ĐÁNH GIÁ TÍNH GỐC CỦA TẾ BÀO UNG THƯ KHI BIỂU HIỆN VƯỢT MỨC CD47

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIỀU OANH ĐÁNH GIÁ TÍNH GỐC CỦA TẾ BÀO UNG THƯ KHI BIỂU HIỆN VƯỢT MỨC CD47 Chuyên ngành : Sinh lý Động vật Cán hướng dẫn : TS Phạm Văn Phúc ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIỀU OANH ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐÁNH GIÁ TÍNH GỐC CỦA TẾ BÀO UNG THƯ KHI BIỂU HIỆN VƯỢT MỨC CD47 Chuyên ngành : Sinh lý động vật Mã số : 60 42 30 Xác nhận Cán hướng dẫn TS Phạm Văn Phúc Tp.HCM, Tháng 05 năm 2015 MỤC LỤC !"# Tính cấp thiết đề Tổng quan Mục đích nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu 10 Nội dung nghiên cứu 10 Nơi thực đề tài 19 Thời gian thực 19 Tài liệu tham khảo 19 ! Tính cấp thiết đề tài Ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới, đặc biệt nước phát triển Ung thư cơng ai, khơng phân biệt tuổi tác, giới tính, mơi trường hồn cảnh xã hội Hiện nay, bệnh trở thành ám ảnh cho bệnh nhân gánh nặng cho gia đình xã hội Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO) năm 2012, 8.2 triệu người chết ung thư, 60% ca mắc thường niên thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á, khu vực Trung Nam Mỹ Ung thư bắt nguồn từ tế bào tăng sinh phân chia khơng kiểm sốt, gây đột biến DNA tác động đến gien thúc đẩy trình phân chia tế bào ức chế chế chống ung thư tự nhiên Các nghiên cứu cho thấy tất tế bào ung thư giống Trong khối u ác tính tế bào ung thư bạch cầu hệ tuần hồn, có nhiều loại tế bào Từ xuất giả thuyết tồn loại tế bào giống tế bào gốc khối u, gọi tắt tế bào gốc ung thư Việc xâm lấn tế bào giống tế bào gốc có vài tính chất đặc biệt, ví dụ khả lẩn trốn hệ miễn dịch tính kháng với liệu pháp hóa trị liệu Việc xác định tế bào giống tế bào gốc ung thư hiểu rõ tính chất mang tính định phát triển liệu pháp chống ung thư mới, quần thể tế bào ung thư khác khối u chuyển đổi qua lại lại tế bào phân chia nhanh không xâm nhập tế bào giống tế bào gốc phân chia chậm có khả di cư nhanh Việc xác định đường mà tế bào sử dụng để điều hòa tăng sinh, biệt hóa sống sót có vai trị quan trọng để hiểu rõ chế ung thư cần thiết để thiết kế trị liệu cho bệnh nguy hiểm Trong chiều hướng này, có nhiều gien đường truyền liên hệ đến tiến trình ung thư khám phá ứng dụng Tại PTN Tế bào gốc, nghiên cứu gien CD47 để tìm hiểu chế biệt hóa tái biệt hóa tế bào gốc ung thư Nghiên cứu dựa số tính đường truyền tín hiệu liên quan đến CD47 giới hạn khả sống sót tái tạo tế bào sau stress, người ta thấy CD47 tăng biểu bề mặt tế bào ung thư làm tăng cường khả tăng sinh sống sót.[1] Như thế, việc nghiên cứu gien CD47 chức tế bào gốc ung thư có tiềm giúp tìm chế liệu pháp cho bệnh ung thư Tổng quan: 2.1 Thuyết tế bào gốc ung thư Từ lâu, nhiều nhà nghiên cứu đặt giả thiết mối liên hệ tế bào gốc tế bào ung thư Cách 150 năm, Durante (1874) đề xuất ung thư bắt nguồn từ quần thể nhỏ tế bào bình thường mang tính chất tế bào gốc Sau năm, Cohnheim (1875) đưa giả thiết tế bào gốc lạc q trình hình thành phôi trở thành nguồn gốc khối u hình thành q trình sống Trong thời gian dài, nhiều nhà nghiên cứu xem xét giả thiết để khẳng định tồn tế bào gốc ung thư Sau nhiều năm, nhiều nhà nghiên cứu dần khẳng định tồn quần thể tế bào giống tế bào gốc khối u ung thư (Bruce WR,1963); (Kleismith LJ, 1964); (Makino, 1956); (Park CH, 1971); (Hamburger AW, 1977).[2] Năm 1994, John E.Dick cộng lần chứng minh hầu hết tế bào bạch cầu dòng tủy ác tính có khả tăng sinh giới hạn, từ đưa đề xuất dịng tế bào bạch cầu trì quần thể tế bào gốc nhỏ[3] Tính đến nay, có nhiều nghiên cứu chứng minh tồn quần thể nhỏ tế bào khởi nguồn ung thư, có khả tái tạo lại quần thể tế bào ung thư cấy ghép dị loài.