Ứng dụng mới trong nhân giống lan hồ điệp

Ứng dụng mới trong nhân giống lan hồ điệp

Ứng Dụng Mới Trong Nhân Giống Lan Hồ Điệp GVHD: Lê Thị Thủy Tiên ỨNG DỤNG MỚI TRONG NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP MỤC LỤC GVHD: Ts Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ PHẦN I TỔNG QUAN CHƯƠNG I Sơ Lược Về Lan Hồ Điệp 1.1 Giới thiệu lan Hồ Điệp 1.1.1 Vị trí loài Lan hồ điệp thuộc: Ngành: Magnoliophyta (thực vật hạt kín) Lớp: Monocotyledoneae (lớp mầm liliopsida) Bộ: Orchidaceae Họ: Orchidaceae Giống: Phalaenopsis Loài: Phalaenopsis spp Tên khoa học: Phalaenopsis wedding promenade 1.1.2 Đặc điểm hình thái Hình 1: đặc điểm hình thái lan Hồ Điệp Thân: Cây đơn giả hành, tạo đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục Các đốt thân ngắn thường bao bọc hai hàng bẹ lá, xếp dọc theo chiều dài thân Lá: Lá đơn nguyên, dày, mọng nước, cuống có bẹ ôm lấy thân, hình dạng đơn (elip thuôn hình lưỡi mác) với mà sắc đơn tạp sắc Lá mang đặc tính thực vật Cam Rễ: Rễ lan rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc than xuyên qua bẹ Rễ phát triển mạnh màu lục, xung quanh rễ có màng xốp bao bọc, lớp mô xốp tạo dễ dàng cho lan hút nước, muối khóang chất dinh dưỡng cho cây, đồng thời đóng vai trò đặc biệt việc giữ nước ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Hoa: Phát hoa mọc nách lá, hoa mọc thành cụm, đối xứng hai bên, bao hoa dạng cánh rời xếp thành hai vòng, cánh hoa có hình giống cánh bươm bướm có nhiều màu sắc sặc sỡ khác nhau, nói lan hồ điệp hoàng hậu loài lan Keiki: Chỉ mọc từ mắt cuống hoa Một số loài có hoa nhỏ P lueddemanniana thường tạo keiki cuống hoa GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp 1.1.3 Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ Nguồn gốc phân bố Lan Hồ Điệp có tên khoa học Phalaenopsis sp, loại lan có hoa lớn, đẹp, bền Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua giống lan khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến loại lan Hồ Điệp có sọc nằm ngang thẳng đứng có đốm to hay nhỏ Giống Phalaenopsis có khoảng 70 loài có 44 chủng loại, mọc từ d.y Hymalaya đến châu Á có 20 loài lan ưa nóng có nước Đông Nam Á bán đảo M Lai, Indonesia, Philippine, đông Ấn Độ, (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Lan Hồ Điệp khám phá vào năm 1750, ông Rumphius xác định tên Angraecum album Đến năm 1753, Linne đổi lại Epidenndrum amabilis vào năm 1825, Blume nhà thực vật Hà Lan định danh lần Phalaenopsis amabilis Bl tên dùng ngày Lan Hồ Điệp sống độ cao 200- 400 m (William kramer, 1983) nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm vừa chịu khí hậu mát, nhiệt độ trung b.nh từ 200300C, khí hậu l tưởng cho việc nuôi trồng loại lan 220C – 270C Việt Nam có khoảng 5- giống nguyên chủng, gồm Phalaenopsisi gibbosa Sweet, phalaenopsis mannii Rchob.f, Phalaenopsis braceana (Hook.f) christenson, phalaenopsis fuscata Rchob.f, Phalaenopsis lobbii (Rchob.f.) Hầu hết chúng có hương thơm độc đáo 1.1.1 Điều kiện sinh trưởng phát triển 1.1.4.1 Nhiệt độ Hồ điệp loài lan vùng nhiệt đới mà tăng trưởng chúng chịu ảnh hưởng hai mùa.Tuy nhiên hồ điệp xuất vùng rừng núi ẩm ven suối, biến đổi nhiêu nhiệt độ độ ẩm mùa mưa mùa khô Nhiệt độ tối thích cho lan hồ điệp phát triển 25 – 30 0C GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ 1.1.4.2 Ánh sáng Đây loài lan chịu biên độ ánh sáng rộng, ánh sáng hữu hiệu cho loài 30% Nếu ta nuôi lan nhà kính ta phải dùng lưới che bớt ánh sáng Có thể dùng bốn đèn loại ống 40w hai bóng đèn thường đạt cách lan khoảng 15 – 20cm chiếu sáng 12 – 16h/ngày 1.1.4.3 Độ ẩm Độ ẩm tối thích lan 50% - 80%, nhiệt độ cao thấp lan phát triển không bình thường gây hư hỏng giết chết lan 1.1.4.4 Thay chậu Nếu để lan phát triển lâu mà không thay chậu lan phát triển, nhận thấy chậu lan có dấu hiệu như: lan cao chậu, rễ lan mọc vượt khỏi chậu nên tiến hành thay chậu cho lan Thay chậu lần sau trồng từ 16-20 tháng, khoảng cách đạt khoảng 18cm chậu có đường kính 12cm 1.1.4.5 Chế độ chăm sóc: Ngoài điều kiện trên, giai đoạn sinh trưởng cần giữ nhiệt độ khoảng 23oC, không thấp 20oC, hệ thống thông gió hoạt động tốt Mùa hè che bớt 80-90% ánh sáng, mùa đông từ 60-70% Sau trồng tháng bón thêm phân NPK 30-10-10 pha 30-40mg/lít nước phun ngày/lần Phun NPK 30-10-10 (pha 40mg/lít); bổ sung thêm loại phân bón khác Komix 1.2 Giá trị kinh tế 1.2.1 Trong nước Sau đất nước giành độc lập, nhân dân ta bắt tay vào công sản xuất, xây dựng nên kinh tế Đặc biệt sau gia nhập WTO, kinh tế lại có thêm nhiều hội phát triển Đời sống người dân nâng cao cả vật chất tinh thần, người ngày có nhu cầu thưởng thức cảm nhận đẹp lan loài hoa có sắc đẹp kiêu sa, lộng lẫy nhiều người giới chơi hoa tìm đến GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ Hình 2: Lan Hồ Điệp Một giò lan hồ điệp có giá từ 150.000 đến vài triệu đồng, có nhiều hộ dân làm giàu nghề trồng lan.” Lan hồ điệp đẹp sang trọng nên chiếm cảm tình người chơi hoa, giá phù hợp với túi tiền Vì nhiều năm gần nghề trồng lan Hồ Điệp phát triển, để đáp ứng nhu cầu chơi lan người dân, nhiều phương pháp lai tạo nhân giống áp dụng cho ngành trồng lan Sản xuất lan Hồ Điệp không đáp ứng nhu cầu nước, mà ngày vươn sang thị trường xuất Tuy nhiên xuất hoa tươi ngặp nhiều khó khăn, nên xuất lan chưa trọng Thị trường chủ yếu Hà Lan, Hà Lan chiếm 55% tổng lượng hoa xuất VN, chủ yếu lan hồ điệp (Đà Lạt), với lượng xuất đạt 400 nghìn cành, trị giá gần 100 nghìn USD.Từ đầu năm 2010, lượng kim ngạch xuất hoa sang Hà Lan đặn, dao động từ 45-65 nghìn cành Xuất hoa sang Hà Lan chủ yếu đường hàng không Theo