Virút bướu nhú người (HPV) gen và protein p53 trong ung thư niêm mạc miệng

Protein p53 đột biến Mutant p53 Sửa lỗi bắt cặp sai Mismatch repair Sự đáp ứng với xạ trị Response to radiotherapy Thụ thể tăng trưởng biểu bì Epidermal growth factor receptor Tiền gen u

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ KIM CÚC

VIRÚT BƯỚU NHÚ NGƯỜI (HPV)

GEN VÀ PROTEIN P53 TRONG UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2012

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ KIM CÚC

VIRÚT BƯỚU NHÚ NGƯỜI (HPV)

GEN VÀ PROTEIN P53 TRONG UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG

CHUYÊN NGÀNH PHẪU THUẬT HÀM MẶT

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả ghi trong luận án này

là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác

Trần Thị Kim Cúc

Trang

Danh mục các chữ viết tắt i

Danh mục các bảng iv Danh mục các biểu đồ vi

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh học của ung thư niêm mạc miệng 4

1.2 HPV và gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng 15

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Mẫu nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.2.2 Tỉ lệ các týp HPV trong mẫu khảo sát 55

3.2.3 Liên quan giữa nhiễm HPV với lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM 57

3.3 Đột biến gen p53 và biểu hiện protein p53 trong UTNMM 58

3.3.1 Tỉ lệ đột biến gen p53 58

3.3.2 Các kiểu đột biến gen p53 58

3.3.3 Các codon đột biến 64

3.3.4 Các loại nucleotid và vị trí nucleotid đột biến 65

3.3.5 Sự biến đổi protein p53 do đột biến gen p53 66

3.3.7 Liên quan đột biến gen p53 với lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM 75

3.3.8 Liên quan biểu hiện p53 với lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM 77

3.4.1 Liên quan HPV với đột biến gen p53 trong UTNMM 79

3.4.2 Liên quan HPV với biểu hiện protein p53 trong UTNMM 79

3.4.3 Liên quan HPV, đột biến gen p53 với biểu hiện protein p53 trong

4.3 Về đột biến gen p53 và biểu hiện protein p53 trong UTNMM 94

4.4 Liên quan giữa HPV với đột biến gen p53, biểu hiện protein p53

trong UTNMM

109

4.5 Liên quan giữa HPV, đột biến gen p53 và biểu hiện protein p53 với

lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM

110

4.6 Về ứng dụng HPV và p53 trong chẩn đoán UTNMM 112

4.7 Về ứng dụng HPV và p53 trong điều trị và phòng ngừa UTNMM 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GiẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Danh sách bệnh nhân

Phiếu thu thập dữ liệu

Bovine Papillomavirus Cottontail Rabbit Papillomavirus Cytosin (DNA)

Cyclin-dependent kinase Diaminobenzidine tetrachloride Deoxynucleotide triphosphate Dideoxynucleotide triphosphate Deoxyribonucleic acid

Early Ethylene diaminetetra acetic acid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Mouse double minute 2 Methylnitrosamino propionaldehyde Methylnitrosamino propionitrile N-nitrosoguvacoline

N-nitrosoguvacine Odds ratio

Open read frame

p53 gene

a 53-kDa protein Phosphate buffer saline Polymerase chain reaction Retinoblastoma gene Ribonucleic acid Synthesis (phase) Thymin (DNA) Thermus aquaticus Tris-buffered saline Tumour, node, metastasis Vascular endothelial growth factor

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CỦA

1.3 Các protein của HPV và chức năng trong tế bào bị nhiễm 16 2.1 Xếp độ mô học của carcinôm tế bào gai ở hốc miệng 37

2.6 Chương trình PCR khuếch đại các exon 5-8 gen p53 45 2.7 Thành phần và chương trình PCR trước giải trình tự 47

3.3 Liên quan giữa HPV với lâm sàng, mô bệnh học UTNMM 57 3.4 Kết quả đột biến gen p53 trong 52 bệnh nhân UTNMM 59 3.5 Các kiểu đột biến và phổ đột biến gen p53 trong UTNMM 63 3.6 Loại nucleotid và vị trí nucleotid đột biến trong UTNMM 65 3.7 Tình trạng protein p53 đột biến và biểu hiện protein p53 66 3.8 Các axít amin bị biến đổi do đột biến gen p53 68 3.9 Biến đổi giữa các nhóm axít amin do đột biến gen p53 69 3.10 Biểu hiện của protein p53 trong UTNMM so với NMMBT 72

3.11 Liên quan giữa đột biến gen p53 và biểu hiện protein p53 74

3.12 Phân bố các kiểu đột biến gen p53 theo biểu hiện protein p53 75

3.13 Liên quan đột biến gen p53 với lâm sàng, mô bệnh học UTNMM 76

3.14 Liên quan biểu hiện protein p53 với lâm sàng và mô bệnh học 78

3.15 Liên quan HPV với đột biến gen p53 trong UTNMM 79 3.16 Liên quan HPV với biểu hiện protein p53 trong UTNMM 79

3.17 Liên quan HPV và đột biến gen p53 với biểu hiện protein p53 80

3.18 Liên quan giữa HPV và đột biến gen p53 với các đặc điểm lâm sàng,

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Số biểu

3.3 Tỉ lệ đột biến trên các exon và intron của gen p53 58

3.5 Các codon đột biến trên exon 5-8 gen p53 64 3.6 Vùng đột biến trên gen p53 trong UTNMM 65 3.7 Các vùng chức năng của protein p53 đột biến 68

3.9 Liên quan giữa đột biến gen p53 trong UTNMM với số điếu

1.2 Sơ đồ bộ gen của HPV-16 và chức năng của các gen 17

1.4 Các giai đoạn trong phản ứng chuỗi polymerase 21 1.5 Cơ chế sinh ung thư liên quan gen E6 và E7 của HPV 25 1.6 Cấu trúc của protein p53 và các điểm nóng đột biến 26

1.8 Vai trò của gen p53 và mối liên quan với các gen khác 30

2.1 Bộ xét nghiệm và kháng thể kháng p53 dùng nhuộm HMMD 40

2.5 Trình tự đọc bằng đoạn mồi cùng chiều và ngược chiều 48 2.6 Máy giải trình tự ABI 3130 Genetic Analyzer 49

3.8 Kết quả real-time PCR phát hiện HPV týp 16 dương tính 56

3.9 Đột biến điểm thay thế Histidin bằng Arginin tại codon 193

(Đột biến sai nghĩa)

60

3.10 Đột biến mất cytosin tại codon 241 và dừng tổng hợp axít amin

tại codon 246 (Đột biến dịch khung)

61

3.11 Đột biến điểm tại codon 196 dừng tổng hợp axít amin

(Đột biến vô nghĩa)

61

3.12 Đột biến mất 3 nucleotid tại codon 246 làm mất Methionin

(Đột biến trong khung)

62

3.13 Đột biến điểm thay thế Guanin bằng Thymin tại intron 6

(Đột biến ghép nối sai)

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH

Biểu hiện quá mức Overexpression

Carcinôm tế bào gai Squamous cell carcinoma

Chết tế bào theo lập trình Apoptosis

Điểm nóng đột biến Hot spot for mutation

Điện di trên gel Gel electrophoresis

Đoạn mồi thông dụng Consensus primer

Độ ác tính mô học Histologic grade of malignancy Đột biến dừng codon Stop codon mutation

Đột biến dịch khung Frameshift mutation

Đột biến sai nghĩa Missense mutation

Đột biến vô nghĩa Nonsense mutation

Đột biến trong khung Inframe mutation

Đột biến thay thế Substitue mutation

Enzym giới hạn Restriction enzyme

Gen đè nén bướu Tumour suppressor gene

Gen ung thư (oncogen) Oncogene

Giải trình tự chuỗi DNA DNA sequencing

Hóa mô miễn dịch Immunohistochemistry

Hiệp hội quốc tế chống ung thư International Union Against Cancer

Kháng thể đơn dòng Monoclonal antibody

Kháng thể đa dòng Polyclonal antibody

Khoảng tin cậy Confidence interval

Khuếch đại gen Gene amplification

Kinase phụ thuộc cyclin Cyclin-dependent kinase

Liệu pháp nhắm trúng đích Targeted therapy

Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction

Phân hủy protein Protein degradation

Phục hồi kháng nguyên Antigen retrieval

Protein p53 nguyên thủy Wild- type p53

Protein p53 đột biến Mutant p53

Sửa lỗi bắt cặp sai Mismatch repair

Sự đáp ứng với xạ trị Response to radiotherapy

Thụ thể tăng trưởng biểu bì Epidermal growth factor receptor

Tiền gen ung thư Proto-oncogene

Tiền ung thư niêm mạc miệng Oral precancer

Tín hiệu rời nhân Nuclear export signal

Tín hiệu vào nhân Nuclear localization signal

Ung thư niêm mạc miệng Oral cancer

Viêm môi hóa chun do ánh nắng Solar cheilitis

Virút bướu nhú người Human Papilloma virus

Vòng phản hồi tự điều hòa Autoregulary feedback loop

Vùng hoạt hóa phiên mã Transcription activation domain Vùng kiểm soát chiều dài Long control region

Vùng phiên mã sớm Early transcription region

Vùng phiên mã trễ Late transcription region

Xếp độ ác tính mô học Histologic malignancy grading Xếp giai đoạn lâm sàng Clinical staging

Xơ hóa dưới niêm mạc miệng Oral submucous fibrosis

Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch Vascular endothelial growth factor

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư niêm mạc miệng (UTNNM) là một bệnh lý quan trọng vì có xuất độ và

tử suất cao, là một trong 10 loại ung thư thường gặp nhất [57], [87], [192] Đặc biệt ở

Ấn Độ, UTNMM chiếm 40-50% các loại bướu ác [61], [192] Hơn 40 năm qua, tỉ lệ tử vong do UTNMM gây ra vẫn còn cao, bởi vì bệnh nhân đến khám ở giai đoạn bướu đã tiến triển, xâm lấn và di căn [196] Hiện tại, các tiêu chuẩn lâm sàng và giải phẫu bệnh

là thước đo duy nhất để hướng dẫn điều trị và dự đoán tiên lượng Điều trị kinh điển bằng phẫu thuật, xạ trị và hóa trị gây ra nhiều di chứng ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống Thế nhưng, tỉ lệ tái phát bệnh vẫn hơn 50%, tỉ lệ sống 5 năm cải thiện không đáng kể trong thập niên qua [61], [152], [196]

UTNMM là một bệnh lý đa nguyên nhân, và những yếu tố nguy cơ quan trọng nhất đã biết là thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai trầu [61], [139], [204] Tác nhân virút, trong đó đáng chú ý nhất là virút bướu nhú người (HPV), được xem là nguyên nhân sinh ung trong một số bệnh nhân UTNMM [84], [89], [98]

Hơn 30 năm qua, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về HPV [35], [89] HPV

là virút DNA nhỏ, gây ra bướu nhú lành tính ở người và là yếu tố bệnh căn trong một

số ung thư [27], [50], [70] HPV liên quan với nhiều loại ung thư, đặc biệt là ung thư

cổ tử cung (UTCTC) với tỉ lệ HPV từ 80-90% [3], [50], [52] Mối liên quan giữa HPV

với các yếu tố phân tử, như các gen đè nén bướu p53, pRb đã được làm rõ trong cơ chế

sinh ung do HPV ở cổ tử cung, và vắc-xin chống HPV đã lưu hành để phòng ngừa UTCTC [1], [6], [30], [147] Năm 2008, giải Nobel y học đã được trao cho nhà khoa học Harald Zur Hausen do những cống hiến không mệt mỏi của ông - “người giăng câu nhẫn nại”- cho nghiên cứu HPV và sự sinh ung thư [11], [12]

Vùng miệng có đặc điểm tương đồng với cổ tử cung Niêm mạc đều lót bởi biểu

mô gai có lớp mỏng sừng hóa và đều chịu những chấn thương cơ học tạo điều kiện cho

vi khuẩn, các chất hóa học xâm nhập Ung thư tế bào gai là loại bướu ác thường gặp nhất trong hốc miệng [35], [173] Những nghiên cứu trực tiếp trên mô bướu phát hiện DNA của HPV trong UTNMM, các týp phân lập được trong tổn thương UTNMM cũng là những týp thuộc nhóm nguy cơ cao như trong UTCTC [38], [70] HPV liên quan và có thể có giá trị như một yếu tố tiên lượng mức độ và diễn tiến bệnh [134],

[143], [162] Tuy nhiên, vai trò của HPV trong bệnh sinh và là yếu tố tiên lượng chưa được hiểu rõ trong UTNMM [79]

Ở Việt Nam, nghiên cứu HPV tập trung trong lĩnh vực phụ khoa và tai mũi họng, đã có một số nghiên cứu báo cáo về HPV ở bướu gai thanh quản [2], tình hình nhiễm HPV cổ tử cung ở phụ nữ [20], [23], [28], tỉ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ có phết tế bào cổ tử cung bất thường [24], tỉ lệ HPV và các týp HPV thường gặp trong UTCTC [13], [21], mối liên quan giữa HPV với nghịch sản và UTCTC [22], HPV và ung thư đường sinh dục nam [18]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy bất hoạt gen đè nén bướu là mấu chốt quan trọng trong quá trình sinh ung thư bao gồm nhiều bước [200] Các gen đè nén bướu mã hóa cho các protein ngăn cản sự phân bào và tăng trưởng tế bào, cũng như các tín hiệu kháng tăng sinh [68], [200] Đã có nhiều gen đè nén bướu được phát hiện liên quan đến các bước ác tính khác nhau ở người, cũng liên quan trong ung thư đầu cổ (UTĐC)

và UTNMM, trong đó gen đè nén bướu p53 được gọi là “yếu tố bảo vệ bộ gen” do có

vai trò duy trì sự ổn định của bộ gen, vai trò quan trọng trong sự tiến triển của chu kỳ

tế bào, biệt hóa tế bào, sửa chữa DNA tổn thương và hướng dẫn chết tế bào theo lập

trình [39], [68], [183] Gen đè nén bướu p53 là yếu tố di truyền thay đổi nhiều nhất

trong các loại ung thư, với gần phân nửa các loại [39], [91], [183] Đột biến hay bất

hoạt gen p53 làm rối loạn chức năng của protein p53, tích lũy tổn thương DNA và tăng

sinh tế bào chứa DNA hư hại, kéo dài sự sống còn tế bào Năm 1993, Tạp chí Science bình chọn p53 là “phân tử của năm”, do những khám phá về tính chất sinh lý và cơ chế

phân tử trong chức năng của gen p53 từ lúc được phát hiện vào năm 1979 [72] Trong UTNMM, tỉ lệ đột biến gen p53 thay đổi từ 25-69% [35], [41], [68]

Nghiên cứu trong nước về gen và protein p53 trong UTNMM còn ít ỏi, vài nghiên cứu về hóa mô miễn dịch protein p53 [7], [108], một nghiên cứu đầu tiên về

đột biến gen p53 trên một cỡ mẫu nhỏ 18 trường hợp [7] Ngoài ra, đã có nghiên cứu

về đột biến gen p53 trên ung thư đại tràng [17], ung thư vú [26]

Đến nay, chưa có nghiên cứu trong nước về HPV trong UTNMM, liên quan

giữa tình trạng nhiễm HPV với gen p53 và protein p53 trong UTNMM

Ở Việt Nam, tỉ lệ bệnh nhân UTNMM có thói quen hút thuốc cũng như nhai trầu rất cao (87,5% và 64,8%) [7] Ngoài các thói quen nguy cơ phổ biến trên, vấn đề đặt ra là UTNMM ở người Việt Nam có liên quan với HPV hay không? Đột biến gen

p53 xảy ra như thế nào trong UTNMM? HPV và gen đè nén bướu p53 có liên quan

với các đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh của UTNMM hay không?

