Nuôi cấy phôi dừa dứa ( Cocos nucifera L.)

nghiên cứu: Nuôi cấy phôi dừa dứa (Coscos nucifera L.) được thực hiện tại phòng thí nghiệm Cấy mô, Bộ môn Sinh Lý Sinh Hoá, khoa nông nghiệp và sinh học ứng dụng, Trường Đại Học Cần Thơ nhằm mục tiêu xác định môi trường thích hợp cho sự nhân giống cây dừa Dứa thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi. Các thí nghiệm bao gồm các nội dung xác định môi trường và điều kiện thích hợp nuôi cấy phôi dừa Dứa; bước đầu thuần dưỡng cây con nhà lưới; đồng thời xác định môi trường thích hợp cho sự tạo mô sẹo từ mầm chồi của phôi. Kết quả cho thấy: (1) Môi trường dinh dưỡng Y3 (Eeuwens, 1976) dược đặt cả trong điều kiện tối và ngoài sáng đều cho tỷ lệ nảy mầm của phôi dừa Dứa tối ưu 100% phôi nảy mầm. Chồi ra rễ và phát triển tốt 60 ngày nuôi cấy; (2) Cây dừa Dứa in vitro sau 4.5 tháng có từ 23 lá khi chuyển ra thuần dưỡng ở nhà lưới có tỷ lệ sống tương đối cao, khoảng 85.71% sau 2 tháng. Cây con phát triển xanh tốt, khoẻ mạnh

MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH TỪ VIẾT TẮC GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân bố 1.2 Đặc tính thực vật 1.2.1 Rễ 1.2.2 Thân 1.2.3 Lá 1.2.4 hoa 1.2.5 Trái 1.3 Giống dừa 1.3.1 Nhóm giống dừa cao 1.3.2 Nhóm dừa lùn 1.3.3 Nhóm dừa lai 1.4 Sinh thái 1.5 Đặc tính dừa Dứa 1.6 Nhân giống dừa 1.7 Nuôi cấy in vitro dừa số họ Ảecaceace 1.7.1 Nuôi cấy phôi dừa 1.7.2 Tạo phôi vô tính dừa số họ Arecaceace 1.8 Hiện tượng hoá nâu mẫu cấy 1.8.1 Nguyên nhân tượng hoá nâu 1.8.2 Ngăn chặn hoá nâu CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện 2.1.1 Vật liệu 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 2.1.3 Hoá chất 2.1.4 Địa điểm thời gian thí nghiệm 2.1.5 Điều kiện thí nghiệm 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm 2.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên phát triển phôi Thí nghiệm 2: Hiệu 2,4-D BA lên tạo mô sẹo từ mầm chồi phôi 2.2.3 Xử lý số liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên phát triển phôi 3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu 2,4-D BA lên tạo mô sẹo từ mầm chồi phôi CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.4 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ CHƯƠNG DANH SÁCH BẢNG STT Tựa bảng Trang Bảng 2.1 Các nồng độ 2,4-D BA nghiệm thức (NT) Bảng 3.1 Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ nảy mầm phôi (%) 30 ngày sau cấy Bảng 3.2 Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ rễ phôi (%) 30 60 ngày sau cấy Bảng 3.3 Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên chiều cao chồi (cm) 30 60 ngày sau cấy Bảng 3.4 Ảnh hưởng 2,4-D BA lên tỷ lệ mẫu hoá nâu mẫu cấy (%) 30 ngày sau cấy Bảng 3.5 Hiệu 2,4-D BA lên tỷ lệ tạo mô sẹo từ mầm chồi (%) 60 ngày sau cấy DANH SÁCH HÌNH STT TỰA HÌNH Trang Hình 2.1 Cây dừa Dứa trồng Trại Nghiên cứu Thực Nghiệm Nông nghiêp Hình 2.2 Vị trí phôi trái dừa Dứa Hình 2.3 Vị trí mầm chồi cắt để nuôi cấy Hình 3.1 Phôi tách nuôi cấy môi trường đặc (a) môi trường lỏng (b) Hình 3.2 Phôi môi trường Y3 điều kiện sáng (a), điều kiện lỏng lắc (b), điều kiện tối (c) 15 ngày sau cấy Hình 3.3 Mẫu cấy mầm chồi bị chết hoá nâu Hình 3.4 Mầm chồi tạo mô sẹo môi trường Y3 bổ sung mg/l 2,4-D 0.5 mg/l BA 60 ngày sau cấy Hình 4.1 Quy trình nuôi cấy phôi dừa dứa TỪ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BA Benzyl adenine MS Murashige Skoog (1962) NSKC Ngày sau cấy NT Nghiệm thức Y3 Eeuwent (1976) GIỚI THIỆU Dừa (cosos nucifera L.) lấy dầu quan trọng giới với tổng diện tích khoảng 11.5 triệu trồng 86 quốc gia, chủ yếu khu vực Châu Á Thái Bình Dương chiếm khoãng 86% (Perseley,1992) Cây dừa cung cấp nguồn thực phẩm (chủ yếu chất béo), nguyên liệu cho công nghiệp chế biến hàng tiêu dùng xuất Cây dừa xem sống (tree of lief) Sản phẩm từ dừa đa dạng phong phú Từ sản phẩm nước dừa, cơm dừa, dầu, sợi gỗ khai thác, dừa đóng vai trò quan trọng lĩnh vực công nghiệp thương mại Trong dừa dứa giống dừa quý nhập nội từ Thái Lan thời gian gần Dừa dứa có mùi thơm nếp Bắc pha với mùi dứa, loại thức uống nhiều du khách nước ưa thích, bên cạnh cơm dừa tương đối dày, có hàm lượng dầu tương đối cao có giá trị ngành công nghệ chế biến thực phẩm Hiện nay, giống dừa Dứa nhân giống trồng phổ biến số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt Bến Tre Trà Vinh, không mang lại giá trị cao ngành công nghiệp thực phẩm mà có giá trị lĩnh vực du lịch Tuy nhiên, giống trồng nhập nội nên giá thành cao mà nguồn gốc chắn có phải Dừa Dứa hay không khó khăn xác định, bên cạnh phương pháp nhân giống thông thường từ trái nhiều thời gian gặp trở ngại lớn tỉ lệ nảy mầm dừa Dứa tự nhiên thấp Sự cứu phôi hây nuôi cấy phôi