mg/1) được tỉnh theo công thức:

V4: thĩ tich mau lay phan neh, ml

Ly: thẻ tích HCI tiíu chuẩn chăng đẻ chuản dĩ mau, nil: E?: thí tích HC tiíu chuẩn chóng đề chuẩn ch) nấu trang, mỉ: Cnr nong do axu HC) chudn dime dĩ chuan do, mol/l:

14.01: khoi heong neuven ne cua nite Lưu ý:

- Trong quả trình vò cơ hoâ câc khi độc như SOa, Ha§, HCN có thể sinh ra vì vậy cần tiễn hănh vô cơ hoâ mẫu tronp tủ hút hoặc phải lắp đặt bộ phận xu lý khi

- Bộ cất ni phai đam bao kín đí không gđy that thoat NH; trong qua trình chưng

- Phần cặn còn lại sau khi chưng chứa selen (tắt độc) cần thu gam va chứa vao bình riíng đề có biện phâp vụ lý thích hợp

1.5 ĐỊNH LƯỢNG TỎNG PHOTPHO BĂNG PHƯƠNG PHÂP TRÂC QUANG

I 5.1 Nguyín tắc yíu cầu lấy mẫu

1 Nguyín tặc

Định lượng tông Photpho hêng phương nhâp trắc quang dựa trín phản

ứng tạo phức antimonx photphomolipdat giữa octophotphat với molipdat va

anfimony trong mỗi trường axIt

Khu phire antimony photphomolipdat bằng axi ascobic thănh phức

molipden có mău xanh đậm Đo độ chiết quang của dung dịch sẽ xâc định được nồng độ ocfophorphat

Trước khi phđn tích toăn bộ photpho hữu cơ vă vô cơ trong mẫu được

chuyín về dạng octophorphat,

Trang 28

2⁄ Lấy mẫu vă bảo quản mẫu

- Dụng cụ chứa mẫu:

+ Tốt nhất lă chai thuy tỉnh đặc biệt khi hăm lượng photpho thấp nhất

thiết phải dùng chai thuy tinh,

+ Cĩ thí sử dụng chat PE, PVC

+ Chai chứa mẫu phải được rừa sạch bằng axit HC] 2M (nóng) sau đỏ trắng nhiều lđn băng nước cất Tuyệt đôi không sử dụng chđt tđy giặt chứa

photpho đí rưa chai đựng mẫu

- Xu ly va bao quan mẫu:

Loc mau:

- Mẫu dùng đí xâc định photphat hoả tan phải lọc ngay sau khi lắv mẫu

+ Măng lọc có cỡ lỗ 0.45 tưn được rưa băng 200 mÍ nước ẩm để loại bo

photphat trín giấy lọc,

+ Loc mau qua mang da xu ly bo 10 ml mau loc dau tiĩn va thy phan con lại văo lọ thuy tính sạch, khô

Bảo quản mẫu:

+ Mẫu được bảo quđn ở 4°C vă tốt nhất nín tiến hănh phđn tích trong

thời gian không quâ 4 giờ sau khi lẫy mẫu

+ Đối với mẫu xâc định tông P: thím 1 mI ÍICI đậm đặc/1 lít mẫu, bảo

quản lạnh trước khi phđn tịch

I.5.2 Hóa chất vă thiết bị

- H:SO, đặc (98% d— 1.81 g/em `)

- Chị thị phenolphthalein: hoa tan 0.5 g phenolphtalein trong 50 ml cĩn 95%, sau dĩ thĩm 50 mi nude cat

- Dung dich photphat gĩc 50.0 tự PO,” : hoa tan 219,5 mg KH¿PO¿ bằng

nước cất vă định mức tới I Lit

- Dung địch photphat chuẩn: pha loêng 50.0 ml dung dịch photphat pac thanh Lit băng nước cất | mÍ dụng địch năy chứa 2,50 ng P

- Tâc nhđn khư (E)

Trang 29

- Dung dich 11:80, 5 N (A}: Pha lodng 70 ml H-SO, dam đặc bang nước

cât vă dịnh mức tới S00 mỊ

- Dung dich Amoni molipdat 40 ø/l (H): hoă tan 20 ø (NH:}»Mo;O;¿.4H2O

vă dinh muc tdi 500 ml bang nude cat Bao quan dung dich trong chai sam mau - Dune dich Kali antimon tartrat 2.743 g/l (C): hoa tan 1.3715 g

