Ứng dụng mới trong nhân giống lan hồ điệp

Trang 1

ỨNG DỤNG MỚI TRONG NHÂN GIỐNG

LAN HỒ ĐIỆP

MỤC LỤC

GVHD: Ts Lê Thị Thủy Tiên

1

Trang 2

PHẦN I

TỔNG QUAN

CHƯƠNG I

Sơ Lược Về Lan Hồ Điệp

1.1 Giới thiệu về lan Hồ Điệp.

Hình 1: đặc điểm hình thái lan Hồ Điệp

Thân: Cây đơn không có giả hành, được tạo ra bởi một đỉnh sinh

trưởng hoạt động liên tục Các đốt thân ngắn và thường được bao bọc bởi hai hàng bẹ lá, xếp lá dọc theo chiều dài thân

Lá: Lá đơn nguyên, dày, mọng nước, không có cuống và có bẹ ôm lấy

thân, hình dạng lá đơn (elip thuôn hoặc hình lưỡi mác) với mà sắc đơn hoặc

có thể tạp sắc Lá mang đặc tính của thực vật Cam.

Rễ: Rễ lan là rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc than xuyên qua bẹ lá Rễ

phát triển mạnh màu lục, xung quanh rễ có màng xốp bao bọc, lớp mô xốp này tạo sự dễ dàng cho lan hút nước, muối khóang và các chất dinh dưỡng cho cây, đồng thời đóng vai trò đặc biệt trong việc giữ nước cũng như ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt

Hoa: Phát hoa mọc ở nách lá, hoa mọc thành cụm, đối xứng hai bên,

bao hoa dạng cánh rời nhau và xếp thành hai vòng, cánh hoa có hình giống như cánh bươm bướm và có nhiều màu sắc sặc sỡ khác nhau, có thể nói lan

hồ điệp là hoàng hậu của loài lan

Keiki: Chỉ là một cây mọc từ một mắt trên cuống hoa Một số loài có hoa nhỏ như P lueddemanniana thường tạo keiki trên cuống hoa.

GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên

2

Trang 3

Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis sp, là loại lan có hoa lớn,

đẹp, bền Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém giống lan nào khác

từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại lan Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc

thẳng đứng hoặc có đốm to hay nhỏ Giống Phalaenopsis có khoảng 70 loài

Độ, (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Lan Hồ Điệp được khám phá vào năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius

xác định dưới tên là Angraecum album Đến năm 1753, Linne đổi lại là

Epidenndrum amabilis vào năm 1825, Blume một nhà thực vật Hà Lan định

trong đó khí hậu l tưởng cho việc nuôi trồng loại lan này là 220C – 270C

Việt Nam có khoảng 5- 6 giống nguyên chủng, gồm Phalaenopsisi gibbosa Sweet, phalaenopsis mannii Rchob.f, Phalaenopsis braceana (Hook.f)

christenson, phalaenopsis fuscata Rchob.f, Phalaenopsis lobbii (Rchob.f.)

Hầu hết chúng đều có hương thơm độc đáo

30 0C

3

Trang 4

Đây là loài lan chịu được biên độ ánh sáng khá rộng, ánh sáng hữu hiệu cho loài là 30% Nếu ta nuôi lan trong nhà kính ta phải dùng lưới che bớt ánh sáng Có thể dùng bốn đèn loại ống 40w và hai bóng đèn thường được đạt cách ngọn lan khoảng 15 – 20cm và chiếu sáng 12 – 16h/ngày.

1.1.4.3 Độ ẩm

Độ ẩm tối thích của lan là 50% - 80%, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn thì lan sẽ phát triển không bình thường và có thể gây hư hỏng hoặc giết chết lan

1.1.4.4 Thay chậu.

Nếu để lan phát triển quá lâu mà không thay chậu thì lan sẽ kém phát triển, khi nhận thấy chậu lan có các dấu hiệu như: lan cao quá chậu, rễ lan mọc vượt ra khỏi chậu thì nên tiến hành thay chậu cho lan Thay chậu lần 2 sau trồng từ 16-20 tháng, khoảng cách giữa 2 lá đạt khoảng 18cm bằng chậu

có đường kính 12cm

1.1.4.5 Chế độ chăm sóc:

Ngoài các điều kiện trên, trong giai đoạn sinh trưởng cần giữ nhiệt độ

hè che bớt 80-90% ánh sáng, mùa đông từ 60-70% Sau trồng 1 tháng bón thêm phân NPK 30-10-10 pha 30-40mg/lít nước phun 7 ngày/lần Phun NPK 30-10-10 (pha 40mg/lít); có thể bổ sung thêm các loại phân bón lá khác như Komix

1.2.Giá trị kinh tế.

1.2.1. Trong nước.

Sau khi đất nước giành được độc lập, nhân dân ta bắt tay vào công cuộc sản xuất, xây dựng nên kinh tế Đặc biệt là sau khi gia nhập WTO, nền kinh tế lại có thêm nhiều cơ hội phát triển Đời sống của người dân được nâng cao cả cả về vật chất và tinh thần, con người ngày càng có nhu cầu thưởng thức cảm nhận những cái đẹp và lan là một loài hoa có sắc đẹp kiêu sa, lộng lẫy được nhiều người trong giới chơi hoa tìm đến

4

Trang 5

Hà Lan, Hà Lan chiếm trên 55% tổng lượng hoa xuất khẩu của VN, chủ yếu là lan hồ điệp (Đà Lạt), với lượng xuất đạt trên 400 nghìn cành, trị giá gần 100 nghìn USD.Từ đầu năm 2010, lượng và kim ngạch xuất khẩu hoa sang Hà Lan khá đều đặn, dao động từ 45-65 nghìn cành Xuất khẩu hoa sang Hà Lan chủ yếu bằng đường hàng không Theo thống kê năm 2010, Hà Lan gần như là thị trường nhập khẩu hoa duy nhất của Việt Nam trong khối EU [Trích trên tờ:

http://danviet.vn/21371p1c25/xuat-khau-hoa-sang-ha-lan-tang-manh.htm]

1.2.2. Thế giới.

Thị trường xuất nhập khẩu lan trên thế giới diễn ra hết sức tấp nập, đáp ứng được nhu cầu chơi lan ở khắp mọi nơi Theo thống kê năm 2004 ở một số nước

có thế mạnh về xuất khẩu lan như sau

5

Trang 6

Trong năm 2004 Saudi Arabia

Xuất khẩu: $ 189,70 tỷ USD

Ấn Độ

1.3. Lịch sử phát triển của phương pháp nuôi cấy mô thực vật.

Bảng 2: Lịch sử nuôi cấy mô

1665 Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm

tế bào

1838 Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

1902 Haberlandt lần dầu tiên thí nghiệm nuôi cấy phôi cây một lá mầm nhưng không

thành công

1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở cây họ cải Crucifers.