Chúng tôi thực hiện nghiên cứu “HPV và gen đè nén bướu trong UTNMM”,

mong muốn tìm hiểu tình trạng nhiễm HPV và đột biến gen p53 trong UTNMM với

3 Phân tích mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với đột biến gen p53, biểu

hiện protein p53 trong UTNMM

4 Phân tích mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV, đột biến gen p53, biểu hiện

protein p53 với các đặc điểm lâm sàng (tuổi, giới tính, thói quen nguy cơ, vị trí bướu, kích thước bướu nguyên phát, tình trạng di căn hạch, giai đoạn lâm sàng)

và giải phẫu bệnh (độ ác tính mô học) của UTNMM

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

UTNMM là sự tân sinh ác tính ảnh hưởng đến hốc miệng, chủ yếu ở lớp niêm mạc lót Các vị trí của hốc miệng bao gồm môi, 2/3 trước của lưỡi, niêm mạc má, nướu răng, sàn miệng, khẩu cái cứng và hậu hàm [74], [152]

1.1 BỆNH HỌC CỦA UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG

1.1.1 Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ

1.1.1.1 Tần suất UTNMM

Thống kê năm 2010 (Globocan 2008) của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế ghi nhận xuất độ chuẩn theo tuổi UTNMM ở nam giới là 5,3 /100.000 và ở nữ giới là 2,5 /100.000, tính chung cả hai giới là 3,9 /100.000 [87]

Tần suất UTNMM thay đổi theo mỗi quốc gia, từ 2-45% Hình ảnh toàn cầu cho thấy UTNMM trội ở Nam Á và ung thư miệng- hầu trội ở Đông Nam Á [111], [173] Ở Ấn Độ, Bangladesh, Pakistan và Srilanka, UTNMM là loại thường gặp nhất, chiếm 1/3 tổng số các loại ung thư Có hơn 100.000 ca UTNMM mắc mới mỗi năm ở Nam Á và Đông Nam Á, với tỉ lệ sống còn thấp [173], [196]

Kết quả ghi nhận ung thư tại Việt Nam năm 2008 của IARC (2010) cho thấy xuất độ chuẩn theo tuổi của UTNMM ở nam giới là 1,7 /100.000 và ở nữ giới là 0,9 /100.000, tính chung cả hai giới là 1,3 /100.000 [87]

1.1.1.2 Phân bố theo tuổi

Tỉ lệ mắc bệnh ung thư gia tăng theo tuổi Ở phương Tây, 90% bệnh nhân trên

40 tuổi, thường gặp khoảng 60 tuổi [53], [173], [196] Trong những vùng có tỉ lệ mắc bệnh cao trên thế giới, nhiều trường hợp bệnh nhân dưới 35 tuổi [173] Hơn thế, ở nhiều nước phương Tây trong 2-3 thập niên qua có sự gia tăng đáng báo động về tỉ lệ UTNMM ở người trẻ, và xu hướng dường như tiếp tục tăng [118], [130], [173]

Ở Việt Nam, 90% bệnh nhân UTNMM trên 40 tuổi, thường gặp nhất từ 60-70 tuổi [8]

1.1.1.3 Phân bố theo giới

Ở các nước công nghiệp hóa, tỉ lệ UTNMM ở nam gấp 2-3 lần so với nữ [118], [152], [173] Tuy nhiên, tỉ lệ ung thư lưỡi và các ung thư vị trí khác trong hốc miệng ở

nữ bằng hay nhiều hơn UTNMM ở nam trong một số vùng có tỉ lệ mắc bệnh cao như

Ấn Độ, vì nữ có thói quen nhai trầu [173]

Ở nước ta, số liệu tổng kết tại bệnh viện Ung Bướu TPHCM năm 2005-2006 cho thấy tỉ lệ nam/ nữ là 1,95/1 [8] Tỉ lệ này thay đổi theo từng vị trí trong miệng, tỉ lệ nam/ nữ cao nhất tại vị trí sàn miệng, lưỡi, nướu răng, khẩu cái, giảm dần xuống ở vị trí môi, niêm mạc má [8]

1.1.1.4 Vị trí

Tổng kết gần đây tại Bệnh viện Ung Bướu [7] ghi nhận ung thư lưỡi chiếm 47,3% và là vị trí UTNMM gặp nhiều nhất ở nam giới, ung thư niêm mạc má, ung thư môi cùng chiếm tỉ lệ 12,7% và là vị trí gặp nhiều nhất ở nữ giới, tiếp đến là ung thư sàn miệng, nướu răng và khẩu cái cứng

1.1.1.5 Các yếu tố nguy cơ

 Thuốc lá và nguy cơ UTNMM

Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất liên quan trực tiếp với UTNMM và UTĐC [70], [173] Nghiên cứu ca bệnh - chứng cho thấy mối liên quan giữa hút thuốc

và UTĐC, với nguy cơ gia tăng từ 3-12 lần [70], [88] Sử dụng thuốc lá không hút có nguy cơ ung thư tăng 5-6 lần [88] Ở Việt Nam, hơn 88% bệnh nhân nam UTNMM có thói quen hút thuốc [8]

Hơn 300 chất sinh ung hiện diện trong khói thuốc hay ở hỗn hợp tan trong nước của thuốc lá đọng trong nước bọt, chủ yếu là hydrocacbon dạng vòng và nitrosamin [109] Benzopyren là chất sinh ung mạnh và có lượng 20-40ng trong mỗi điếu thuốc lá [109] Hoffman [100] đề cập đến vai trò của N-nitrosamin Một điếu thuốc có thể chứa 310ng NNN (N-nitrosonornicotine) và 150ng NNK (4-(methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl)-1-butanone) Các chất này hoạt động tại chỗ như ở tế bào tạo sừng, hấp thu cũng như tác động lên nhiều mô và cơ quan khác nhau trong cơ thể

Các chất sinh ung trong thuốc lá gây ra những thay đổi ở DNA, chủ yếu là O-6- methylguanine làm cản trở tính chính xác của quá trình sao chép DNA, gây đột biến, chuyển dạng ác tính một tế bào hay cả dòng tế bào [109] Ung thư liên quan với thuốc

lá thường có biểu hiện quá mức protein p53 cao và tỉ lệ nhiễm HPV thấp hơn [173]

 Rượu và nguy cơ UTNMM

Ethanol nguyên chất không phải là tác nhân sinh ung trong thực nghiệm Rượu

có ảnh hưởng khi có các chất sinh ung khác hiện diện trong thức uống, được gọi là chất đồng sinh ung-và với các chất sinh ung khác trong môi trường, chủ yếu trong thuốc lá [110] Hút thuốc nhiều (trên 25 điếu/ ngày) tăng nguy cơ UTNMM lên 20 lần, uống rượu nhiều tăng nguy cơ UTNMM lên 5 lần, kết hợp cả hút thuốc và uống rượu làm gia tăng nguy cơ UTNMM lên đến 50 lần [89]

Cơ chế sinh ung do rượu theo đường tại chỗ và toàn thân [110]: (1) Ethanol tăng tính thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước Tính hòa tan của ethanol trong màng tế bào tạo sừng làm tăng tính thẩm thấu của chất sinh ung vào các tế bào đang tăng sinh, có thể gây ra đột biến gen (2) Chất chuyển hóa trung gian của ethanol

là acetaldehyd được tạo thành tại chỗ gây tổn thương tế bào (3) Bệnh lý gan do rượu thường gặp ở người nghiện rượu và giảm sự khử độc các chất sinh ung (4) Rượu có năng lượng cao, giảm sự ngon miệng ở người nghiện rượu, tạo thành một chế độ ăn uống không đúng, kết quả là suy dinh dưỡng, khả năng đề kháng với ung thư thấp hơn Bệnh nhân nghiện rượu dễ bị UTĐC, đặc biệt tại vị trí tiếp xúc trực tiếp với rượu