thống kê năm 2010, Hà Lan gần thị trường nhập hoa Việt Nam khối EU [Trích tờ: http://danviet.vn/21371p1c25/xuat-khau-hoa-sang-ha-lan-tang-manh.htm] 1.2.2 Thế giới Thị trường xuất nhập lan giới diễn tấp nập, đáp ứng nhu cầu chơi lan khắp nơi Theo thống kê năm 2004 số nước mạnh xuất lan sau GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ Xuất nhập lan Saudi Arabia Trong năm 2004 Saudi Arabia Xuất khẩu: $ 189,70 tỷ USD Nhập khẩu: 82290000000 $ USD Bảng 1: Mỹ Xuất Nhập 1.3 Năm 1665 1838 1902 1904 1922 1924 1925 1929 1934 1936 1939 1941 1942 Nhật 17,1 % Hàn Quốc 15,2 % 10,1 % Trung Quốc 9,3 % Ấn Độ 7% 12,2 % 7,7 % 10,5 % 4,2 % 5,1 % Singapoge Italia Anh 4,8 % 4,1 % 4,4 % Lịch sử phát triển phương pháp nuôi cấy mô thực vật Bảng 2: Lịch sử nuôi cấy mô Những phát minh kiện quan trọng Robert Hooke quan sát tế bào sống kính hiển vi đưa khái niệm tế bào Matthias Schleiden Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào Haberlandt lần dầu tiên thí nghiệm nuôi cấy phôi mầm không thành công Hannig tiến hành thí nghiệm nuôi cấy phôi họ cải Crucifers Cho hạt lan nảy mầm in vitro Hình thành mô sẹo từ củ cà rốt môi trường có acid lactic Làm hạt phong lan nảy mầm in vitro Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục tượng bất hòa hợp lai Linum spp White thành công nuôi cấy mô cấy mô rễ cà chua thời gian dài Nuôi cấy phôi loài hạt trần khác Gauthere, Noecourt whte lần nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô tượng tầng cà rốt thuốc Overbeek cộng sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Gauthere lần theo dõi hình thành chất trao đổi thứ cấp nuôi cấy mô sẹo GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp 1944 1946 1948 1950 1951 1951 1952 1952 1953 1954 1955 1957 1957 1958 1958 1959 1959 1960 1960 1960 1962 1964 1967 1969 1970 1971 1972 1973 1974 Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ Skoog lần nghiên cứu hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc in vitro Sự tạo từ đỉnh chồi Lupinus Tropaeolum Hình thành trồi phụ rễ thuốc Lần nuôi cấy thành công mầm nước dừa Nitsch lần nuôi cấy noãn tách rời in vitro Skoog nghiên cứu sử dụng chất điều hòa sinh trưởng phát triển quan Morel Martin lần tạo thược dược virus nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Morel Martin lần thực vi ghép in vitro thành công Tulecke lần thành công nuôi cấy bao phấn tạo mô sẹo đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba Muir cộng lần tạo mô sẹo từ mô nuôi dưỡng (nurse culture) Miller cộng phát minh cấu trúc đường sinh tổng hợp kinetin Skoog Miller khám phá vai trò tỉ lệ nồng độ chất auxin/ cytokinin môi trường phát sinh quan Vasil nghiên cứu nuôi cấy bao phấn tách rời Allium cepa Maheshwari thực nuôi cấy noãn tách rời in vitro anh túc Papaver somniferum Maheshwari tái sinh thành công phôi soma từ phôi tâm (nucella) nuôi cấy noãn Citrus Tulecke Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134L) nuôi cấy chìm Reinert Steward tạo phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt Kanta lần đầu thực thụ tinh ống nghiệm Papaver rhoeas Cocking lần sử dụng enzyme phân giải tế bào để tạo ta số lượng lớn tế bào trần Morel lần thành công nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh phong lan Murashige Skoog đề nghị môi trường nuôi cấy tế bào thực vật- môi trường MS Guha Maheshwari lần thành công tạo đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà rốt Bourgin Nitsch tạo đơn bội từ hạt phấn thuốc Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy huyền phù tế bào Hapopapus gracilis Chọn lọc đột biến sinh hóa thuốc Takebe cộng tạo từ tế bào trần mô thịt thuốc Carlson cộng tạo từ lai xa tế bào trần nhờ dung hợp tế bào trần loài Nicotiana glauca N langsdorfii Phát cytokinin có khả phá ngủ Gerberas Zaenen cộng phát plasmid Ti đóng vai trò yếu tố gây u (crown gall) GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp 1974 1975 1977 1977 1978 1978 1979 1980 1981 1982 1982 1983 1983 1984 1985 1985 1985 1985 1985 1986 1987 1987 1988 Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ trồng Melchers Lalib tạo đơn bội từ tế bào trần đơn bội Gengenbach Green chọn lọc dòng tế bào không bệnh nấm Helminthosporium maydis nuôi cấy mô sẹo ngô Chilton cộng chuyển thành công T-DNA vào thực vật Noguchi cộng nuôi cấy tế bào thuốc bioreactor 200001 Melchers cộng tạo lai soma cà chua- thuốc dung hợp tế bào trần Tabata cộng nuôi cấy tế bào thực vật quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Marton cộng xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần đồng nuô cấy tế bào Agrobacterium Alfermann cộng sử dụng tế bào nuôi cấy chuyển hóa sinh học digitoxin thàh digoxin Larkin Scowcroft đưa thuật ngữ “ biến dị soma” để thay đổi di truyền tính trạng xảy nuôi cấy mô tế bào in vitro Krens chuyển DNA tế bào trần Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện dung hợp tế bào trần Công ty Mitsui Petrochemicals lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp quy mô công nghiệp nuôi cấy huyền phù tế bào Lithospermum spp Zambryski cộng thiết kế vector chuyển gen thông qua Agrobacterium Chuyển gen vào tế bào trần thuốc Nicotiana DNA plamid tái sinh chuyển gen Fraley cộng thiết kế vector Ti plasmid loại bỏ gen độc gây hại cho việc chuyển gen vào thực vật Horsch cộng chuyển gen vào mảnh Agrobacterium tumefaciens tái sinh chuyển gen An cộng phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật Chuyển gen vào tế bào trần mầm hai mầm phương pháp điện thẩm Flores Filner lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ Hyoscyamus muicus Những rễ sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine tự nhiên Crossway cộng chuyển gen vào tế bào trần thuốc vi tiêm DNA trực tiếp Klein cộng sử dụng sung bắn gen (particle gun) mang vi đạn chuyển gen tái sinh biểu gen chuyển Bytebier cộng lần chuyển gen vào mầm (Asparagus) Agrobacterium tumefaciens Klein cộng tái sinh chuyển gen ổn định thông qua phương pháp bắn gen GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ 1991 Sản xuất mang gen thông Larix deciduas chuyển gen qua Agrobacterium zhizodenes 1992 Lúa kháng chất diệt cỏ nhờ chuyển gen vào tế bào trần thông qua PEG 1993 Kranz Lorz thực thụ tinh in vitro tạp nuôi cấy phôi hợp tử ngô Các trình phát triển phân hóa phôi sâu quan sát kính hiển vi bà phân tích biểu gen nhằm xác định cà gen tham gia giai đoạn phát triển phôi 1994 Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen “Flavr- Savr” 1998 Hamilton cộng phát triển vector mang NST nhân tạo hai vi khuẩn ( BBIC) cho chuyển gen thông qua Agrobacterium (khả chuyển 150kb) GVHD:TS Lê Thị Thủy Tiên PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG 2.1 giống phương pháp truyền thống 2.1.1 Nhân Phương pháp giâm cành  Vật liệu: cành bánh tẻ (không non, không già) , không bị bệnh, không bị tật  Phương pháp: - Bước : dùng dao sắc cắt thành đoạn hom, đoạn hom cắt khoảng đốt (có mắc lá), sau cắt mắt phía gốc cho vào sô nước hom khỏi bị héo Chú ý nên cắt gần sát mắt gốc để hom dễ rễ - Bước : Lấy hom giống cắt xong nhúng ngập mắt hom gốc vào thuốc kích thích rễ pha sẵn, sau dùng dớn mút xé nhỏ quấn quanh mắt gốc giâm vào vỉ xốp (loại vỉ 102 lỗ, giâm hom cách hom 01 hàng lỗ vỉ) Khi giâm hom giống vào vỉ xốp xong nên tưới sương nhẹ cho hom để hom giống khỏi bị héo, hom giống giâm phải để nhà lưới có mái che lưới đen 70% (cần che chắn xung quanh để tránh gió lùa vào làm héo), sau cần tưới từ – lần/ngày để đảm bảo không bị nước, tạo điều kiện thuận lợi cho trình rễ hom giống Giai đoạn kéo dài khoảng 30 ngày hom giống rễ, lúc ta tiến hành chuyển hom giống có rễ sang bầu đất PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp 5.3.1 Ảnh hưởng monosaccharide lên phát sinh phôi vô tính Thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ khác D- glucose lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis Khảo sát ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh mô sẹo của P.amabilis được thực hiện mẫu : A1 với môi trường bổ sung D-glucose có nồng độ 10g/l, A2 (20g/l), A3 (30g/l), và A4 (40g/l) Kết quả sau tuần nuôi cấy ta thấy được các cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm chuyển dần dang màu vàng nhạt sáng, kích thước nhỏ, xốp và thấy được sự gia tăng sinh khối bằng mắt thường Sau đó tiếp tục quan sát sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy đến sau ngày 45 ( này sự khác biệt giữa các mẫu cấy được thể hiện rõ rệt) thì tiến hành thu thập số liệu quan tâm Kết quả thu thập sau 45 ngày sau: - - Với mẫu A1 (trọng lượng tươi là 124,990±40,81 mg): phát sinh phôi tương đối đồng nhất, phôi cầu, vàng nhạt, kích thước nhỏ, một số phôi màu nâu kém sức sống Mẫu A2 (trọng lượng tươi là 116,312±38,53 mg): phôi cầu, kích thước nhỏ màu vàng nhạt Mẫu A3 (trọng lượng tươi là 101,310±27,62 mg): phôi cầu, kích thước nhỏ, khỏe Mẫu A4 (trọng lượng tươi là 75,100±48,23 mg): phôi vàng nhạt nâu, tỷ lệ sống sót của mẫu cấy 57,14% Qua kết quả thu nhận được thấy rằng nồng độ D-glucose thấp thì trọng lượng tươi của mẫu cấy cao, và ta tăng nồng độ chất bổ sung lên cao thì trọng lượng tươi của mẫu cấy giảm đi, cụ thể sau: ở nghiệm thức A1 trọng lượng tươi của mẫu cấy là 124,990 mg/ cụm mẫu, và tăng nồng độ D-glucose lên 20g/l (nghiệm thức A2) thì trọng lượng tươi của mẫu cấy giảm còn 116,312mg/cụm mẫu, nồng độ chất bổ sung tăng lên 30g/l (nghiệm thức A3) thì trọng lượng tươi chỉ còn 101,310 mg/ cụm mẫu, và tăng lên 40g/l (nghiệm thức A4) thì trọng lượng tươi của mẫu cấy gia tăng rất ít (75,1mg/cụm mẫu) – thấp nhất thí nghiệm này Đồng thời qua kết quả thu nhận ta thấy rằng ở môi trường bổ sung 10g/l D-glucose (nghiệm thức A1) thì mẫu cấy phát sing mô sẹo tương đối đồng nhất, phôi hình cầu, hình trứng, dạng chuyển tiếp, có màu vàng nhạt, kích thước nhỏ và chỉ có một số ít mô màu nâu kém sức sống; ở nghiệm thức A2 và A3 mẫu cấy chỉ tạo phôi hình cầu, kích thước nhỏ , màu vàng nhạt, phôi khỏe; đến nghiệm thức A4 mẫu cấy cũng tạo phôi phôi yếu, màu vàng nhạt nâu và tỷ lệ sống sót của mẫu cấy là 57,14% Như vậy Nhìn chung nồng độ D- glucose thấp (10g/l) thí nghiệm nghiệm thức A1 thích hợp cho việc phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy Đồng thời qua thí nghiệm ta có thể rút được nồng độ D-glucose tăng cao không PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp làm giảm tăng sinh phát sinh phôi mẫu cấy mà làm giản sức sống mô sẹo làm cho phôi hình thành yếu, sức sống làm tăng tỷ lệ chết mẫu cấy mô sẹo, làm cho phôi bị hóa nâu Sau ba tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung D- glucose nồng độ khác nhau, cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu vàng nhạt sáng, có kích thước nhỏ, xốp có gia tăng sinh khối quan sát mắt thường Tiếp tục quan sát sinh trưởng phát triển mẫu cấy, có khác biệt rõ rệt nghiệm thức tiến hành thu số liệu Số liệu thu sau 45 ngày nuôi cấy trình bày Bảng 18 Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ D- glucose có ảnh hưởng đến trình phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy Nhìn chung nồng độ D- glucose thấp (10g/l) thí nghiệm nghiệm thức A1 thích hợp cho việc phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy Sau 45 ngày nuôi cấy so với nghiệm thức lại thí nghiệm môi trường A1 mẫu cấy có trọng lượng tươi lớn (124,9 mg/cụm cấy) Bảng 18 Ảnh hưởng nồng độ khác D- glucose lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis sau 45 ngày nuôi cấy NT A1(10g/l) Trọng lượng tươi (mg) 124,990±40,81 A2(20g/l) A3(30g/l) A4(40g/l) 116,312±38,53 101,310±27,62 75,100±48,23 Đặc điểm Phát sinh phôi tương đối đồng nhất, phôi cầu, vàng nhạt, kích thước nhỏ, số phôi màu nâu sức sống Phôi cầu, kích thước nhỏ, màu vàng nhạt Phôi cầu, kích thước nhỏ, khỏe Phôi vàng nhạt nâu Tỷ lệ sống sót mẫu cấy 57,14% Khi nồng độ D- glucose tăng dần trọng lượng tươi giảm dần, cụ thể tăng nồng đô D-glucose lên 20g/l (nghiệm thức A2), trọng lượng tươi mẫu cấy 116,3mg/cụm mẫu ( thấp so với A1), nồng độ D-glucose tăng lên 30g/l (nghiệm thức A3), trọng lượng tươi mẫu cấy 101,3 mg/cụm mẫu tăng nồng độ D-glucose lên 40g/l (nghiệm thức A4) trọng lượng tươi mẫu cấy gia tăng (75,1mg/cụm mẫu), thấp PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp thí nghiệm Hơn nữa, nồng độ thấp (A1, 10g/l D-glucose), mẫu cấy mô sẹo phát sinh tương đối đồng nhất, phôi hình cầu, hình trứng, dạng chuyển tiếp, có màu vàng nhạt , kích thước nhỏ, số phô màu nâu sức sống Ở hai nghiệm thức A2 A3 mẫu cấy mô sẹo tạo phôi hình cầu, kích thước nhỏ, có màu vàng nhạt, phôi khỏe Còn nghiệm thứ A4, mẫu cấy tạo phôi, phôi yếu, màu vàng nhạt nâu Tỷ lệ sống sót mẫu cấy 57,14% Như nồng độ D-glucose tăng cao làm giảm tăng sinh phát sinh phôi mẫu cấy mà làm giản sức sống mô sẹo làm cho phôi hình thành yếu, sức sống làm tăng tỷ lệ chết mẫu cấy mô sẹo, làm cho phôi bị hóa nâu a b c d Hình 20: Ảnh hưởng nồng độ D- glucose lên phát sinh phôi từ mô sẹo Phalaenopsis sau 45 ngày nuôi cấy a: 10 g/l D-glucose; b: 20 g/l D-glucose;c: 30 g/l D-glucose; d: 40 g/l Dglucose Thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ khác D- fructose lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis Khảo sát ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo của P.amabilis được thực hiện mẫu : với môi trường bổ sung D-fructose có nồng độ lần lượt là B1(10g/l), B2 (20g/l), B3 (30g/l), và B4 (40g/l) Kết quả sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung D-fructose ở các nồng độ khác thấy các cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu nâu Sau đó tiếp tục quan sát sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy đến sau ngày 45 thì nhận thấy tất cả các mẫu cấy đều hóa nâu rồi chết Như vậy thí nghiệm ta thấy rằng tất cả mẫu cấy phản ứng tăng sinh tất nồng độ D-fructose từ 10g/l đến 40g/l Sau tuần nuôi cấy, quan sát thấy tất nghiệm thức mẫu cấy có biểu hóa nâu chết dần Như vậy, PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp D-fructose thí nghiệm có tác dụng không tốt lên mẫu cấy mô sẹo Dfructose không thúc đẩy mô sẹo tăng sinh hay phát triển thành phôi mà gây chết toàn mô sẹo tất nồng độ Điều chứng tỏ D-fructose không thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo Phalaenopsis amabilis Sau tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung D-fructose nồng độ khác nhau, cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu nâu Sau 45 ngày nuôi cấy, tất mẫu hóa nâu chết Số liệu trình bày bảng 19 Bảng 19 Ảnh hưởng nồng độ khác D- fructose lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis sau 45 ngày nuôi cấy NT Trọng lượng tươi (mg) Đặc điểm B1 - B2 - B3 - B4 - Mẫu chết, nghiệm phát sinh phôi Mẫu chết, nghiệm phát sinh phôi Mẫu chết, nghiệm phát sinh phôi Mẫu chết, nghiệm phát sinh phôi thức không thích hợp cho thức không thích hợp cho thức không thích hợp cho thức không thích hợp cho Hình 21: Ảnh hưởng nồng độ D-frutose lên phát sinh phôi từ mô sẹo Phalaenopsis amabilis sau 45 ngày nuôi cấy PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp a: 10 g/l D- fructose; b: 20 g/l D- fructose; c: 30 g/l D- fructose; d: 40 g/l Dfructose Trong thí nghiệm này, mẫu cấy phản ứng tăng sinh tất nồng độ D-fructose từ 10g/l đến 40g/l Sau tuần nuôi cấy, quan sát thấy tất nghiệm thức mẫu cấy có biểu hóa nâu chết dần Như vậy, D-fructose thí nghiệm có tác dụng không tốt lên mẫu cấy mô sẹo D- fructose không thúc đẩy mô sẹo tăng sinh hay phát triển thành phôi mà gây chết toàn mô sẹo tất nồng độ Điều chứng tỏ D-fructose không thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo Phalaenopsis amabilis 5.3.2 Ảnh hưởng disaccharide lên phát sinh phôi vô tính Thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ khác sucrose TN lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis Khảo sát ảnh hưởng của sucrose TN lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo của P.amabilis được thực hiện mẫu : với môi trường bổ sung sucrose TN có nồng độ lần lượt là C1(10g/l), C2 (20g/l), C3 (30g/l), và C4 (40g/l) Sau tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung sucrose TN nồng độ khác nhau, cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu vàng nhạt sáng, số nghiệm thức phôi có màu xanh, có kích thước nhỏ, xốp, có gia tăng sinh khối quan sát mắt thường, số nghiệm thức mẫu cấy tạo mô sẹo Theo dõi sinh trưởng phát triển mẫu cấy sau 45 ngày thì thu được kết quả sau: - Mẫu C1 (trọng lượng tươi 337,56±31,73 mg): Phôi có màu xanh, có nhiều long hút màu trắng Mẫu phát sinh phôi không đồng nhất, số phôi có màu vàng nhạt, phôi hình cầu xốp Mẫu C2 ( trọng lượng tươi 248,06±72,39 mg): Phôi có màu vàng nhạt, phôi hình cầu, có số phôi trắng, mẫu cấy tạo cụm phôi Mẫu C3 (trọng lượng tươi 171,68±77,83mg): Phôi vàng tươi, có tạo mô sẹo, phôi hình cầu, có số nâu đen, tỷ lệ sống sót mẫu 57,14% Mẫu C4 ( trọng lượng tươi 097,90±30,98 mg): Mẫu trì trạng thái mô sẹo, nhiên mô sẹo chết nhiều, tỷ lệ sống sót mẫu cấy 28,57% Từ kết quả thí nghiệm ta thấy được sucrose TN có ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo, nồng độ chất bổ sung càng gia tăng thì trọng lượng tươi càng giảm và ngược lại cụ thể sau: ở nghiệm thức C1 trọng lượng tươi của mẫu cấy là cao nhất (337,56 mg/ cụm mẫu), cụm mẫu cấy này sau tuần nuôi cấy bắt đầu cảm ứng với môi trường nuôi cấy, định hướng biệt hóa để hình thành phôi Tuy nhiên PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp phát sinh phôi khối mô sẹo nghiệm thức không đồng nhất, sau 45 ngày nuôi cấy xuất nhiều dạng phôi, số phôi có màu vàng nhạt, hình cầu xốp, số phôi dạng chuyển tiếp, số phôi khác có màu xanh nhạt (dạng embryogenic callus), sáng bóng, có nhiều lông hút màu trắng Mặc dù gia tăng trọng lượng tươi cụm mẫu cấy mô sẹo lớn nhất, nhiên chưa phải nghiệm thức tốt cho phát sinh phôi hình thái phôi không đồng Đối vói nghiệm thức C2 (20g/l sucrose TN), trọng lượng tươi mẫu cấy 248,06 g/cụm mẫu, cao thứ hai sau C1 Nhưng khả phát sinh phôi mẫu cấy nghiệm thức lại tốt Các cụm mẫu cấy mô sẹo sau tuần nuôi cấy, bắt đầu cảm ứng với môi trường nuôi cấy, định hướng biệt hóa để hình thành phôi Phôi có màu vàng nhạt hình cầu, có số phôi màu vàng trắng, số dạng chuyển tiếp, mẫu cấy tạo phôi dạng cụm, xốp, phôi khỏe bóng mượt Khi tăng nồng độ sucrose TN lên 30 g/l (nghiệm thức C3) trọng lượng tươi cụm mẫu lại giảm xuống (171,68 mg/ cụm mẫu), thấp nghiệm thức C1 C2 Ở nồng độ này, khả biệt hóa phôi cụm mô sẹo bắt đầu bị giảm dần Một số mẫu cấy trì trạng thấy mô sẹo, số khác biệt hóa phôi có dạng hình cầu hay dạng chuyển tiếp, số mô sẹo phát sinh phôi có màu vàng tươi, số mô sẹo phôi có màu nâu đen chết, tỷ lệ sống sót mẫu 57,14% Khi tăng nồng độ sucrose TN lên 40g/l (C4) , toàn mẫu cấy mô sẹo không tạo phôi mà trì trạng thái mô sẹo Tuy nhiên đến thời điểm khối mô sẹo tiết nhiều phenol, chúng có màu nâu đen, tỷ lệ sống sót mẫu cấy thấp (28,57%) Như vậy thí nghiệm cho thấy sucrose TN nồng độ thấp (10 đến 20 g/l) có ảnh hưởng tốt đến gia tăng trọng lượng tươi mẫu cấy mô sẹo có tác dụng tích cực phát sinh phôi mẫu cấy Ở nồng độ cao (30 đên 40 g/l), sucrose TN làm giảm khả phát sinh phôi khối mô sẹo nuôi cấy, gây chết mẫu dẫn đến làm giảm trọng lượng tươi khối mô sẹo nuôi cấy Trong thí nghiệm môi trường C2 (20 g/l sucrose TN thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy Sau tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung sucrose TN nồng độ khác nhau, cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu vàng nhạt sáng, số nghiệm thức phôi có màu xanh, có kích thước nhỏ, xốp, có gia tăng sinh khối quan sát mắt thường, số nghiệm thức mẫu cấy tạo mô sẹo Theo dõi sinh trưởng phát triển mẫu cấy sau 45 ngày Số liệu trình bày bảng 20 PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp Bảng 20 Ảnh hưởng nồng độ khác sucrose TN lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis sau 45 ngày nuôi cấy NT C1 Trọng lượng tươi (mg) 337,56±31,73 C2 248,06±72,39 C3 171,68±77,83 C4 097,90±30,98 Đặc điểm Phôi có màu xanh, có nhiều long hút màu trắng Mẫu phát sinh phôi không đồng nhất, số phôi có màu vàng nhạt, phôi hình cầu xốp Phôi có màu vàng nhạt, phôi hình cầu, có số phôi trắng, mẫu cấy tạo cụm phôi Phôi vàng tươi, có tạo mô sẹo, phôi hình cầu, có số nâu đen, tỷ lệ sống sót mẫu 57,14% Mẫu trì trạng thái mô sẹo, nhiên mô sẹo chết nhiều, tỷ lệ sống sót mẫu cấy 28,57% Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ sucrose TN có ảnh hưởng đến khả phát sinh phôi mẫu cấy mô sẹo Nhìn chung, nồng độ sucrose TN thấp mẫu cấy gia tăng trọng lượng khô nhiều, tăng dần nồng độ sucrose TN (từ 10g/l đến 40g/l) trọng lượng tươi cụm cấy giảm dần, mối tương quan nồng độ sucrose TN với trọng lượng tươi mẫu cấy mối tương quan nghịch tuyến tính Hình 22: Ảnh hưởng nồng độ sucrose TN lên phát sinh phôi từ mô sẹo Phalaenopsis amabilis sau 45 ngày nuôi cấy a: 10 g/l sucrose TN; b: 20 g/l sucrose TN; c: 30 g/l sucrose TN; d: 40 g/l sucrose TN Ở nghiệm thức C1 (10g/l sucrose TN), trọng lượng tươi mẫu cấy cao (337,56 mg/ cụm mẫu) thí nghiệm này, cụm mẫu cấy mô sẹo sau tuần nuôi cấy bắt đầu cảm ứng với môi trường nuôi cấy, định hướng biệt hóa để hình thành phôi Tuy nhiên phát sinh phôi khối mô sẹo PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp nghiệm thức không đồng nhất, sau 45 ngày nuôi cấy xuất nhiều dạng phôi, số phôi có màu vàng nhạt, hình cầu xốp, số phôi dạng chuyển tiếp, số phôi khác có màu xanh nhạt (dạng embryogenic callus), sáng bong, có nhiều lông hút màu trắng Mặc dù gia tăng trọng lượng tươi cụm mẫu cấy mô sẹo lớn nhất, nhiên chưa phải nghiệm thức tốt cho phát sinh phôi hình thái phôi không đồng Đối vói nghiệm thức C2 (20g/l sucrose TN), trọng lượng tươi mẫu cấy 248,06 g/cụm mẫu, cao thứ hai sau C1 Nhưng khả phát sinh phôi mẫu cấy nghiệm thức lại tốt Các cụm mẫu cấy mô sẹo sau tuần nuôi cấy, bắt đầu cảm ứng với môi trường nuôi cấy, định hướng biệt hóa để hình thành phôi Phôi có màu vàng nhạt hình cầu, có số phôi màu vàng trắng, số dạng chuyển tiếp, mẫu cấy tạo phôi dạng cụm, xốp, phôi khỏe bóng mượt Khi tăng nồng độ sucrose TN lên 30 g/l (nghiệm thức C3) trọng lượng tươi cụm mẫu lại giảm xuống (171,68 mg/ cụm mẫu), thấp nghiệm thức C1 C2 Ở nồng độ này, khả biệt hóa phôi cụm mô sẹo bắt đầu bị giảm dần Một số mẫu cấy trì trạng thấy mô sẹo, số khác biệt hóa phôi có dạng hình cầu hay dạng chuyển tiếp, số mô sẹo phát sinh phôi có màu vàng tươi, số mô sẹo phôi