Khảo sát tinh dầu một số giống cây thuộc họ rutaceae miền nam việt nam cô lập limonen và tổng hợp một số dẫn xuất theo các phương pháp mới

Tinh dầu vỏ trái các loài thuộc giống Citrus, Fortunella, Citrofortunella còn gọi là giống cây có múi – họ Rutaceae hầu hết đã được cả thế giới quan tâm nghiên cứu và sản xuất từ rất x



NGUYỄN THỊ THẢO TRÂN

KHẢO SÁT TINH DẦU MỘT SỐ GIỐNG CÂY THUỘC HỌ

RUTACEAE MIỀN NAM VIỆT NAM

CÔ LẬP LIMONEN VÀ TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT THEO CÁC PHƯƠNG PHÁP MỚI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THẢO TRÂN

KHẢO SÁT TINH DẦU MỘT SỐ GIỐNG CÂY THUỘC HỌ

RUTACEAE MIỀN NAM VIỆT NAM

CÔ LẬP LIMONEN VÀ TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT THEO CÁC PHƯƠNG PHÁP MỚI

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số chuyên ngành: 62.44.27.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS.TS LÊ NGỌC THẠCH

Tp HỒ CHÍ MINH - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Luận án Tiến sĩ Khoa học Hóa học “Khảo sát tinh dầu một số giống cây thuộc họ Rutaceae miền nam Việt Nam Cô lập limonen và tổng hợp một số dẫn xuất theo các phương pháp mới” do tôi thực hiện Theo sự hiểu biết và tìm hiểu từ thực tế cũng như từ các nguồn tài liệu tham khảo khoa học tìm thấy được, tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu của tôi là mới chưa có ai công bố tại Việt Nam cũng như trên thế giới

Nghiên cứu sinh

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

GS.TS Fritz Duus điều phối chương trình)

học tập, nghiên cứu khoa học và giảng dạy

Trần Thị Việt Hoa, PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Hạnh, TS Lê Khắc Tích đã luôn đóng góp những

ý kiến quý báo cho kết quả nghiên cứu khoa học của tôi

Thulstrup đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập, nghiên cứu khoa học cũng như hỗ trợ rất nhiều về tinh thần, cuộc sống trong nhưng năm tháng tôi học tập, nghiên cứu tại trường Đại học Roskilde (Đan Mạch) cũng như ở Việt Nam GS.TS Torben Lund luôn có những bài giảng thú vị về các phương pháp phân tích sắc ký cũng như cách sử dụng thiết bị một cách thuần thục Cảm ơn thầy đã không quên động viên tinh thần chúng em qua những chuyến đi thực tế

bổ ích thông qua các chuyến tham dự Hội nghị, tham quan và sử dụng các thiết bị phân tích hiện đại tại các trường Đại học tại Đan Mạch GS.TS Jens Spanget-Larsen cùng gia đình đã mang lại cho chúng em những giây phút ấm áp của một gia đình những ngày xa nhà GS.TS Poul Erik Hansen cùng các thầy Fadhil S Kmounah, thầy Wei Zhang đã giúp đỡ tôi rất nhiều

về kiến thức khoa học trong nghiên cứu và học tập Tất cả các thầy cô Đại học Roskilde cùng các anh chị, các bạn – các em Việt Nam, bạn Kristin Tropp và Fengbin, Cô Cathi – thầy Lenart, anh Vấn – Thông – Thăng cùng gia đình Nguyên – Kim – Klaos và gia đình Thanh – Martin – Dennis đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong những ngày tháng sống xa nhà

tích phổ TS Trần Hữu Anh, TS Lưu Thị Xuân Thi, TS Đoàn Ngọc Nhuận, TS Đỗ Quang Hiền,

TS Hoàng Việt, ThS Diệp Thế Tài, ThS Trần Hoàng Phương, ThS Châu Nguyễn Duy Khiêm cùng các em trong nhóm Nghiên cứu Hóa học Xanh cùng tất cả các thầy cô, đồng nghiệp Khoa Hóa học, đặc biệt là Bộ môn Hóa học Hữu cơ đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập và nghiên cứu

Chung (SV04), Thu Thảo – Trúc Anh+… (SV05), Thu Hương (SV05), Trà My (SV06), Linh Giang – Vân Quỳnh+… – Thanh Huyền – Thúy Uyên – Đình Vĩnh (SV07) và Minh Châu – Phương Thảo – Phượng – Thùy Dung (SV08), … luôn là nguồn động viên đáng yêu nhất của cô Cảm ơn các em đã luôn bên cạnh cô ngay cả những lúc cô nặng kg nhất

sống cũng như trong quá trình nghiên cứu

Và lời cảm ơn cả cuộc đời này đến:

dựa vững chắc cho con trong cuộc sống này

luôn và mãi là nguồn động viên, tình yêu vĩnh cửu của mẹ Trân cùng thiên thần Sunny nhé

lúc mẹ bế tắc nhất Con là sức mạnh của mẹ trong những lúc mẹ yếu đuối nhất

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Một số giống cây phổ biến thuộc họ Rutaceae ở miền nam Việt Nam 3

1.1.1 Citrus, Citrofortunella 3

1.1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.1.2 Ứng dụng 4

1.1.2 Murraya 10

1.1.2.1 Càri 10

1.1.2.1.1 Thực vật học 10

1.1.2.1.2 Ứng dụng 11

1.1.2.2 Nguyệt quới 12

1.1.2.2.1 Thực vật học 12

1.1.2.2.2 Ứng dụng 13

1.2 Phương pháp RTL trong GC 15

1.2.1 Khái niệm 15

1.2.2 Nguyên tắc 17

1.2.3 Phương pháp 18

1.2.4 Phân tích tinh dầu theo phương pháp GC/FID & GC/MSD kết hợp RTL 20

1.2.4.1 Lý do sử dụng 20

1.2.4.2 Phương pháp RTL 21

1.3.1 Nguồn cung cấp 23

1.3.2 Phương pháp cô lập 24

1.3.3 Ứng dụng 24

1.3.4 Tình hình sản xuất 25

1.4 Dẫn xuất của limonen 26

1.4.1 Oxid limonen 27

1.4.2 Carvenon 31

1.4.3 Carvon 32

1.4.4 p-Cimen 34

1.4.5 α-Terpineol 35

1.5 Sơ lược về xúc tác montmorillonite sử dụng trong nghiên cứu 36

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

2.2.1 Khảo sát tinh dầu 41

2.2.1.1 Tuyến tinh dầu 42

2.2.1.2 Hàm lượng tinh dầu 45

2.2.1.3 Tính chất vật lý và hóa học của tinh dầu 51

2.2.1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu 57

2.2.1.5 Hoạt tính sinh học của tinh dầu 63

2.2.2 Cô lập limonen 67

2.2.3 Bán tổng hợp các dẫn xuất limonen 68

2.2.3.1 Carvenon 68

2.2.3.2 Carvon 77

2.2.3.3 p-Cimen 88

2.2.3.4 α-Terpineol 94

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 99

3.1 LY TRÍCH TINH DẦU 99

3.1.1 Định danh 99

3.1.2 Giải phẫu học tuyến tinh dầu 99

3.1.3 Xử lý nguyên liệu 99

3.1.4 Khảo sát hàm lượng tinh dầu 100

3.2 PHÂN TÍCH TINH DẦU 101

3.2.1 Xác định tính chất vật lý và hóa học 101

3.2.1.1 Tính chất giác quan 101

3.2.1.2 Tính chất vật lý 101

3.2.1.3 Chỉ số hóa học 102

3.2.1.4 Phân tích thành phần hóa học 103

3.3 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU 105

3.3.1 Kháng khuẩn 106

3.3.1.1 Phương pháp nghiên cứu 106

3.3.1.2 Phương pháp tiến hành 106

3.3.2 Kháng nấm 107

3.3.2.1 Nguyên tắc 107

3.3.2.2 Phương pháp tiến hành 107

3.5 BÁN TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT LIMONEN 109

3.5.1 Điều chế oxid 1,2-limonen 109

3.5.2 Điều chế carvenon 111

3.5.3 Điều chế l-carvon 113

3.5.3.1 Nitrosoclorur d-limonen 114

3.5.3.2 l-Carvoxim 117

3.5.3.3 l-Carvon 119

3.5.4 Điều chế p-cimen 119

3.5.5 Điều chế α-terpineol 120

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 121

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH 125

TÀI LIỆU THAM KHẢO 127 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AI: Chỉ số acid (acid index)