 Thói quen nhai trầu

Trầu cau là dạng quả cau tươi hay phơi khô cắt ra, đặt trên lá trầu Vôi là một thành phần cần thiết làm cho độ pH thay đổi, tăng sự phóng thích alkaloid từ cả thuốc

lá và quả cau nên dược lực tăng lên Thuốc lá thường được thêm vào trong miếng trầu [89], [173]

Gần đây, thói quen này giảm dần ở một số nước như Thái lan, Campuchia, nhưng lại có chiều hướng gia tăng trên một số quốc gia khác như Đài Loan, đặc biệt ở trẻ em và người trẻ Trong một điều tra ở Ấn Độ, Nepal và Pakistan, 20-40% người trẻ trên 15 tuổi nhai trầu hoặc nhai cau Ở Việt Nam, thói quen này đang trên đà giảm dần, chỉ còn gặp ở một số phụ nữ trên 60 tuổi [14], [15] Thói quen này làm tăng nguy cơ ung thư miệng từ 4-35 lần so với người không nhai trầu [89] Nghiên cứu năm 2006 cho thấy 64,8% bệnh nhân nữ UTNMM có thói quen nhai trầu [7]

Quả cau là ngưyên nhân chính gây xơ hóa niêm mạc miệng Số lượng các tế bào biểu mô nhân nhỏ gia tăng là chất đánh dấu nguy cơ ung thư ở những người nhai cau

không có thuốc lá ở Philippine và Ấn Độ [69] Ngoài ra, chất trích trực tiếp từ quả cau gây tổn thương DNA ở tế bào biểu mô người trong thực nghiệm với chất tannin và làm tính thấm biểu mô mạnh lên Hỗn hợp nitroso từ các alkaloid của cau là 3-MNPN, 3-MNPA, NG, NGV và các MNPA là các chất sinh ung mạnh nhất [173]

 Nhiễm trùng niêm mạc miệng

Nhiều virút liên quan với tổn thương tiền ung và UTNMM [173], [200] HPV- tác nhân gây lây nhiễm cho hàng trăm triệu người trên thế giới, là thủ phạm của hàng chục loại bướu lành và ác, trong đó đặc biệt ung thư cơ quan sinh dục nam và nữ [30], [27], [173] - cũng được tìm thấy trong tổn thương tiền ung thư và ung thư ở miệng, 75% là các týp nguy cơ cao 16 và 18 [50], [84]

Nhiễm nấm Candida albicans khá phổ biến trong các tổn thương tiền ung thư

và ung thư Tổn thương bạch sản nhiễm nấm có dạng lâm sàng không đồng nhất, vi thể cho hình ảnh nghịch sản, tuy nhiên khả năng hóa ác rất thấp [56]

 Chấn thương và tình trạng vệ sinh răng miệng

Niêm mạc thường xuyên chịu những kích thích mạn tính có khả năng thoái hóa thành ung thư Các nghiên cứu có nhóm chứng cho thấy tình trạng vệ sinh răng miệng

ở bệnh nhân ung thư kém hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng, số răng sâu cũng nhiều hơn Vệ sinh răng miệng được cho là một yếu tố nguy cơ trong UTNMM [137], [141]

 Chế độ dinh dưỡng

Tình trạng suy dinh dưỡng làm cho niêm mạc nhạy cảm hơn với các tác nhân sinh ung Những người dùng ít trái cây và rau xanh có nguy cơ bị UTNMM [185], [196] Bổ sung vitamin C và chất xơ có hiệu quả trên tỉ lệ sống còn của bệnh nhân ung thư miệng- hầu [159]

1.1.1.6 Các tổn thương tiền ung thư

Nhóm nguy cơ ung thư thấp:

 Bạch sản [68], [118], [192]: mảng trắng đồng nhất, sờ láng hoặc có dạng không đồng nhất, kết hợp dạng hòn, nốt hoặc hồng sản Nguy cơ hóa ác cao đối với dạng không đồng nhất: 10-15%

 Xơ hóa dưới niêm mạc miệng [68], [152]: liên quan với thói quen nhai trầu Niêm mạc miệng teo mỏng, mất dần sự đàn hồi và xuất hiện những dãy sợi

co kéo, hạn chế cử động của miệng Tỉ lệ hóa ác 3-19%

 Viêm môi hóa chun do ánh nắng [56]: đặc điểm xơ, teo Tỉ lệ hóa ác 10%

 Lichen phẳng [68], [118]: nguy cơ hóa ác thấp 0,4-5,6%

 Lupus đỏ mạn tính [56], [152]: tỉ lệ hóa ác chỉ 0,5%

Nhóm nguy cơ ung thư cao:

 Hồng sản [56], [68]: là những mảng đỏ như nhung, không có đặc tính lâm sàng hay bệnh lý giống bất cứ bệnh nào Đây là tổn thương thường đã hóa

ác về mặt vi thể, hơn 90% có biểu hiện nghịch sản, carcinôm tại chỗ hay carcinôm xâm lấn

1.1.2 Bệnh sinh phân tử của UTNMM

UTNMM xuất hiện là kết quả của nhiều sự kiện phân tử, có được do sự kết hợp khuynh hướng di truyền của mỗi cá thể và sự tíếp xúc với các tác nhân sinh ung trong môi trường Tiếp xúc lâu dài với các chất sinh ung như thuốc lá, rượu; nhiễm virút sinh ung và tình trạng viêm nhiễm khác có thể làm tổn thương các gen và nhiễm sắc thể [51], [63], [73]

Tích lũy những thay đổi di truyền như vậy dẫn đến sự phát triển các tổn thương tiền ung thư và ung thư xâm lấn Những thay đổi di truyền bao gồm hoạt hóa hoặc khuếch đại oncogen, khuyến khích sự sống và tăng sinh tế bào, bất hoạt các gen đè nén bướu liên quan đến sự ức chế tăng sinh tế bào [68], [73]

Từ những thay đổi của oncogen hay/và gen đè nén bướu, tế bào bướu đạt được

sự tăng trưởng tự động và phá vỡ tín hiệu điều hòa tăng trưởng, sinh sản không kiểm soát được Do vậy, tế bào bướu thoát khỏi sự chết theo lập trình, sao chép vô hạn nhờ quá trình bất tử tế bào do hoạt động của enzym telomerase [95] Ngoài ra, khi

UTNMM tăng trưởng, có sự kích thích tăng sinh các tế bào nội mô và hình thành các mạch máu mới Giai đoạn tiến triển tiếp theo của ung thư là xâm lấn mô và di căn [95]

1.1.2.1 Gen đè nén bướu

Gen đè nén bướu mã hóa các protein dẫn truyền các tín hiệu điều hòa tăng trưởng theo kiểu âm Những protein này liên quan đến quá trình điều hòa chu kỳ tế bào, bao gồm dừng chu kỳ tế bào và chết theo lập trình [63], [68] Protein p53 bị bất hoạt bởi nhiều cơ chế như đột biến điểm, khuyết gen, gắn với protein của tế bào hay

của virút và bị phân hủy [39], [63] Một khi protein p53 bị bất hoạt, tế bào thoát khỏi

sự kiểm soát chặt chẽ trong chu kỳ tế bào, có khuynh hướng tăng sinh và phân chia

không kiểm soát, tạo nên kiểu hình ác tính Đột biến gen p53 xảy ra trong 25-69%

UTNMM và biểu hiện protein p53 trong 15-60% [41], [46], [68]

Trong tế bào bình thường, gen p16 sản xuất protein p16 giữ vai trò điều hòa chu

kỳ tế bào Protein p16 gắn với kinase phụ thuộc cyclin CDK4 và làm mất chức năng

khởi phát sự phân chia tế bào của CDK4 [164] Đột biến gen p16 hoặc mất biểu hiện

protein p16 thường gặp trong tổn thương tiền ung thư và UTNMM (59% và 63%) cho thấy đây là một bước sớm trong quá trình sinh ung thư ở miệng [86], [154], [169]