K(SbOJC HO«.1/2H2O băng nước cất va dinh mirc thanh 500 ml Bao quan

dung dich trong chat sam mau

- Dung dich axit ascorbic 0.1 M (D): hoa tan 1.76 g axit ascorbic trong

100 ml nuĩe cat Dung dich nay dn dinh khoang | tudn o 4°C,

- Dụng dich hĩn hop (t:): on SO ml dung dich A, 15 ml dung dich B 5 ml dung dich C va 30 ml dung dịch D Dung dịch năy ôn định trong khoang 4 h

Lim Ý- Đề câc chng dịch trín đạt đến nhiệt độ phòng trước khi trộn Nếu

dụng cụịch hồn hợp đục, lắc đều vă đề vín văi phút đến khi trong trước khi dùng 2/ Thiết bị

- Quang pho kế

- Dụng cụ thuy tỉnh thông thường trong phòng thí nghiệm - Bếp phâ mẫu

Dụng cụ thuy tỉnh dùng cho phđn tích photpho cđn rửa băng dung dịch HỚI 2 Mi nóng sau đó trâng kỹ bảng nước cất Tuyệt đôi không sử dụng chất tđy rửa chứa photpho

3/ Chu ÿ

- Asenat phan ứng với molipdat tạo phức mău xanh giống như phức của photphat gđy sai số đương Ở nông độ Asen lă 0.1 mg/1 bắt đđu có ảnh hưởng

tới việc xâc định photphat

- Nông độ Fe`” > I5 ppm sẽ cân trở đến quâ trình khử tạo thănh mău xanh níu nôns độ lín đín 30 ppm thì mău xanh không xuđt hiện

- NÓ+ Cí”” gđy sai số đm: khoang 3% ở nồng độ ! mg/l vă giảm tới 15%

I.5.3 Câc bước tiín hănh

Lập dêy mẫu chuđn gồm it nhất 6 mẫu theo bảng chỉ dan Lay vao binh

định mức 50 ml lần lượt câc dung dịch theo chỉ dẫn ở bảng sau:

Trang 30

Để 10 phút ơ nhiệt độ phòng dung dịch sẽ có mău xanh đậm Đo mật độ quang của mẫu trăng vă mẫu ở bước sóng 2 — 880 nm

Dựng đường chuẩn quan hệ ølữa mật độ quang (ABS) vă lượng photpho (ug) trong mỗi bình

2⁄/ Tiến hănh phan ich

- Lay 100 ml mau da lac dĩu

- Thím | mf H2SO, dae va 5 m! HNO; dac Dun nhe mau toi thĩ tich khoang | ml, sau dĩ dun tiĩp dĩn khi mat mau dĩ dudi hĩt HNO3

- Lăm lạnh vă thím khoang 20 ml nude cat, | giot phenolphthalein, sau đó trung hoă băng NaOH |N dĩn mau hĩng nhat Dinh mire dĩn 100 ml, lọc bỏ

can (nĩu có)

- Hút thí tích mẫu văo bình định mức 50 ml sao cho nồng độ photpho nằm trong đường chuẩn (tôi đa lă 40 ml) thím 8 ml tâc nhđn khử E Định mức

bang nước cất tới vạch Đề yín 10 phút

- Do độ hấp thụ cua mẫu ở bước song 2 ~ 880 nm

- Song song tiền hănh với mẫu trắng trong đó phần mẫu thử được thay

bằng nước cất

Đôi với mẫu có độ đục vă độ mâu cao, cần hiệu chính bằng câch sử dụng

mẫu trăng thím tất câ câc tâc nhđn trừ (C) vă (Ð) Độ hap thu cua dung dich

nay phai duoc trir di trong phan tinh toân

3/ Tinh kĩt qua

Từ mật độ quang của mẫu vă mẫu trăng dựa văo đường chuẩn tính được lượng P ứng với thể tích dung dịch đê hút

Trang 31

ye , ne

}

trong đô:

Ă- hăm lương P có trong mâu phản tích, mg/l

mụ lương P cả trong bình tương ứng với thẻ tích đê hút g L2 thẻ tích mâu lấi trong phản tích mỈ

1.6 DINH LU'ONG LIPIT BANG SOXHLET

Lipit lă thuật ngữ chung đẻ chị dầu mỡ nguồn gốc động thực vật Về cấu trúc hóa học lipit lă este của axit bẻo no hoặc không no với rượu đơn hoặc đa chức

Câc axI bĩo nọ có công thức chúng CnHxO; như axit Palmitic C;¢6H320.,

axit Steric C¡sÍ 13C»: "` axit bĩo không no có công thức chung CaHsn,mO; (m lă số nối đôi trong liín kết) như axit Oleic €¿sH:O› (1 nối đôi) axit Linoleic

€CayH2O› (2 nối đôi), axit Linolĩnie CịgH:eO» (3 nội đội)

Rượu đơn chức, rượu mạch thăng phđn tư lượng lơn mạch vòng nhu Cholesterol Estradiol Testosterol vă đa chức như G]yxerin

Lipit tồn tại đưới hai dạng:

- Lipit đơn giản:

+ Cac Triglyxerit: Este cua Glyxerin vă 3 axit bĩo

+ Câc Sterit (sâp): liín kết este giữa rượn phđn từ lượng lớn với axit bĩo

+ Câc Steroit: liín kết giữa Sterol vă axit bĩo

~ Photpholipit: giữa Glyxerin với 2 axit bĩo vă photpho

- Lipit phire tap: gam Lipoprotein, Glycolipit

Photnholipit vă câc lipit phức tạp đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc

cua câc mô liín kết ö cơ thể động vật

Lipit không tan trong nuộc, chúng có phđn tử lượng rất lớn, đặc biệt lă

câc lpn phức tạp nín rất khó phđn huy, kí cả phđn húy hiểu khí nhờ câc vị

sinh vat co hoạt lực Lipaza

Dầu mỡ động thực vật có trong chất thải răn, nước thải sinh hoạt, một số

loại nước thai công nghiệp nhờ nước thai lò mô chế biến thủy hải sản, chế biến

thịt, sữa câc hạt có dấu

Việc nhđn tích vâc định hăm lượng lipit trong nước thải vă chất thai ran

có ý nghĩa quan trọng đẻ quyết định phương ân công nghệ trong tiền xử lý vă

trong quâ trình xư lý câc chất thải Phương phâp phô biín để định lượng dau

mở động thục vật lô phương phâp Soxhlet

Trang 32

1.6.1 Nguyín tắc

~- Dựa văo khả năng đễ tan của Lipit trong dung môi hữu cơ như etanol, benzen, metanol, elorofooc, toluen, diclometan, axeton, (Dung môi yíu cầu

có nhiệt độ sôi thấp, trọng lượng nhỏ)

- Lipit được định lượng trín cơ sở xâc định khói lượng mẫu phđn tích

trước vă sau khi chiết lipit bằng dung môi hữu cơ,

Một số vitamin vă tạp chất tan trong chất bĩo cũng được chiết cùng với

lipit nhưng trong đa số trường hợp lă không đâng kể

1.6.2 Hóa chất vă thiết bị

~ Dung môi hữu cơ: Etanol

~ Mây chiết Soxhlet

Hệ thống tự động Soxtherm (S 306 AK/S 306 A) được thể hiện trín hình

II.1 Hệ thống năy đơn giản vă tiết kiệm thời gian so với mây Soxhlet truyền thống (Hinh II.2)

Hình I.1 Hệ thống tự động Soxtherm

1 Van thâo dung mĩi 6 Vỏ bọc hình trụ có thẻ chịu âp

2 Cốc chiết bằng thủy tỉnh, 54x30 mm 7 Bình ngưng bằng thủy tỉnh

3 Ong chiết đựng mẫu, 33x80 mm 8 Kẹp hình trụ 4 Kẹp giữ cốc chiết 9 Cấp khi nĩn

5 Công tắc kiểm tra khí nẻn, thu hỗi dung môi 10 Công tắc kiím tra khí nĩn, nđng

Trang 33

1.6.3 Câc bước tiền hănh

- Chuđn bị cốc chiết Cốc chiết (2) được sđy ở 103°C trong tu say Sau đó được

lăm nguộ

đến nhiệt độ phòng trong binh hút đm vă cần trín cđn phđn tích (mi g)

- Câc bước tiền hănh: + Cđn khoảng Š

tích (m g) cho văo ĩr

chiết, Mẫu có thể

được lăm khỏ nếu cần thiết Da khoang 140 ml dung mai văo cốc chiết (2)

ống chiết văo cốc chiết vă thím

Đối với hệ thống Soxthcrm quâ trình

chiĩt được cải đặt bởi chương trình vă gồm

5 giai đoạn đí đđm băo mầu được chiết

hoản toản Quả trình năy được thực hiện tự

động hoản toăn vă đặc biệt higu qua dĩ

phđn tích chất bĩo vă phđn bê còn lại

Giai đoạn 1 f Giai đoạn2 ' Giai đoạn 3

Hinh 1.3 Qua tinh chiĩt nhứ hệ thông Soxtherm

Giai đoạn }: Mẫu được đặt ngập hoăn toăn trong dung môi đang sỏi vă

chất bĩo được tâch khỏi mẫu (hình II.3.a)

Dung môi bay hơi đi lín, được lăm lạnh ngưng tụ lại

Giai đoạn

chảy văo ông chiết Khi mức dung môi bắt dau thập hơn ông chiết đựng mẫu

Trang 34

Giai đoạn 3: Chất bĩo được chiết vă gom bởi dụng môi ngưng tụ (hình H1.3.c) Giải đoạn 4: Phần dụng môi thừa được chưng cất vă gom trong thùng chứa đí tâi sử dụng (hình II.3.đ)

Giải đoạn 5: Cốc chiết được tự động nđng khỏi bếp (hình II.3.€) Nước lăm lạnh vă bếp đun nóng được tất sau 5 giai đoạn

Sau khi kết thúc chương trinh cốc chiết được lăm khô ở 103°C đến khối

lượng không đôi (ít nhất | gid), gid trong bình hút đm, lăm nguội đến nhiệt độ

X === 100 (%)

X: Hăm lượng chât bĩo cỏ trong mâu phđn tích, % mị: khối lượng cóc khi chưa chiết lipk, g

Trang 35

PHAN If

VI SINH UNG DUNG TRONG CONG NGHE MỖI TRƯỜNG

11.1 PHAN LAP VĂ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẠT

(1.1.4 Mĩi trường dinh dưỡng

!⁄ Yíu cđu đâi với môi trường dinh đường

Môi trường dinh dưỡng lă hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự tồn tại vă phât triĩn cua vi sinh vật Đđy lă yíu tổ đầu tiín quan trọng thậm chí quyết định sự thănh công trong nghiín cứu về Vĩ sinh vat

Trong dinh đưỡng, câc loăi vị sinh vật đều cần một sô nguyín tô hóa học

cơ bản như C.N P vă một số nguyễn tổ khoâng khâc Tuy nhiín mỗi loăi vi

sinh vật có khả năng hấp thụ nhù cđu dính dưỡng cũng như cơ chế trao đồi

chất khâc nhau Vì vậy, không có môi trường dinh dưỡng năo lă vạn năng Tùy

mục đích thỉ nghiệm tùy chúng loại vi sinh vật mă cung cấp một môi trường cần thiết thích hợp đề chúng phât triển

Câc vi sinh vật tự dưỡng cacbon có khả năng sử dụng cacbon dưới dạng

vô cơ (CO; hoặc câc muỗi cacbonat) lăm nguồn Cacbon duy nhất Vì vậy,

chúng được gọi lă nhóm vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ Chúng gốm câc vi sinh

vật có sắc tố như tăo vi khuđn lưu huỳnh dồng hóa cacbon băng nêng lượng mặt trời (tụ dưỡng quang năng } Một số vì sinh vật khâc không có sắc tổ như

vi khuđn nitrùt, nữrat hóa thực hiện quâ trình đồng hóa cacbon nhở năng lượng

hóa năng tù câc quâ trình oxy hỏa

Khâc với câc vi sinh vật tự đưỡng, câc vì sinh vật dị dưỡng cacbon cần

môi trường chứa câc hợp chất caehon dưới dạng câc chất hữu cơ như axit hữu

cơ rượu hydratcacbon hoặc hydrocacbua

Tuy nhiín, câc môi trường dinh dưỡng đều phải đâp ứng được những víu cđu sau:

Trang 36

- Cung cấp đđy đu chất định dưỡng cho ví sinh vật, trong đó chủ yếu lă

nguồn C N P câc nguyín tỏ khoang đa lượng (Ca K Na, S, Mg ) vă vi lượng (Mo Co Zn Cu ) câc chất kich thích sinh trưởng (axit amin,

vitamin ) trong trường hợp cần thiết,

- Môi trường dinh dưỡng cđn có pH thích hợp (câc loại nắm ưa môi trường

axit nhẹ vì khuđn ưa kiềm hoặc trung tính tăo ưa môi trường kiềm ) Có thí điều

chính pH của mồi trường bang axit (HCI, H2SQa, .), kiĩm (NaOH, KOH ) hoặc câc muỗi có phan ứng kiểm như bicacbonat (NaHCO?) hoặc cacbonat (Na;CO;), Khi khử trùng pH cua môi trường có thí thay đổi Vì vậy, cần kiểm tra lại pH của

môi trường sau khi khử trùng vă điều chỉnh lại khi cần thiết

- Môi trường cần có đệ ẫm độ nhớt vă âp suất thđm thấu thích hợp

- Môi trường phải đăm bảo tuyệt đối vô trùng Phương phâp khử trùng

thông dụng đói với câc loại môi trường định dưỡng lă dùng hơi nước bêo hòa ö nhiệt độ cao vă âp suất lớn hơn âp suất của khí quyín bằng câch sử dụng nỗi bâp âp lục (xem phản câc thiết bị)

Trang 37

€ hú Y-

Thời gian vă nhiệt độ khư trùng phụ thuộc văo thănh phản môi trường Câc chất hữu có dễ bị biến tính do nhiệt như ax(t amin, vitamin câc loại đường khư dịch chiết nắm men sữa cần được khư trùng ở 0.5 atm Câc chất

kích thích sinh trưởng như avít amin, vitamin nín được khư trùng riíng a

chế độ thích họp vă bỏ sung văo môi trường sau khi đê khử trùng

- Khí môi trường có phản ứng kiềm hoặc axit khí khư trùng sẽ xuất hiện kết tủa câc sản phẩm caramen hóa vă bị biến tỉnh trở nín không hoặc khó hấp

thụ đối với ví sinh vật Đề trảnh hiện tượng nđy, môi trường để nuôi cđy vi

Sinh vật ưa axit hoặc kiềm nẻn khử trùng ở pH trung tính, sau đó kiếm hỏa hoặc axit hóa môi trường bằng dung địch tương ứng đê vô trùng

- Sau khủ trùng, môi trường được bảo quản ở nhiệt độ 0 — 5°C,

- Truce Khi sur dung cần kiím tra độ tình khiết của môi trường bằng câch để

trong tủ âm ở nhiệt độ 30 32%C trong 24 siờ, nếu thấy môi trường vđn đục có vâng hoặc xuđt hiện khuđn lạc lạ thì cđn loại bỏ

2/ Phĩn logi moi trường

Vĩ sinh vật lă nhóm sinh vật gồm nhiều chúng loại vò cùng đa dạng,

phong phú Mỗi loăi thậm chí mỗi chúng lại có nhu cầu dinh đưỡng rđt khâc

nhau, Vị vậy môi trường đề nuôi cảy giữ giống vă nghiín cứu chúng cũng rất

đa dạng vă khâc biệt

Có thể phđn biết câc loại môi trường theo nhiều câch khâc nhau: 4) Phản loại thes thanh phan:

Căn cứ văo nguôn nguyín liệu đề chẻ tạo môi trường người ta phần biệt: Môi trường tự nhiín đuộc chế tạo từ nguyín liệu tự nhiín có nguồn gốc

động thực vật (canh thang thịt nước ĩp khoai tđy carot, nước rnalt nước chiết đđt nước suối khoang ) Môi trường tự nhiín có thănh nhđn không xâc định thường đuợc sư dụng nuôi cấy, gift giống vă phđn lập vi sinh vật

Môi trường tự nhiín thường có một số thanh phần đễ bị biến tính: axit amir vitamin đường khư , Vì vậy, cần khử trùng ở chế độ thích hop

Ví dụ:

+ Mỗi trường canh thang thit - pepton: | atm trong 20 — 30 phút:

+ Moi truong malt: 0.5 atm trong 30 - 30 phút:

x Mỗi trường dịch chiết nắm men: 0.5 atm trong 20 30 phút; † Môi trường nước ĩp carolt, khoai tđy: 1 atm trong 30 phut

Trang 38

- Mói trường tòng họp: được pha chế từ hóa chât thănh phần môi trường

được xâc định cụ thí

Nguyín liệu chứa CN ÐP vă câc khoảng khâc được hòa tan trong nước mây vă khi không cần thiết thì không cần bô sung thím câc nguyín tô ví lượng

- A467 trưởng bân tổng hợp lă loại trung pian giữa 2 loại trín Míi

trường ban tông hợp được chế từ hóa chất (câc loại đường muối chứa nito photpho ) vă câc nguyín liệu tự nhiín chưa biết chính xâc thănh phần như

dịch chiết nắm men dịch thuy phản casein cao ngô chúng được bỏ sung chú

yếu lăm nguồn bô suns vỉ lượng vitamin arinoaxit vă câc chất kích thích sinh trưởng khâc

b) Phđn loại theo mục địch sự dụng môi trường dinh dưỡng gồm

-_ Âöi trường cơ so (đa năng): thích hợp cho nhiều loại vì sinh vật như môi

trường thạch mạch nha thạch thịt pepton, môi trường Shacpec

Mới nướng riíng biệt chỉ thích hợp cho một loăi nhất định không chứa chất ức chế hoặc kim hăm câc vì sinh vật phât triển Tỉnh riẻng biệt thường đuộc đâp ứng qua thănh phđn dinh dưỡng đặc thù (nguồn cacbon nitơ độ nH hoặc câc chất bỏ sung khâc)

-_ Mi trường phản lấp vă Huyễn chọn: chỉ thịch hợp cho mội loăi nhất định đóng thời ức chế sự phât triển của câc loăi khâc như những chất có độc

tinh ma chi vi sinh vat nav chia được,

Ví dụ: Môi trường Endo có chúa Fuchsin kiểm vă Natrisunphit ức chế

mạnh câc vị khuẩn Gram (1) Như vậy có thẻ tâch được câc ví khuẩn

Gram (-) như E coli Shatmonella

- Modi trường xâc dịnh vă chđn đoân: Môi trường được bô sung một số hóa

chđt ch: thị đặc thủ cho phĩp phât hiện một câch khâ chính xâc đặc điểm

cua một loăi năo đó nh phản ứng của môi trường như sự đổi mđu sự tạo thănh câc chất khi đặc trưng Một số chất chỉ thị điển hình như đó trung tinh (5 ppm) da phenol (50 ppm)

- Moi trvong chu thi: duge su dung trong phan lập định tín trong nghiín cứu tính

chât sinh lý sinh hỏa đi truyền vă phđn loại vi sinh vật

cy Phan loai theo tinh chat lý học

Trang 39

- Mi trường (địch thể: tă môi trường dung dịch đướt dạng lỏng: nguyín liệu được hòa tan trọng nHớc

Môi trường dịch thẻ được sư dụng để nghiín cứu đặc tính sinh lý sinh hóa, đặc tính nuòi cấy, quả trình trao đôi chất của vì sinh vật

- Môi trường đặc: lă môi trường lông được bộ sung thím câc tâc nhđn đông đặc ở nhiệt độ cao như thach (agar agar) gelatin

Môi trường đặc được dùng đề phđn lập định lượng xac định đặc tính

nuôi cđy giữ giống vi sinh vật

+ Thạch (agar agar) được sản xuất từ tăo biín thuộc họ Hồng tảo (chu yếu lă Gelidium) Bân chất hóa học của agar lă Polysaccarit được tạo thănh chu yĩu tir D- galactoza vă 3.6-anhvdrogalactoza Hđu hết câc vi sinh vật không cỏ khả nđng phản giải Agar đồng đặc ở nhiệt độ 40 - 43°C vă được sử dụng ở nỏng độ 2-3%

Agar có phản ứng trung tỉnh vă không lăm thay đổi pH của môi trường Đâng chú ý lă agar hín trong môi trường trung tính axit nhẹ kiềm nhẹ Tuy

nhiín ở môi trường axit pH < Ấ.5 agar sẽ bị phđn hủy một phần trong quâ trình khư trùng ở nhiệt độ cao dẫn đến khă năng tạo gel kĩm Mỗi trường sẽ bị nhêo

sau nhiều lần thanh trùng

Đề trânh hiện tượng năy, khi cần nuôi cay vi sinh vat trín môi trường có tinh axit agar can duoc khủ trùng riíng sau đó bố sung văo môi trường đê

được khử trùng

+ Gelatin (có bản chất lă protein) được san xuất từ đa động vật, Gelatin

nóng chay ở nhiệt độ 23 - 26°C, thấp hơn so voi nhiệt độ nuôi cđy câc ví sinh

vật ưa âm Mặt khâc gelatin con dĩ bi thay phan boi Enzym Proteaza Vi vay, gelatin được sử dụng chủ yếu để phât hiện hoạt lực Proteaza của vì sình vat

Gelatin thường được bồ sunp với nồng độ 10 — 15%, pH = 6.8 — 7,0 Môi trường có chứa Gelatin được khử trùng ở 0.5 atm trong 15 phút - Mĩi trường rấn: lă môi trường bân tổng hợp được chế từ một số nguyín

liệu tự nhiín như câm, trđu, bột ngô bột xenllulo khô lạc khô bông có thẻ bố

sung thím nguồn nitơ photpho va khoảng khâc bằng hóa chất khi cần thiết

Môi trường tắn được sử dụng trong phỏng thí nghiệm, trong công nghiệp

đề nuôi cấy vi sinh vat thu chế pham sinh hoc

3⁄/ Một số môi trường thông dung được sử dụng trong công nghệ môi trường

d) Câch chế mội số nghiện hiệu đề pha chế mới trường dinh dưỡng

Canh thang thịt: Dùng nuồi cđy câc vì khuẩn đị dưỡng,

Trang 40

500 g thịt thăn bò tưới nghiền nhỏ thím văo 1 lít nước giữ ở nhiệt độ

50°C trong thời gian I giờ khuấy thường xuyín sau đó đun sôi trong 3 - 5 phút lọc qua giấy lọc vă định mực đến ! lít

Dịch chiết nắm men

Dịch chiết nằm men được sư dụng nuôi cấy nhiều nhóm ví sinh vật khâc nhau đặc biết môi trường nuôi cđy câc loại nấm có nguồn nitợ lă địch chiết nắm men sẽ hạn chế đâng kĩ kha nang bi ahiĩm khuẩn

Nguyín liệu để thu dịch chiết co thĩ lă nắm men bia dưới dạng men lòng, men ĩp hoặc nđm men khô

Lấy 100 ø năm men khơ (hay 200 ¢ nam men bânh, 400 8 nắm men bía

tươi) trộn văo Í ljt nước đun sơi để nguội đến 60%C Điều chỉnh pH đến 4.5 -

4.7 băng axit sunphuric (ElsSO, IN), Thím văo 2 — 3 giọt Clorofooc gìữ hỗn hop o nhiĩt do 48 50°C trong 48 gid Sau đỏ đun sôi, lọc lay dich chiĩt, phan

phói văo bình vă khư trừng ở nhiệt độ LI5°C trong 15 phút Dịch ehiết giău axit

amin va peptit: có thể cô đặc thănh cao nắm rnen hoặc sấy khô thănh bột Có thí kiểm tra bằng cam quan: nước chiết có mău vă mùi đặc trưng như

nưoc mắm từ câ,

Nước chiết malt

Căn 250 g đại mạch nảy mầm đê nghiền nhỏ trộn văo | lit nước vă đun nóng đến 45 š0°C vă duy trì trong Khoảng | gid

Dĩ trânh vón cục bỗn hợp được khuđy liín tục, sau đó nang nhiệt độ lín

SS 58°€ vă giữ đến khi đường hóa hoăn toăn (mất mâu với iot) Lọc qua giđy

lọc thu được dịch chiết malt

\Đjch chiết được sử dụng lăm môi trường mạch nha trong nuôi cđy giữ

giếng va phđn lập hđu hết câc loại năm đặc biệt lă năm men Kiểm tra nồng đệ

đường bằng ty trọng kế Balling (B) hoặc hăm lượng chất khô bằng khúc xạ kế

cam tav

Nong đệ đường trong nước nha thường đạt i6 - 18°B Hăm lượng chất khô có thể đạt 18 — 20%,

khử trùng nước nha ở 0.5 atm trong 20 - 30 phút trước khí băo quản

hy) Mot so midi trong thong dung

Môi trường canh thang thịt: dùng phđn lập nhiều loăi vi khuđn + Pepton: l0

~NaCh 5 g (khuấy cho tan hết)

Điều chnhpH: 74 76