1922 Cho hạt lan nảy mầm in vitro.

1924 Hình thành mô sẹo từ củ cà rốt trong môi trường có acid lactic

1925 Làm hạt phong lan nảy mầm in vitro.

1929 Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa hợp khi lai ở

Linum spp.

1934 White đã thành công khi nuôi cấy mô cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài

1936 Nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau

1939 Gauthere, Noecourt và whte lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời

gian dài từ mô tượng tầng ở cà rốt và thuốc lá

1941 Overbeek và cộng sự sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non cà rốt

1942 Gauthere lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi

cấy mô sẹo

6

Trang 7

in vitro.

1946 Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum

1948 Hình thành trồi phụ ở rễ thuốc lá

1950 Lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa

1951 Nitsch lần đầu tiên nuôi cấy noãn tách rời in vitro

1951 Skoog nghiên cứu sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng và phát triển cơ quan

1952 Morel và Martin lần đầu tiên tạo được cây thược dược sạch virus bằng nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng

1952 Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công

1953 Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo đơn bội

từ hạt phấn Ginkgo biloba.

1954 Muir và cộng sự lần đầu tiên tạo được mô sẹo từ mô nuôi dưỡng (nurse culture)

1955 Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và con đường sinh tổng hợp kinetin

1957 Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỉ lệ nồng độ các chất auxin/ cytokinin trong

môi trường đối với sự phát sinh cơ quan

1957 Vasil nghiên cứu nuôi cấy bao phấn tách rời ở Allium cepa.

1958 Maheshwari thực hiện nuôi cấy noãn tách rời in vitro ở cây anh túc Papaver

somniferum.

1958 Maheshwari đã tái sinh thành công phôi soma từ phôi tâm (nucella) trong nuôi

cấy noãn Citrus

1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134L)

bằng nuôi cấy chìm

1959 Reinert và Steward tạo được phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt

1960 Kanta lần đầu thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm ở Papaver rhoeas.

1960 Cocking lần đầu tiên sử dụng enzyme phân giải tế bào để tạo ta số lượng lớn tế

1967 Bourgin và Nitsch tạo cây đơn bội từ hạt phấn thuốc lá

1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy huyền phù tế bào Hapopapus gracilis.

1970 Chọn lọc đột biến sinh hóa ở thuốc lá

1971 Takebe và cộng sự tạo được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá

1972 Carlson và cộng sự tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ dung hợp tế

bào trần của 2 loài Nicotiana glauca và N langsdorfii

1973 Phát hiện cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas.

1974 Zaenen và cộng sự phát hiện plasmid Ti đóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall)

7

Trang 8

1974 Melchers và Lalib tạo cây đơn bội từ tế bào trần đơn bội.

1975 Gengenbach và Green chọn lọc dòng tế bào không bệnh nấm Helminthosporium

maydis trong nuôi cấy mô sẹo ở ngô.

1977 Chilton và cộng sự chuyển thành công T-DNA vào thực vật

1977 Noguchi và cộng sự nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor 200001

1978 Melchers và cộng sự tạo được cây lai soma cà chua- thuốc lá bằng dung hợp tế

bào trần

1978 Tabata và cộng sự nuôi cấy tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản

xuất shikonin

1979 Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuô

cấy tế bào và Agrobacterium.

1980 Alfermann và cộng sự sử dụng các tế bào nuôi cấy trong chuyển hóa sinh học

digitoxin thàh digoxin

1981 Larkin và Scowcroft đưa ra thuật ngữ “ biến dị soma” để chỉ các thay đổi di

truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro

1982 Krens đã chuyển DNA và tế bào trần

1982 Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện trong dung hợp tế bào trần

1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên

quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy huyền phù tế bào Lithospermum spp.

1983 Zambryski và cộng sự thiết kế các vector chuyển gen thông qua Agrobacterium.

1984 Chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá Nicotiana bằng DNA plamid và tái sinh cây

chuyển gen

1985 Fraley và cộng sự thiết kế vector Ti plasmid đã loại bỏ các gen độc gây hại cho

việc chuyển gen vào thực vật

1985 Horsch và cộng sự chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và

tái sinh cây chuyển gen

1985 An và cộng sự phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật

1985 Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng phương pháp

điện thẩm

1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở

Hyoscyamus muicus Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn

cây tự nhiên

1986 Crossway và cộng sự chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá bằng vi tiêm DNA trực

tiếp

1987 Klein và cộng sự đó sử dụng sung bắn gen (particle gun) mang vi đạn trong

chuyển gen và tái sinh cây biểu hiện gen chuyển

1987 Bytebier và cộng sự lần đầu tiên đã chuyển gen vào cây một lá mầm (Asparagus)

Trang 9

Agrobacterium zhizodenes.

1992 Lúa kháng chất diệt cỏ nhờ chuyển gen vào tế bào trần thông qua PEG

1993 Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh in vitro tạp ra và nuôi cấy phôi hợp tử ở ngô

Các quá trình phát triển và phân hóa của phôi sâu đó được quan sát dưới kính hiển vi bà phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định cà gen tham gia trong từng giai đoạn phát triển của phôi

1994 Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen “Flavr- Savr”

1998 Hamilton và cộng sự đã phát triển vector mang NST nhân tạo của hai vi khuẩn

( BBIC) cho chuyển gen thông qua Agrobacterium (khả năng chuyển 150kb).

9

Trang 10

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG

2.1.1. Nhân Phương pháp giâm cành.

 Vật liệu: là những cành bánh tẻ (không quá non, không quá già) , không bị

bệnh, không bị tật

- Bước 1 : dùng dao sắc cắt thành các đoạn hom, mỗi đoạn hom cắt khoảng 2 đốt

(có 3 mắc lá), sau đó cắt sạch lá ở mắt lá phía gốc rồi cho ngay vào sô nước sạch để cho hom khỏi bị héo Chú ý nên cắt gần sát mắt gốc để hom dễ ra rễ