CXSA: Chiếu xạ siêu âm

MS: Khối phổ (mass spectrometry)

NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance)

RI: Chỉ số lưu (retention index)

RT: Thời gian lưu (retention time)

RTL: Khóa thời gian lưu (retention time locking)

SI: Chỉ số savon (saponfication index)

TLC: Sắc ký bảng mỏng (thin layer chromatography)

% GC: % sản phẩm có trong hỗn hợp được phân tích bằng GC

d: tỉ trọng (specific gravity hay relative density, g/cm3)

αD: góc quay cực (optical rotation)

nD: chỉ số khúc xạ (refractive index)

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Lá và trái càri 11

Hình 1.2 Cây nguyệt quới cùng với hoa và trái 13

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa sự dịch chuyển thời gian lưu khi cột bị thay đổi hoặc bị cắt và sự chênh lệch thời gian lưu giữa đầu dò FID và MSD 17

Hình 1.4 Cửa sổ được dùng để tính áp suất RTL và cập nhật phương pháp 6890 19

Hình 1.5 Cửa sổ phần mềm chuyển đổi Method giữa hai hệ thống GC 23

Hình 1.6 Cơ cấu limonen 24

Hình 1.7 Các dẫn xuất limonen 27

Hình 1.8 Các sản phẩm từ sự epoxid hóa limonen 28

Hình 1.9 Phản ứng đồng phân hóa oxid 1,2-limonen bởi xúc tác acid vô cơ 29

Hình 1.10 Đồng phân hóa oxid 1,2-limonen bởi xúc tác acid Lewis 29

Hình 1.11 Bán tổng hợp oxid 8,9-limonen từ limonen 30

Hình 1.12 Sinh chuyển hóa các oxid 8,9-limonen thành bisabolol 31

Hình 1.13 Qui trình điều chế carvon từ (+)-limonen 32

Hình 1.14 Sự hình thành sản phẩm p-cimen qua phản ứng đồng phân hóa limonen 35

Hình 1.15 Bán tổng hợp  -terpineol từ limonen 36

Hình 2.1 Vị trí tuyến tinh dầu trên vỏ trái 42

Hình 2.2 Xoang tiết đang hình thành (x60) 42

Hình 2.3 Quá trình tiêu bào (x150) 42

Hình 2.4 Quá trình ly bào (x60) 43

Hình 2.5 Hình ảnh giải phẫu vỏ trái giống Citrus chụp qua kính hiển vi 43

Hình 2.7 Sự phân bố túi tiết trong lá càri (x10) và (x40) 43

Hình 2.8 Sự phân bố túi tiết trong lá nguyệt quới (x10) và (x40) 43

Hình 2.9 Bán tổng hợp carvenon từ limonen 68

Hình 2.10 Một số sản phẩm chính từ phản ứng phản ứng đồng phân hóa oxid 1,2-limonen bởi montmorillonite 69

Hình 2.11 Phản ứng nitrosoclor hóa d-limonen 78

Hình 2.12 Cơ chế cộng clorur nitrosil vào limonen vị trí 1,2 thông qua nitrit etil 78

Hình 2.13 Phản ứng khử clorur hidrogen của nitrosoclorur d-limonen 80

Hình 2.14 Cơ chế khử HCl của nitrosoclorur d-limonen theo cơ chế E1 81

Hình 2.15 Thủy giải l-carvoxim thành l-carvon trong môi trường acid 85

Hình 2.16 Cơ chế thủy giải l-carvoxim thành l-carvon trong môi trường acid 85

Hình 2.17 Các sản phẩm chính của phản ứng đồng phân hóa limonen bởi montmorillonite Việt Nam 88

Hình 2.18 Cơ chế hình thành p-cimen từ phản ứng đồng phân hóa limonen 89

Hình 2.19 Phản ứng tổng hợp  -terpineol từ d-limonen 94

Hình 2.20 Cơ chế phản ứng ester hóa limonen với TFA 95

Hình 2.21 Cơ chế phản ứng thủy giải ester trifluoroacetat 96

Hình 3.1 Sơ đồ (trái) và hệ thống (phải) chưng cất tinh dầu ĐNTT 99

Hình 3.2 Sơ đồ (trái) và hệ thống (phải) chưng cất tinh dầu dưới sự CXVS 100

Hình 3.3 Tỉ trọng kế 2 ml 102

Hình 3.4 Khúc xạ kế 102

Hình 3.5 Triền quang kế 102

Hình 3.6 Hệ thống GC/MS 104

Hình 3.7 Hệ thống chưng cất áp suất kém 108

Hình 3.8 Biểu đồ áp suất-nhiệt độ theo de Waard-Milliams 109

Hình 3.9 Lò nung chân không 109

Hình 3.10 Chuẩn độ H2O2 với KMnO4 110

Hình 3.11 Hệ thống siêu âm 111

Hình 3.12 Hệ thống phản ứng đồng phân hóa oxid 1,2-limonen tạo carvenon với lò vi sóng gia dụng cải tiến KENWOOD SJW17 113

Hình 3.13 Bồn siêu âm Branson 3510 114

Hình 3.14 Lò vi sóng chuyên dụng CEM MDS-2000 114

Hình 3.15 Hệ thống phản ứng nitrosoclor hóa d-limonen 115

Hình 3.16 Trầm hiện nitrosoclorur d-limonen 116

Hình 3.17 Cơ cấu của nitrosoclorur d-limonen 116

Hình 3.18 Cơ cấu của l-carvoxim 117

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loại trái cây có múi nổi tiếng ở miền nam Việt Nam 5

Bảng 1.2 Tóm tắt một số công trình nghiên cứu tinh dầu vỏ trái và lá giống cây có múi đã công bố 8

Bảng 1.3 Báo cáo sản lượng limonen nhập khẩu từ năm 1998-2001 26

Bảng 1.4 Sản phẩm phụ của Citrus tại Brazil 26

Bảng 1.5 Kết quả điều chế nitrosoclorur d-limonen từ d-limonen đã công bố 33

Bảng 1.6 Kết quả điều chế l-carvoxim từ nitrosoclorur d-limonen đã công bố 34

Bảng 1.7 Kết quả điều chế l-carvon từ l-carvoxim được công bố đã công bố 34

Bảng 1.8 Thành phần hóa học montmorillonite tinh chế và montmorillonite biến tính 36

Bảng 1.9 Các thông số tính chất của montmorillonite biến tính 38

Bảng 2.1 Các loài được sử dụng trong nghiên cứu 41

Bảng 2.2 Thể tích nước chưng cất và hàm lượng tinh dầu thu được theo thời gian chưng cất qua các phương pháp chưng cất hơi nước 45

Bảng 2.3 Kết quả đo chỉ số vật lý tinh dầu ly trích theo các phương pháp chưng cất hơi nước 51

Bảng 2.4 Kết quả đo chỉ số hóa học tinh dầu ly trích theo các phương pháp chưng cất hơi nước 53

Bảng 2.5 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ trái giống Citrus và Citrofortunella lý trích theo phương pháp ĐNTT 59

Bảng 2.6 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ trái giống Citrus và Citrofortunella ly trích theo phương pháp CXVS 59

Bảng 2.7 Thành phần hóa học tinh dầu lá giống Citrus và Citrofortunella ly trích theo phương pháp ĐNTT 60

Bảng 2.8 Thành phần hóa học tinh dầu lá giống Citrus và Citrofortunella ly trích theo phương pháp CXVS 61

Bảng 2.9 Thành phần hóa học tinh dầu lá giống Murraya theo phương pháp chưng cất hơi

Bảng 2.18 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của biên độ chiếu xạ trên phản ứng đồng phân hóa

oxid 1,2-limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp CXSA 74 Bảng 2.19 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của công suất chiếu xạ trên phản ứng đồng phân hóa oxid 1,2-limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp CXVS 75 Bảng 2.20 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiếu xạ trên phản ứng đồng phân hóa oxid 1,2-limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp CXVS 76 Bảng 2.21 Hiệu suất carvenon theo các phương pháp kích hoạt 77

Bảng 2.22 Khảo sát nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đến hiệu suất điều chế nitrosoclorur

d-limonen 79

Bảng 2.23 Hiệu suất nitrosoclorur d-limonen theo thời gian với tác nhân EtNO2 sinh ra từ

sự kích hoạt bằng ĐKT và CXSA 80

Bảng 2.24 Ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa và thời gian phản ứng khử HCl của nitrosoclorur d-limonen tạo l-carvoxim 81

Bảng 2.25 Ảnh hưởng của công suất và thời gian chiếu xạ lên phản ứng khử HCl của nitrosoclorur d-limonen tạo l-carvoxim dưới sự CXVS 82

Bảng 2.26 Ảnh hưởng của tác nhân khử lên phản ứng khử HCl của nitrosoclorur d-limonen tạo l-carvoxim 83

Bảng 2.27 Hiệu suất l-carvon theo thời gian phản ứng bởi phương pháp ĐNTT 86

Bảng 2.28 Hiệu suất l-carvon theo thời gian phản ứng bởi phương pháp ĐKT 86

Bảng 2.29 Hiệu suất l-carvon theo thời gian phản ứng bởi phương pháp CXSA 86

Bảng 2.30 Hiệu suất l-carvon theo thời gian phản ứng bởi phương pháp CXVS 87

Bảng 2.31 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trên phản ứng đồng phân hóa limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp ĐKT 90

Bảng 2.32 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trên phản ứng đồng phân hóa limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp ĐKT 91

Bảng 2.33 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác trên phản ứng đồng phân hóa limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp ĐKT 92

Bảng 2.34 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của công suất chiếu xạ trên phản ứng đồng phân hóa limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp CXVS 92

Bảng 2.35 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiếu xạ trên phản ứng đồng phân hóa limonen bởi xúc tác montmorillonite theo phương pháp CXVS 93

Bảng 2.36 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và hiệu suất  -terpineol đạt được trong phản ứng ester hóa limonen trong điều kiện CXSA 96

Bảng 3.1 Kết quả phân tích 1H-NMR và 13C-NMR hợp chất l-carvoxim 117

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 2.1 Hàm lượng tinh dầu vỏ trái Citrus và Citrofortunella theo các phương pháp

chưng cât hơi nước 46

Đồ thị 2.2 Hàm lượng tinh dầu lá Citrus và Citrofortunella theo các phương pháp chưng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với xu hướng phát triển tột bậc ngành công nghiệp mỹ phẩm, nhu cầu sử dụng tinh dầu trên thế giới hiện nay ngày càng cao Tại Việt Nam đã có nhiều nhà máy sản xuất mỹ phẩm nổi tiếng như Công ty Cổ phần Mỹ phẩm Sài Gòn nổi tiếng với sản phẩm nước hoa đã có mặt tại nhiều thị trường trên thế giới; Công ty TNHH Sản xuất Mỹ phẩm Lan Hảo – Thorakao nổi tiếng với nhiều sản phẩm dưỡng da được cả nước ưa chuộng; và nhiều công ty, tập đoàn mỹ phẩm nổi tiếng trên thế giới cũng

có mặt tại Việt Nam từ rất lâu như Procter & Gamble, Unilever, Johnson & Johnson, Rohto, … Tuy nhiên, hầu hết hương liệu bao gồm tinh dầu mà các nhà máy tại Việt Nam sử dụng đều được nhập từ nước ngoài Các loại tinh dầu Việt Nam sản xuất thành công và có mặt trên thị trường thế giới có thể kể đến là tinh dầu

xá xị, tinh dầu bạc hà, tinh dầu nghệ, tinh dầu sả chanh chủ yếu phục vụ cho sản xuất dầu xoa cũng như xuất khẩu dạng thô sang các nước khác

Tinh dầu vỏ trái các loài thuộc giống Citrus, Fortunella, Citrofortunella (còn gọi là

giống cây có múi) – họ Rutaceae hầu hết đã được cả thế giới quan tâm nghiên cứu

và sản xuất từ rất xa xưa Do vậy, cho đến nay, khối lượng công trình nghiên cứu trên thế giới đã đạt đến con số khổng lồ so với Việt Nam Bên cạnh đó, tinh dầu

thuộc giống Murraya – họ Rutaceae, trồng phổ biến ở các nước Trung Đông, Địa

Trung Hải, thuộc họ Rutaceae cũng được nghiên cứu từ rất lâu đời nhưng chưa phổ biến tại Việt Nam

Từ thực tế này, để đóng góp vào việc hoàn thiện công trình khảo sát tinh dầu tại Việt Nam, đặc biệt là tinh dầu họ Rutaceae, với thời gian và phạm vi nghiên cứu có hạn, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu với các mục tiêu:

- Khảo sát tinh dầu một số giống cây trồng phổ biến thuộc họ Rutaceae tại

miền Nam Việt Nam bao gồm tinh dầu vỏ trái và lá cây giống Citrus,

Citrofortunella và tinh dầu lá Murraya nhằm mục đích hệ thống hóa lại một

phần thông tin về ly trích, tính chất hóa lý, thành phần hóa học, hoạt tính sinh

học của từng loài khảo sát Bên cạnh khảo sát ly trích tinh dầu từ nguồn nguyên liệu thu hái từ tự nhiên, bước đầu kết hợp với Công ty TNHH SXTM Hưng Hợp chuyên sản xuất và xuất khẩu nước ép tắc (thuộc giống

Citrofortunella), tận dụng nguyên liệu vỏ trái tắc sau khi ép và dịch dầu thu

được từ dịch tắc ép đang bị bỏ phí để ly trích tinh dầu

- Cô lập limonen, thành phần chính của tinh dầu vỏ trái Citrus để làm rõ hơn

tầm quan trọng của nguồn cấp limonen từ tự nhiên này

- Bán tổng hợp các dẫn xuất có giá trị của limonen với phương pháp xanh hơn nhằm xanh hóa điều kiện phản ứng đáp yêu cầu giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tiết kiệm năng lượng, thời gian cho ngành tổng hợp hữu cơ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Một số giống cây phổ biến thuộc họ Rutaceae ở miền Nam Việt Nam

Họ Rutaceae chứa khoảng 150 giống với khoảng hơn 900 loài, mọc chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới và ôn hòa Trong đó, giống cây có tầm quan trọng kinh tế to lớn

nhất có thể kể đến là Citrus với sản lượng trái cây (cam, quýt, bưởi, chanh) chiếm

khoảng 30% thị trường trái cây tươi của thế giới.[1,28,55,86]

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiều giống cây thuộc họ Rutaceae cũng hiện diện Việt Nam Đặc biệt tại miền Nam, điều kiện thời tiết tương đối ổn định,

ôn hòa và mưa nhiều, tạo điều kiện cho các giống Citrus, Citrofortunella, Murraya phát triển Trong đó, giống cây có múi (Citrus và Citrofortunella) là giống cây chủ

lực đã và đang phát triển rất mạnh ở các vùng đồng bằng sông Cửu Long Việc trồng trọt giống cây có múi tại Việt Nam nói chung chủ yếu phục vụ cho thị trường trái cây.[1,5,10,105]

1.1.1 Citrus, Citrofortunella

1.1.1.1 Nguồn gốc

Citrus: Theo Dugo (2002), việc trồng trọt các cây giống Citrus có thể bắt nguồn ít

nhất 4000 năm trở lại đây ở khu vực các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới của lục địa Châu Á (đặc biệt là các nước Đông Nam Á) và quần đảo Malaysia Trong thời gian

gần đây hơn, cây Citrus đến đầu tiên ở các nước Địa Trung Hải, do vậy, vùng trồng cây Citrus mở rộng khắp thế giới Theo Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2001), giống

Citrus gồm khoảng trên dưới 20 loài phân bố tự nhiên từ Ấn Độ, miền Nam Trung

Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Malaysia, Myanmar, Philippines, Thái Lan, Indonesia cho đến miền Bắc Australia và New Caledonia.[1,4,5,11,55,82,86]

Citrofortunella: còn gọi là giống x Citrofortunella, là giống lai giữa giống Citrus

với loài cây quất thuộc giống Fortunella Cây thuộc giống này cứng và chắc hơn cây Citrus Các cây này đa số cho ra trái chua Ngoài ra, chúng được sử dụng làm cây trang trí rất đẹp Trong đó, giống Fortunella trước kia được gọi là giống Citrus

Tuy nhiên hình dáng, kích cỡ trái của một số loài khác với trái thuộc các loài giống

Citrus nên được các nhà nghiên cứu tách ra Về mặt sinh học di truyền, các nhà

khoa học đã khám phá ra sự khác biệt trong nhiễm sắc thể của giữa các loài của các

giống cây này Giống Fortunella cho trái ăn được và được gọi là kim quất hay cây

quất (kumquat).[1,55]

Hiện nay, với sự phát triển của kỹ thuật lai giống, giống Citrus đã được lai ghép

thành rất nhiều giống khác nhau và cho ra đời rất nhiều các loài cây lai trên khắp thế giới Tuy nhiên, chỉ một số ít loài cây được nghiên cứu và được xác định tên khoa học một cách chính xác Đa số các cây lai từ các nhà vườn được lai một cách ngẫu nhiên sao cho phù hợp với thời tiết, thổ nhưỡng và cho ra năng suất trái tốt.[5,11,55]

1.1.1.2 Ứng dụng

Việc sản xuất trái cây giống Citrus trên thế giới tăng đáng kể trong vài thập kỷ qua,

trung bình từ 48 triệu tấn /năm trong khoảng thời gian 1970-1971 đến 1978-1979, đến giai đoạn năm 1999-2000 đã tăng đến 90 triệu tấn/năm Các quốc gia ở Bắc Bán Cầu (The Northern hemisphere, chủ yếu là Mỹ và các nước Địa Trung Hải) đóng góp khoảng 75% tổng sản lượng Trong khi đó Nam Bán Cầu (The Southern hemisphere, chủ yếu là Brazil và Argentina) đóng góp phần còn lại, 25% Trái

Citrus chiếm thị phần đáng kể, khoảng 30% của thị trường trái cây tươi của thế giới

và một lượng lớn được tiêu thụ tại nơi sản xuất Ngoài ra, có hơn 30% tổng sản lượng được dùng để sản xuất nước ép.[55]

Từ tháng 09 năm 1995, ở miền Nam Việt Nam, diện tích trồng cây có múi đã tăng nhanh và vượt hơn 30.000 ha Các giống cam quít ở nước ta vô cùng phong phú bao gồm các giống trồng trọt, hoang dại và bán hoang dại Hiện tại đã có nhiều loài cây nổi tiếng bởi cho trái ngon, ngọt đã và đang được xuất khẩu sang các nước (Bảng 1.1).[1,4,5,10]

Các loại bưởi Năm Roi (Vĩnh Long), nổi tiếng và được xem là ngon nhất trên thế giới với đặc điểm ít hột, mọng nước, vỏ mỏng và rất ngọt Hiện nay, bưởi Năm Roi

đồng bằng sông Cửu Long đã và đang nổi tiếng trong nước và trên thế giới Bưởi Tân Triều, một loại bưởi nổi tiếng ở Biên Hoà, Đồng Nai Các giống cam mật, cam sành, cam xoàn trồng tại Tiền Giang … cho đến nay vẫn là những giống chủ lực trồng để xuất khẩu và cung cấp cho nhu cầu trong nước, tuy còn nhiều nhược điểm

so với các giống tiêu chuẩn trên thị trường cam thế giới Quít đường, quít Xiêm (Vĩnh Long, Cần Thơ Các giống chanh cũng đang được chú ý phát triển và được trồng chuyên canh lẫn trồng xen nhiều nhất ở tỉnh Bến Tre trên 2.000 ha, Cần Thơ

400 ha.[5,10,55,82,86]

Bảng 1.1 Một số loại trái cây có múi nổi tiếng ở miền nam Việt Nam

chủ yếu

Citrus maxima (Burm.) Merr

Vĩnh Long

Citrus maxima (Burm.) Merr Đồng Tháp Bến Tre,

Citrus maxima (Burm.) Merr

Biên Hòa

(*) Tên gọi chưa chính xác

Các loại lá Citrus bên cạnh việc ly trích lấy tinh dầu, còn được dùng làm gia vị và thuốc trị bệnh trong dân gian Các loài thuộc giống Fortunella, Citrofortunella bên

cạnh được sử dụng để làm thực phẩm hàng ngày, sản xuất nước ép trái còn làm cây cảnh.[4,5,55] Ngày nay, công nghệ sản xuất nước ép trái Citrus, Fortunella,

Citrofortunella kết hợp chặt chẽ với việc sản xuất tinh dầu và limonen, thức ăn cho

gia súc tạo thành một qui trình khép kín và tận dụng tối đa nguồn nguyên liệu sản xuất đã và đang rất phát triển trên thế giới Hiện tại, ở Việt Nam đã có nhiều công ty sản xuất nước ép trái cây tắc, cam, … bắt đầu hoạt động sản xuất và xuất khẩu Tuy

nhiên, ở Việt Nam, các nhà sản xuất chưa tận dụng hết, như vỏ trái, dịch dầu (có chứa tinh dầu) bị bỏ đi như rác thải thông thường.[4,5,53,55]

Tinh dầu và nước thơm: Trong suốt quá trình cô đặc nước ép trái Citrus, một số hợp

chất thơm tự nhiên cũng bị loại bỏ cùng với nước, bao gồm lượng nhỏ tinh dầu vỏ trái trong nước ép Các hợp chất dễ bay hơi được thu hồi trong suốt quá trình sản xuất nước ép cô đặc được gọi là phần nước thơm (essence).[28,53,55,78,89] Tinh dầu các loài giống cây có múi này đặc biệt là tinh dầu vỏ trái được ly trích, sử dụng và biết đầu tiên trong lịch sử loài người Các công trình nghiên cứu về tinh dầu giống cây này đã và vẫn đang được quan tâm[71,87,123,161] và công bố khắp nơi trên thế giới kể

cả Việt Nam với số lượng khổng lồ (Bảng 1.2) Hầu hết các loài cây thuộc giống

Citrus đều có chứa tinh dầu trong tất cả các bộ phận của cây, đặc biệt là vỏ trái, lá

và hoa Hàm lượng tinh dầu trong vỏ trái thường rất cao (thay đổi từ 1,5 đến 6,5%

so với sinh khối tươi của vỏ hoặc từ 0,15 đến 0,85% so với sinh khối trái tươi) Tinh dầu vỏ trái được quan tâm và nghiên cứu rất nhiều, bởi lẽ chứa hàm lượng tinh dầu

và limonen cao Chính vì vậy, tinh dầu vỏ trái xem như là nguồn cung cấp limonen.[6,30,53,59,138] Trong lá và hoa cũng chứa tinh dầu Tinh dầu hoa cam (tinh dầu neroli), hoa bưởi được đánh giá rất cao Đặc biệt là tinh dầu neroli Đây là tinh dầu nổi tiếng nhất và cũng thuộc loại đắt tiền nhất trong những tinh dầu chưng cất từ chanh, cam, quít Người ta bắt đầu khai thác tinh dầu này từ thế kỷ thứ 16 Tên

“tinh dầu Neroli” là do vợ của hoàng tử xứ Neroli, nước Ý, đã dùng để làm thơm

găng tay của mình Tinh dầu Neroli thu được từ hoa tươi của cây cam đắng (Citrus

aurantium Linn var amara) bằng phương pháp chưng cất hơi nước Tinh dầu trong

lá của phần lớn các loài cũng là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm (bánh kẹo, nước giải khát…).[55,60,80,89,92,93] Hạt các loài cây thuộc

giống Citrus nói chung này thường được trích lấy limonoid, dầu béo.[179] Ngoài tinh

dầu từ các bộ phận thực vật riêng rẽ trên các loài thuộc giống Citrus còn có một loại

tinh dầu có tên gọi là “petitgrain” (petitgrain oils) Tinh dầu này được sản xuất từ lá tươi, búp, cành non (có cả trái non) được cắt tỉa sau mỗi mùa thu hoạch hoặc từ

thành phần của nước hoa do đặc tính khử mùi và hương thơm rất ngọt ngào của chúng Chúng được sử dụng rất rộng rãi trong các sản phẩm vệ sinh trong gia đình Nếu được khử terpen, tinh dầu petitgrain có thể trở thành tiền chất rất tuyệt vời cho các chuyển hóa thành hợp chất đắt tiền hơn Tinh dầu “petitgrain” thường được sản

xuất từ các loài cam đắng (Citrus aurantium Linn var amara) hoặc cây cam ngọt (Citrus sinesis Osbeck) Tinh dầu petitgrain cam đắng thơm và đắt tiền hơn Trong

quá trình trồng cam chanh hàng năm phải cắt tỉa bỏ cành, người ta dùng cành lá này

để chưng cất lấy tinh dầu Tinh dầu petitgrain khử terpen bền hơn tinh dầu gốc của chúng Chính vì thế được sử dụng làm thành phần tạo mùi trong các sản phẩm của

xà phòng và xà phòng thơm.[6,55,72,89,92,155] Tinh dầu của nhiều loài cam, chanh, quít còn có một số hợp chất chứa oxigen (alcol, aldehid và ester) Do đó chúng được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực sản xuất nước hoa, kem đánh răng, xà phòng thơm, dầu chải tóc, nguyên liệu các dược phẩm và thực phẩm … Đã có nhiều nghiên cứu

cho thấy tinh dầu giống Citrus còn có hoạt tính sinh học.[27,35,55,89,124,153,165] Thành phần hóa học tinh dầu thay đổi phụ thuộc vào điều kiện ly trích, nơi trồng, loài cây,

sự lai tạo, ….[6,22,24,31,50,56,69,70,95,106,107,131,172]

Bên cạnh cho các các sản phẩm là nước ép, tinh dầu, nước thơm, quá trình ép trái Citrus còn cho ra các sản phẩm phụ khác được chia làm ba loại chính: thức ăn gia súc, nguyên liệu thô được sử dụng cho việc trích các sản phẩm có thể bán được và

các sản phẩm thực phẩm Do việc tận dụng các sản phẩm phụ Citrus để sản xuất

nhiều sản phẩm có giá trị hơn ngày càng gia tăng và quan trọng nên việc sản xuất

trái Citrus trên thế giới cũng gia tăng và làm tăng các sản phẩm nước giải khát và nước ép trái Citrus một cách vượt bậc.[55,96,149]

Bảng 1.2 Tóm tắt một số công trình nghiên cứu tinh dầu vỏ trái và lá giống cây có múi đã công bố

Bộ phận Loài Phương pháp

ly trích

Hàm lượng (%)

Loại Bưởi/Nơi thu – hái Cấu phần chính Tác giả

Vỏ trái Bưởi Ép lạnh

Chưng cất hơi nước

0.03a 0.04-0.09a

0.36 0.39c

1.06

Viện Nghiên cứu Rau quả Hà Nội Văn Giang (Hưng Yên), Bắc Ninh, Năm Roi (Cần Thơ), Phúc Trạch Năm Roi (Vĩnh Long)

Năm Roi (Vĩnh Long) Tunisia

Limonen

Minh Tú[105]Thảo[158] Anh Lương[3]Anh Lương[3]Hosni[74]Cam mật Ép lạnh

Chưng cất hơi nước

0.13a

0.3-0.6a

0.1 0.04 0.39 0.42c

Meski, Valencia Late, Thomson Navel, Maltaise blanc (tất cả thu hái tại Tunisia)

Limonen

Minh Tú[105]Mitiku[109] Njoroge[117]Thảo[158] Ferhat[63]

0.01-0.07a

3.5 2.61 2.63c

7.4

Đà Lạt (Lâm Đồng), Bến Tre (Vĩnh Long), Vinh (Nghệ An) São Sebastião do Caí

Củ Chi – Tp Hồ Chí Minh São Sebastião do Caí

β-Pinen, limonen,

γ-terpinen, citral a, citral

b

Thảo[158] Atti-Santos[18]Thảo Trân[7,8,9]Atti-Santos[18]

Trạm nghiên cứu nông nghiệp INRA-CIRAD tại San Ghjulianu –Corsica – Phápd

Hà Tây (mẫu được mua tại chợ Hàng Da, Hà Nội) Vĩnh Long, Hà Giang

Tunisia Nigeria Kanpur - Ấn Độ

Limonen

Lota[91,92]

Minh Tú[105] Thảo[158] Hosni[74]Karioti[81]Mishra[108]

citronelil Chanh Chưng cất hơi nước 0.81

terpinen-4-ol, citral b, acetat neril, citral a, acetat geranil

Thảo Trân[8,9]

Lota[93]

Quýt đường Chưng cất hơi nước 1.2

0.1 0.3

Shopra El Khima – Ai Cập Trạm nghiên cứu nông nghiệp INRA-CIRAD tại San Ghjulianu –Corsica – Pháp

a : Hàm lượng tinh dầu tính trên cả trái tươi

b : Cam Valencia Late, loài cam quan trọng nhất trên thế giới Được xem là loài cam chính ở Florida, Calofornia, Nam Phi và Úc

( http://mfruits.net/index.php?productID=2571 )

c : Chưng cất dưới sự hỗ trợ của vi sóng

d : Trạm nghiên cứu nông nghiệp (Station de Recherches Agronomiquesa ) INRA-CIRAD là nơi chuyên nghiên cứu về giống cây có múi với kho lưu trữ hơn 1000 giống

( http://www.jeanpierrecoffe.com/metier-san-giuliano )

e : Vỏ trái được xử lý với enzyme Xylanases trước khi chưng cất hơi nước

Trong khi ngành công nghiệp Citrus phát triển một cách nhanh chóng và vượt bậc

thì tại Việt Nam vẫn chưa tận dụng được hết tiềm năng của chúng mặc dù nguồn cung cấp thực vật rất dồi dào Đặc biệt là các công trình nghiên cứu về tinh dầu vẫn còn quá ít và rời rạc so với tiềm năng nguồn nguyên liệu sẵn có (Bảng 1.2)

1.1.2 Murraya

Murraya có khoảng 15 loài Tên giống được đặt bởi John Andreas Murraya, giáo sư

người Thụy Điển ngành Thực vật học và Y khoa, đại học Göttingen, Đức Trong số

15 loài, chỉ có hai loài phổ biến: Murraya koenigii (Linn.) Sprengor (càri) và

Murraya exotica Linn (nguyệt quới)[1,147]

Hai loài cây này cũng được tìm thấy rất phổ biến tại miền Nam Việt Nam Tuy cùng

họ Rutaceae với các loài thuộc giống Citrus, Citrofortunella, nhưng tinh dầu càri và

cả nguyệt quới có thành phần hóa học khác hẳn

1.1.2.1 Càri

1.1.2.1.1 Thực vật học

Tên khoa học của cây càri đầu tiên được mô tả và đặt bởi các nhà khoa học Hooker, Kirtikar, Basu, Nadkarni Sau đó được nghiên cứu và đặt tên lại theo hệ thống bởi nhiều nhà thực vật học khác nhau.[1,4,113]

Tên khoa học: Murraya koenigii (Linn.) Sprengor

Đồng danh: Murraya foetidissima Teyem et Binn.,

Chalcas koenigii Kurz

Tên thông dụng:

- Việt Nam: càri, tí nị, xăn tróc, sao nhớn, chum hôi trắng

- Anh: curry tree, curryleaf tree

- Ấn Độ: mitha nim (sweet nim), mitha neem (sweet neem), kathmin, kurry patta, kariaphulli, karayapan, barsanga, glandla

Cây càri đượ

ấu ăn Tên

Ấn Độ và các nước Ấ scar, Zanzi child đã đư ược ưa chu

g cho các m y), các loạ hâu Phi T

m thuốc bổ

và rất hiệu

êm nướu, c

vempu, kara upillai, ker

be

yếu ở các Myanmar

Ấn Độ, Sr ibar, Pemb

ưa cây càr uộng bởi lẽ

ình 1.1 Lá

ất và hàng rry) được b ăng thêm m

ri được chế món ăn có

ại sauce ở c Tất cả bộ p

ổ, thuốc gi

u quả trong các vết cắn

apincha, ka rupulai, kar

ế biến, pha

ó vị cay nồ các nước Ấ phận cây c iúp tiêu hó

26, nhà thự Florida nh

át tán rất rộ

ri

việc sử dụn

ủ yếu trong biệt, món

a trộn trong

ng như bộ

Ấn Độ, một àri được s

óa, thuốc k

ữa trị các b vật [21,44,113,

ái Lan, các Việt Nam Pakistan, B

ực vật học

hư một loạ ộng.[1,113]

c hòn đảo

m Cây càri angladesh, người Mỹ

i cây cảnh

gia vị trong

sử dụng lá

ng của Ấn gia vị, nhất ương ớt lá Đông Nam

ất hiệu quả , thuốc hạ kiết lỵ, ghẻ

o

i ,

Đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy cây càri có chứa tinh dầu cũng như các hợp chất alkaloid có khả năng kháng oxid hóa, giảm colesterol, giảm lượng đường trong máu của chuột bị tiểu đường và có hoạt tính chống nấm, chống khuẩn.[97,114]

Tinh dầu: xuất hiện ở hầu hết các bộ phận của cây càri, đặc biệt là ở lá và trái Tinh

dầu có màu từ vàng nhạt cho đến không màu, mùi hăng nồng Tinh dầu lá, hoa, trái được ly trích bởi cả hai phương pháp chưng cất hơi nước và tẩm trích.[1,19,41,44,58,126,141, 167,168,169,174]

- Tinh dầu lá: thành phần chính chủ yếu là các hợp chất hidrocarbon terpen và rất

ít các hợp chất chứa oxigen Trong đó các hợp chất chính là cariophilen, α-pinen,

pinen, α-phelandren, limonen, phelandren, tujen, elemen, α-copaen,

β-gurjunen, isocariophilen, germacren D Thành phần bách phân các hợp chất cũng như cấu phần chính trong tinh dầu thay đổi theo nơi mọc, nơi trồng

- Tinh dầu chồi cây: cariophilen, α-pinen, β-pinen, α-phelandren, ocimen,

aromadedren, selinen, …

- Tinh dầu cả trái: chủ yếu là monoterpen hidrocarbon (trên 80%) và một ít hợp chất monoterpen oxigen

- Tinh dầu cuống lá: chủ yếu là các hợp chất monoterpen hidrocarbon (trên 60%)

như α-pinen, β-pinen, α-phelandren, copaen, một số các hợp chất monoterpen

oxigen và sesquiterpen alcol

- Tinh dầu trái: chủ yếu là các hợp chất monoterpen

- Tinh dầu lá mầm hạt: chủ yếu là α-pinen (trên 50%) và cis-β-ocimen (trên 30%)

- Tinh dầu hoa: chứa chủ yếu các hợp chất terpen hidrocarbon (khoảng 90%)

1.1.2.2 Nguyệt quới[1,134]

1.1.2.2.1 Thực vật học

Tên khoa học: Murraya exotica Linn

nh 1.2 Cây

ng

nếu như c

i được biết áng trong v cây nguyệ

ệt quới trư làm thuốc

uới cùng vớ

xem là loại việc sử dụn

nh, uốn càn ước cửa nh trong dân

ai Sẽ rất d

ơi trên thế trị bệnh tiê

ese myrtle

nhân giống dụng hàng

hương vị lá

ây cho hoa

dễ dàng tìm giới Cây

bệnh kiết lỵ, chữa lành vết thương, hạ nhiệt, giảm đau, tác nhân ngừa thai.[57,64,120]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy cây nguyệt quới cho tinh dầu ở nhiều

bộ phận cây Bên cạnh đó, nhiều hợp chất như flavon, alkaloid, coumarin được ly trích từ trái, hoa, lá và rễ.[64,88,147]

Tinh dầu: xuất hiện ở hầu hết các bộ phận cây như lá, hoa, trái, rễ Thành phần hóa

học phụ thuộc vào bộ phân cây và vùng trồng khác nhau Tinh dầu có màu vàng nhạt hoặc không màu, mùi thơm nhẹ Tinh dầu được ly trích bởi cả hai phương pháp chưng cất hơi nước và tẩm trích. [44,57,120,143]

- Tinh dầu lá: cấu tử chính khác nhau giữa các vùng trồng khác nhau

+ Ai Cập: α-pinen (62.5%), α-gurjunen, tujopsen

+ Nigeria: salicilat metil (22.4%), β-ciclocitral (22.9%), trans-nerolidol (11.7%), α-cubeben (7.9%), (-)-cubenol (6.8%), β-cubeben (5.8%),

1.2 Phương pháp RTL trong GC

RTL: Retention-time locking (khóa thời gian lưu)

1.2.1 Khái niệm

Ngày nay, để xác định chính xác hơn nữa trong việc xác định các hợp chất đặc biệt

là trong phân tích tinh dầu và thuốc trừ sâu, các nhà hóa học đưa ra phương pháp RTL Phương pháp RTL là kỹ thuật được phát triển bởi công ty Agilent Technologies (Hewlett-Packard) Và sự phát triển cơ sở dữ liệu RTL từ:

- Viện nghiên cứu sắc ký (Research Institute for Chromatography), Kortrijk,

Bỉ (Belgium)

- Quest International, Naarden, Hà Lan (The Netherlands)

- Phòng Thí nghiệm Hóa học Hữu cơ, Đại học Gent, Bỉ (Laboratory of Organic Chemistry, University of Gent, Belgium)

- Hợp tác với công ty Agilent Technologies (Hewlett-Packard)

Với kỹ thuật RTL áp suất đầu vào (inlet pressure) được cài đặt theo yêu cầu phải tương thích với thời gian một cách chính xác từ đường cong hiệu chuẩn của áp suất đầu vào đối thời gian lưu.[29,51,59,84,128]

Trong lĩnh vực hóa học phân tích, tR được xem là thước đo, là một trong những đặc tính quan trọng nhất trong sắc ký Do vậy, tR được xem là thông số chìa khóa (key parameter) để tách, xác định và định lượng các hợp chất cần quan tâm từ các hỗn hợp phức tạp Thực tế, việc xác định mũi (peak identification) được thực hiện bằng cách so sánh tR của một cấu tử chưa biết với một chất chuẩn Tuy nhiên, việc xác định mũi cấu tử xác định nào đó thường gặp khó do có sự thay đổi, dịch chuyển giá trị tR của chính nó giữa các mẫu phân tích mẫu phân tích khác nhau trên cùng một thiết bị Nguyên nhân này thường xuất hiện sau khi thực hiện các quá trình bảo trì

hệ thống sắc ký thường ngày cũng như sau khi cắt cột Hơn thế nữa, mỗi hệ thống sắc ký khác nhau cũng sẽ cho các giá trị tR khác nhau, thậm chí chạy trong cùng điều kiện. [59,128]

Có rất nhiều yếu tố rất khó nhận thấy gây ra sự khác biệt về thời gian lưu giữa các

hệ thống GC cùng cấu hình

- Các cột sắc ký có số bộ phận (part number) giống nhau: có thể khác nhau một chút về chiều dài, đường kính và độ dày màng

- Áp suất đầu vào thực sự không giống với áp suất được thiết lập (setpoint)

- Nhiệt độ thực sự của lò sắc ký cũng có thể lệch so với giá trị đã thiết lập Tổng tất cả các yếu tố này gây ảnh hưởng lớn đến sự khác biệt về thời gian lưu giữa các hệ thống GC có cấu hình tương tự nhau.[128]

Thời gian lưu có mối liên hệ chặc chẽ với áp suất đầu vào của quá trình phân tích bởi GC Chính vì thế, bằng cách thiết lập tiến trình điều chỉnh áp suất đầu vào, thời gian lưu trên qui trình thiết lập cho GC của các hệ thống GC cấu hình tương tự nhau

sẽ gần nhau hơn Và kỹ thuật RTL ra đời dựa trên nguyên tắc này RTL nhằm để xác định những gì mà qui trình thiết lập về áp suất đầu vào cần thiết để đạt được điểm mong muốn về thời gian lưu.[128]

RTL là một phần kết quả trong quá trình cải tiến thiết bị nhằm làm tăng độ chính xác về việc điều khiển áp suất và dòng Kỹ thuật RTL nhắm đến mục tiêu đảm bảo tất cả thời gian lưu giống nhau cho các mẫu phân tích giống nhau khi chúng được phân tích trên cùng các hệ thống GC Ngoài ra, RTL rất tiện lợi và dễ sử dụng Từ đây việc sử dụng RTL được mở rộng để tăng hiệu suất phân tích trong các phương pháp sàng lọc (screening method).[29,128]

RTL là một đặc tính của phần mềm Agilent ChemStation áp dụng cho các hệ thống Agilent có thế hệ từ 6850 trở về sau, xa hơn nữa là các hệ thống GC trang bị với điều khiển khí điện tử (electronic pneumatic control, EPC) RTL được phát triển để đảm bảo thời gian lưu tương ứng gần nhau, đặc biệt khi các hệ thống GC khác nhau làm việc trên cùng một loại cột là cột nhỏ như cột mao dẫn (capillary column).[29] Tóm lại, RTL đơn giản là tiến trình chuyển đổi phương pháp (method) phân tích từ

ký khác, từ đầu dò này đến đầu dò khác Sử dụng RTL, thời gian lưu giữa các hệ thống GC có độ chênh lệch trung bình 0.16% (0.02-0.03 phút) với chế độ chạy đẳng

áp (constant pressure mode).[128]

1.2.2 Nguyên tắc

RTL có thể được áp dụng trên bất kỳ hệ thống GC Agilent từ dòng 6850 nào có cột chuẩn giống nhau Ngoài ra, để thực hiện quá trình RTL, đòi hỏi hệ thống GC cần được trang bị các điều kiện sau:[128]

- EPC

- Split/splitless inlet

RTL nên được thực hiện ngay khi:[29128]

- Cột bị thay đổi hoặc bị cắt

- Phương pháp (method) được cài đặt trên một thiết bị mới

- Một đầu dò của áp suất đầu ra khác nhau bị sử dụng

- Đặc tính hệ thống có hiệu lực

- Gặp rắc rối với các vấn đề sắc ký

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa sự dịch chuyển thời gian lưu khi cột bị thay đổi hoặc bị

cắt và sự chênh lệch thời gian lưu giữa đầu dò FID và MSD

Colum

Ngay cả khi sử dụng cột có cùng số bộ phận (cùng id-số hiệu, cùng pha tĩnh, cùng tỉ

lệ pha, cùng độ dài chuẩn), các đường chuẩn khóa sự khác nhau/riêng biệt cũng cần thiết khi sử dụng: [128]

- Các hệ thống với áp suất đầu ra khỏi cột khác nhau (FID/khí quyển, MSD/kém, AED/được nâng lên)

- Các cột khác nhau về độ dài chuẩn hơn 15% (ví dụ do cắt cột, …)

- Các hệ thống nơi áp suất khóa dự đoán rơi ra khỏi vùng chuẩn hóa hiện tại Tóm lại, việc thực hiện RTL với các điều kiện như trên có thể được dùng để khóa thời gian lưu giữa các hệ thống GC của hãng Agilent: GC/FID-GC/FID, GC/MSD- GC/MSD, GC/FID-GC/MSD Khi đó, để có được các thông số để đạt thời gian lưu mong muốn giữa hai hệ thống, có thể sử dụng phần mềm chuyển đổi

- Bước 2: Lấy áp suất đầu (head pressure) của phương pháp chuẩn (nominal method), Pn, xem như giá trị tham khảo; thực hiện 5 lần chuẩn hóa (calibration run)

ở các áp suất đầu khác nhau: Pn – 20%, Pn – 10%, Pn, Pn + 10%, Pn + 20% Lập đường chuẩn biểu diễn mối liên hệ giữa áp suất và thời gian lưu

- Bước 3: Từ đường chuẩn, chọn thời gian lưu nào đó cho chất mục tiêu, suy ra được áp suất tương ứng Khóa thời gian của chất mục tiêu tại điểm đó, và cập nhật giá trị áp suất tương ứng vào method ban đầu, lưu lại Lúc này, method này được gọi là method đã khóa thời gian lưu

sẽ được lưu

ẩn hóa này

ể sử dụng thiết lập t8]

hoặc thiết l

ác điều ki chất mục tiê

i gian lưu thod” (Hìn hương phá

u lại và trở

y chỉ cần đ

sự chuẩn h thiết bị tươ

ở thành mộ được hệ thố hóa này kh ơng tự (fam

uất RTL và

itted curve chấp nhận,

t phần của ống hóa m

hi phương miliar instru

các bước s ethod cond

a phương ph một lần Nh pháp (met rument setu

phương ph

ệ giữa thời lưu so với háp sắc ký hững người thod) phân up), không

1.2.4 Phân tích tinh dầu theo phương pháp GC/FID & GC/MSD kết hợp RTL 1.2.4.1 Lý do sử dụng

GC mao quản đã và đang được xem như là phương pháp chọn lựa cho việc phân tích tinh dầu qua nhiều năm Các cấu tử trong tinh dầu được xác định dựa trên sự kết hợp các kỹ thuật GC khác nhau như GC/FID-RI (RI, retention index), GC/sniffing (olfactometric detection = sniffing, xác định hơi, GC/Olfactometry), GC/MSD, GC/FID, GC/flame photometric detection, GC/nitrogen phosphorous detection, GC/AED (atomic emission detection), … GC/MSD tuy được xem là kỹ thuật có quyền lực nhất cùng với thư viện khối phổ mở rộng nhưng vẫn không có khả năng xác định chính xác tất các cấu tử có trong tinh dầu, một hỗn hợp phức tạp của các hợp chất monoterpen, sesquiterpen, và diterpen Không có bất kỳ cột mao quản nào có thể giải quyết tất cả các hợp chất có trong tinh dầu Mặt khác, dữ liệu phổ không phải luôn mang tính thuyết phục bởi lẽ các đồng phân thường cho phổ tương tự nhau.[84]

Trong quá trình điều khiển chất lượng của hương liệu và mùi thơm, các chỉ số lưu (RI) vẫn được sử dụng thường xuyên như là một kỹ thuật bổ sung cho GC/MSD Đã

có nhiều thư viện phổ cung cấp các giá trị RI cho nhiều hợp chất trong hương liệu

và hương thơm Các chỉ số lưu ít phụ thuộc vào các thông số hoạt động hơn thời gian lưu thuần túy (absolute retention time), tuy nhiên chúng vẫn phụ thuộc một cách đáng kể vào loại cột (pha tĩnh và nhà cung cấp), phụ thuộc vào chương trình nhiệt, và xa hơn nữa là phụ thuộc vào vận tốc khí mang Hơn nữa hầu hết các công

ty về công nghiệp hương liệu và hương thơm vẫn sử dụng phương pháp truyền thống (in-house), mang tính chất thói quen trong việc lựa chọn loại cột từ các lựa

chọn trước đó Cuối cùng, việc sử dụng RI (trong đó, các n-alkan được xem là các

hợp chất tham khảo) là không thích hợp với phương pháp GC với loại đầu dò dạng ESD (element-selective detector, đầu dò chọn lọc nguyên tố) Ví dụ, một mũi được xác định ở một thời gian lưu (tR) nào đó sử dụng đầu dò chọn lọc sulfur, sẽ không

[84]

Ngày nay, việc sử dụng RTL không còn cần thiết để tính toán chỉ số lưu, nhưng thời gian lưu thuần túy có thể được sử dụng như một công cụ xác định Và dĩ nhiên, thời gian lưu vẫn còn phụ thuộc vào các điều kiện hoạt động, nhưng sự khác biệt nhỏ về vận tốc khí mang và độ dài cột sẽ được bù đắp bởi khóa lại (re-locking) phương pháp GC bằng cách điều chỉnh áp suất đầu cột Sau khi khóa phương pháp lại, nhiệt

độ rửa giải của chất tan là hằng số Hơn thế nữa, RTL cũng có thể được sử dụng kết hợp với các đầu dò khác nhau, đo độ chính xác của các phổ đồ GC/FID, GC/sniffing, GC/MSD, GC/AED Chính vì thế, RTL và dữ liệu RTL (RTL database) là những công cụ tuyệt vời cho phân tích QA/QC của tinh dầu và chất thơm.[84]

1.2.4.2 Phương pháp RTL

Thông thường, một tinh dầu cần xác định rõ thành phần hóa học và thành phần bách phân của từng cấu tử trong tinh dầu cần phải thực hiện song song quá trình phân tích với GC/FID (cho giá trị thành phần bách phân cấu tử tương đối chính xác) và GC/MSD (nhận danh cấu tử) kết hợp các chỉ số lưu (RI) như chỉ số KI, AI

Có 2 cách khóa thời gian lưu (RTL) giữa hai hệ thống GC khác nhau có cùng cấu hình:

- Thời gian lưu của cấu tử i trong mẫu phân tích giống nhau trên cả hai hệ thống, tRi

- Thời gian lưu của cấu tử i trong mẫu phân tích lệch nhau một giá trị M nhất định nào đó, tRi ± M, sao cho trật tự cấu tử trong phổ đồ giữa hai hệ thống không thay đổi

Chế độ phân tích có thể thực hiện ở đẳng áp hoặc đẳng dòng

Như vậy, để thời gian lưu không bị dịch chuyển đáng kể giữa 2 phương pháp GC/FID và GC/MSD, cần kết hợp với việc thực hiện RTL và sự xác định có thể kết hợp dựa trên cơ sở dữ liệu thời gian lưu các hợp chất hương thơm (GC/FID & GC/MSD RTL flavor databases).[12,128] Và dĩ nhiên, trong một số trường hợp có thể

kết hợp thêm các phương pháp khác như MNR, IR để định danh cấu tử trong tinh dầu.[12]

Điều kiện để thực hiện khóa thời gian lưu giữa hai hệ thống GC/FID và GC/MSD được sản xuất bởi Agilent Technologies

- Đầu dò: 5975C VL MSD with Triple-Axis Detector

- Chế độ inlet (split/splitless): split (25:1); 250 oC

- Khí mang: Helium; 10.604 psi, áp suất đầu (sau RTL)

- Cột: 30 m (chiều dài) x 250 μm (đường kính ngoài) x 0.25 μm (đường kính trong)

- Chương trình nhiệt: Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC

GC/FID

- GC: 6890N Network GC System

- Đầu dò: FID

- Chế độ inlet (split/splitless): splitless; 250 oC;

- Khí mang: Nitrogen; 8.250 psi, áp suất đầu (trước khi RTL)

- Cột: 30 m (chiều dài) x 320 μm (đường kính ngoài) x 0.25 μm (đường kính trong)

C/MSD đư ờng kính c

ấu tử phân ãng Agilen h) giữa cá

ềm chuyển

ược xem là cây thuộc h onen cũng một số cây

ược sử dụn cột và khí m tích khôn

y thuộc h

ng có cùng mang trong

GC

ần hóa học dầu vỏ trái rong thành

oa tán) và

n