Gen đè nén bướu p21 là yếu tố ức chế chu kỳ tế bào quan trọng Protein p21

tương tác với cyclin/CDK, tương tác này làm dừng chu kỳ tế bào Protein p21 đóng vai trò chính trong việc điều hòa chức năng đè nén tăng trưởng và thúc đẩy tế bào chết, đây cũng là chức năng của protein p53 [63] Các nghiên cứu chứng minh biểu hiện của protein p21 tăng trong tổn thương tiền ung thư và ung thư, gợi ý những thay đổi trong biểu hiện của protein p21 có thể là sự kiện sớm trong quá trình sinh ung thư [63], [86]

Sản phẩm của gen đè nén bướu pRb, chất điều hòa chính của tiến triển chu kỳ tế

bào pha G1/S Bình thường protein pRb không được phosphoryl hóa, tạo thành phức hợp với yếu tố phiên mã E2F ức chế sự phiên mã các gen điều hòa tổng hợp DNA

[192] Đột biến gen pRb dẫn đến sự phóng thích E2F và hoạt hóa sự phiên mã của gen

này trong chu kỳ tế bào [63] Protein pRb là điểm đích của nhiều oncoprotein của virút DNA như protein E7 của HPV Vắng biểu hiện protein pRb trong 66% UTNMM và 64% tổn thương tiền ung thư ở miệng [154], [169]

1.1.2.2 Oncogen

Oncogen (gen ung thư) là những gen phát sinh nhờ vào sự thay đổi của tiền oncogen (tiền gen ung thư) mã hóa các protein điều hòa sự tăng trưởng tế bào theo kiểu dương và / hoặc tín hiệu sống còn tế bào [10], [68] Khi tiền oncogen hoạt hóa thành oncogen, tế bào tăng sinh không kiểm soát dẫn đến sự hình thành bướu [10], [63] Một số cơ chế phổ biến của sự hoạt hóa oncogen gồm có đột biến, chuyển vị nhiễm sắc thể, khuếch đại gen [63], [68]

Oncogen được chia thành các nhóm có chức năng sau: (1) yếu tố tăng trưởng và thụ thể yếu tố tăng trưởng, (2) yếu tố dẫn truyền tín hiệu tế bào (ras, raf, stat-3), (3) yếu tố phiên mã (myc, fos, jun, c-myc), (4) yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào (cyclin D1)

và (5) yếu tố liên quan sự chết tế bào theo lập trình (bcl-2, bax) Đa số các oncogen khuyến khích tế bào tăng sinh bằng cách tăng tốc các điểm kiểm soát G1/S, G2/M và M trong chu kỳ tế bào [10], [63], [192], [200]

1.1.3 Bệnh học của UTNMM

1.1.3.1 Vi thể

Về mặt vi thể, carcinôm tế bào gai chiếm tỉ lệ nhiều nhất (90-95%), carcinôm tế bào tuyến (5-6%), ngoài ra có các dạng mêlanôm và sarcôm [9], [16] Carcinôm tế bào gai còn có các biến thể như carcinôm dạng mụn cóc, carcinôm tế bào gai dạng tuyến Carcinôm tế bào gai được phân chia theo độ ác tính mô học (độ 1, độ 2, độ 3 và carcinôm dạng mụn cóc) dựa vào cấu trúc, mức độ biệt hóa, sự dị dạng của nhân tế bào, số phân bào, mức độ sừng hóa, kiểu và mức độ xâm lấn [68], [152] Nghiên cứu trong nước (2006) cho thấy 94,2% UTNMM có dạng vi thể là carcinôm tế bào gai [8]

1.1.3.2 Bướu nguyên phát

Các dạng lâm sàng thường gặp của bướu nguyên phát ở miệng gồm có dạng chồi sùi, dạng loét, dạng thâm nhiễm, dạng kết hợp giữa chồi sùi- loét, loét- thâm nhiễm Bướu lan rộng trên bề mặt hay xâm lấn sâu tùy thuộc dạng lâm sàng và vị trí tổn thương Xâm lấn da, cơ, xương, thần kinh xảy ra ở giai đoạn trễ [56], [68], [152]

1.1.3.3 Di căn hạch

Tỉ lệ di căn hạch phụ thuộc vào vị trí, kích thước, loại mô học và độ mô học của bướu nguyên phát; thời gian tiến triển và điều trị trước đó [173] UTNMM thường cho

di căn đến hạch dưới hàm và cơ hai thân [56], [152] Hạch di căn giai đoạn đầu sờ chắc, không đau, di động Nếu tế bào bướu làm vỡ vỏ bao hạch và xâm lấn mô liên kết xung quanh, hạch lúc này dính cứng và thâm nhiễm Khoảng 30% UTNMM có hạch

cổ di căn ngay vào thời điểm phát hiện bệnh Đặc biệt với vị trí ung thư tại lưỡi, 66% bệnh nhân có hạch cổ tại thời điểm chẩn đoán [99] Hạch cổ di căn là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng nhất [173]

1.1.3.4 Di căn xa

Ngoài di căn hạch vùng, khoảng 10% UTNMM có di căn xa [152] Vị trí di căn

xa thường gặp là phổi (52-60%), xương (19-35%), gan, da, não Tỉ lệ di căn xa ở bệnh nhân có hạch cổ cao hơn ở bệnh nhân không có hạch [132]

1.1.4 Chẩn đoán

Để chẩn đoán UTNMM và xếp hạng giai đoạn lâm sàng hoàn chỉnh, cần có đầy

đủ các thông tin từ khám lâm sàng tại chỗ, khám hạch vùng kết hợp các xét nghiệm như chụp cắt lớp điện toán, chụp phim phổi, siêu âm, xét nghiệm máu, sinh thiết bướu

và / hoặc hạch vùng [9], [10], [152], [173]

Bảng 1.1: Xếp hạng lâm sàng TNM (Hiệp hội quốc tế chống ung thư, 2002)

T: bướu nguyên phát

TX: không tìm thấy bướu nguyên phát

T0 : không có bướu nguyên phát

TIS : carcinôm tại chỗ

T1: bướu có kích thước nhỏ hơn 2cm

T2 : bướu có kích thước lớn hơn 2cm và nhỏ hơn 4cm

T3 : bướu có kích thước lớn hơn 4cm

T4 : bướu xâm lấn cấu trúc xung quanh (cơ, xương, da, )

N : hạch vùng

NX : không xác định được hạch vùng

N0 : không có hạch sờ được trên lâm sàng

N1 : một hạch cùng bên, kích thước nhỏ hơn 3cm

N2a : một hạch cùng bên, kích thước lớn hơn 3cm và nhỏ hơn 6cm

b : nhiều hạch cùng bên, kích thước nhỏ hơn 6cm

c : hạch hai bên hay đối bên, kích thước nhỏ hơn 6cm

mô học và tình trạng của bệnh nhân [9], [68], [173]

1.1.5.1 Phẫu thuật

Phẫu thuật điều trị ung thư bao gồm cắt rộng bướu đơn thuần; cắt rộng bướu kèm nạo hạch cổ; phối hợp phẫu thuật với xạ và hóa trị [9], [10], [182] Phẫu thuật chỉ định với bướu nguyên phát nhỏ (T1 và T2), bướu xâm lấn xương hay bướu kèm di căn hạch cổ, bướu không đáp ứng xạ trị [68], [173] Phẫu thuật có ưu điểm giúp biết được mức độ ăn lan của bướu; ít gây biến chứng và tác hại đối với mô xung quanh, nhưng

có phần hạn chế do vị trí vùng miệng khó đạt được phẫu thuật tận gốc nên dễ tái phát

và gây ảnh hưởng đến thẩm mỹ và chức năng [9], [10], [173]

Hạch cổ di căn được điều trị với phẫu thuật nạo hạch cổ tận gốc Nạo hạch cổ tận gốc phòng ngừa khi có nguy cơ di căn hạch cao, đặc biệt chỉ định trong điều trị ung thư lưỡi [9], [68]