[4, 5] Thuyết tế bào gốc ung thư cho tất tế bào ung thư có vài tế bào hoạt động tế bào gốc, tạo trì ung thư, giống tế bào gốc bình thường khác tự làm trì quan mơ thể Theo thuyết này, tế bào ung thư khơng phải tế bào gốc khơng thể trì công thể chúng thời gian dài Từ đó, ý tưởng tế bào ung thư chủ yếu thúc đẩy quần thể tế bào gốc nhỏ có ý nghĩa quan trọng Ví dụ, nhiều liệu pháp chống ung thư đánh giá dựa khả làm teo khối u, liệu pháp không giết tế bào gốc ung thư, khối u sớm mọc trở lại (thường kháng lại với liệu pháp sử dụng hóa xạ trị) Có thể so sánh với việc cắt cỏ, đánh giá dựa việc cắt cỏ thấp tới mức nào, không quan trọng cỏ cắt bao nhiêu, rễ không nhỏ cỏ mọc lại Ý nghĩa tế bào gốc ung thư trị liệu ung thư[6] Nếu tế bào gốc ung thư nguồn dẫn đến tăng trưởng di cư ung thư, tác động nhằm điều trị ung thư phải nhắm đến tế bào gốc ung thư Việc teo nhỏ khối u ung thư giảm tác động tế bào ung thư máu dòng máu đem lại suy giảm tạm thời, tiếp tục chữa trị thời gian dài tế bào gốc ung thư không loại bỏ Hơn nữa, tế bào gốc ung thư bị loại bỏ, tế bào ung thư cịn sót lại thể bị tế bào hệ miễn dịch công chết tự nhiên tế bào ung thư tế bào gốc, xác định khơng có khả tự làm Hình 1: Liệu pháp teo nhỏ khối u dựa việc công tế bào gốc ung thư (CSC) Vì vậy, liệu pháp hữu hiệu để điều trị ung thư tương lai tập trung vào mục tiêu tế bào gốc ung thư Việc tìm kiếm liệu pháp cần hiểu biết định số lượng biểu tế bào gốc ung thư Việc tìm hiểu tế bào gốc ung thư giúp xác định liệu pháp hiệu cho tác động tối đa, ví dụ, nhà nghiên cứu trung tâm Y học nghiên cứu tế bào gốc ung thư Ludwig, khám phá lý tế bào gốc, bao gồm tế bào gốc ung thư, kháng lại xạ ion sử dụng nhiều trị liệu ung thư Trong tương lai, việc hiểu biết tính kháng giúp nhà nghiên cứu tìm phức hợp phá hoại trình làm cho tế bào tế bào gốc ung thư bị tổn thương phá hủy Những chứng việc xác định tế bào gốc từ khối u rắn Al-Hajj cộng công bố, phân lập tế bào sinh u từ khối mô ung thư vú cách sử dụng kĩ thuật FACS để tinh quần thể có khả hình thành khối u chuột bị suy giảm miễn dịch Những tế bào ung thư biểu mô vú phân tách dựa vào biểu CD44 CD24 nó, hai cho biểu tương đối đồng tế bào khối u Những mẫu phân đoạn ghép vào tuyến vú chuột NOD/SCID phân đoạn CD44+/CD24- mang hoạt tính khởi đầu khối u, với lượng tế bào gấp 100 từ phân đoạn CD44 +/CD24+ CD44- khơng có khả hình thành khối u [7] 2.2 Tái thiết lập chương trình tế bào ung thư thành tế bào gốc ung thư Theo giả thiết tế bào gốc ung thư tế bào biểu trưng cho tình trạng bệnh lý tế bào gốc phôi tế bào gốc sinh dưỡng Những tế bào gốc ung thư biểu marker chuyên biệt gen liên quan đến tính kháng hóa xạ trị, tính gốc, q trình chuyển dạng nội mơ-trung mơ, v.v.[8] Có nhiều liệu pháp trị liệu áp dụng chưa có liệu pháp tiêu diệt hồn tồn ung thư Trong trường hợp ung thú vú, có nhiều liệu pháp tập trung tác động trúng đích vào tính gốc tế bào gốc ung thư vú Tất liệu pháp nhắm đến việc biệt hóa tế bào gốc ung thư vú thành tế bào tế bào bào gốc ung thư vú Thật vậy, chúng tính gốc, chúng tiềm kháng với liệu pháp xạ trị hóa trị, giảm khả xâm lấn, di cư sang mô xung quanh Một khái niệm liệu pháp biệt hóa đề xuất cơng bố đáng ý, cách knockdown CD44 tế bào gốc ung thư có kiểu hình CD44+/CD24- làm cho tế bào biểu đặc điểm tế bào gốc tiềm sinh ung thấp, thay đổi chu trình tế bào, biểu gen, [9] Mặt khác, từ xuất tế bào iPSC (Yamanaka cs, 2006), chuyển biệt hóa trực tiếp từ tế bào chức thể thành tế bào có tính gốc giống tế bào gốc phơi, thông qua việc chuyển nhân tái thiết lập chương trình trực tiếp (OCT4, SOX2, Klf4 c-Myc) với triển vọng đem lại hiệu lớn lao cho liệu pháp y học tái tạo Từ giả thiết việc tái thiết lập chương trình tế bào gốc ung thư thành tế bào ung thư đưa Thật vậy, liệu pháp ung thư truyền thống cơng giết tế bào ung thư khối u tiêu diệt tế bào gốc ung thư, khối u teo nhỏ tăng sinh trở lại Do đó, liệu pháp nhắm trúng đích tế bào gốc ung thư đời với hy vọng công tất tế bào gốc ung thư làm cho khối u bị tiêu biến Những nhà nghiên cứu thử áp dụng việc tái thiết lập chương trình tế bào ung thư gen tái thiết lập (Yamanaka, 2006) thu nhận tế bào có biểu marker bề mặt (CD44/CD24) giống với thuộc tính tế bào gốc ung thư.[10] Gần đây, nghiên cứu Kaur cs (2013) cho thấy mối liên quan việc biểu cao protein CD47 gen liên quan đến tính gốc tế bào ung thư Cụ thể, nghiên cứu cho thấy giảm biểu CD47 giúp tăng cường biểu gen tính gốc c-Myc, Klf, Oct4 Sox2.[11] Qua đó, mở hướng nghiên cứu tiềm năng, liên quan đến việc chuyển biệt hóa tế bào thơng qua đường CD47 Hình 2: Tín hiệu CD47 làm giới hạn khả tự làm tế bào gốc.[1] 2.3 Mối tương quan marker xác định tế bào gốc Tế bào gốc ung thư định nghĩa quần thể tế bào diện khối u, có khả tự làm biệt hóa Giống tế bào gốc thông thường, tế bào gốc ung thư tạo tất tế bào ung thư khối u gọi tế bào gốc ung thư Có nhiều chứng hỗ trợ cho vai trò thiết yếu tập hợp tế bào việc khơi mào trì khối u, cộng với khả điều khiển xâm lấn, di căn, tính hỗn tạp kháng với liệu pháp điều trị Việc xác định phân lập tế bào gốc ung thư cách sử dụng marker bề mặt giữ vai trò yếu nghiên cứu ung thư Trong nhiều nghiên cứu cho thấy quần thể tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24- biểu gen tiền xâm lấn cao thấy biểu xâm lấn cao hơn[12] Theo nghiên cứu AlHaji cộng sự, 2003, quần thể nhỏ (khoảng 200 tế bào) có biểu marker bề mặt CD44+/CD24-/low hình thành khối u chuột NOD/SCID, quần thể lớn (khoảng 1000 tế bào) phân lập từ khối u lại khơng thể hình thành khối u chuột NOD/SCID Do đó, kiểu hình tế bào CD44+/CD24được sử dụng để xác định phân lập tế bào ung thư với tiềm sinh ung cao[2] Hình 3: Kiểu hình marker bề mặt tế bào tế bào gốc ung thư số bệnh ung thư.[13] Trong nghiên cứu Ginestier C, 2007 chứng minh quần thể biểu ALDH+, dẫn đến oxi hóa retinol thành axit, kiện xảy đầu giai đoạn biệt hóa tế bào gốc Việc kết hợp kiểu hình CD44+/CD24- ALDH+ để chọn lọc tế bào gốc ung thư cho thấy tế bào có kiểu hình có tiềm sinh ung cao tế bào có kiểu hình CD44+/CD24- ALDH+.[14] Gần đây, CD47 lưu tâm cho nghiên cứu tế bào gốc ung thư cho biểu CD24/CD44/CD47 giúp phân biệt quần thể tế bào khác mô thường mô bệnh.[15]  Integrins – vài integrin màng, phổ biến integrin avb3 Những tương tác dẫn đến hình thành phức hợp CD47/integrin tác động loại chức tế bào gồm bám dinh, lan rộng di cư Những tương tác với nhiều protein nhiều loại tế bào tạo vài chức quan trọng, bao gồm : tăng sinh tế bào, chết theo chu trình tế bào, di cư, hình thành mạch đáp ứng viêm Liên kết CD47 gây loại đáp ứng khác nhau, phụ thuộc vào loại tế bào phối tử liên kết Kiểu hình M2 đại thực bào liên kết với khối u (TAM) diện nhiều khối u thường liên kết với trình tiến triển vài loại ung thư Mô ung thư đại tràng người chứng minh biểu vượt trội tế bào CD68+ (marker đại thực bào) tế bào CD206+ (dấu hiệu đại thực bào M2) tăng biểu CD47[16] Những nghiên cứu gần đường tín hiệu CD47-SIRPα nội cân miễn