kỹ thuật nhằm giúp cho nảy mầm phôi áp dụng dừa Makapuno giống dừa đột biến có giá trị kinh tế với cơm dừa dày, đặc sệt sáp phôi giống dừa nảy mầm điều kiện tự nhiên Kỹ thuật ngày ứng dụng phổ biến philippine (Batugal Engelmann, 1998; Rillo, 1999) Bên cạnh đó, phương pháp nuôi cấy tạo phôi vô tính nhằm tạo số lượng lớn giống đồng có đặc tính giống với mẹ nghiên cứu Chính đề tài “Nuôi cấy phôi dừa dứa (Coscos nucifera L.)” thực nhằm mục tiêu xác định môi trường thích hợp cho nhân giống dừa Dứa thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân bố Cây dừa có tên khoa học Coscos nucifera L., giống Coscos có loài, thuộc họ Arecaeae, họ phụ Cocoideae Dừa có nguồn gốc từ vùng Indo—Malaysia (Chan Elevitch, 2006) Dừa trồng nhiều Ấn Độ, Philippine, Sri Laka, Mã Lai, Indonesia, Trung Mỹ, quần đảo Cuba, Puerto Rico, quần đảo Nam Thái Bình Dương… Thảm thực vật đảo bờ biển vùng Nam Thái Bình Dương chủ yếu dừa (Apacible, 1986) Được phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới, có khoãng 90% dừa tìm thấy giới hạn vĩ độ 20o Bắc 20o Nam Sự phân bố rộng rãi phán tán từ vùng sang vùng khác tác nhân: người biển Trái dừa nước mưa đưa biển trôi nỗi xa hàng nghìn dặm, đến chúng bị giữ lại bờ cát định cư (Ohler,1999; Woodroof 1979) Dưới ánh nắng mặt trời vùng nhiệt đới, dừa mọc mầm bắt đầu sống mới, mà dừa tìm thấy khắp bờ biển vùng Thêm vào đó, trình giao lưu buôn bán trao đổi hàng hoá, người vận chuyển dừa canh tác nhiều vùng khác giới 1.2 Đặt tính thực vật Dừa có số lượng nhiễm sắc thể 2n= 32, phân loài đơn từ diệp, hiển hoa bí tử, thân gỗ Dừa có đỉnh sinh trưởng cây, không may đỉnh sinh trưởng bị hại làm chết toàn Dừa sống lâu từ 50- 120 năm, trung bình 70 năm (Ohler, 1999) 1.2.1 Rễ Dừa có rễ bất định sinh liên tục phần đáy gốc thân, rễ cọc, chúng mọc dài ngang 5-7 m sâu 0.3- 1.2 m (Perley, 1992; Reynold, 1988), lúc mọc có màu trắng sau chuyển dần sang màu đỏ nâu Cá biệt rễ mọc dài 30 m mọc sâu đến 5.5 m tìm thấy (Ohler, 1984) Rễ bất định không lớn theo bề ngang thiếu thượng tầng Rễ lông hút mà có rễ nhỏ rễ dinh dưỡng Những rễ nhỏ hình thành rễ hoạt động rễ hô hấp, rễ trao đổi khí giúp cho dừa chụi gập nước 1.2.2 Thân Trong giai đoạn đầu trồng chiều dài lóng thân dừa ngắn chậm phát triển, đến chiều ngang thân phát triển đầy đủ thân bắt đầu cao lên, tiến trình kéo dài năm tuỳ thuộc vào giống (Ohler, 1984) Dừa mọc cao đến 35m, không nhánh, thân cột to, chắc, khẻo mang nhiều sẹo quấn quanh trọn thân Thân dừa thượng tầng (tầng phát sinh gỗ), bị cắt hay tổn thương không phục hồi lành vết thương mô mới, đường kính thân không lớn thêm theo thời gian 1.2.3 Lá Lá dừa (tàu lá) to gồm bẹ ôm trọn thân, mọc theo hình xoắn ốc Bẹ cách bẹ 1400, diệp tự 2/5 nghĩa vòng xoắn ốc vị trí, thứ thứ chẳng hạn (Tôn Thất Trình, 19974) Bẹ gồm phần cứng yếm dừa xơ đan chéo Tàu dừa có sóng mang hai hàng phụ hai bên, dạng hình lông chim dài từ 4.5- m, rộng từ 0.5- 0.8 m, nặng 10- 15 kg Lá phụ nhỏ hẹp, dài khoảng mét, có k khoảng 200 lá, mọc không đối xứng hai bên sóng thường chênh 4-5 Lá phụ có gân nhiều gân phụ song hành, mặt có màu xanh láng mặt Cây dừa lúc nhỏ có tàu nguyên , sau tàu có phụ tách ra, đến khoảng 45 năm hoàn toàn có tàu lông chim (Nguyễn Bảo Vệ et al., 2005) 1.2.4 Hoa Dừa có phát hoa sau trồng từ 3- năm (nhóm dừa cao từ 5-8 năm nhóm dừa lùn từ 3-4 năm) Phát hoa to, trổ quanh năm nách lá, nách có phát hoa, lúc đầu phát hoa bắc dày gọi mo dừa (thật có mo, mo nhỏ ngoài, mo lớn trong) Phát hoa có nhiều nhánh, dài từ 0.6 -1.2 m, mang hoa Hoa dừa thuộc đơn tính đồng chu, nghĩa hoa đực hoa riêng nhánh phát hoa, hoa đực chóp nhánh hoa gần đáy nhánh, thường nhánh hoa có hoa Mỗi phát hoa có khoảng 8.000 hoa đực, chiếm gần hết phát hoa, với 1- 30 hoa (Ohler, 1984; Ohler, 1999; Woodroof, 1979) Sự thụ phấn chéo xảy dừa cao, dừa lùn hoa nhận phấn trước hoa đực chấm dứt, hoa thụ phấn phát hoa Thụ phấn chéo tạo nhiều lai, lai giống dừa lùn dừa cao tạo ưu lai Sức sống hạt phấn mạnh dừa cao dừa lai, giống dừa lùn bán lùn (Ohler, 1999) 1.2.5 Trái Trái dừa phân loại hạch sợi, phát triển từ noãn có tâm bì có “mắt”, bì chứa tiểu noãn Thông thường có tiểu noãn không phát triển thụ phấn, “mắt’ có mắt chứa mầm tiểu noãn phát triển (Ohler, 1984) Mắt dừa có chứa mầm mềm, mắt lại mầm bị cứng hoá gỗ Mầm nhỏ nằm cơm dừa có tử diệp (mộng dừa) phù to mọc để tiêu hoá phôi phôi nhũ (Phạm Hoàng Hộ, 1968) Phôi nhũ đặc biệt, gồm phần lỏng bên phần đặc (cơm dừa) bao bọc Trái dừa lớn chứa 0.6 lít nước, 30 g đường (Fuctose sucrose) g kali (Ohler,1999) Mỗi quầy dừa trung bình có từ 1-20 trái, thông thường 6-7 trái dừa cao 10 trái dừa lùn, trái có trọng lượng vài kilogram Một dừa cho 100 trái năm Trái thường già vòng 12 tháng sau thu phấn có dạng tròn hay oval có mảnh dấu tích tâm bì Ngoại bì chuyển từ màu xanh sang nâu trái trưởng thành Mô trung bì thể sợi Nội bì gáo dừa cứng có mảnh, phần tiếp giáp với cuống trái thấy rõ có “mắt” Vỏ khô lúc với nước ruột trái 1.3 Giống dừa Theo Nguyễn Bảo Vệ et at (2005), giống dừa trồng thường xác nhận dựa màu sắc, hình dạng, kích thước trái dặc tính lùn Bởi tự nhiên dừa có dặc tính lai tap cao, tạo nhiều loại khác màu sắc, kích thước chất lượng trái vùng khác Hầu hết giống dừa biết đến với tên địa phương nơi mà canh tác Nhiều giống mà tên gọi địa phương khác Tuy nhiên, phân biệt theo nhóm dừa, chúng xác định khác biệt ghi nhận dừa hình thái dừa cao (C Nucifera typica) dừa lùn (C nucifera nana) Ngoài dừa lai dừa cao dừa lùn 1.3.1 Nhóm dừa cao Gọi dừa cao có thân to cao, cao 20 m Giống dừa cao chiếm hầu hết quần thể dừa giới trồng với mục đích hàng hoá cho copra thuộc loại tối ưu, khô dầu cơm dừa phơi khô dùng để ép lấy dầu Dừa cao cho nhiều dừa lùn (khoãng 40 lá/cây), kích thước trái từ trung bình đến lớn Cây có gốc phình to, dễ nhiễm bệnh chết vàng bệnh Cadang cadang Đặc tính giống dừa cao là: Tốc độ sinh trưởng chậm trái muộn (6-10 năm sau trồng) Thụ phấn chéo với tỷ lệ cao nên dễ bị lai Chống chụi tốt điều kiện khắc nghiệt môi trường (chụi mặn chụi hạn giỏi) Sống lâu lên đến 80-120 năm Copra, dầu, sợi có chất lượng cao Trái già sau 12 tháng kể từ thụ phấn 1.3.2 Nhóm dừa lùn Gọi dừa lùn thấp Dừa lùn biến dị từ dừa cao, canh tác rộng rãi cho khô dầu có chất lượng dừa cao, thường không trồng với quy mô lớn Dừa lùn có chiều cao từ 7.5- 9m trổ hoa cao khoảng 1m Dừa có gốc không phình to, có ưu điểm cho nhiều trái kháng bệnh chết vàng Đặc tính nhóm dừa lùn Tốc độ sinh trưởng nhanh cho trái sớm (4-5 năm sau trồng) Giống lai có trái sau năm trồng Phần lớn tự thụ phấn Chống chụi điều kiện môi trường đòi hỏi đất tốt khí hậu thích hợp đạt suất cao Có đời sống ngắn, khoảng 30 năm Thường trồng để uống nước dừa tươi Màu sắc trái thay đổi: vàng, đỏ, xanh, vàng cam… 1.3.3 Nhóm dừa lai Trên giới có nhiều chương trình lai tạo hay chọn lọn dừa lai tự nhiên để có giống dừa chô trái sớm, suất cao, phẩm chất khô dầu tốt kháng bệnh chết vàng Tóm lại, dừa lai có nhiều ưu điểm dừa cao hay dừa lùn, phải thâm canh tốt phát huy tiềm 1.4 Sinh thái Theo Purseglove (1972), đặc điểm cấu trức sinh lý, dừa phát triển tốt bờ biển vùng đất duyên hải phẳng Cấu trúc rễ giúp chui đựng mặn Dừa yêu cầu khí hậu ôn hoà với độ ẩm cao điều thường gần với bờ biển Cây cần thoát nước tốt, đất thoáng khí đầy đủ Nhiệt độ trung bình thích hợp từ 27 – 32OC Lượng mưa phân bố 1.270 – 2550 mm năm Ẩm độ cao, ánh sáng nhẹ, không chụi bóng râm Dừa trồng nhiều vùng đất: đất cát duyên hải, đất phù sa, đất vùng núi lửa, đất laterit, than bùn, đất, sét… với cung cấp đầy đủ tháo nước thoáng khí Chụi khoảng pH rộng tư 5- Yêu cầu cung cấp đầy đủ muối kali 1.5 Đặc tính dừa Dứa Theo viện nghiên cứu dầu có dầu (2008), dừa Dứa thuộc nhóm dừa lùn Đặc điểm bật giống dừa Dứa không nước dừa mà thành phần khác dừa Trái ương tháng bắt đầu mọc mầm Đây thời điểm chọn trái mọc mầm đem vườn ươm Thời gian vườn ươm lâu mau tuỳ thuộc vào phát triển Nguyên tắc bắt đầu có hình lông chim bứng đem trồng, thường khoảng 5-7 tháng cho nhóm dừa cao 3-4 tháng cho nhóm dừa lùn, không nên để lâu vườn ươm 1.7 Nuôi cấy in vitro dừa số họ Arecaceace 1.7.1 Nuôi cấy phôi dừa Sự cứu phôi hay nuôi cấy phôi kỹ thuật báo cáo lần De Guzman Del Rosario (1964) giúp cho nảy mầm phôi dừa Makapuno phôi nảy mầm biến đổi sinh hoá nội nhũ trái Kỹ thuật ngày ứng dụng phổ biến Philippine (Batugal Engelmam, 1998; Rillo, 1999) Tuy nhiên, hiệu quy trình bị giới hạn, đặc biệt tỷ lệ sống sót điều kiện ex vitro Theo báo cáo tình trạng nuôi cấy phôi dừa kỹ thuật dưỡng trường đại học Philipne Los Banxos (Batugal Engelmam,1998), trái thu hoạch để tách phôi cấy thường giai đoạn 9-11 tháng tuổi dừa Makapuno Phôi nuôi cấy môi trường Y3 cho tỉ lệ nảy mầm 86% sau 4-6 tuần Quy trình nuôi cấy phôi dừa Philippine Coconut Authority (PCA) (Batugal Engelmann, 1998) Thu thập phôi đồng: Dùng ống khoang lấy phôi nhũ chứa phôi, để vào keo lọ Mẫu khữ trùng sơ cách rữa nước máy rữa nhanh với ethanol 95% để loại bỏ lớp dầu Sau khử trùng với chất tẩy thương mại 100% (Zỗn ) 20 phút Trong điều kiện vô trùng, phôi sau tách khử trùng lại với chất tẩy 10% phút rửa nước cất vô trùng 3-5 lần Phôi nuôi cấy môi trường dinh dưỡng Eeuwens (1976), ký hiệu Y3 Phôi hình thành rễ chồi sau 6- tuần Thời gian chuyển điều kiện ex vitro sớm tháng Cây chuyển từ phòng thí nghiệm xuống nhà lưới tuần để giúp cứng Sau lấy ra, rữa agar khử trùng thuốc diệt nấm