Bước 2 : Lấy hom giống đã được cắt xong nhúng ngập mắt hom gốc vào thuốc

kích thích ra rễ đã được pha sẵn, sau đó dùng dớn mút đã được xé nhỏ quấn quanh mắt gốc rồi giâm vào vỉ xốp (loại vỉ 102 lỗ, giâm hom cách hom 01 hàng lỗ trên vỉ) Khi giâm hom giống vào vỉ xốp xong nên tưới sương nhẹ cho hom ngay để hom giống khỏi bị héo, hom giống giâm phải được để trong nhà lưới có mái che lưới đen 70% (cần che chắn xung quanh để tránh gió lùa vào làm cây héo), sau đó cần tưới từ 2 – 4 lần/ngày để đảm bảo cây không bị mất nước, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ra rễ của hom giống Giai đoạn này kéo dài trong khoảng 30 ngày thì

hom giống đã ra rễ, lúc này ta tiến hành chuyển hom giống đã có rễ sang bầu đất

Trang 11

Hình 3: Giâm cành

- Bước 3 : Hom giống sau khi đã có rễ đạt yêu cầu (cây con) thì tiến hành trồng

vào bầu đất

+ Bầu đất: Dùng loại bịch nilon đường kính 15cm (đã đục lỗ) để làm

bầu đất Giá thể bầu đất gồm có: 70% đất đỏ + 20% đất sạch DASA + 10% phân chuồng đã ủ hoai

+ Cách trồng: Chuẩn bị sẵn bầu đất sau đó nhổ cây con từ vỉ xốp (chú

ý không được làm đứt rễ ) và trồng ngay vào bầu đất, dùng ngón tay nén chặt xung quanh gốc để giữ cây được đứng vững tránh cây bị đổ ngã khi tưới nước Cây sau khi trồng vào bầu được chuyển vào nhà lưới có che lưới đen 60% và tưới bằng vòi nhỏ (phải kê bầu đất lên trên gạch để tránh bầu đất bị đọng nước), sau đó tưới 2 lần/ngày đảm bảo bầu đất luôn đủ ẩm để cây nhanh hồi phục và phát triển

+ Giai đoạn này kéo dài trong khoảng 30 – 40 ngày cây có thể xuất vườn đi trồng được

 Nhận xét:

Phương pháp này đơn giản, dễ làm, vốn đầu tư thấp, giữ được ưu điểu của cây mẹ thích hợp cho các hộ gia đình sản xuất nhỏ lẻ Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp không cao, hệ số nhân giống thấp, không tạo được giống sạch bệnh, cây con rễ mang bệnh của cây mẹ phương pháp này không được

áp dụng quy mô công nghiệp

2.1.2. Nhân giống bằng phương pháp ghép cành.

Trang 12

Sau khi cắt cành ghép, cát bỏ gai, cắt bỏ lá và giữ lại cuống lá, ngâm ngay vào nước sạch không được để cạn nước Tôt nhất là cắt xuống ghép ngay không để lâu Ở nhiệt độ 50C đảm bảo đủ ẩm có thể để được 1-2 tuần.

+ Chuẩn bị gốc ghép: Gốc ghép có thể là cây thực sinh hoặc cắm cành, khi đạt độ lớn nhất định từ 30 – 40 cm và đường kính thân khoảng 1cm ghép là tốt nhất

Hình 3: Phương pháp ghép cành

Vật liệu

Là một đoạn cành của cây cần nhân giống, trong thời gian phát triển mạnh, đã ra hoa một lần Đoạn cảnh được ghép không quá dài, có đường kính phù hợp với gốc ghép

Phương pháp và kỹ thuật ghép:

- Ghép đoạn cành:

Cành ghép là 1 đoạn cành nhỏ, ghép lên gốc ghép chủ yếu bằng phương pháp: ghép nối tiếp, ghép bên, ghép lưỡi… Nhưng sử dụng phương pháp ghép bên tiện lợi hơn cả, cụ thể như sau:

+ Sử dụng cành ghép.

Dùng cành ngủ sau khi rụng lá làm cành ghép, mỗi cành ghép có hai mắt

là vừa, sau khi cắt cành ngủ, bảo quản lạnh có thể sử dụng được trong thời gian dài

+ Thao tác ghép.

Gốc ghép phải to hơn cành ghép, cắt bỏ gốc ghép ở vị trí định ghép từ mặt ngang Dùng dao chẻ thành 1 đường làm miệng cắt, mang theo 1 phần gỗ.Cành ghép là một đoạn cành nhỏ gồm 2-3 mắt, dùng dao cắt ở gốc cành ghép tạo thành một mặt nghiêng 450 từ phía đối diện mặt nghiêng có độ dài cách

Trang 13

2-2,5cm, độ sâu vết cắt vừa bằng một lớp gỗ mỏng và phần vỏ bị cắt Khi cắt trước tiên là cắt vào phần vỏ, sau đó cắt xuống phía dưới Mặt cắt của cành ghép và mắt ghép phải phẳng, nhẵn sau khi ghép tượng tầng 2 bên tiếp hợp rồi dùng dây nilông buộc lại Cách ghép này có thể tiến hành trong vụ đông xuân nhưng đòi hỏi kỹ thuật cao, sau khi ghép xong đặt vào trong thùng tưới nước, giữ ẩm, dùng nilông buộc kín đặt trong thùng ấm từ 15-170 C, lúc đầu phải che nắng Sau mắt nảy mầm có thể cho tiếp xúc ánh sáng dần dần Sau

40 ngày có thể đem ra ruộng trồng Nếu muốn có cây con to hơn thì phải trồng trong vườn ươm, đợi khi mắt ghép cao khoảng 20cm ngắt ngọn 1 lần có thể đem trồng

Ngoài ra trong vụ xuân sớm có thể ghép trong nhà che phủ nilông tránh mưa phùn, sương muối, nâng cao nhiệt độ không khí

2.1.3. phương pháp chiết cành.

 Vật liêu.

Cành chiết được lấy trên các cây giống đã được chọn lọc ở thời kỳ sinh trưởng khoẻ, cây có năng suất cao, ổn định và không có sâu bệnh nguy hiểm gây hại Chọn những cành có đường kính từ 1 - 2 cm ở tầng tán giữa và phơi

Hình 4: Phương pháp chiết cành

Trang 14

Dùng dao cắt khoanh vỏ với chiều dài khoanh vỏ bằng 1,5 - 2 lần đường kính gốc cành Sau khi bóc lớp vỏ ngoài, dùng dao cạo sạch phần tượng tầng

đến lớp gỗ

Sau khi khoanh vỏ 1 - 2 ngày thì tiến hành bó bầu Đất bó bầu gồm 2/3 là đất vườn hoặc đất bùn ao phơi khô, đập nhỏ + 1/3 là mùn cưa, rơm rác mục, xơ

dừa tưới ẩm, bọc bầu bằng giấy polyetylen và buộc kín hai đầu bằng lạt mềm

Sau 60 - 90 ngày, tuỳ thuộc vào thời vụ chiết, cành chiết rễ Khi cành chiết có rễ ngắn chuyển từ màu trắng sang màu vàng ngà là có thể cắt cành

chiết đưa vào vườn ươm

2.1.4. nhân giống bằng phương pháp tách cây.

Phương pháp này đơn giản, giữ được tính ưu việt của cây mẹ, bộ rễ phát triển, dễ sống và mọc nhanh Phương pháp này thích hợp với các loài cây bụi và cây có rễ chùm Nghề nuôi trồng hoa gia đình thường dùng cách này thời gian tách cây theo loài hoa: Hoa nở mùa xuân tách vào mùa thu (tháng 10 - 11) hoa nở vào mùa thu tách cây vào mùa xuân (tháng 3 - 4)

Hình 5: Tách cây để trồng

Có hai phương pháp tách cây: (l) Đào cây lên, bỏ đất để lộ rễ, cắt rời các bộ phận rễ cây con từ cây mẹ, làm như vậy không ảnh hưởng đến cây mẹ, bảo vệ được sự hoàn chỉnh của bộ rễ (2) Không đào hết cây mẹ lên mà chỉ đào bên cạnh rồi cắt lấy cây con đem trồng

2.1.4. Phương pháp gieo hạt.

- Gieo ươm hạt trong bầu

Phương pháp gieo ươm hạt trong túi bầu được sử dụng cho cả phương pháp nhân giống bằng hạt và gieo ươm cây gốc ghép cho nhân giống

bằng phương pháp ghép Hạt giống được gieo trực tiếp vào túi bầu tiêu chuẩn

hoặc gieo vào túi bầu nhỏ rồi tiến hành ra ngôi sau Hạt giống thường được xử

lý và ủ cho nứt nanh mới tiến hành gieo Hỗn hợp bầu đang được sử dụng là

chuồng hoai mục + 10 - 15 kg supe lân

+ Hạt được gieo vào bầu Độ sâu lấp hạt từ 1 - 3 cm tuỳ thuộc vào thời

vụ gieo và tuỳ thuộc vào hạt giống cây ăn quả đem gieo

+ Các khâu chăm sóc phải được làm thường xuyên như: tưới nước giữ

ẩm, nhổ cỏ, xới xáo phá váng, bón phân đặc biệt là theo dõi, phát hiện và

Trang 15

phòng trừ bệnh kịp thời Bón thúc bằng nước phân chuồng pha loãng 1/10 - 1/15 hoặc các loại phân vô cơ pha loãng 1%

2.1.5. Nhận xét.

Nhìn chung các phương pháp nhân giống truyền thống khá đơn giản, rễ làm, không đòi hỏi trang thiết bị, kỹ thuật cao Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp không cao: hệ số nhân giống thấp, cây giống tạo thành không đồng nhất

về kiểu hình và di truyền, không đảm bảo sạch bệnh và dễ bị lây bệnh từ cây

mẹ, giá thành sản xuất cao Không thể áp dụng hoặc áp dụng không có hiệu quả trong nhân giống lan

Các phương pháp này thích hợp cho quy mô sản xuất nhỏ lẻ, hộ gia đình, khó áp dụng cho quy mô lớn(quy mô công nghiệp) Để tạo giống với số lượng lớn, đồng nhất về chất lượng , hiệu quả kinh tế cao cần áp dụng các phương pháp nhân giống hiện đại

2.2.1 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống.

Hiện nay người ta sử dụng nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau: nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy nốt đơn thân… Nhưng các phương pháp đều phải qua các giai đoạn cơ bản sau

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ.

Khi chọn cây mẹ cần phải xác định rõ mục tiêu nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất nên chon cây trong nhà kính hoặc trong phòng tăng

trưởng Cây mẹ phải được bón phân, phun thuốc trừ sâu bệnh chu đáo

Thời gian tăng trưởng của cây trong năm có ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy Các thay đổi về nhiệt độ, chiều dài ngày, cường độ ánh sáng và lượng nước tưới trong năm sẽ ảnh hưởng đến lượng carbohydrate, protein và các cơ chất khác của cây mẹ

Không nên chọn cây mẹ ở giai đoạn chồi ngọn còn quá non, nếu chọn đỉnh sinh trưởng thì đỉnh sinh trưởng đang hoạt động Rễ, thân, lá chọn mẫu còn non

Giai đoạn 2: khử trùng mẫu cấy.

Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể được sử dụng để nuôi cấy nhưng mức độ thành công phụ thuộc vào hệ số môi trường sử dụng, loài

Trang 16

thực vật được nuôi cấy và sự khử trùng thành công Mục tiêu của giai đoạn này là thu được lượng lớn các mẫu cấy vô trùng mà vẫn có khả năng tăng trưởng tốt Khử trùng bề mặt bao gồm rửa mẫu, tiếp theo là khử trùng mẫu.

Rửa mẫu: Mẫu được rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút ÷ 2 giờ, sau

đó rửa mẫu bằng xà bông sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm trên những mẫu cấy ngoài đồng, các mẫu có lông măng, rễ hoặc các cơ quan dự chữ, giúp cho việc khử trùng dễ dàng hơn

Khử trùng: Mẫu sau khi rửa sạch được ngâm chìm trong dung dịch

khử các nguồn nhiễm trên bề mặt mẫu cấy Dung dịch thường được sử dụng

để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 ÷ 5,25 % Các dung dịch được

sử dụng như: cồn, hylochlorite calcium, oxy già, natrie bạc … Khi thêm

tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) sẽ làm tăng hiệu quả khử

trùng Các loại thuốc thử khác nhau có thể được sử dụng một mình hoặc liên tiếp nhau sẽ đem lại hiệu khử trùng cao

Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy để rửa sách các chất khử trùng còn bán vào mẫu, những phần

bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp Sau đó mẫu cấy được đưa vào môi trường dinh dưỡng có bổ xung vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho mẫu cấy

Nếu mẫu cấy bị nhiễm bên trong thì có thể được khử trùng bằng cách bổ xung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý bằng các chất này trước khi khử trùng mẫu Thông thường sự khử trùng không thể loại bỏ được tình trạng nhiễm từ bên trong mẫu, vì vậy người ta thường bổ xung các chất kháng sinh vào môi trường nuôi cấy để kiểm soát sự tăng trưởng của vi khuẩn

Giai đoạn 3: Giai đoạn tăng sinh.