1.1.5.2 Xạ trị

Điều trị UTNMM chủ yếu là xạ trị trong, cắm hay đặt nguồn đồng vị phóng xạ vào trong bướu Xạ trị ngoài được chỉ định khi bướu lớn, bệnh nhân bị khít hàm hay trong điều trị hỗ trợ Liều xạ triệt để là 60-70Gy Xạ trị ngoài hạch cổ chỉ định đối với hạch di căn không rõ nguyên nhân, carcinôm không biệt hóa, hạch kích thước lớn N3 [9], [10], [68], [173]

Xạ trị có ưu thế là trường chiếu rộng, có khả năng tiêu diệt những tế bào ung thư ở vùng rìa tổn thương nên an toàn hơn, đồng thời bảo tồn chức năng và thẩm mỹ Hạn chế của xạ trị là gây nhiều biến chứng, có biến chứng rất nặng như hoại tử xương hàm sau xạ [9], [10], [173]

1.1.5.3 Hoá trị

Có thể dùng đơn hóa trị (5-FU, Cisplatin, Methotrexate, Bleomycin, carboplatin, vinblastine…) hoặc đa hóa trị [9], [10], [173], [182] Hóa trị có thể dùng dẫn đầu, phối hợp hay hỗ trợ, trong trường hợp ung thư giai đoạn tái phát hay trong điều trị tạm bợ [9], [68] Phác đồ phối hợp thường dùng là Cisplatin với 5-FU hay Cisplatin với Methotrexate Kết hợp Cisplatin với 5-FU cho tỉ lệ đáp ứng hoàn toàn đến 50% trong nhóm bệnh nhân UTNMM chưa được điều trị gì trước đó, nên hóa trị

đã được sử dụng thường xuyên hơn trên bệnh nhân giai đoạn tiến xa hay bệnh nhân UTNMM tái phát [173]

Các biến chứng của hóa trị như nôn ói, độc tính trên gan, thận, da, viêm thần kinh, gây suy tủy [10], [173]

1.1.5.4 Điều trị đa mô thức

Phẫu thuật kết hợp với xạ trị- xạ trị trước mổ và hay xạ trị sau mổ [9], [10], [74], [173] Hóa trị kết hợp với xạ trị và phẫu trị; hóa trị- xạ trị đồng thời hay xen kẽ; hóa trị hỗ trợ sau phẫu hay xạ [9], [10], [182]

1.1.5.5 Điều trị nâng đỡ

Bệnh nhân ở giai đoạn bệnh tiến triển, bệnh nhân già yếu, suy kiệt không thể chỉ định điều trị triệt để Những trường hợp này được xử trí triệu chứng bằng điều trị nâng đỡ, bao gồm điều trị tạm bợ (liều xạ 20-30Gy), điều trị nội khoa để kiểm soát đau hoặc giảm nhẹ triệu chứng [35], [173]

1.1.5.6 Điều trị mới: liệu pháp nhắm trúng đích

Đã có những hiểu biết vượt bậc về các đặc điểm tiêu biểu của ung thư và các phân tử đóng vai trò chủ chốt trong cơ chế của các đặc điểm này [95] Điều trị trực tiếp nhắm vào các đích phân tử này là một chiến lược điều trị hiệu quả [10], [63] Nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng với các tác nhân khác nhau trong liệu pháp nhắm trúng đích,

và thử nghiệm lâm sàng cho thấy khả năng của các thuốc mới này gia tăng hiệu quả điều trị mà ít có độc tính [63], [73]

Với UTNMM, đích nhắm chủ yếu trong liệu pháp đích gồm có yếu tố liên quan điều hòa tăng trưởng như thụ thể tăng trưởng biểu bì (EGFR), yếu tố tăng trưởng nội

mô mạch (VEGF), gen p53 [63], [73]

1.1.6 Tiên lượng

Các yếu tố tiên lượng đã và đang được ứng dụng chủ yếu vẫn dựa vào lâm sàng

và giải phẫu bệnh [68], [118], [152], [182]: (1) Kích thước bướu, di căn hạch, di căn

xa (TNM), (2) Giai đoạn lâm sàng, (3) Vị trí bướu, (4) Loại và độ mô học của bướu, (5) Diện cắt của phẫu thuật, (6) Sự đáp ứng với xạ trị, (7) Tình trạng tái phát và (8) Sự xuất hiện ung thư thứ hai

1.2 HPV VÀ GEN p53 TRONG UTNMM

Các nghiên cứu sâu hơn chứng minh liên quan của virút bướu nhú người với các tổn thương tiền ung thư và ung thư ở cổ tử cung, âm đạo, kết mạc, đường hô hấp - tiêu hóa trên [30], [194] Nhiễm HPV liên quan với khoảng 10% tổn thương ung thư, chủ yếu là ung thư đường niệu-sinh dục và HPV hiện diện trong khoảng 90% UTCTC trên toàn cầu [81], [101]

Hình 1.1 : Hình dạng HPV (Ali S.M.A) [35]

A & C : HPV-2 (trên kính hiển vi điện tử)

B & D : mô phỏng hình dạng HPV

1.2.1.2 Cấu trúc bộ gen của HPV

HPV là virút DNA (đường kính 55nm) thuộc họ Papovaviridae Họ này gồm có papillomavirus, polyomavirus và vacuolating simianvirus (SV40), virút sau cùng hiện nay được xếp chung vào nhóm polyoma Các papillomavirus được đặt tên theo chủng

gây nhiễm và đánh số theo thứ tự khám phá Những virút được nghiên cứu nhiều nhất

là papillomavirus thỏ đuôi bông (CRPV), bò (BPV) và người (HPV) [172]

Bộ gen HPV gồm 7.900 cặp base trong chuỗi đôi DNA xoắn tròn bao quanh là capsid Bộ gen có 10 đơn vị chức năng gọi là cấu trúc đọc mở (ORF) ORF được chia thành vùng phiên mã sớm (E), chiếm 50% bộ gen, và vùng trễ (L) chiếm 40% [101]

Vùng gen phiên mã sớm E gồm từ E1 đến E8, biểu hiện sớm sau khi nhiễm trùng và mã hóa những protein liên quan đến quá trình sao chép của virút Gen E8 nằm trong E1, còn gen E3 đến nay vẫn chưa biết rõ chức năng [101]

Vùng gen phiên mã trễ L gồm L1 và L2, biểu hiện trễ sau nhiễm trùng và mã hóa protein capsid Vùng không liên quan cấu trúc đọc mở là vùng kiểm soát chiều dài chiếm 10% bộ gen, chứa yếu tố điều hòa sự sao chép và phiên mã [52], [101], [194]

Bảng 1.3: Các protein của HPV và chức năng trong tế bào bị nhiễm [101]

Điều hòa biểu hiện gen, dừng chu kỳ tế bào tại G2 Liên quan màng, hoạt hoá các yếu tố tăng trưởng Tương tác với E6-AP (liên quan p53)

Phiên mã gen Kéo dài đời sống tế bào bị nhiễm Tăng hoạt động telomerase Tương tác với protein pRb, cyclin A và E Tăng sinh, bất tử và chuyển dạng tế bào nhiễm virút

Tự tập hợp thành phân tử virút Protein capsid loại lớn, 360 bản sao/ phân tử virút Protein capsid loại nhỏ, 12 bản sao/ phân tử virút

Hình 1.2: Sơ đồ bộ gen của HPV- 16 và chức năng của các gen [106]

“Nguồn: http://www.microbiologybytes.com/virology/papillomaviruses.html”

1.2.1.3 Phân loại HPV nhóm nguy cơ cao và thấp

Hiện nay, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng để phân loại HPV Nếu tính đồng dạng của E6, E7 và L1 thấp hơn 90%, bộ gen được xếp vào một týp mới và đánh số týp theo thứ tự khám phá Tính đồng dạng vượt trên 90% được xem là phân nhóm của virút, và đồng dạng hơn 98% chỉ ra đây là một biến thể [52], [101], [194] Hiện nay có hơn 200 týp virút được phát hiện và phân loại [139]