Trồng vào giá thể cát sông (river sand) khử trùng Cây trùm bao plastic 5-7 ngày để giữ ẩm độ Sau mở bao plastic phần để quen dần với điều kiện nhà lưới, giữ tuần Tuần thứ 3, mở bao plastic hoàn toàn Tưới nước dặn cung cấp dinh dưỡng pha loãng phát triển Sau tháng chuyển sang chậu lớn với giá thể đất Sau 3-5 tháng, chuyển cánh đống sau có 4-6 Ở Bangladesh, phôi hợp tử bốn giống dừa BARI Narikel 1, BARI Nairkel 2, Srilanka Tall Malaysian Dwarf nuôi cấy môi trường dinh dưỡng Y3 Tỷ lệ nẩy mầm phôi tương ứng 93, 96, 89 40% Hầu phôi tạo rễ chồi lúc tỷ lệ sống 60% (Molla et at., 2004) 1.7.2 Tạo phôi vô tính dừa số họ Arecaceae Việc kích thích tạo mô sẹo từ nhiều nguồn mẫu cấy khác rễ (Fulford et all, 1981), (Pannetier Buffard- Morel, 1982b), phát hoa(Eeuwens, 1976, Blake Eeuwens, 1981)… nghiên cứu Những nghiên cứu tạo phôi vô tính nuôi cấy dừa đạt từ nhiều mẫu cấy khác non, rễ, phôi, phát hoa non với nhiều mức độ thành công khác Những năm đầu thập niên 90, mô sẹo thu từ tất mô phôi vô tính tái sinh phôi đạt từ mẫu non (Karunaratne periyapperuma, 1989) phát hoa non (Branton Blake, 1986) Những nghiên cứu cho thấy tạo phôi vô tính tái sinh đạt từ mẫu cấy mầm chồi (plumule) cho kết cao mẫu cấy khác (Hornung, 1995; Chan et al., 1998) Theo Duval et al (1993), có phát sinh quan (callogenesis) hai loại mẫu cấy khác phát hoa non dừa trưởng thành (20- 25 năm tuổi) thuộc giống dừa yellow Dwarf giống lai Malayan Yellow Dwarf x West African Tall Mẫu nuôi cấy môi trường đa vi lượng theo Eeuwens (1976), vitamin theo Morel Wetmore, sucrose 40g/l, than hoạt tính 2-3 g/l, agar 7.5 g/l, bổ sung 2,4-D (30-80 mg/l) điều kiện tối 270C Cảm ứng tạo phôi cách tăng nồng độ 2,4- D Sự trưởng thành phôi vô tính có giảm dần nồng độ 2,4-D Chồi phát điều kiện sáng, môi trường có than hoạt tính chất điều hoà sinh trưởng Sự tạo rễ yêu cầu môi trường có NAA Phôi hữu tính trưởng thành cọ dầu Elaeis guineensis Jacq var tenera tách cấy môi trường Eeuwens (1976) chứa mg/l 2,4 –D Những mẫu phôi tạo mô sẹo tuần Mộ sẹo cấy môi trường Murashige Skoog (1962, MS) bổ sung 0.5 mg/l 2,4-D để tạo phôi Hai môi trường nuôi cấy thành công để biệt hoá phôi tái sinh MS-CAP bổ sung 0.05% than hoạt tính, chứa 2,4-D môi trường MS-CAP bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D 2.5 mg/l BA (Kanchanapoon Domyoas, 1999) 1.8 Hiện tượng hoá nâu mẫu cấy 1.8.1 Nguyên nhân tượng hoá nâu Mẫu cấy vài loài thực vật hoá nâu đen sau vài ngày kể từ bắt đầu nuôi cấy Khi bị hoá nâu tăng sinh mẫu bị ức chế để lâu ngày mẫu chết (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002) Sự hoá nâu hoạt động enzyme oxy hoá có chứa đồng (catechol oxidase), thường gọi polypphenol oxidase, phenolase tyrosinase (monophenol) oxidase ) phóng thích, tổng hợp, hay diện với điều kiện oxy hoá chất thích hợp mô bị tổn thương hay lão hoá (George, 1996) 1.8.2 Ngăn chặn hoá nâu Theo George (1996), có nhiều biện pháp ngăn cản hoá nâu làm giảm tổn thương mẫu cấy, loại bỏ hợp chất phenol sản sinh phenol không tối ưu, giảm trình oxy hoá khử mô, giảm hoạt động phenolase chất sẵn có hay thay đổi thành phần môi trường chất điều hoà sinh trưởng sử dụng Hoạt động enzyme liên quan đến tổng hợp oxy hoá phenol tăng cường ánh sáng (Creasy, 1968) Theo Durand-Cresswell et all., 1985), dịch trích Eucalytus cho thấy hàm lượng hợp chất phenol cao hơn, đặc biệt flavonoid trích điều kiện sáng so với điều kiện tối Vì biện pháp khắc phục giữ mẫu cấy điều kiện tối vài tuần Bên cạnh đó, mẫu cấy có khả bị hoá nâu rửa dung dịch chất chống oxy hoá hay ngâm dung dịch chất chống oxy hoá sau kh cắt Những chất sử dụng accorbic acid (0.1%), hỗn hợp ascorbic acid citric acid Sự hoá đen xuất mẫu cấy họ dừa vấn đề phổ biến khắc phục cách thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy hay chuyển mẫu thường xuyên giai đoạn nuôi cấy Những phương pháp ngăn cản hoá nâu khác dường hiệu (Tisserat, 1979) Một vài ví dụ ngăn cản hoá nâu họ Palmae cách thêm than hoạt tính nồng độ từ 0.45- 3g/l báo cáo trà (Tisserat, 1979; Reynolds Murashige, 1979), dừa (Fisher Tsai, 1978)… Theo George (!996), hoá nâu thường có liên quan đến việc sử dụng 2,4 –D, đặt biệt thêm môi trường với nồng độ cao Theo Giri et al.(1993), mô sẹo Aconitum heterophyllum tiết phenol môi trường có bổ sung mg/l NAA mg/l BAP hoá nâu không vấn đề đáng ngại Sự hoá nâu xảy mẫu cấy phát hoa dừa sử dụng 2,4-D nồng độ từ 100- 500 µM (Ebert Taylor, 1990) CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện 2.1.1 Vật liệu Trái dừa dứa giai đoạn 9-10 tháng tuổi thu từ trồng trại nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp, khoa nông nghiệp sinh học ứng dụng, trường đại học Cần Thơ (Hình 2.1) Hình 2.1: Cây dừa Dứa trồng Trại Nghiên Cứu Thực nghiệm Nông Nghiệp 2.1.2 Thiết bị dụng cụ Tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng (autoclave), microwave, bếp điện, máy đo pH, cân phân tích, máy khuấy từ, tủ sấy cao độ… Micropipette, beaker, ống đông, đũa thuỷ tinh, chai lọ, kẹp cấy, ống khoan, dao mổ, găng tay, giấy cấy, gòn, dao lam,… 2.1.3 Hoá chất Khoáng đa vi lượng vitamin Chất điều hoà sinh trưởng: 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Benzyl adenine (BA) Đường sucrose, agar, than hoạt tính, nước dừa Hoá chất khử trùng: cồn 70O, clorox Hoá chất khác: HCl 0.1 N, NaOH 0.1 N… 2.4.1 Địa điểm thời gian thí nghiệm Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô nhà lưới, Bộ môn sinh lý hoá, khoa Nông Nghiệp Sinh học ứng dụng, trường đại học Cần Thơ Thời gian thực hiện: từ tháng 06 năm 2008 đến tháng năm 2010 2.1.5 Điều kiện thí nghiệm Phòng cấy mô có trang bị: Máy điều hoà nhiệt độ (26 ± 20C) Cường độ ánh sáng: 1.500 lux Quang kỳ 16 giờ/ngày 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm Chuẩn bị môi trường Môi trường sau pha chế xong điều chỉnh pH 5.8, sau nấu cho tan agar rót vào ống nghiệm (20 ml/ống) keo có đường kính cm cao 12 cm (30 ml/keo) Môi trường khử trùng nồi hấp khử trùng 121Oc, áp suất atm 20 phút Thành phần môi trường Môi trường nuôi cấy môi trường đa vi lượng vitamin theo Eeuwens (1976), kí hiệu Y3 Bổ sung thành phần: đường (45g/l), agar (8g/l) Tuỳ theo thí nghiệm có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật, nước dừa, than hoạt tính (2.5g/l) Khử trùng mẫu cấy Trái dừa dứa tách bỏ lớp vỏ sợi Rửa bề mặt trái vòi nước máy Lau cồn bề mặt trái điều kiện vô trùng tách làm đôi Dùng ống khoan vô trùng khoan lấy khối phôi nhũ chứa phôi cho nước cất vô trùng (hình 2.2) Ngâm mẫu dung dịch Clorox: Nước tỷ lệ 1:2 15 phút Tách lấy phôi đặt vào môi trường nuôi cấy chứa ống nghiệm Hình 2.2: Vị trí phôi trái dừa Dứa 2.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên phát triển phôi Mục tiêu: Xác định môi trường điều kiện thích hợp cho nảy mầm phát triển phôi dừa dứa Phương pháp: Phôi dừa giai đoạn 9-10 tháng tuổi sau phân lập điều kiện vô trùng theo bước mô tả cấy vào loại môi trường khác để đánh giá sức sống sinh trưởng phôi Môi trường nuôi cấy Y3 (Eeuwens, 1976) môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung agar (8g/l) than hoạt tính (2.5g/l) Tuỳ theo nghiệm thức có bổ sung thêm nước dừa (100 ml/l), môi trường lỏng bổ sung than hoạt tính Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên nhân tố, có nghiệm thức với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại ống nghiệm chưa phôi Các nghiệm thức: 1/ Y3+ agar + than hoạt tính 2/ Y3 + agar + than (đặt tối) 3/ Y3 + agar + than + nước dừa 100 ml/l 4/ MS + agar + than + nước dừa 100 ml/l 5/ Y3 lỏng lắc Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian phôi nảy mầm Tỷ lệ % phôi nảy mầm Tỷ lệ % phôi tạo rễ Chiều cao chồi (cm): chiều cao chồi đo từ gốc đến vị trí cao Thời gian ghi nhận tiêu: 15, 30 60 ngày sau cấy Thí nghiệm 2: Hiệu 2,4-D BA lên tạo mô sẹo từ mầm chồi phôi Mục tiêu: Xác định môi trường thích hợp cho phát sinh mô sẹo từ mầm chồi Phương pháp: Phôi nảy mầm môi trường Y3 đặc, điều kiện tối 60 NSKC cắt thành lát mỏng ngang khoảng 0.2-0.3 cm Vị trí cắt từ phần thân lên đến đỉnh chồi (Hình 2.4) Mẫu cấy vào môi trường Y3 có nồng độ 2,4-D BA khác để kích thích biến đổi sẹo Hình 2.3: Vị trí mầm chồi cắt để nuôi cấy Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên thừa số hai nhân tố, có nghiệm thức với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại keo chứa mẫu Bảng 2.1: Các nồng độ 2,4-D BA nghiệm thức (NT) Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) 0.55 NT NT NT NT NT NT NT NT Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ % mẫu hoá nâu Thời gian mẫu tạo mô sẹo Tỷ lệ % mẫu tạo mô sẹo 2.2.3 Xử lý số liệu Số liệu xử lý chương trình Microsoft Excel phần mềm thống kê MSTATC, kiểm định LSD mức ý nghĩa 5% Các số liệu tỷ lệ phần trăm biến động từ 0- 100% chuyển sang dạng Arcsine √x theo công thức bảng tính Excel: Giá trị chuyển đổi arsin(sqrt(x)/10)*180/3,1416; giá trị 0% chuyển đổi công thức 1/4n, 100% chuyển đổi công thức 100-1/4n; với x giá trị phần trăm cần chuyển đổi (%); n mẫu dựa để tính trăm (Gomez Gomez, 1984) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên phát triển phôi Sự phát triển mẫu cấy phụ thuộc lớn vào trình xử lý mẫu thao tác khử trùng mẫu Có mẫu vô trùng hoàn toàn bước đầu thành công nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiệu việc khử trùng bề mặt phụ thuộc vào nhiều yếu tố nguồn mẫu, loại lượng hoá chất khử trùng thời gian khử trùng bề mặt mẫu Phôi dừa giai đoạn bao quanh cơm dừa phôi chưa lộ không khí nên phương pháp khử trùng bề mặt đơn giản với dung dịch Clorox đạt hiệu mẫu vô trùng cao Kết mẫu vô trùng theo phương pháp nêu đạt tỷ lệ phôi sống 100% (Hình 3.1) a b Hình 3.1: Phôi tách nuôi cấy môi trường đặt (a) môi trường lỏng (b) Tỷ lệ nảy mầm phôi Sau 15 ngày nuôi cấy, phôi chuyển sang màu xanh, bắt đầu phát triển có gia tăng kích thước tất nghiệm thức đặt sáng Phôi điều kiện tối có phát triển tổng hợp diệp lục tố nên có màu trắng (Hình 3.2) a b c Hình 3.2: Phôi môi trường Y3 điều kiện sáng (a), điều kiện lỏng lắc (b), điều kiện tối (c) 15 ngày nuôi cấy Kết bảng 3.1 cho thấy, đến 30 ngày sau cấy, phôi phát triển chồi rễ nghiệm thức môi trường đặc (có agar), nghiệm thức môi trường Y3 lỏng, phôi tăng kích thước không phát triển chồi.Tỷ lệ nảy mầm phôi khác biệt có ý nghĩa 1% nghiệm thức Tỷ lệ nảy mầm cao đạt 100% môi trường Y3 đặt điều kiện sáng tối Môi trường Y3 hay môi trường MS có bổ sung nước dừa 100 ml/l cho tỷ lệ nảy mầm phôi thấp (tương ứng 50% 25%) Môi trường Y3 điều kiện lỏng lắc phôi tăng kích thước không nảy mầm Theo dõi đến 60 ngày sau cấy, gia tăng tỷ lệ nảy mầm nghiệm thức Bảng 3.1: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ nảy mầm phôi (%) 30 ngày sau cấy Tỷ lệ nảy mầm Nghiệm thức Y3 + agar + than Y3 + agar + than (đặt tối) Y3 + agar + nước dừa 100ml/l MS + agar + than + nước dừa 100ml/l Y3 lỏng lắc F CV (%) 100 a 100 a 50 ab 25 b 0b ** 61.82 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD mức ý nghĩa 5%, (**): Khác biệt mức ý nghĩa 1% Tỷ lệ rễ Kết bảng 3.2 cho thấy, 30 NSKC, phôi có hình thành rễ cao môi trường Y3 đặt điều kiện tối sáng tương tự với tỷ lệ 50% Môi trường Y3 môi trường MS có bổ sung 100ml/l nước dừa thời điểm chưa thấy có phát triển rễ Bảng 3.2: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ rễ phôi (%) 30 60 ngày sau cấy Nghiệm thức Y3 + agar + than Y3 + agar + than (trong tối) Y3 + agar + than + nước dừa (100 ml/l) MS + agar + than + nước dừa (100 ml/l) Y3 lỏng lắc Tỷ lệ rễ (%) 30 NSKC 50 50 60 NSKC 100 100 50 0 - - Đến thời điểm 60 NSKC, có gia tăng tỷ lệ tạo rễ nghiệm thức Chồi môi trường Y3 đặt điều kiện tối sáng cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất, đạt 100% Môi trường Y3 bổ sung 100 ml/l nước dừa cho tỷ lệ tạo rễ chồi thấp, đạt 50% Chồi môi trường MS có bổ sung 100 ml/l nước dừa thời điểm hình thành rễ Bảng 3.3: Hiệu môi trường điều kiện nuôi cấy lên chiều cao chồi (cm) 30 60 ngày sau cấy Chiều cao chồi (cm) Nghiệm thức 30 NSKC Y3 + agar + than Y3 + agar + than (đặt tối) Y3 + agar + than + nước dừa 100 ml/l MS + agar + than + nước dừa 100 ml/l Y3 lỏng lắc 0.53 0.95 0.25 0.2 - 60 NSKC 1.45 2.03 0.4 0.3 - Đến 60 ngày sau cấy, có gia tăng cao chồi nghiệm thức Chiều cao chồi cao đạt môi trường Y3 đặt điều kiện tối, trung bình khoảng cm Chồi phát triển điều kiện có màu trắng Môi trường Y3 sáng cho kết chiều cao chồi cao với khoảng 1.45 cm cao nghiệm thức có bổ sung nước dừa môi trường Y3 môi trường MS Qua kết đạt cho thấy môi trường Y3 bổ sung nước dừa, đặt điều kiện tối sáng cho tỷ lệ nảy mầm dừa Dứa tối ưu với 100% phôi ddeeuff nảy mầm Chiều cao chồi đạt kết cao tỷ lệ tạo rễ 100% 60 NSKC Môi trường Y3 có bổ sung 100 ml/l nước dừa cho thấy hiệu lên nảy mầm sinh trưởng chồi phát triển rễ thấp môi trường Y3 đối trứng Môi trường MS có bổ sung 100 ml/l nước dừa cho thấy tỉ lệ nảy mầm phôi thấp, khoảng 25% hình thành rễ Theo viện nghiên cứu dầu có dầu (2008) tỷ lệ nảy mầm trái dừa Dứa khác biệt tuỳ theo nhóm giống tỷ lệ nảy mầm trái tỷ lệ thuận với kích thước trái nhóm giống Nhóm giống có trái nhỏ tỷ lệ nảy mầm thấp Bên cạnh đó, bên trái dừa phôi bắt đầu nảy mầm, tử diệp phát triển hút chất dinh dưỡng từ nước cơm (phôi nhũ) để nuôi Nhờ nước dừa cơm dừa nên phát triển thời gian dài sau nảy mầm không cần dưỡng chất từ môi trường bên Vì nảy mầm phôi ảnh hưởng thành phần chất có nước dừa trái Trong thí nghiệm, nước dừa sử dụng nước dừa tươi giống dừa Ta nước dừa Dứa Kết việc bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy cho thấy không hiệu cho nảy mầm phôi dừa Dứa, chí gây cản trở cho phát triển phôi hình thành rễ so với môi trường đối chứng không bổ sung nước dừa Môi trường Y3 điều kiện lỏng lắc cho thấy không hiệu cho nảy mầm phôi dừa Dứa Khi cấy vào môi trường này, phôi ngâm hoàn toàn môi trường, đặc điều kiện lắc để tăng cường trao đổi khí không cung cấp đủ oxy cho hô hấp nên gây ức chế nảy mầm phôi dừa Dứa Môi trường dinh dưỡng Y3 môi trường có hiệu chuyên biệt sử dụng nuôi cấy dừa phát Eeuwens vào năm 1976 (Oropeza et al., 1999) Phôi dừa Dứa nuôi cấy môi trường cho tỷ lệ nảy mầm cao đạt đến 100%, đặt điều kiện tối sáng Cây nảy mầm môi trường Y3 điều kiện sáng phát triển xanh tốt, thích hợp cho việc chuẩn bị dưỡng điều nhà lưới Theo Molla et al (2004), tỷ lệ nảy mầm phôi hợp tử bốn giống dừa BARI Nairkel 1, BARI Narkel 2, Srilanka Tall Malaysian Dwart Bangladesh đạt cao tuỳ theo giống nuôi cấy môi trường dinh dưỡng Y3 Tỷ lệ nảy mầm phôi tương ứng 93, 96, 89, 40% Hầu phôi tạo rễ chồi lúc Kết thí nghiệm cho thấy môi trường dinh dưỡng Y3 điều kiện tối sáng cho tỷ lệ nảy mầm phôi dừa Dứa tối ưu với 100% phôi nảy mầm Chồi rễ phát triển tốt sau 60 ngày nuôi cấy (Hình 3.2) 2.2 Thí nghiệm 3: Hiệu 2,4 – D BA lên tạo mô sẹo từ mầm chồi phôi Mầm chồi non phôi dừa nảy mầm điều kiện tối cắt thành lát có kích thước khoảng 0.2- 0.3 cm nuôi cấy môi trường Y3 bổ sung nồng độ 2,4- D BA khác để kích thích hình thành mô sẹo Trong thí nghiệm này, tượng hoá nâu mẫu cấy (browing) trở ngại lớn cho kết thí nghiệm Mầm chồi sau cắt nuôi cấy dần trở nên đen chết với tỷ lệ cao (Hình 3.2) Tuy nhiên thí nghiệm thu kết khả quan mẫu cấy mầm chồi phôi dừa Dứa có hình thành mô sẹo, tỷ lệ chưa cao Hình 3.3: Mẫu cấy mầm chồi bị chết hoá nâu Kết trình bày bảng 3.4 cho thấy, tượng hoá nâu xuất tất nghiệm thức với tỷ lệ cao Mẫu bị hoá nâu cao tất nghiệm thức có bổ sung 2,4D nồng độ từ 1-8 mg/l kết hợp với mg/l BA, 100% mẫu cấy bị nâu chết, khác biệt có ý nghĩa mức 5% so với nghiệm thức kết hợp với BA nồng độ thấp 0.5 mg/l Trên môi trường này, tỷ lệ mẫu hoá nâu trung bình 87.5% Ở nghiệm thức bổ sung 2,4-D, nồng độ 2,4-D cao mg/l cho thấy tỉ lệ hoá nâu mẫu cấy cao với 100% Tuy nhiên kết khác biệt ý nghĩa thống kê nghiệm thức nồng độ từ 2,4-D 1-8 mg/l Tương tác nghiệm thức 2,4-D BA khác biệt ý nghĩa thống kê Bảng 3.4: Ảnh hưởng 2,4-D BA lên tỷ lệ hoá nâu mẫu cấy (%) 30 ngày sau cấy Nồng độ 2,4-D (mg/l) Trung bình Nồng độ BA (mg/l) 0.5 1.0 85.71 100.000 85.71 100.000 78.75 100.000 100.00 100.000 87.50 b Trung bình 92.86 92.86 89.29 100.00 100.000 a FNAA FBA FNAA x FBA Ns * Ns CV (%) 20.77 Ghi chú:Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD mức ý nghĩa 5%, (ns): Khác biệt ý nghĩa thống kê, (*): Khác biệt mức ý nghĩa 5% Theo Tisserat (1979) hoá đen xuất mẫu cấy họ dừa vấn đề phổ biến khắc phục cách thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy Bên cạnh tiến hành kết hợp đặt mẫu cấy điều kiện tối Tuy nhiên, chưa hạn chế tình trạng hoá nâu mẫu cấy Theo George (1996), chất điều hoà sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lên hoá nâu mẫu cấy, đặc biệt 2,4-D thêm vào môi trường với nồng độ cao Trong thí nghiệm này, nồng độ 2,4-D sử dụng tương đối cao từ 1-8 mg/l kết hợp với BA nồng độ 0.5 mg/l nên có nguyên nhân gây mẫu cấy với tỷ lệ cao Kết trình bày bảng 3.5 cho thấy, thời điểm 60 NSKC, mẫu cấy mầm chồi môi trường Y3 bổ sung mg/l 2,4-D kết hợp với 0.5 mg/l BA có hình thành mô sẹo nhiên với tỷ thấp, khoảng 7.14% Mô sẹo có màu trắng , có dạng rời có nguồn gốc từ mẫu mầm chồi (Hình 3.4) Các nghiệm thức khác mẫu hoàn toàn tạo mô sẹo Bảng 3.5: Hiệu 2,4-D BA lên tỷ lệ tạo mô sẹo từ mầm chồi (%) 60 ngày sau cấy Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) 0.5 7.14 0 0 0 Hình 3.4: Mầm chồi tạo sẹo môi trường Y3 bổ sung mg/l 2,4-D 0.5 mg/l BA 60 ngày sau cấy 2.4-D có hiệu tạo mô sẹo từ nhiều loại mẫu cấy khác số loài thuộc họ dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy theo báo cáo Eshraghi et al (2005), Kanchanapoon Domyoas (1999), Duvat et al (1993) Tuy kết cảm ứng tạo mô sẹo đạt thí nghiệm thấp bước đầu mỡ hướng có triển vọng việc nhân giống dừa Dứa thông qua đường tạo phôi vô tính Từ mô sẹo hình thành biến đổi tạo phôi vô tính tái sinh chồi Theo Hornung (1995), Chan et al (1998), nghiên cứu cho thấy tạo phôi vô tính tái sinh đạt từ mẫu cấy mầm chồi (plumule) cho kết cao mẫu cấy khác Qua kết thí nghiệm cho thấy tạo mô sẹo từ mầm chồi phôi dừa Dứa môi trường 7.14% 60 NSKC CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Môi trường dinh dưỡng Y3 điều kiện tối sáng cho tỷ lệ nảy mầm phôi dừa Dứa tối ưu với 100% phôi nảy mầm Chồi rễ phát triển tốt sau 60 ngày nuôi cấy Mẫu cấy mầm chồi tạo mô sẹo môi trường Y3 bổ sung mg/l 2,4-D 0.5 mg/l BA với tỷ lệ 7,14% 60 NSKC 4.2 Đề nghị Ứng dụng quy trình nuôi cấy phôi dừa Dứa trình bày hình 4.1 để nhân giống từ phôi hợp tử Tiếp tục nghiên cứu môi trường thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo tái sinh chồi với tỷ lệ cao từ mẫu cấy mầm chồi nhằm nầng cao hệ số nhân giống Tiếp tục đánh giá sinh trưởng phát triển trồng điều kiện tự nhiên [...]... đem trồng, thường thì khoảng 5-7 tháng cho nhóm dừa cao và 3-4 tháng cho nhóm dừa lùn, không nên để cây con lâu ở vườn ươm 1.7 Nuôi cấy in vitro dừa và một số cây họ Arecaceace 1.7.1 Nuôi cấy phôi dừa Sự cứu phôi hay nuôi cấy phôi là kỹ thuật đã được báo cáo lần đầu tiên bởi De Guzman và Del Rosario (1 964) giúp cho sự nảy mầm của phôi dừa Makapuno vì phôi không thể nảy mầm do những biến đổi sinh hoá... tỷ lệ phôi sống và sạch 100% (Hình 3.1) a b Hình 3.1: Phôi được tách ra và nuôi cấy trên môi trường đặt (a) và môi trường lỏng (b) Tỷ lệ nảy mầm của phôi Sau 15 ngày nuôi cấy, phôi chuyển sang màu xanh, bắt đầu phát triển và có sự gia tăng kích thước ở tất cả các nghiệm thức đặt ngoài sáng Phôi trong điều kiện tối cũng có sự phát triển nhưng không có sự tổng hợp diệp lục tố nên có màu trắng (Hình 3.2)... nước và cơm (phôi nhũ) để nuôi cây con Nhờ nước dừa và cơm dừa nên cây con phát triển trong thời gian dài sau khi nảy mầm không cần dưỡng chất từ môi trường bên ngoài Vì vậy sự nảy mầm của phôi cũng có thể ảnh hưởng bởi các thành phần các chất có trong nước dừa của trái Trong thí nghiệm, nước dừa sử dụng là nước dừa tươi của giống dừa Ta không phải là nước dừa Dứa Kết quả việc bổ sung nước dừa này vào... trong điều kiện tối và sáng cho tỷ lệ nảy mầm của phôi dừa Dứa tối ưu với 100% phôi nảy mầm Chồi ra rễ và phát triển tốt sau 60 ngày nuôi cấy Mẫu cấy mầm chồi tạo mô sẹo trên môi trường Y3 bổ sung 2 mg/l 2,4-D và 0.5 mg/l BA với tỷ lệ 7,14% ở 60 NSKC 4.2 Đề nghị Ứng dụng quy trình nuôi cấy phôi dừa Dứa trình bày trong hình 4.1 để nhân giống cây từ phôi hợp tử Tiếp tục nghiên cứu môi trường thích hợp... glucid từ 2.46- 6.38 g/ 100g Thành phần dinh dưỡng trong cơm dừa cuar giống dừa dứa cao hơn so với giống dừa cao (dừa ta) 1.6 Nhân giống dừa Theo Nguyễn Bảo Vệ et al (2 005), dừa được nhân giống chủ yếu bằng cách ương trái Kỹ thuật cấy mô cũng đã được nghiên cứu như là một phương pháp nhân giống mới (Kovoor, 1981) nhưng chưa được sử dụng rộng rãi Dừa rất dễ bị lai, nên khi nhân giống bằng hột, việc chọn... việc bổ sung nước dừa này vào môi trường nuôi cấy cho thấy không hiệu quả cho sự nảy mầm của phôi dừa Dứa, thậm chí gây cản trở cho sự phát triển của phôi và sự hình thành rễ so với môi trường đối chứng không bổ sung nước dừa Môi trường Y3 trong điều kiện lỏng lắc cũng cho thấy không hiệu quả cho sự nảy mầm của phôi dừa Dứa Khi được cấy vào môi trường này, phôi được ngâm hoàn toàn trong môi trường,... cường sự trao đổi khí nhưng có thể vẫn không cung cấp đủ oxy cho sự hô hấp nên đã gây ức chế sự nảy mầm của phôi dừa Dứa Môi trường dinh dưỡng Y3 là môi trường có hiệu quả được chuyên biệt sử dụng trong nuôi cấy dừa được phát hiện bởi Eeuwens vào năm 1976 (Oropeza et al., 1999) Phôi dừa Dứa nuôi cấy trên môi trường này cũng cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt đến 100%, khi được đặt ở điều kiện trong tối và... kiện tối và ngoài sáng đều cho tỷ lệ nảy mầm của phôi dừa Dứa tối ưu với 100% phôi nảy mầm Chồi ra rễ và phát triển tốt sau 60 ngày nuôi cấy (Hình 3.2) 2.2 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của 2,4 – D và BA lên sự tạo mô sẹo từ mầm chồi của phôi Mầm chồi non của phôi dừa nảy mầm trong điều kiện tối được cắt thành lát có kích thước khoảng 0.2- 0.3 cm và được nuôi cấy trên môi trường Y3 bổ sung các nồng độ 2,4-... môi trường MS có bổ sung 100ml/l nước dừa ở thời điểm này vẫn chưa thấy có sự phát triển của rễ Bảng 3.2: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ ra rễ của phôi (% ) ở 30 và 60 ngày sau khi cấy Nghiệm thức Y3 + agar + than Y3 + agar + than (trong tối) Y3 + agar + than + nước dừa (1 00 ml/l) MS + agar + than + nước dừa (1 00 ml/l) Y3 lỏng lắc Tỷ lệ ra rễ (% ) 30 NSKC 50 50 0 60 NSKC 100 100... (Hình 3.2) a b c Hình 3.2: Phôi trên môi trường Y3 ở điều kiện ngoài sáng (a), điều kiện lỏng lắc (b), và điều kiện tối (c) ở 15 ngày nuôi cấy Kết quả bảng 3.1 cho thấy, đến 30 ngày sau khi cấy, phôi phát triển chồi và ra rễ ở các nghiệm thức môi trường đặc (có agar), trong khi nghiệm thức môi trường Y3 lỏng, phôi tăng kích thước nhưng không phát triển chồi.Tỷ lệ nảy mầm của phôi khác biệt có ý nghĩa ... 5-7 tháng cho nhóm dừa cao 3-4 tháng cho nhóm dừa lùn, không nên để lâu vườn ươm 1.7 Nuôi cấy in vitro dừa số họ Arecaceace 1.7.1 Nuôi cấy phôi dừa Sự cứu phôi hay nuôi cấy phôi kỹ thuật báo cáo... nghiệm, nước dừa sử dụng nước dừa tươi giống dừa Ta nước dừa Dứa Kết việc bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy cho thấy không hiệu cho nảy mầm phôi dừa Dứa, chí gây cản trở cho phát triển phôi hình... Đặc tính dừa Dứa Theo viện nghiên cứu dầu có dầu (2008), dừa Dứa thuộc nhóm dừa lùn Đặc điểm bật giống dừa Dứa không nước dừa mà thành phần khác dừa lá, hoa, phấn, cơm vỏ dừa thơm mùi dứa ưa chuộng