Mục đích của giai đoạn này là tăng sinh nhanh mô

Viêc tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành cây nguyên vẹn Phôi soma là tổ chức đơn giản được taọ ra từ tế bào soma nhưng sự phát sinh hình thái lại tương tụ như phôi hữu tính Việc sinh phôi từ tế bào soma hiên nay đã được thực hiện

Trang 17

thành công ở một số loài trong đó có ca rốt, Antirrhinum, petunia và một số

loài khác Phôi soma thường được sinh ra từ mô sẹo hơn là từ huyền phù tế bào

Các bước tạo phôi soma từ huyền phù tế bào

Bước 1: Tạo mô sẹo có khả năng tăng trưởng mạnh trên môi trường

có lượng khoáng và auxin giảm so với môi trường ban đầu

Bước 2: Sự phát triển của những tế bào đang tăng trưởng trong môi

trường lỏng tương tự như môi trường tạo mô sẹo

Bước 3: Loại bỏ auxin hoặc giảm lượng auxin trong môi trường nuôi

cấy

Bước 4: Sự tạo thành phôi soma và phát triển thành cây con.

 Tăng trưởng và sự phát triển của chồi bên.

Chồi bên hoặc chồi ngọn có thể được cảm ứng phát triển in vitro bằng

cách làm tăng sự phát triển những chồi đang hiện hữu Một mẫu cấy có mang một chồi đơn sẽ phát triển thành một cây hay thành một cụm chồi tùy thuộc vào loài thực vật và môi trường nuôi cấy Chồi bên sẽ được hình trên chồi ban đầu, qua những lần cấy chuyền quá trình này sẽ được lặp lại nhiều một cách chính xác Sự hình thành sẹo có thể xảy ra cùng với sự phát triển của chồi, và những chồi bất định có nguồn gốc từ vùng phân sinh ở trong mô sẹo sẽ phát triển thành cây con Cytikinin nồng độ 1 ÷ 30 % mg/l có thể sử dụng để kích thích sự tăng sinh của chồi bên Sau vài lần cấy chuyền cây con sẽ được tao ra

và chuyển qua giai đoạn 4 để cảm ứng ra rễ

 Sự phát triển của chồi bất định.

Chồi bất định và những mô có liên quan là những cấu trúc có nguồn gốc

từ những vùng không phải trục lá hoặc chồi ngọn Chồi bất định, rễ, vi củ và các cấu trúc đặc biệt khác có thể có nguồn gốc từ thân, lá, rễ, củ Chồi hoặc rễ bất định có thể có nguồn gốc từ mô sẹo, mô sẹo có thể coi như là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con Số lượng cụm chồi/ mô sẹo được tăng lên qua những lần cấy chuyền cây con có thể được chuyển sang giai đoạn 4 để tạo rễ

Giai đoạn 4: Sự tạo rễ in vitro và điều kiện ra rễ.

Ít có loài thực vật nào có thể ra rễ ngay trong môi trường nhân giống Nguyên nhân là do cytokinin hiện diện trong môi trường nuôi cấy đã ức chế sự hình thành rễ vì vậy cần có môi trường chuyên biệt để cảm ứng tạo rễ Các yếu

Trang 18

tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa lượng, vi lượng, các hợp chất hữu cơ, cơ chất (chất làm đặc môi trường), ánh sánh, nhiệt độ.

Ở một số loài thực vật, để cảm ứng sự tạo rễ nhất thiết phải chuyển sang môi trường hoàn toàn không có cytokinin Có một số loài có thể tạo rễ trực tiếp

mà không cần môi trường cảm ứng là Aechmea, anh đào lai, đỗ quyên Tuy

nhiên có một số loài ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin Những loại auxin thường được bổ sung vào môi trường để cảm ứng tạo rễ là IAA (0,1 ÷1,0 mg/l), NAA (0,05÷ 1,0 mg/l) và IBA (0,5 ÷ 3 mg/l) Sự đáp ứng của chồi với auxin và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào loài thực vật Rễ được tạo thành trong môi trường có auxin nhưng đôi khi nó lại không thể tiếp tực phát triển, tăng trưởng trong môi trường trong chính môi trường đó Vì vậy, có những trường hợp cần phải ngâm chồi vào môi trường lỏng có auxin trong một thời gian ngắn trước khi cấy vào môi trường ra rễ

Nồng độ của khoáng đa lương, vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nửa so với bình thường (tuy theo loài thực vật) Nguyên nhân là do nhu cầu sử dụng đạm của chồi ở giai đoạn này giảm Kamada và Harada đã chú ý rằng amino acid và vitamin có thể kích thích hoặc ngăn cản sự tạo thành rễ tuy theo loài Đường cần thiết cho sự tạo rễ ở nhiều loài thực vật Gautheret chứng minh rằng glucose là nguồn gốc carbonhydrate giúp cho sự ra

rễ của chồi in vitro thích hợp là hơn là fructose và sucrose

Ánh sáng cũng cần thiết cho sự ra rễ ở một số loài thực vất xác định Nhu cầu ánh sáng ở một số loài thực vật để củng cố hàm lượng carbonhydrate nội sinh khi tạo rễ Carbonhydrate có thể được cung cấp trực tiếp vào môi trường nuôi cấy hoặc được cung cấp qua quá trình quang hợp của chồi Nhưng nếu carbonhydrate giảm xuống dưới mức tối thiểu thì sự tạo rễ không xảy ra Ánh sáng cũng không nhất thiết cần cho sự tạo rễ ở một số loài thực vật thậm chí nó

có thể ngăn cẳn sự tạo rễ ở một số loài

Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vitro.

Khi được chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, chồi được nuôi cấy vào trong một hỗn hợp cơ chất ẩm để giúp cho sự ra rễ hỗn hợp cơ chất có thể là than bùn, vở cây, khoáng chất, đá nhỏ, đá bọt, cát, đất, và có thể trộn thêm một lượng nhỏ phân bón Than bùn có thể quá acid đối với một số loài xác định, trong khi đó khoáng chất thì có thể quá kiêm Môi trường lý tưởng cho sự ra rễ là PH trung tính hoặc hơi acid, có khả năng giữ nước nhưng phải thông thoáng

Trang 19

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

2.2.4.1. Đỉnh sinh trưởng.

Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nước Lớp cutin này bao bọc luôn cả chồi ngọn

Quá trình sinh trưởng được chia thành ba giai đoạn:

trưởng xẩy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành mô riêng biệt

quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định

thành tế bào, và kết quả là mô không có khả năng sinh trưởng Trước hết là các

u lồi dần được hình thành và được gọi là u lá Thể tích của u lá phát triển rất nhanh và kéo dài theo nó là một phần lớn của đỉnh sinh trưởng Dần dần u lồi chuyển thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá) Pháp thể phát triển nhanh theo chiều dài Sau khi lá được tách ra sẽ lặp lại sự phân chia tế bào, kết quả là thể tích đỉnh sinh trưởng được khôi phục laị nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu Ở mỗi nách lá đều có chồi nách (chồi bên) Chồi bên thực chất

có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân Do sự ưu tính ngọn, chồi bên gần như không phát triển, nhưng khi thoát ra khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì chúng bắt đầu tăng trưởng và có lá đầy đủ như thân chính

Quá trình tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong tế bào đỉnh sinh trưởng Vì vậy, đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus Do đó kỹ thuất nuôi cấy mô thực vật, đỉnh sinh trưởng được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy tạo cây sạch virus Do vùng ô phân sinh nhỏ, kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng được thực hiến dưới kính lúp hay mô phân sinh được lấy bao gồm luôn cả chồi ngọn

Các phương pháp tạo cây sạch bệnh.

Nếu nghi ngờ cây bị nhiễm bệnh virus thì tiến hành các phương pháp sau đây (Quak, 1977)

Trang 20

(2) Tiếp theo cố gắng loại trừ virus.

không

Các mẫu cấy sạch bệnh virus cũng có thể bị nhiễm virus trở lại Các phương pháp sau đây tiến hành nhằm ngăn cẳn sự nhiễm virus trở lại (Quak, 1966; Theiler, 1981)

gian gây bệnh truyền nhiễm virus

trùng, tuyến trùng

ghép, ngăn cản sự truyền bệnh do tác động cơ học trong suốt thời gian chăm sóc cây ghép

nghiệm

Cây mẹ Tách đỉnh sinh trưởng Môi trường nuôi cấy Hình thành chồi Cảm ứng ra rễ Đưa ra vườn ươm Huấn luyện giống Cây giống

2.2.4.2. Nhân giống đỉnh sinh trưởng.

Quy trình nhân giống

Trang 21

• Kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng:

Chồi ngọn phải được rửa sạch và bỏ

dịch hypoclorite calcium và cuối cùng

lúp rồi ngâm lại

Hình 6: Vùng tách lấy đỉnh sinh trưởng

trong dung dịch khử trùng pha loãng hoặc cồn 70% trong khoảng thời gian ngẳn rồi tách bằng dao mổ có đầu nhọn dưới kính lúp Chồi ngọn được giữ bằng một kẹp nhỏ trong lúc tiến hành tách lá Đầu dao mổ phải được khử trùng thường xuyên trong quá trình thao tác Khi đỉnh sinh trưởng chỉ còn 1÷2 phác thểlá thì dùng dao mổ tách rời ra và đặt ngay vào môi trường nuôi cấy để tránh cho mẫu bị khô Không nên dùng kính lúp có đèn có ánh sáng mạnh để tách lấy đỉnh sinh trưởng

• Huấn luyện giống.

Trang 22

Cây con sau khi được tạo thành không thể đưa vào sản xuất ngay, vì lúc này cây yếu, rễ non Cây con rễ bị mất nước và chết Vì vậy, để đảm bảo chất lượng giống khi đưa vào sản xuất ta nên đưa cây con vào vườn ươm (huấn luyện giống), tạo điều kiện thích hợp cho cây con phát triển như: cung cấp nước đầy

đủ, bổ xung khoáng và các chất dinh dưỡng cần thiết vào đất, cường độ ánh sáng không nên cao quá Cây con sau khi

được huấn luyện thì có thể đưa vào sản xuất

một cách ổn định

2.2.4 Nhân giống bằng tạo hột nhân

tạo.

Khái niệm.

Hột nhân tạo được tao thành từ phôi vô

tính và lớp vỏ bọc Hột nhân tạo có khả năng

nẩy mầm và tạo thành cây hoàn chỉnh khi gặp

điều kiện thích hợp Lớp vỏ bọc được làm

bằng các loại polymer chúng có chứa chất

dinh dưỡng, có khả năng giữ ẩm, có độ cứng

thích hợp để bảo vệ phôi

Các đặc điểm của hột nhân tạo Hình 7: Hạt nhân tạo

+ Không có phôi nhũ

+ Có khả năng nẩy mầm giống hạt tự nhiên

+ Phôi của hạt nhân tạo là phôi vô tính

+ Vỏ được cấu tạo bởi lớp cacbonhydrate tạo gel như alginade agar… và các thành phần dinh dưỡng

Mục đích của việc tạo hạt nhân tạo.

ứng

sinh trưởng tạo điều kiện tốt khi hạt nảy mầm

hoặc thực vật chuyển gen

Quy trình nhân giống.

Phôi soma

Trang 23

Phôi trưởng thành Nhân sinh phôi Tiêu chuẩn hóa phôi nhũ Tạo vỏ bọc cho hạt Làm khô hạt Hạt nhân tạo

Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi trường dinh dưỡng với mật độ phôi

vô tính thích hợp và bổ sung Na- alginate được làm tan trong nước với nồng độ 2-4 %

Dùng pipet (hoặc máy nhỏ giọt nhỏ 100-150 µl chứa một phôi soma vào

nhân được hình thành, có độ cứng thích hợp sau đó được đưa qua ngâm trong nước để làm cứng hạt

Dùng Ca- alginate thường hạt luôn luôn ẩm ướt bề mặt, hiện nay người ta dùng một loại polymer Elvax 4260 để bao lớp alginate

Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản và nẩy mầm khi cần thiết Kitto & Janick, đặt hạt nhân tạo của cây cà rốt trên khay có chứa 25% polyoxyethylene để làm mất nước, và khi làm ướt hạt lại thì hạt được tái sinh (hạt nẩy mầm) và phát triển thành cây hoàn chỉnh

Các phương pháp nhân giống in vitro đã thể hiễn rõ ưu điểm như: hệ số nhân giống cao, cây con đồng nhất về mặt di truyền, kích thướng đồng đều,

Trang 24

cây con sạch bệnh và ít bị nhiễm bệnh từ cây mẹ, phương pháp này được áp dụng ở quy mô công nghiệp, giá thành giảm do chi phí lao động thấp Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa đáp ứng một

PHẦN II

ỨNG DỤNG MỚI VÀO NHÂN GIỐNG

Trang 25

sử dụng trong thời gian dài mà không cần cấy chuyền Hiện nay đánh chú ý là

Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau

+ Cung cấp oxy đầy đủ

+ Có thể thay đổi môi trường và điều kiển tự động

+ Hạn chế sự nhiễm

+ Góp phần hạ giá thành sản phẩm

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một

số nguyên tắc sau: Phải có khả năng tạo sự ngập chìm không liên tục mà theo chu kỳ xác định Các hệ thống phải có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau, hay gồm một hệ thống bình chứa môi trường nối với hệ thống mẫu bằng hệ thống dây dẫn và bơm điều khiển

Tóm lại hệ thống ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận sau: -Bơm hay máy nén khí tạo áp lực cao để hút từ ngăn chứa môi trường lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại

- Hệ thống cài đặt thời gian dùng điều khiển chu kỳ ngập chìm

- Hệ thống ống dẫn và van điều khiển

Trang 26

- Các màng lọc

- Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh

Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập chìm khác nhau, tùy vào mục đính nuôi cấy khác nhau

3.1.2. Các hệ thống ngập chìm.

3.1.2.1.Hệ thống RITA

Hình 8: Hệ thống RITA ®

1995 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống gồm bốn pha:

Pha 1: mẫu cấy không ngập trong môi trường

Pha 2: Hiện tượng bắt đầu được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lên ngập mẫu nuôi cấy

Pha 4: chu kỳ kết thúc, van đóng lại và môi trường rút xuống ngăn bên dưới

3.1.2.2.Hệ thống bình sinh đôi BIT ®

Trang 27

Hệ thống được thiết kế bởi Escalona và cộng sự (1998) Được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 ml – 10L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình

Hình 9: Hệ thố ng bình sinh

đôi BIT ®

3.1.2.3.Hệ thống Plantima.

Biosecientific tại Đài Loan

Hình 10:

Hệ thống Plantima

3.2.1. Hệ thống nuôi cấy:

Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống bình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất Hệ thống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: bơm hay máy nén khí tạo

Trang 28

áp lực để đẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điều khiển chu kì ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thoáng khí vô trùng Các bình Plantima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa môi trường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật

Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí thông qua một máy bơm, môi tường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gian ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới Trong giai đoạn dung dịch ngập mẫu có sự trao đổi không khí, mẫu được xoay chuyển nhẹ và làm mới không khí bên trong bình nuôi cấy Dòng khí đi vào và thoát ra được khử trùng nhờ các lọc vô trùng 0,45µm Thời gian ngập chìm và tần suất

3.2.2. Mẫu cấy Lan Hồ Điệp

Đối tượng thí nghiệm là một loài Lan Hồ Điệp lai có tên gọi là

Doritaenopsis Taida Salu Mẫu gồm có:

thống khác nhau trên môi trường tái sinh chồi

3.2.3. Phương pháp thí nghiệm:

Điều kiện thí nghiệm

độ ẩm 80% - 85%, thời gian chiếu sáng 10h/ngày, cường độ chiếu sáng

2500lux

Nghiên cứu tập trung vào 3 nội dung:

• Khảo sát sự nhân nhanh của PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau.

Thí nghiệm khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau được tiến hành nhằm so sánh kết quả trong việc nâng cao hệ số nhân và chất lượng của PLBs trong hệ thống TIS so với các hệ thống nhân giống trên môi trường thạch và trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc Đồng thời khảo sát các thông số tối ưu cho việc nhân nhanh PLBs trên hệ thống TIS: mật độ mẫu cấy và tần suất ngập chìm

Trang 29

Môi trường nuôi cấy: môi trường MS bổ sung BA và NAA, sucrose và glucose, nước dừa Môi trường đối chứng trên thạch có sử dụng than hoạt tính và agar.

• Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS

Mẫu cấy là những PLBs được thu nhận từ quá trình nhân PLBs, môi trường nuôi cấy là môi trường MS ½ có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose Đối chứng là các mẫu cấy được nuôi trên môi trường đặc

Khảo sát các thông số tối ưu cho việc tái sinh chồi và nhân chồi trên hệ thống TIS: mật độ nuôi cấy và tần suất ngập chìm

• Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS

Mẫu cấy là những chồi được tách ra từ quá trình tái sinh chồi, chồi lúc cấy vào có chiều dài khoảng 8 – 9mm, chiều rộng lá khoảng 3 – 4mm, chiều cao thân khoảng 10mm, không rễ Môi trường nuôi cấy là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA Đối chứng là các mẫu được nuôi trên môi trường đặc

3.3 Kết quả.

3.3.1. Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau

3.3.1.1.Tối ưu quá trình nhân nhanh PLBs trong hệ thống TIS

Chu kỳ ngập chìm, mật độ và thể tích môi trường sử dụng trong hệ thống TIS có tác động lớn đến chất lượng mẫu cấy Vì vậy để đạt được hiệu quả cao nhất khi sử dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân nhanh PLBs, cần khảo sát và tối ưu các thông số về mật độ, thể tích, và chu kỳ ngập chìm của hệ thống TIS

 Tối ưu mật độ nuôi cấy PLBs:

Mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS ½ có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA với mật độ PLBs lần lượt là: 2g, 4g, 6g, 8g Trong hệ thống Plantima có chứa 200ml môi trường Sau 6 tuần nuôi cấy ta thua kết quả như sau:

Mẫu 1 (2g PLBs): Có trọng lượng tươi 11,25±1,87 (g), số lượng PLBs

trong 1(g) mẫu ban đầu 973,37 ± 30,68, tổng số chồi tạo thành 19,58 ±4,79

Trang 30

PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Không gian bình TIS cấy còn trống nhiều.

Mẫu 2(4g PLBs): Có trọng lượng tươi 23,05±4,65 (g), số lượng PLBs trong

xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Không gian bìnhTIS còn trống

Mẫu 3 (6 g PLBs): Có trọng lượng tươi 40,15± 5,08 (g), số lượng PLBs

PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Không gian trong TIS bình vừa đủ

Mẫu 4 (8g PLBs): Có trọng lượng tươi 53,30± 6,80 (g), số lượng PLBs

PLBs màu vàng, không được tròn, một số PLBs phát triển thành chồi, chồi có

lá màu vàng Không gian trong TIS chật kín

Khi để nuôi cấy trong bình Plantima có chứa môi trường để nhân PLBs với

thể tích là 200ml sử dụng 6g PLBs cho kết quả tốt nhất:

 Tối ưu thời gian và chu kỳ ngập chìm

Thực hiện ba thí nghiệm:

Thí nghiệm 1: Chu kỳ 1 giờ thời gian ngập chìm 10 phút

Trang 31

Kết quả:

Ở thí nghiệm 1 trọng lương tươi của PLBs, số lượng chồi hình thành, số lượng PLBs hình thành là lớn nhất là do thời gian ngập chìm ngắn PLBs được cung cấy chất dinh dưỡng đầy đủ Nhưng chu kỳ ngập chìm ngắn PLBs chìm trong môi trường liên tục làm giảm sự thông thoáng và trao đổi khí của PLBs nên chồi tạo thành rất to và mọng nước

Ở thí nghiệp 2 và 3 chu kỳ ngập chìm là 2 giờ, thời gian ngập chìm 5 – 10 phút Với chu kỳ và thời gian ngập chìm này đủ để cung cấp chất dinh dưỡng cho PLBs và tạo được sự khô thoáng cho PLBs Vì vậy PLBs tạo thành xanh tốt, khỏe mạnh

Tóm lại việc nhân PLBs trên hệ thống TIS cho kết quả tối ưu khi thời gian ngập từ 5 – 10 phút sau mỗi 2 giờ, thể tích nuôi cấy 200ml và mật độ 6g PLBs Sau 6 tuần nuôi cấy, mỗi bình Plantima cho khoảng 6100 LBs từ 600 PLBs ban đầu, tức là từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 10 – 11 PLBs mới, nếu so sánh trên môi trường thạch, cùng thời gian nuôi cấy, cùng thể tích và mật độ, sau 6 tuần thu được 2200 PLBs tức là từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 3 – 4 PLBS mới, và so sánh với nuôi cấy lỏng lắc trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường 40ml thì từ 1 PLBs ban đầu tạo ta 7-8 PLBs mới Vậy nuôi cấy trên hệ thống TIS cho

Hình 11 a: PLBs được nuôi trong hệ thống platima ở tuần suất 2 giờ/5 phút

3.3.1.2.Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau

Trang 32

Tiến hành nuôi 6 (g) PLBs trên 200ml môi trường trong các hệ thống nuôi cấy lỏng lắc, thạch, TIS Kết quả thu nhận sau 2 tháng như sau:

Kết quả:

Đối với mẫu cấy trên môi trường thạch (3,6±0,31 số PLBs/1(g) PLBs ban đầu),

số PLBs tạo thành là thấp do nuôi cấy trên môi trường rắn PLBs khó hấp thu chất dinh dưỡng Mẫu nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc (8,3±0,58 số PLBs/1(g) PLBs ban đầu) và hệ thống TIS (10,2 ± 1,55 số PLBs/1(g) PLBs ban đầu), số PLBs tạo thành lớn do mẫu được tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy nên dễ dàng hấp thu chất dinh dưỡng Tuy nhiên số PLBs trong hệ thống lỏng lắc vẫn nhỏ hơn trong

hệ thống TIS vì trong hệ thống lỏng lắc không tạo ra được quá trình thống thoáng khí cần thiết cho PLBs

Hình 12: PLBs được nuôi cấy trong các loại hệ thống khác nhau:

a: Lỏng có lắc; b: trên TIS; c: trên thạch 3.3.2. Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS

3.3.2.1.Tối ưu mật độ PLBs lên sự tái sinh chồi và nhân chồi trong hệ thống TIS.

Thí nghiệm trên bốn mẫu 1,2, 3, 4 với mật độ PLBs lần lượt như sau: 20 PLBs, 30 PLBs, 50 PLBs và mẫu đối chứng trên môi trường thạch 30 PLBs Sau hai tháng nuôi cấy ta thu được kết quả như sau

Kết quả

Tỷ lệ tái sinh chồi ở tất cả các mẫu là 100% tuy nhiên ở các mẫu có sự khác nhau về trọng lượng chất tươi, số chồi tạo thành trên một PLBs ban đầu Cụ thể như sau:

Mẫu 1 (trọng lượng tươi 11,54±2,19; 4,35±0,38 số chồi/ PLBs ban đầu)

2,67; 4,66 ± 0,71 số chồi/PLBs ban đầu) cho cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt,

Trang 33

có rễ Mẫu 3 (trọng lượng tươi 31,25 ± 5,10; 6,30 ± 0,64 số chồi/PLBs ban đầu) cho cụm chồi xanh tốt nhưng nhỏ hơn ở mẫu 1 và 2 Ở mẫu 4 (trọng

chồi kéo dài

Giải thích

Ở mẫu 1, 2, 3 PLBs được nuôi trong hệ thống TIS có trọng lượng tươi và

số chồi tạo thành /PLBs ban đầu lớn hơn trong mẫu 4, và tăng dần từ mẫu 1 đến mẫu 3 Trong mẫu 1 và 2 số chồi tạo thành thấp hơn so với mẫu 3 tuy nhiên chồi ở mẫu 1, 2 mập, xanh tốt lá tròn và to hơn mẫu 3 Có hiện tượng trên là vì trong mẫu 1, 2 lượng PLBs sử dụng với mật độ thấp so với môi trường, PLBs được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng nên quá trình tạo chồi

ít xảy ra Ở mẫu 3 sử dụng nồng độ PLBs vừa đủ với chất dinh dưỡng có trong môi trường nên quá trình tạo chồi và quá trình phát triển chồi đều đạt giá trị lớn nhất Trên môi trường thạch PLBs khó tiếp cận được chất dinh dưỡng nên quá trình tạo chồi và quá trình phát triển của chồi là thấp nhất Tóm lại trong bình Platima ở mật độ 50PLBs cho trung bình số cây tái sinh từ 1 PLBs ban đầu là 6,3 so với 1,73 PLBs trên môi trường thạch ( gấp 3,6 lần) Thêm vào đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn chồi trong bình tam giác về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá Vậy ở mật độ 50PLBs thích hợp cho quá trình tạo chồi

3.3.2.2.Tối ưu tần xuất ngập chìm lên sự tái sinh chồi từ PLBs

Thực hiện ba thí nghiệm nuôi cấy PLBs với mật độ 50PLBs trong bình Platima với thờ gian ngập chìm khác nhau trên môi trường MS Cụ thể

Thí nghiệm 1: Chu kỳ ngập chìm 4 giờ, thời gian ngập chìm 3 phút.

Thí nghiệm 2: Chu kỳ ngập chìm 6 giờ, thời gian ngập chìm 3 phút.

Thí nghiệp 3: Chu kỳ ngập chìm 8 giờ, thời gian ngập chìm 3 phút.

Kết quả

Sau thời gian nuôi cấy ta thu được kết quả sau

Thí nghiệp 1 (trọng lượng tươi 25,48 ± 4,84(g), số chồi /PLBs ban đầu 3,17

± 0,66 ) chồi xanh tốt, có PLBs dạng cụm Thí nghiệp 2 (trọng lượng tươi 34,39 ± 6,79 (g), số chồi /PLBs ban đầu 6,46 ± 0,64 ) chồi xanh tốt Thí nghiệp 3 (trọng lượng tươi 28,17 ± 4,05 (g), số chồi /PLBs ban đầu 4,46 ± 0,60) chồi xanh tốt Kết quả cho thấy: tần suất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho kết quả sổ chồi tạo thành trên một PLBs là cao nhất Chu kỳ ngắn (4 giờ) hay dài (8 giờ) cho kết quả tạo chổi thấp hơn hẳn Điều này cho thấy với chu kỳ 4 giờ cho ngập một lần mẫu được cung cấp chất dinh dưỡng thường xuyên hơn nhưng số chồi tạo ra chỉ là 3,17 và từ gốc lại tạo thêm PLBs mới, còn chu

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	4,87 MB