Đa số týp HPV tìm thấy trong những tổn thương tăng sản biểu mô như bướu nhú, mụn cóc, condylôm Đây là những týp được phân thành nhóm nguy cơ thấp gồm týp 2, 4, 6, 11, 13, 32, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 63…[101], [194]

Biểu hiện gen

Protein tín hiệu màng Giải phóng virút

Sao chép DNA

Những týp HPV khác tìm thấy trong UTCTC, ung thư khác ở đường hậu sinh dục, UTĐC, UTNMM, ung thư da HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58…được phát hiện trong 90% tổn thương tiền ung và ung thư vùng sinh dục [101], [82] Đây là những týp nhóm nguy cơ cao Bộ gen virút tích hợp vào DNA mô chủ và hoạt động phiên mã trong bướu và dòng tế bào từ bướu Từ những bằng chứng này, Cơ quan quốc tế nghiên cứu ung thư phân loại HPV-16, 18 là tác nhân sinh ung ở người (nhóm 1) HPV-31 và 33 là tác nhân có khả năng sinh ung (nhóm 2A) và các týp còn lại là tác nhân có thể sinh ung (nhóm 2B) [139], [194]

môn-Sự khác biệt về mặt chức năng giữa các týp nguy cơ cao và thấp liên quan rõ với sự chuyển dạng ác tính của các tế bào bị nhiễm Týp nguy cơ cao gây ra sự bất ổn nhiễm sắc thể trong tế bào và các protein E6, E7 của virút tương tác đặc hiệu với các protein của tế bào (p53, pRb) - protein liên quan đến sự tăng trưởng và tăng sinh tế bào So sánh chuỗi DNA giữa các týp nguy cơ cao và thấp cho thấy sự khác biệt một axít amin tại codon 21 (như Asp21 ở HPV16- E7 và glycin ở HPV6-E7) [168]

1.2.1.4 Chu kỳ đời sống của HPV

Nhiễm HPV có thể từ rất sớm, virút nhiễm vào miệng từ đường sinh dục của người mẹ trong khi sinh; do tự lây nhiễm từ tổn thương ở đường sinh dục hoặc do tiếp xúc miệng- sinh dục giữa các bạn tình Nhiễm HPV có thể không có triệu chứng hoặc gây ra những tổn thương lành hay ác tính [52], [194]

HPV nhiễm vào các tế bào biểu mô gai và quá trình nhiễm trùng xảy ra song song với các giai đoạn biệt hóa của tế bào biểu mô [206] Giai đoạn sớm của nhiễm trùng gồm có hiện tượng virút bám dính vào tế bào và sao chép DNA, chỉ xảy ra trong các tế bào lớp đáy đang phân chia nhờ các trầy sướt trên da, niêm mạc Nhiễm trùng giai đoạn trễ hơn, gồm có sự sản xuất các phân tử virút, xảy ra ở các tế bào biểu mô lớp gai đã biệt hóa hoàn chỉnh Virút di chuyển vào nhân, quá trình sao chép đưa bộ gen virút lên đến 50 bản sao trong mỗi tế bào (số bản sao tùy thuộc týp HPV) Bộ gen virút ở dạng episôm với số bản sao thấp trong một thời gian dài trong lớp đáy biểu mô, nơi virút sao chép đồng thời với pha S trong chu kỳ sinh sản của tế bào chủ [49], [96], [101]

Hình 1.3: Chu kỳ đời sống của HPV (Zur Hausen H) [206]

1.2.1.5 Đáp ứng của mô chủ đối với nhiễm HPV

Nhiễm HPV thường không tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh Tuy nhiên, nhiễm HPV thường hoàn toàn hết hẳn trong vài năm, và 18 tháng sau khi bị nhiễm, hơn 80%-90% bệnh nhân khỏi bệnh [27], [31] Hệ thống miễn dịch mô chủ, đặc biệt đáp ứng qua trung gian tế bào có liên quan trong cơ chế làm sạch nhiễm trùng Kháng thể kháng HPV đặc hiệu theo týp và có hiệu quả trong phòng ngừa nhiễm trùng, trong khi đáp ứng qua tế bào T liên quan với làm sạch nhiễm trùng [195] Nồng độ kháng thể trong huyết thanh ổn định theo thời gian và được sử dụng như dấu ấn nhiễm HPV, mặc

dù không phải tất cả trường hợp nhiễm HPV đều có nồng độ kháng thể trong huyết thanh tăng cao

1.2.1.6 Các kỹ thuật phát hiện HPV

Người là vật chủ duy nhất của HPV Lây truyền virút qua tiếp xúc sinh lý trực tiếp hoặc qua bề mặt bị nhiễm Chẩn đoán HPV qua nuôi cấy không thực hiện được vì virút chỉ sao chép trong tế bào biểu mô biệt hóa [52], [55] Vì vậy, chẩn đoán HPV bằng cách phát hiện sự hiện diện DNA virút bằng PCR, lai phân tử hoặc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng HPV trong huyết thanh [193], [194]

 Southern blot

Kỹ thuật này được sử dụng để phát hiện DNA-HPV DNA mô chủ được cắt nhỏ bằng các enzym giới hạn, sau đó được phân cách bằng điện di trên gel Sau khi biến tính, chuyển DNA lên màng và định týp HPV bằng cách lai với DNA- HPV đã được

tạo dòng và có gắn chất đánh dấu Kỹ thuật cung cấp thông tin virút ở dạng tích hợp hay dạng episôm (thể bổ sung) Ưu điểm chính của kỹ thuật là tính đặc hiệu cao trong định týp HPV Xét nghiệm cần nhiều thời gian và lượng DNA tương đối lớn (5-10µg) [52], [55], [193]

 Dot blot

Kỹ thuật với DNA được chuyển và gắn lên màng ở dạng chuỗi đơn mà không cần sử dụng enzym cắt giới hạn Giống như Southern blot, định týp HPV bằng cách lai với DNA-HPV có gắn chất đánh dấu Độ nhạy kỹ thuật khoảng 1 bản sao bộ gen/ tế bào, sử dụng khoảng 0,3-1µg DNA Kỹ thuật có ưu điểm thực hiện nhanh, tuy nhiên tính đặc hiệu thấp hơn so với Southern blot [19], [75]

 Lai tại chỗ

DNA trong kỹ thuật lai tại chỗ không chỉ để phát hiện DNA virút mà còn giúp xác định vị trí của virút trong mô Các lát cắt mô tổn thương trên tiêu bản kính được biến tính DNA và lai với mẫu dò DNA hay RNA Độ nhạy thay đổi tùy thuộc các kỹ thuật lai khác nhau, có thể nhận diện 20-25 bản sao HPV/tế bào Lai tại chỗ nhận diện virút ở dạng tích hợp trong nhiễm sắc thể hay ở thể episôm trong nhân [55], [75]

 PCR

PCR là phương pháp in vitro dựa trên phản ứng chuỗi polymerase, khuếch đại

một đoạn đích của DNA [19], [25], [29], [194] DNA được khuếch đại có thể phát hiện được nhờ hiện hình dưới tia tử ngoại sau khi điện di trên gel agarose nhuộm ethidium bromide hoặc nhờ vào một mẫu dò gắn chất đánh dấu [193], [194] Xét nghiệm này phát hiện HPV với độ nhạy cao và đã trở thành phương pháp chọn lựa cho các nghiên cứu dịch tễ [52], [55], [194]

Hình 1.4: Các giai đoạn trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

“Nguồn: http://www.users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html” [105]

 Một số PCR phổ biến

 PCR đơn mồi: dùng một cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA đích [25]

 PCR đa mồi: sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích các týp

HPV muốn phát hiện đồng thời [25], [29]

 Real-time PCR hay còn gọi là PCR thời gian thực: cho biết chính xác thời điểm

khuếch đại DNA đích Ưu điểm của real-time PCR có thể định tính và định lượng, kết quả khuếch đại hiển thị ngay Do vậy, không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả [19], [25], [29]