dịch điều hòa mạng lưới tế bào thần kinh Những tiến việc phân tích cấu trúc chức đường tín hiệu CD47- SIRPα cung cấp gợi ý thú vị cho lợi ích liệu pháp thao tác hệ thống tín hiệu bệnh tự miễn, ung thư rối loạn thần kinh [17] Khía cạnh trị liệu lâm sàng CD47 bệnh ung thư người CD47 biểu vượt mức nhiều loại tế bào bệnh ung thư người chức chúng biết tín hiệu “đừng ăn tơi”, cho thấy tiềm để nhắm trúng đích đường CD47-SIRPα liệu pháp chung cho khối u ác tính người[18, 19] Sự tăng điều hòa biểu CD47 bệnh ung thư người ảnh hưởng tới tăng trưởng lan rộng khối u Đầu tiên, việc tăng biểu CD47 vài khối u máu ác tính tìm thấy có liên quan với tiên lượng lâm sàng tồi tệ ALL để tiên lượng dai dẳng với liệu pháp hóa trị tiêu chuẩn[19-22] Thứ hai, CD47 chứng minh để điều hòa di lan rộng khối u HM NHL[19] CD47 biểu rộng khắp bề mặt tế bào thụ thể cho thrombospondin-1 SIRPα Liệu pháp kháng thể trúng đích CD47 tác động đến tế bào gốc ung thư vú thông qua việc giảm biểu thụ thể EGFR bề mặt tế bào Đây chế đưa kháng thể khóa CD47 trở thành liệu pháp ứng viên tiềm cho điều trị bệnh ung thư vú triple-negative (triple negative breast cancer-TNBC).[23] Nhiều nỗ lực thực để phát triển liệu pháp ức chế đường CD47-SIRPα, chủ yếu qua việc ngăn chặn kháng thể đơn dòng trực tiếp kháng CD47, với loại protein SIRPα tái tổ hợp gắn ngăn chặn CD47 Trong liệu pháp đơn nhắm đến CD47 có hiệu vài mơ hình khối u tiền lâm sàng, chiến lược kết hợp liên quan đến ức chế đường CD47SIRPα thường đem lại tiềm liệu pháp lớn Đặc biệt là, kháng thể nhắm đến CD47-SIRPα bao gồm liệu pháp với kháng thể liệu pháp khác, tác nhân tăng cường đại thực bào, liệu pháp hóa trị liệu pháp tá dược để ức chế di căn[19] Hơn nữa, tăng điều hòa qua gián tiếp liệu pháp hóa – xạ trị calreticulin bề mặt tế bào làm tăng tiềm hoạt động kháng thể kháng CD47 Tuy nhiên, hướng tiếp cận dẫn đến tăng tính độc calreculin bề mặt tế bào biểu tế bào ung thư trải qua trình apoptosis, tác động chủ yếu liệu pháp hóa – xạ trị[24] 10 Hình 4: Cơ chế nhắm trúng đích đường CD47/SIRPα ung thư[19] Liệu pháp nhắm trúng đích đường CD47/SIRPα gây việc loại bỏ tế bào ung thư qua nhiều chế khác Đầu tiên ức chế tương tác CD47-SIRPα với kháng thể ngăn chặn kháng CD47, kháng thể ngăn chặn kháng SIRPα protein SIRPα tái tổ hợp (ở mô tả protein dung hợp kép với Fc) dẫn đến thực bào “ăn” tế bào khối u đại thực bào Thứ hai, kháng thể kháng CD47 loại bỏ tế bào khối u qua chế truyền thống phụ thuộc Fc kháng thể bao gồm ADCC CDC gián tiếp qua tế bào NK Thứ ba, kháng thể kháng CD47 trực tiếp kích hoạt q trình apoptosis tế bào khối u qua chế không phụ thuộc caspase Thứ tư, kháng thể kháng CD47 có khả thực bào tế bào khối u tế bào tua (DC) tiếp tục trình diện kháng nguyên với tế bào T CD4 CD8, theo kích hoạt đáp ứng miễn dịch thích ứng kháng khối u Một số nghiên cứu chứng minh cách mà tế bào ung thư trì mức độ biểu CD47 cao để lẩn trốn công hệ miễn dịch, 11 trì đồng thời tế bào gốc ung thư/tế bào khởi phát khối u giúp trì phát triển khối u.[1] Mục đích nghiên cứu Con đường biệt hóa tế bào gốc ung thư thành tế bào ung thư đường chiều Đã có nghiên cứu cho thấy số tế bào quần thể khối u có khả tái biệt hóa thành tế bào gốc ung thư, dẫn đến khả trì ung thư lâu dài Như chiến lược, dùng phương pháp để tái thiết lập chương trình tế bào ung thư thành tế bào gốc ung thư, mở hướng trị liệu ung thư thơng qua tiêu diệt hồn tồn tế bào gốc ung thư Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan mật thiết việc biểu CD47 tính gốc tế bào gốc Mục đích nghiên cứu nhằm bước đầu đánh giá ảnh hưởng CD47 lên tính gốc tế bào ung thư biểu vượt mức CD47 Mặt khác, bước đầu đánh giá việc sử dụng CD47 marker việc nhận diện tế bào gốc ung thư knockdown CD44 Cancer stem cell Cancer cell Overexpression CD47 Đối tượng nghiên cứu  Vector pcDNA3.4 mang gen CD47 thiết lập Phịng Thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc cách phân lập mRNA mã hóa cho protein CD47 từ tế bào gốc ung thư, gắn vào plasmid pcDNA3.4 có gắn sẵn enzyme Topoisomerase, giúp cho việc gắn gen dễ dàng  Tế bào ung thư vú MCF-7 (Michigan Cancer Foundation 7) dòng tế bào ung thư vú ác tính người, phân lập từ mơ vú người phụ nữ gốc Âu năm 12 1970 Dòng tế bào sử dụng nghiên cứu khởi đầu thụ thể estrogen sử dụng rộng rãi nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát: Tế bào gốc ung thư Vector mang gene CD47 RNA tổng số Gắn vào plasmid RT-PCR Gen CD47 Chuyển gen Tế bào ung thư MCF-7 Đánh giá biểu gen CD47 Real time RTPCR trước sau chuyển gen Đánh giá tính gốc (trước sau chuyển gen) Flow Cytometr y Đánh giá biểu gen CD44+/CD24/CD47 Khả tạo sphere Tính kháng thuốc (Tamoxifen, Verapamil, Doxorubicine) Khả sinh ung in vivo 5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số  Thu toàn huyền phù tế bào cho vào eppendorf 1.5ml  Ly tâm 13000 vòng, 40C phút để loại môi trường nuôi cấy  Rửa tế bào với PBS (-) ly tâm thu tế bào 13.000 rpm, 40C phút  Đổ bỏ PBS (-) huyền phù tế bào ml easyBlue đến khơng cịn thấy cặn tế bào  Bổ sung 200 μl chloroform, đảo eppendorf vài lần, lắc kĩ đến hỗn hợp trộn lẫn thành pha 13  Ly tâm 13.000 rpm, 40C 10 phút Sau ly tâm, hỗn hợp phân tách thành lớp (1) DNA hòa tan pha phenol (pha easyBlue có màu xanh), (2) màng tế bào protein bị biến tính khác (cặn màu trắng phân tách hai lớp), (3) RNA hòa pha nước phía  Cẩn thận thu nhận khoảng 400 μl pha nước vào eppendorf  Tủa RNA cách bổ sung 400 μl isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 vào eppendorf Để hỗn hợp 10 phút nhiệt độ phòng  Ly tâm 13.000 rpm, 40C 10 phút để thu cặn  Rửa tủa RNA thu nhận cách bổ sung 1ml Ethanol 70 lạnh Đảo eppendorf vài lần  Ly tâm 10.000 rpm, 40C 10 phút để thu RNA Đổ bỏ dung dịch đợi tủa RNA khô  Huyền phù tủa RNA thu nhận 50 μl nước xử lý DEPC 5.1 Phương pháp RT-PCR cho gien CD47 Nguyên tắc: sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase để tổng hợp gen dựa mạch mRNA Quy trình thực hiện: Thành phần Thể tích ONE-STEP RT-PCR Premix 𝜇𝑙 RNA template 𝜇𝑙 Mồi xuôi (10 mM) 0.5 𝜇𝑙 Mồi ngược (10 mM) 0.5 Nước Mili-Q 𝜇𝑙  Tổng hợp tồn trình tự nucleotide protein CD47 mồi chuyên biệt cho gen CD47  Sử dụng kit ONE-STEP RT-PCR Premix kit Intron  Thành phần phản ứng 14  Chu trình luân nhiệt Bước Thời gian Nhiệt độ (0C) Phiên mã ngược 30 phút 45 Bất hoạt enzyme phút 95 Biến tính 30 giây 95 Bắt cặp 30 giây 55 Kéo dài phút 72 Kéo dài cuối 10 phút 72 Các cặp mồi sử dụng : Gien Trình tự mồi Kích thước GAPDH 5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3' 238 bp 5' - TTGATTTTGGAGGGATCTCG - 3' CD47 5' - GAGATGTGGCCCCTGGTA - 3' Full length 5' - TCCATCACTTCACTTCAGTTATTC - 3' CD47 5' - GGCAATGACGAAGGAGGTTA - 3' ~ 900 bp 217 bp 5' - ATCCGGTGGTATGGATGAGA - 3' 5.2 Phương pháp Realtime RT-PCR: Nghiên cứu sử dụng kit Brilliant III Ultra-Fast SYBR green QRT-PCR hang Thermo Scientific RNA tổng số sau thu nhận định lượng sử dụng để thực phản ứng realtime RT-PCR RNA tổng số reverse hoạt động dung dịch DTT Các thành phần phản ứng Realtime RT-PCR Thành phần Thể tích SYBR Green QRT-PCR master mix 10 𝜇𝑙 15 DTT 0.2 𝜇𝑙 RT/RNase block 𝜇𝑙 RNA template 𝜇𝑙 Mồi xuôi 0.2 𝜇𝑙 Mồi ngược 0.2 𝜇𝑙 Nước Mili-Q 7.4 𝜇𝑙 Phản ứng phiên mã RNA thành DNA Bước Thời gian (phút) Nhiệt độ (0C) Phiên mã ngược 60 45 Bất hoạt enzyme 94 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt xác định nhiệt độ nóng chảy Bước Thời gian Nhiệt độ (0C) Biến tính 15 giây 95 Bắt cặp 15 giây 60 Biến tính từ từ 20 phút 95 Các cặp mồi sử dụng cho phân tích biểu gien Gien Kích thước Trình tự mồi GAPDH 5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3' 238 bp 5' - TTGATTTTGGAGGGATCTCG - 3' CD47 5' - GGCAATGACGAAGGAGGTTA - 3' 5' - ATCCGGTGGTATGGATGAGA - 3' 16 217 bp 5.3 Tạo dòng protein CD47 tái tổ hợp: Sử dụng hệ thống plasmid biểu pcDNA 3.4 dòng tế bào HEK 293 Hình 3: Sơ đồ plasmid pcDNA3.4 Nguyên tắc hoạt động hệ thống TOPO: pcDNA 3.4-TOPO cung cấp dạng mạch thẳng với đầu 3’ thymidine (T) nhô giúp cho tạo dòng TA, enzyme topoisomerase liên kết cộng hóa trị với vector (dạng vector “được hoạt hóa) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính transferase đầu cuối không phụ thuộc mạch giúp gắn deoxyadenosine (A) vào cuối đầu 3’ sản phẩm PCR Mặt khác vector có gốc deoxythymidine (T) nhơ ra, cho phép sản phẩm PCR chèn hữu hiệu vào vector 17 Enzyme Topoisomerase I từ virus Vaccinia gắn với DNA mạch đơi vị trí chun biệt khung phosphodiester sau vị trí 5’-CCCTT mạch (Shuman, 1991) Năng lượng từ việc phá vỡ khung sườn phosphodiester chuyển đổi hình thành liên kết cộng hóa trị đầu 3’ phosphate mạch bị cắt gốc tyrosyl (Tyr-274) enzyme Topoisomerase I Sau đó, liên kết phosphor-tyrosyl DNA enzyme bị cơng đầu 5’OH mạch gốc bị cắt, đảo chiều phản ứng giải phóng enzyme topoisomerase (Shuman, 1994) Phản ứng tạo dòng TOPO lợi dụng phản ứng để tạo dòng sản phẩm PCR hữu hiệu Khi sản phẩm PCR clone vào vector pcDNA3.4-TOPO thể biến nạp phân tích chiều vector khung đọc mở, plasmid biểu chuyển vào dịng tế bào mong muốn 5.4 Phương pháp chuyển gen lipofectamine : Sử dụng chuyển plasmid DNA vào tế bào động vật đĩa 24 giếng  Trước chuyển gen, phân tách đếm tế bào Bổ sung khoảng 0.5 -1.25x105 tế bào giếng 0.5ml môi trường tăng trưởng hoàn chỉnh Mật độ tế bào trải nên vào khoảng 50-80% bề mặt đĩa nuôi vào ngày chuyển gen  (Tùy chọn) Vào ngày chuyển gen, loại bỏ môi trường cũ thay với 0.5ml môi trường tăng trưởng hoàn chỉnh  Trên giếng tế bào cần chuyển, pha loãng 0.5 μg DNA in 100 μl mơi trường khơng có huyết  Với giếng, bổ sung 0.75-1.75 μl Lipofectamine đặt phía dung dịch môi trường:DNA, trộn ủ khoảng 30 phút nhiệt độ phòng  Sau 30 phút ủ, bổ sung 100 μl hỗn hợp DNA-Lipofectamine trực tiếp vào giếng chứa tế bào trộn cách gõ đáy thành đĩa  Không loại bỏ phức hợp sau chuyển Ủ tế bào 37oC tủ ấm CO2 khoảng 18-24h sau chuyển, trước biểu gen chuyển 18 5.5 Phương pháp nuôi cấy tạo khối tế bào (sphere formation assay)  Tế bào nuôi mật độ 1000 tế bào/ml môi trường DMEM/F12 không huyết thanh, bổ sung nhân tố tăng trưởng bFGF 10 ng/ml, EGF 20 ng/ml, ng/ml insulin 0.4% BSA  Tế bào nuôi cấy điều kiện hình thành cụm tế bào khối cầu khơng bám dính, gọi “sphere” hay “mammosphere”)  Số lượng sphere giếng nuôi cấy đánh giá sau ngày 5.6 Phương pháp Flow Cytometry Trong sinh vật đa bào, DNA tất tế bào giống protein khác nhiều, dựa vào phân tách loại tế bào khác quần thể tế bào Kỹ thuật Flow Cytometry thực thiết bị đặc biệt Fluorescene Activated Cell Sorting (FACS) cho phép :  Phân tách tế bào có kiểu hình khác  Xác định số lượng tế bào biểu protein quan tâm  Định lượng biểu protein quần thể tế bào Ban đầu quần thể tế bào đặt vào bình chứa lần cho tế bào qua ống phân tích, tạo thành dịng chảy nhỏ giọt Khi tế bào xuống theo dòng chảy chất lỏng bị quét tia laser Một số ánh sáng laser bị tế bào tán xạ đầu dò cảm biến thu nhận truyền liệu đến máy tính Tại đây, liệu thu phân tích biểu diễn dạng đồ thị Nếu muốn tách riêng quần thể tế bào, ta dùng loại kháng thể có gắn huỳnh quang gắn chuyên biệt với loại protein có bề mặt tế bào mục tiêu Ánh sáng laser kích thích thuốc nhuộm phát ánh sáng máy cảm biến thu nhận truyền đến máy tính xử lý Bằng cách thu thập thơng tin ánh sáng, máy tính xác định loại tế bào phân tách thu nhận chúng Kết biểu diễn qua đồ thị dot plot với trục X biểu diễn trị số FSC (kích thước tế bào), trục Y biểu diễn trị số SSC (độ đậm đặc tế bào chất) 19 5.7 Phương pháp đo đường cong tăng trưởng tế bào thực thời (Hệ thống xCelligence) Phương pháp sử dụng hệ thống xCelligence phát triển Roche ACE Biosciences để ghi nhận tăng sinh tế bào thực thời Về nguyên tắc thí nghiệm hệ thống dựa thí nghiệm đo đường cong tăng trưởng tế bào Tuy nhiên, thay sử dụng đĩa 96 giếng thơng thường tế bào cấy lên đĩa 96 giếng đặc biệt (E-plate) với vi điện cực vàng bao phủ lớp đáy Càng nhiều tế bào bám dính vào đáy giếng trở kháng điện cực tăng Tuy nhiên, số lượng tế bào, yếu tố khác tương tác di dộng tế bào, hình thái tế bào ảnh hưởng đến trở kháng Do đó, trở kháng điện cực thể số tế bào (Cell Index – CI) phản ánh tình trạng sinh học tế bào bao gồm hình thái tế bào, số lượng tế bào sống, số lượng tế bào bám dính Như vậy, số tế bào (CI) thứ nguyên tham số, biến động tùy thuộc vào tình trạng tế bào, theo quy tắc sau:  Khi khơng có tế bào, tế bào khơng bám dính vào điện cực đáy, số CI Trong điều kiện sinh lý, nhiều tế bào bám số CI lớn Hơn nữa, thay đổi trạng thái tế bào hình thái, bám trải, sức sống dẫn đến thay đổi CI  Đặc điểm ưu việt hệ thống khả ghi nhận số liệu thực thời xác đến phút, cho phép theo dõi tăng sinh tế bào, ảnh hưởng tác nhân lên tế bào mà không cần phải can thiệp trực tiếp vào tế bào phương pháp khác MTT, XTT, BrdU Các thuốc kháng u Thí nghiệm thực với mẫu tế bào xử lý loại thuốc: Doxorubicine, Verapamil, Tamoxifen  Nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú  Ly tâm thu nhận tế bào bổ sung môi trường nuôi cấy mới, huyền phù 20  Đếm xác lượng tế bào máy đếm tế bào trypan blue  Pha loãng dịch huyền phù tế bào để 50 𝜇𝑙 dịch có 1000 tế bào vào giếng  Sau 6h, tế bào bám xuống bề mặt đĩa, cho vào giếng môi trường với nồng độ Doxorubicin khác 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 𝜇𝑔/ml Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu, giải phát triển kết đạt  Nội dung 1: Tạo thành công vector pcDNA3.4 mang gen CD47  Nội dung 2: Đánh giá tế bào MCF-7 tế bào ung thư vú, không biểu đặc điểm tế bào gốc trước chuyển gen  Nội dung 3: Đánh giá biểu tính gốc MCF-7 sau chuyển gen Nơi thực đề tài nghiên cứu luận văn Phịng Thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Cơ sở Linh Trung Tòa nhà B23 – Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp.HCM Thời gian thực hiện: 05/2015 – 30/09/2016 Các tài liệu tham khảo sử dụng viết đề cương Soto-Pantoja, D.R., S Kaur, and D.D Roberts, CD47 signaling pathways controlling cellular differentiation and responses to stress Crit Rev Biochem Mol Biol, 2015: p 1-19 Pham, P.V., Breast cancer treatment by targeting breast cancer stem cells - Gene therapy and Immunotherapy Strategies 2012 Lapidot, T., et al., A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice Nature, 1994 367(6464): p 645-8 Trosko, J.E and M.H Tai, Adult stem cell theory of the multi-stage, multi-mechanism theory of carcinogenesis: role of inflammation on the promotion of initiated stem cells Contrib Microbiol, 2006 13: p 45-65 21 10 11 12 13 14 15 16 O'Brien, C.A., et al., A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice Nature, 2007 445(7123): p 106-10 Reya, T., et al., Stem cells, cancer, and cancer stem cells Nature, 2001 414: p 105 - 111 Al-Hajj, M., et al., Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells Proc Natl Acad Sci U S A, 2003 100(7): p 3983-8 Antoniou, A., et al., Cancer stem cells, a fuzzy evolving concept: a cell population or a cell property? Cell Cycle, 2013 12(24): p 3743-8 Pham, P.V., et al., Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy J Transl Med, 2011 9: p 209 Nishi, M., et al., Induction of cells with cancer stem cell properties from nontumorigenic human mammary epithelial cells by defined reprogramming factors Oncogene, 2014 33(5): p 643-652 Kaur, S., et al., Thrombospondin-1 signaling through CD47 inhibits self-renewal by regulating c-Myc and other stem cell transcription factors Sci Rep, 2013 3: p 1673 Sheridan, C., et al., CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis Breast Cancer Research, 2006 8(5): p R59 Morrison, R., et al., Targeting the Mechanisms of Resistance to Chemotherapy and Radiotherapy with the Cancer Stem Cell Hypothesis Journal of Oncology, 2011 2011 Ginestier, C., et al., ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome Cell Stem Cell, 2007 1(5): p 555-67 Hofner, T., et al., Expression and prognostic significance of cancer stem cell markers CD24 and CD44 in urothelial bladder cancer xenografts and patients undergoing radical cystectomy Urol Oncol, 2014 32(5): p 678-86 Zhang, Y., et al., Crosstalk between colon cancer cells and macrophages via inflammatory mediators and CD47 promotes tumour cell migration Eur J Cancer, 2013 49(15): p 3320-34 22 17 18 19 20 21 22 23 24 Matozaki, T., et al., Functions and molecular mechanisms of the CD47-SIRPalpha signalling pathway Trends Cell Biol, 2009 19(2): p 72-80 Willingham, S.B., et al., The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors Proc Natl Acad Sci U S A, 2012 109(17): p 6662-7 Chao, M.P., I.L Weissman, and R Majeti, The CD47-SIRPalpha pathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications Curr Opin Immunol, 2012 24(2): p 225-32 Majeti, R., et al., CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells Cell, 2009 138(2): p 286-99 Chao, M.P., et al., Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia Cancer Res, 2011 71(4): p 1374-84 Chao, M.P., et al., Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma Cell, 2010 142(5): p 699-713 Kaur, S., et al., Role of CD47 in triple negative breast cancer The FASEB Journal, 2015 29(1 Supplement) Obeid, M., et al., Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death Nat Med, 2007 13(1): p 54-61 23 ... tế bào khởi nguồn ung thư, có khả tái tạo lại quần thể tế bào ung thư cấy ghép dị loài.[4, 5] Thuyết tế bào gốc ung thư cho tất tế bào ung thư có vài tế bào hoạt động tế bào gốc, tạo trì ung thư, ... thời gian dài tế bào gốc ung thư không loại bỏ Hơn nữa, tế bào gốc ung thư bị loại bỏ, tế bào ung thư cịn sót lại thể bị tế bào hệ miễn dịch công chết tự nhiên tế bào ung thư tế bào gốc, xác định... cứu nhằm bước đầu đánh giá ảnh hưởng CD47 lên tính gốc tế bào ung thư biểu vượt mức CD47 Mặt khác, bước đầu đánh giá việc sử dụng CD47 marker việc nhận diện tế bào gốc ung thư knockdown CD44