có màu nâu đen chết, tỷ lệ sống sót mẫu 57,14% Khi tăng nồng độ sucrose TN lên 40g/l (C4) , toàn mẫu cấy mô sẹo không tạo phôi mà trì trạng thái mô sẹo Tuy nhiên đến thời điểm khối mô sẹo tiết nhiều phenol, chúng có màu nâu đen, tỷ lệ sống sót mẫu cấy thấp (28,57%) Nhìn chung, sucrose TN nồng độ thấp (10 đến 20 g/l) có ảnh hưởng tốt đến gia tăng trọng lượng tươi mẫu cấy mô sẹo có tác dụng tích cực phát sinh phôi mẫu cấy Ở nồng độ cao (30 đên 40 g/l), sucrose TN làm giảm khả phát sinh phôi khối mô sẹo nuôi cấy, gây chết mẫu dẫn đến làm giảm trọng lượng tươi khối mô sẹo nuôi cấy Trong thí nghiệm môi trường C2 (20 g/l sucrose TN thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy Thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ khác sucrose TM lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis sau 45 ngày nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của sucrose TM lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo của P.amabilis được thực hiện mẫu : với môi trường bổ sung sucrose TN có nồng độ lần lượt là C1(10g/l), C2 (20g/l), C3 (30g/l), và C4 (40g/l) Sau tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung sucrose thương mại nồng độ khác nhau, cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu vàng nhạt sáng, có kích thước nhỏ, xốp có gia tăng sinh khối quan sát mắt thường Tiếp tục theo dõi sinh PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp trưởng phát triển mẫu cấy , có khác biệt nghiệm thức tiến hành thu số liệu (sau 45 ngày), số liệu thu nhận sau: - - - Mẫu D1 (trọng lượng tươi 149,03±41,18mg): Phôi màu vàng nhạt, hình cầu, kích thước nhỏ, phôi xốp, phôi dễ tái sinh Sự phát triển phôi đồng Mẫu D2 (trọng lượng tươi 331,84±61,04 mg): Phôi vàng nhạt, đồng nhất, phôi xốp, có kích thước nhỏ, phôi hình cầu Mẫu cấy tạo phôi dạng cụm Mẫu D3 ( trọng lượng tươi 107,80±25,31 mg): Mẫu tạo phôi chủ yếu tạo mô sẹo có màu vàng đậm Phần lớn mẫu chết Có khoảng 28,75 mẫu tạo mô sẹo Mẫu D4 : mẫu chết 100% có màu nâu đen Nhìn chung, nồng độ đường cao hay thấp không phù hợp cho trình phát sinh phôi từ mô sẹo, nồng độ cao, đường lại có tác dụng ức chế tạo phôi từ mô sẹo gây chết mẫu Cụ thể nồng độ 40g/l, 100%mẫu cấy mô sẹo tự chết Ở nghiệm thứ D1 (10g/l sucrose TM), mô sẹo phát triên tốt tạo phôi, phôi có màu vàng nhạt, hình cầu, kích thước nhỏ, phôi xốp, dễ tái sinh Sau 45 ngày nuôi cấy toàn khối mô sẹo mẫu ban đầu phát triển thành phôi Tuy nhiên chưa phải nghiệm thức tốt cho phát sinh phôi từ mô sẹo, đạt 149,03 mg/cụm mẫu Ở nghiệm thức D2, trọng lượng mẫu cấy tăng đáng kể (331,84 g/cụm mẫu) Ở nghiệm thức mẫu cấy tạo phôi vàng nhạt, đồng có kích thước nhỏ, hình cầu Mẫu cấy tạo phôi dạng cụm phôi xốp Toàn khối mô sẹo sau 45 ngày nuôi cấy phát triển thành phôi Trong thí nghiệm này, nghiệm thức D2 có khả phát triển phôi tốt Khi tăng nồng độ đường lên 30 g/l, khả tạo phôi từ mô sẹo lại giảm xuống, cụ thể trọng lượng tươi thấp nghiệm thức D1 D2, đạt 107,8 mg/cụm mẫu Mẫu tạo phôi, chủ yếu tăng sinh mô sẹo có màu vàng đậm Phần lớn mẫu chết, có khoảng 28,57% mẫu tạo mô sẹo Mô sẹo môi trường khó tái sinh, khả phát sinh phôi Hơn nghiệm thức mẫu cấy phát triển biệt hóa không đồng nhất, vừa tạo phôi đồng thời tạo mô sẹo Khi tăng nồng độ đường lên cao (40g/l nghiệm thức D4) toàn khối mô sẹo bị hóa nâu, đen chết Chứng tỏ nồng độ cao, đường làm rối loạn trình biến dưỡng sinh trưởng mẫu cấy mô sẹo, làm cho mô bị ức chế sinh trưởng thay sinh tổng hợp chất cần thiết cho sống chúng lại tạo nhiều hợp chất phenol (vốn chất độc, mẫu cấy bị thương tiết phản ứng với stress) Các chất gây độc cho mẫu cấy làm PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp chết mẫu Như vậy, thí nghiệm phát sinh phôi từ mô sẹo nồng độ sucrose TM 20 g/l thích hợp (nghiệm thức D2) Sau tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung sucrose thương mại nồng độ khác nhau, cụm mô sẹo có màu vàng tươi đậm có cấu trúc chắc, chuyển dần sang màu vàng nhạt sáng, có kích thước nhỏ, xốp có gia tăng sinh khối quan sát mắt thường Tiếp tục theo dõi sinh trưởng phát triển mẫu cấy , có khác biệt nghiệm thức tiến hành thu số liệu Số liệu thu sau 45 ngày nuôi cấy trình bày Bảng 21( Hình 23) Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ sucrose thương mại có ảnh hưởng đến trình phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy Nhìn chung, nồng độ đường cao hay thấp không phù hợp cho trình phát sinh phôi từ mô sẹo, nồng độ cao, đường lại có tác dụng ức chế tạo phôi từ mô sẹo gây chết mẫu Cụ thể nồng độ 40g/l, 100%mẫu cấy mô sẹo tự chết Ở nghiệm thứ D1 (10g/l sucrose TM), mô sẹo phát triên tốt tạo phôi, phôi có màu vàng nhạt, hình cầu, kích thước nhỏ, phôi xốp, dễ tái sinh Sau 45 ngày nuôi cấy toàn khối mô sẹo mẫu ban đầu phát triển thành phôi Tuy nhiên chưa phải nghiệm thức tốt cho phát sinh phôi từ mô sẹo, đạt 149,03 mg/cụm mẫu Bảng 21 Ảnh hưởng nồng độ khác sucrose TM lên phát sinh phôi từ mô sẹo P.amabilis sau 45 ngày nuôi cấy NT D1 Trọng lượng Tươi (mg/cụm mẫu) 149,03±41,18 D2 331,84±61,04 D3 107,80±25,31 D4 - Đặc điểm Phôi màu vàng nhạt, hình cầu, kích thước nhỏ, phôi xốp, phôi dễ tái sinh Sự phát triển phôi đồng Phôi vàng nhạt, đồng nhất, phôi xốp, có kích thước nhỏ, phôi hình cầu Mẫu cấy tạo phôi dạng cụm Mẫu tạo phôi chủ yếu tạo mô sẹo có màu vàng đậm Phần lớn mẫu chết Có khoảng 28,75 mẫu tạo mô sẹo Mẫu chết 100% có màu nâu đen PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp Hình 23: Ảnh hưởng nồng độ sucrose TM lên phát sinh phôi từ mô sẹo Phalaenopsis amabilis sau 45 ngày nuôi cấy a: 10 g/l sucrose TM; b: 20 g/l sucrose TM; c: 30 g/l sucrose TM; d: 40 g/l sucrose TM Ở nghiệm thức D2, trọng lượng mẫu cấy tăng đáng kể (331,84 g/cụm mẫu) Ở nghiệm thức mẫu cấy tạo phôi vàng nhạt, đồng có kích thước nhỏ, hình cầu Mẫu cấy tạo phôi dạng cụm phôi xốp Toàn khối mô sẹo sau 45 ngày nuôi cấy phát triển thành phôi Trong thí nghiệm này, nghiệm thức D2 có khả phát triển phôi tốt Khi tăng nồng độ đường lên 30 g/l, khả tạo phôi từ mô sẹo lại giảm xuống, cụ thể trọng lượng tươi thấp nghiệm thức D1 D2, đạt 107,8 mg/cụm mẫu Mẫu tạo phôi, chủ yếu tăng sinh mô sẹo có màu vàng đậm Phần lớn mẫu chết, có khoảng 28,57% mẫu tạo mô sẹo Mô sẹo môi trường khó tái sinh, khả phát sinh phôi Hơn nghiệm thức mẫu cấy phát triển biệt hóa không đồng nhất, vừa tạo phôi đồng thời tạo mô sẹo Khi tăng nồng độ đường lên cao (40g/l nghiệm thức D4) toàn khối mô sẹo bị hóa nâu, đen chết Chứng tỏ nồng độ cao, đường làm rối loạn trình biến dưỡng sinh trưởng mẫu cấy mô sẹo, làm cho mô bị ức chế sinh trưởng thay sinh tổng hợp chất cần thiết cho sống chúng lại tạo nhiều hợp chất phenol (vốn chất độc, mẫu cấy bị thương tiết phản ứng với stress) Các chất gây độc cho mẫu cấy làm chết mẫu Như vậy, thí nghiệm phát sinh phôi từ mô sẹo nồng độ sucrose TM 20 g/l thích hợp (nghiệm thức D2) 5.4 KẾT LUẬN Việc bổ sung đường vào môi trường cần thiết để mẫu cấu mô sẹo phát sinh phôi Tuy nhiên nồng độ đường loại đường bổ sung vào môi trường định khả phát sinh phôi mô sẹo nuôi cấy, nồng độ đường cao hay thấp ảnh hưởng không tốt đến trình phát sinh phôi Nếu nồng độ đường thấp (10g/l) mẫu cấy mô sẹo tạo phôi thời gian PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp ngắn sau phôi nhanh chóng chuyển thành PLB Còn nồng độ cao (40g/l) đường lại có tác dụng gây ức chế trình phát sinh phôi mẫu cấy mô sẹo làm cho khối mô sẹo tiếp tục trì trạng thái mô sẹo chết Loại đường khác gây đáp ứng khác mẫu cấy Nhìn chung, monosaccharide không thích hợp cho nuôi cấy phát sinh phôi, cụ thể D- glucose không gây chết hàng loạt, chúng không gây kích thích phát triển phôi Dường D- glucose có tác dụng trì sống cho mẫu cấy D-fructose hoàn toàn không thích hợp cho nuô cấy phát sinh phôi lan Hồ Điệp từ nguồn mẫu cấy mô sẹo chúng gây chết mẫu toàn nồng độ Các disaccharide dường thích hợp cho nuôi cấy phát sinh phôi từ mẫu cấy mô sẹo Đối với sucrose TN, nồng độ thấp chúng kích thích mẫu cấy tăng sinh mạnh cho trọng lượng tươi cao 10g/l Khi nồng độ sucrose TN bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng dần ngược lại trọng lượng tươi mẫu cấy giảm dần, tăng dần nồng độ đường cách tuyến tính giảm dần trọng lượng tươi mẫu cấy tuyến tính Như vậy, mối quan hệ nồng độ đường sucrose TN với trọng lượng tươi mẫu mối tương quan nghịch Tuy nồng độ 10 g/l , trọng lượng tươi mẫu cao so sánh với nồng độ lại thí nghiệm này, lại không cho hiệu phát sinh phôi tốt mẫu cấy phát sinh phôi không đồng Còn bổ sung sucrose TM vào môi trường nuôi cấy thí kết nghiên cứu cho thấy nồng độ thấp hay cao không thích hợp cho phát sinh phôi cụm mô sẹo nuôi cấy, nồng độ vừa phải (20 g/l) cho hiệu phát sinh phôi tốt Khi so sánh hiệu kinh tế, hiệu tạo phôi nồng độ, loại đường lên phát sinh phôi vô tính Phalaenopsis amabilis nhận thấy đường sucrose TM nồng độ 20 g/l thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp TÀI LIÊU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Teisson C & Alvard D, (1995) A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion In: Terzi M et al (eds) Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology (pp 105-110) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 2/ Etienne H & Berthouly M., (2002) Temporary immersion systems in plant micropropagation Plant Cell, Tissue and Organ Culture 69: 215–231 Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 3/ Dương Tấn Nhựt (chủ biên) Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn giống hoa NXB Nông Nghiệp TP HCM, 2007 4/ Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Lê Thị Thủy Tiên Công nghệ tế bào NXB ĐHQG TP HCM, 2006 5/ Dương Công Kiên Nuôi cấy mô thực vật tập NXB ĐHQG TP HCM, 2002 6/ Dương Công Kiên Nuôi cấy mô thực vật tập NXB ĐHQG TP HCM, 2003 7/ Dương Công Kiên Nuôi cấy mô thực vật tập NXB ĐHQG TP HCM, 2006 8/ Nguyễn Như Khanh, 2002 Sinh học phát triển thực vật Nhà xuất giáo dục, 83 trang 9/ Dương Công Kiên, 2002 Nuôi cấy mô thực vật Tập 1, 2, Nhà xuất Đại Học quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh, 199 trang 10/ V Thị Bạch Mai, 1996 Nhân giống vô tính số loài lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) Luận án Tiến sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 11/ Trần Văn Minh, 1999 Nuôi cấy mô tế bào thực vật Trung tâm khoa học tự nhiên quốc gia Viện sinh học nhiệt đới, trang 4- 12/ Nguyễn Công Nghiệp, 2004 Trồng hoa lan Nhà xuất trẻ 13/ Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội., 199 trang 14/ Huỳnh Văn Thới, 2005 Cẩm nang nuôi trồng kinh doanh phong lan Nhà xuất trẻ, 200 trang 15/ Nguyễn Văn Uyển ctv, 1993 Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác chọn giống trồng Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội 16/ Nguyễn Văn Uyển, 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật Tập Nhà xuất nông nghiệp TP Hồ Chí Minh 17/ http://www.plantphysiol.org/content/140/4/1255.full 18/ http://danviet.vn/31762p1c34/trong-lan-ho-diep-ung-dung-ngoi-ban.htm 19/ http://danviet.vn/21371p1c25/xuat-khau-hoa-sang-ha-lan-tang-manh.htm TÀI LIÊU THAM KHẢO 20/http://khuyennonglamdong.gov.vn/index.php? option=com_content&view=article&id=320:ky-thuat-nhan-giong-cay-chanh-day-bangphuong-phap-giam-hom-canh&catid=44:trong-trot&Itemid=107 21/http://www.cuctrongtrot.gov.vn/Tech_Science.aspx? index=detail&type=a&idtin=217 22/ http://www.uttungbonsai.com/vn/Tin-Tuc-Su-Kien/Ky-Thuat-Trong-Hoa- Canh/Cac-Phuong-Phap-Nhan-Giong-Vo-Tinh/ 23/ http://www.scribd.com/doc/40456299/Sas 24/ http://www.scribd.com/doc/37083143/Orchids-The-Original-Classic-Edition 25/ http://www.scribd.com/doc/30612218/The-Rtu-Orchid-Micro-Propagation- Guidebook 26/ http://www.scribd.com/doc/48066552/Easy-Care-Orchids-Storey-CountryWisdom-Bulletin-A-250 http://www.scribd.com/doc/42907298/Orchids-Biotechnology [...]... áp dụng các phương pháp nhân giống hiện đại 2.2 Nhân giống bằng phương pháp hiện đại 2.2.1 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống Hiện nay người ta sử dụng nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau: nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy nốt đơn thân… Nhưng các phương pháp đều phải qua các giai đoạn cơ bản sau Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ Khi chọn cây mẹ cần phải xác định rõ mục tiêu nhân giống. .. nên được giữ trong điều kiện in vitro (6) Tiến hành chọn lọc liên tục bằng cách quan sát bên ngoài và thực hiện chắc nghiệm Cây mẹ Tách đỉnh sinh trưởng Môi trường nuôi cấy Hình thành chồi Cảm ứng ra rễ Đưa ra vườn ươm Huấn luyện giống Cây giống 2.2.4.2 Nhân giống đỉnh sinh trưởng Quy trình nhân giống PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp • Kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng: Chồi ngọn phải... pháp nhân giống in vitro đã thể hiễn rõ ưu điểm như: hệ số nhân giống cao, cây con đồng nhất về mặt di truyền, kích thướng đồng đều, PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp cây con sạch bệnh và ít bị nhiễm bệnh từ cây mẹ, phương pháp này được áp dụng ở quy mô công nghiệp, giá thành giảm do chi phí lao động thấp Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa đáp ứng một PHẦN II ỨNG DỤNG MỚI VÀO NHÂN... phương pháp không cao: hệ số nhân giống thấp, cây giống tạo thành không đồng nhất về kiểu hình và di truyền, không đảm bảo sạch bệnh và dễ bị lây bệnh từ cây mẹ, giá thành sản xuất cao Không thể áp dụng hoặc áp dụng không có hiệu quả trong nhân giống lan Các phương pháp này thích hợp cho quy mô sản xuất nhỏ lẻ, hộ gia đình, khó áp dụng cho quy mô lớn(quy mô công nghiệp) Để tạo giống với số lượng lớn, đồng... gieo hạt - Gieo ươm hạt trong bầu Phương pháp gieo ươm hạt trong túi bầu được sử dụng cho cả phương pháp nhân giống bằng hạt và gieo ươm cây gốc ghép cho nhân giống bằng phương pháp ghép Hạt giống được gieo trực tiếp vào túi bầu tiêu chuẩn hoặc gieo vào túi bầu nhỏ rồi tiến hành ra ngôi sau Hạt giống thường được xử lý và ủ cho nứt nanh mới tiến hành gieo Hỗn hợp bầu đang được sử dụng là đất + phân chuồng... pháp này vẫn chưa đáp ứng một PHẦN II ỨNG DỤNG MỚI VÀO NHÂN GIỐNG PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp LAN HỒ ĐIỆP CHƯƠNG 3 BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI TRONG NHÂN GIỒNG LAN HỒ ĐIỆP LAI – PHALAENOPSIS HYBRID 3.1 Hệ thống ngập chìm 3.1.1 Sơ lược Trước những yếu điểm của phương pháp nhân giống thực vật trên môi trường thạch, lỏng và lỏng lắc, vào... lượng auxin trong môi trường nuôi cấy Bước 4: Sự tạo thành phôi soma và phát triển thành cây con  Tăng trưởng và sự phát triển của chồi bên Chồi bên hoặc chồi ngọn có thể được cảm ứng phát triển in vitro bằng cách làm tăng sự phát triển những chồi đang hiện hữu Một mẫu cấy có mang một chồi đơn sẽ phát triển thành một cây hay thành một cụm chồi tùy thuộc vào loài thực vật và môi trường nuôi cấy Chồi bên... 0,71 số chồi/PLBs ban đầu) cho cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt, PHẦN I: TỔNG QUAN Nhân Giống Chương 2: Các Phương Pháp có rễ Mẫu 3 (trọng lượng tươi 31,25 ± 5,10; 6,30 ± 0,64 số chồi/PLBs ban đầu) cho cụm chồi xanh tốt nhưng nhỏ hơn ở mẫu 1 và 2 Ở mẫu 4 (trọng lượng tươi 7,24 ± 1,04; 1,73 ± 0,26 số chồi/PLBs ban đầu) lá hơi dúm lại, thân chồi kéo dài Giải thích Ở mẫu 1, 2, 3 PLBs được nuôi trong hệ... tươi và số chồi tạo thành /PLBs ban đầu lớn hơn trong mẫu 4, và tăng dần từ mẫu 1 đến mẫu 3 Trong mẫu 1 và 2 số chồi tạo thành thấp hơn so với mẫu 3 tuy nhiên chồi ở mẫu 1, 2 mập, xanh tốt lá tròn và to hơn mẫu 3 Có hiện tượng trên là vì trong mẫu 1, 2 lượng PLBs sử dụng với mật độ thấp so với môi trường, PLBs được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng nên quá trình tạo chồi ít xảy ra Ở mẫu 3 sử dụng nồng... tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Không gian trong TIS bình vừa đủ Mẫu 4 (8g PLBs): Có trọng lượng tươi 53,30± 6,80 (g), số lượng PLBs trong 1(g) mẫu ban đầu 753,26±151,81, tổng số chồi tao thành 113,25±8,91 PLBs màu vàng, không được tròn, một số PLBs phát triển thành chồi, chồi có lá màu vàng Không gian trong TIS chật kín Giải thích: Ở mẫu 1 và 2 do lượng mẫu sử dụng ít hơn trên cùng lượng môi trường ...PHẦN I: TỔNG QUAN Điệp Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ PHẦN I TỔNG QUAN CHƯƠNG I Sơ Lược Về Lan Hồ Điệp 1.1 Giới thiệu lan Hồ Điệp 1.1.1 Vị trí loài Lan hồ điệp thuộc: Ngành: Magnoliophyta... QUAN Điệp 1.1.3 Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ Nguồn gốc phân bố Lan Hồ Điệp có tên khoa học Phalaenopsis sp, loại lan có hoa lớn, đẹp, bền Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua giống lan. .. cao cần áp dụng phương pháp nhân giống đại 2.2 Nhân giống phương pháp đại 2.2.1 Các giai đoạn trình vi nhân giống Hiện người ta sử dụng nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau: nhân giống đỉnh