 Đoạn mồi khuếch đại DNA HPV

Độ nhạy của PCR phụ thuộc vào đoạn mồi Đoạn mồi có thể đặc hiệu về týp hoặc loại thông dụng khuếch đại nhiều týp So sánh các đoạn mồi thông dụng cho thấy

sự khác nhau về độ nhạy và độ đặc hiệu trong phát hiện HPV [194]

Đa số PCR phát hiện HPV dùng những đoạn mồi thông dụng để khuếch đại DNA đích của virút [194] Đoạn mồi MY09/ MY11 hoặc GP5+/GP6+ định vị trong vùng bảo tồn cao của L1 [199] MY09/MY11 khuếch đại đoạn 450 cặp base và có khả năng phát hiện hơn 30 týp HPV [90] GP5/GP6 khuếch đại chuỗi nhỏ hơn (150 cặp base) so với MY09/ MY11, có hiệu quả hơn đối với mô vùi nến Cải tiến hiệu quả

đoạn mồi bằng cách thêm 3 nucleotid ở GP5 và 5 nucleotid ở GP6 ở đầu tận cùng Đoạn mồi GP5+/GP6+ với độ nhạy cao có thể phát hiện hầu hết các týp HPV Những đoạn mồi thông dụng khác được thiết kế từ vùng bảo tồn E1 (CPI/CPII), vùng E6, E7 (LCR-E7) [93], [194]

 Định týp HPV

Sau khi khuếch đại DNA-HPV, định týp bằng một trong nhiều phương pháp: PCR với đoạn mồi đặc hiệu týp, lai với mẫu dò đặc hiệu týp (Dot blot- Southern blot), giải trình tự chuỗi và xét nghiệm miễn dịch enzym [19], [194]

Ngoài ra, độ nhạy khác nhau đối với mô khác nhau (mô vùi nến hay mô tươi trữ đông) gây phức tạp khi lý giải và so sánh số liệu Nghiên cứu từ các labo kinh nghiệm thường sử dụng mô tươi trữ đông và với nhiều phương pháp phát hiện HPV để có bằng chứng thuyết phục về sự hiện diện HPV [194]

 Xét nghiệm huyết thanh phát hiện nhiễm HPV

Kháng thể đối với kháng nguyên capsid HPV là dấu ấn đáng tin cậy về tình trạng nhiễm HPV hiện tại hay trước đó [76] Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể (IgG) kháng kháng nguyên capsid Độ nhạy của xét nghiệm huyết thanh học khoảng 50% Kháng thể kháng E6 và E7 liên quan với ung thư xâm lấn và không liên quan với kháng nguyên capsid HPV [194] Các nghiên cứu huyết thanh học nhận diện HPV-16

là yếu tố nguy cơ chính trong UTĐC, kháng thể kháng HPV16- E6 và E7 được chứng minh xuất hiện trong UTĐC [82], [98]

1.2.1.7 HPV và các týp HPV trong niêm mạc miệng bình thường (NMMBT)

Tỉ lệ HPV thay đổi từ 0%- 70% [55], [93] với cả các týp thuộc nhóm nguy cơ thấp và nguy cơ cao [127]

HPV tồn tại trong NMMBT thể hiện tình trạng nhiễm trùng tiềm ẩn hay ở dạng chưa biểu hiện trên lâm sàng Nhiễm HPV trong hốc miệng cho thấy niêm mạc miệng

có thể là nơi cư trú của HPV [55]

 HPV ở tổn thương tiền ung thư và UTNMM

Gần 30 năm qua, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về HPV trong UTNMM [89] Các kỹ thuật về DNA phát hiện tổn thương tiền ung và ung thư thường nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao (chủ yếu HPV-16 và 18) [70], [89]

Tỉ lệ HPV trong UTNMM thay đổi từ 0- 100% [82], [89], [93], [97] Phân tích 4.680 trường hợp UTNMM từ 94 báo cáo cho thấy tỉ lệ HPV trong tổn thương tiền ung cao gấp 2-3 lần, trong UTNMM cao gấp 4,7 lần so với trong NMMBT Phát hiện HPV nhóm nguy cơ cao gấp 2,8 lần so với nhóm nguy cơ thấp cho những bằng chứng về tình trạng nhiễm HPV trong miệng, đặc biệt các týp sinh ung là yếu tố nguy cơ có ý nghĩa đối với UTNMM [144]

1.2.1.8 Cơ chế sinh ung của HPV trong UTNMM

Trong các protein của HPV, E6 và E7 có vai trò quan trọng nhất giúp virút sao chép và làm bất tử, chuyển dạng tế bào mô chủ

Trong tế bào ung thư và tế bào sừng chuyển dạng do HPV in vitro, HPV DNA

tích hợp vào bộ gen mô chủ [148] Trong quá trình tích hợp, bộ gen virút thường bị gãy tại vùng E1/E2 Do E2 mã hóa protein ức chế sự phiên mã của gen E6 và E7, nên mất E2 làm tăng sản xuất protein E6 và E7 không kiểm soát Protein E6 và E7 gia tăng làm chuyển dạng tế bào mô chủ và tạo bướu [82], [89] Protein E6 và E7 của HPV nhóm nguy cơ cao bất hoạt protein p53 và pRb [50], [82] Về mặt chức năng, nhiễm HPV có thể thay thế ít nhất hai sự kiện đột biến và góp phần vào quá trình sinh ung thư bao gồm nhiều bước

 Tương tác với protein p53

Protein E6 gắn với protein p53 và kích thích phân hủy p53 [50], [101], [194] Biểu hiện protein p53 bị giảm trong tế bào bị bất tử do HPV-E6 và những tế bào này không dừng được chu kỳ tế bào tại điểm G1 sau khi DNA bị tổn thương [96], [101]

Sự gắn kết protein HPV-16 hoặc 18 với protein p53 xảy ra trong tế bào chất của tế

bào, sự phân hủy protein p53 ngăn cản gen p53 thực hiện chức năng ức chế tạo bướu

xảy ra trong nhân tế bào

Liên quan giữa E6 với p53 qua trung gian một protein hỗ trợ được gọi là protein

liên quan E6 (E6-AP) [101] Nghiên cứu in vitro cho thấy E6-AP kích thích sự kết nối

giữa E6 với p53 và gây ra sự phân hủy p53 phụ thuộc E6 [101], [194] Mặt khác, E6 cũng làm cho khoảng đời sống tế bào kéo dài bằng cách tăng điều hòa hoạt động của enzym telomerase [101], [206]

 Tương tác với pRb

HPV-E7 kết nối với protein pRb và phức hợp pRb-E7 được phát hiện trong tế bào sừng chuyển dạng do HPV-16 [194] Protein E7 của HPV nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp hoàn toàn giống nhau về thành phần axít amin và cách sắp xếp cấu trúc, nhưng khác nhau về tính gây chuyển dạng và một số tính chất sinh hóa Protein E7 của HPV-16 và 18 kết nối với pRb mạnh hơn [50] Kết nối giữa protein E7 với pRb giúp phóng thích yếu tố phiên mã E2F, yếu tố này hoạt hóa sự phiên mã của các gen kích thích tổng hợp DNA trong tế bào [50], [52], [96] Ngoài ra, E7 tương tác và ức chế cyclin A và E là những cyclin chính trong pha G1 và pha S [101], [206] Nếu hoạt động E6 giải phóng tế bào khỏi sự kiểm soát của p53, các tế bào sống sót đi vào pha S với DNA bị hư hại và nhờ hoạt động của E7, có thể sao chép DNA HPV [50], [52]

Ảnh hưởng của E6 và E7 đối với gen p53 và pRb cung cấp những cơ sở về vai

trò sinh ung của HPV Hoạt động của hai oncoprotein này đẩy mạnh chu kỳ tế bào và quá trình điều hòa tế bào như các cyclin, kinase phụ thuộc cyclin (CDK) làm chuyển dạng và bất tử tế bào [206]

Mối liên quan giữa HPV chủ yếu là oncogen E6 và E7 nhóm nguy cơ cao với các gen đè nén bướu trong cơ chế sinh ung thư biểu hiện qua sơ đồ sau: