Phân loại vi sinh Sinh Học Phân Tử Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 27/02/2007 Những tác giả Khái quát phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống: Trước công tác phân loại vi sinh vật dựa đặc tính hình thái, sinh lý hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả sinh acid môi trường sắc tố tạo thành v.v Các đặc trưng bộc lộ hạn chế đặc tính dùng cho nhóm vi sinh vật (Enterobacteriaceae) lại ý nghĩa nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria) Hạn chế phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị định tên vi sinh vật loài, bao gồm nhóm thể có mức độ tương đồng cao đặc điểm hình thái Các phương pháp dựa phản ứng sinh hóa: Từ hạn chế việc xác định đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu tập trung vào phản ứng sinh hóa đặc trưng cho vi sinh vật riêng biệt Sự khác biệt phản ứng có ý nghĩa cho phân loại vi sinh vật - API20E KIT, nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác Nói chung có nhiều nơi dùng kỹ thuật nhìn chung kết nhiều sai số nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trường hợp gene định phản ứng sinh hóa nằm plasmid lại bị nhiều nguyên nhân khác tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trình nuôi cấy dẫn đến sai khác làm sai kết - Phân biệt thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào để sau thực khuẩn thể nhân lên thành hạt tế bào chủ, với số vi khuẩn thực khuẩn thể xâm nhiễm lại không làm tan tế bào vi khuẩn chúng tồn với tế bào vật chủ Dựa vào khác biệt mà người ta dùng thực khuẩn thể khác để phân biệt đối tượng vi khuẩn nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm khó giải đặc tính mẫn cảm vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi điều kiện ngoại cảnh vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác thực khuẩn thể khác Mặt khác nữa, thực khuẩn thể dễ thay đổi đặc tính làm thay đổi chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ - Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây phương pháp dùng lâu hiệu sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt) Nguyên tắc dựa vào nhóm định kháng nguyên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao protein vỏ) Ưu phương pháp kháng huyết dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, nhiều trường hợp đặc trưng cho loài Nói chung phương pháp ổn định hạn chế chủ yếu phương pháp chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết không đồng phòng thí nghiệm tính ổn định lần lặp lại - Phân biệt loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin chất peptid kháng khuẩn sinh vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo loại bacteriocin có khả kháng lại bacteriocin Bởi có nhiều loại vi khuẩn phân loại dựa vào kiểu bacteriocin Kết luận: Có nhiều phương pháp truyền thống sử dụng nhiều nghiên cứu phân loại phương pháp tỏ vạn thích hợp cho đối tượng vi sinh vật, tính xác đạt kết hợp nhiều phương pháp khác Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày tiến sinh học phân tử mở khả ứng dụng hữu hiệu phân loại học nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu phương pháp truyền thống tập trung số đối tượng vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử áp dụng đối tượng vi sinh vật Nói chung phương pháp sinh học phân tử tập trung vào kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic + Phân tích protein + Phân tích lipopolysaccharid + Hóa phân loại học Trong phần tập trung giới thiệu số kỹ thuật phân loại liên quan đến acid nucleic Các phần sau giới thiệu phương pháp liên quan đến polysaccharid, lipoprotein hóa phân loại 2.1 Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN lai ADN a Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích bao gồm tách plasmid, so sánh loại plasmid kích thước sau tinh plasmid xử lý enzym cắt hạn chế, sau điện di gel agarose so sánh đa hình mảnh cắt để phân biệt chủng vi sinh vật với Plasmid vòng Streptomyces Borrelia Plasmid nhân tố di truyền nhân chép độc lập với nhiễm sắc thể Cấu trúc plasmid sợi đôi ADN khép kín theo vòng Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ sợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia Streptomyces) Plasmid tìm thấy hầu hết vi khuẩn số vi sinh vật nhân thực bậc thấp nấm men + Tách plasmid: Thông thường lượng plasmid có tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic tế bào Như vậy, ta phải thực phép tách plasmid khỏi ADN nhiễm sắc thể Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nguyên tắc chung phá tế bào vi khuẩn dùng enzym, siêu âm hay dung dịch kiềm có chất tẩy rửa SDS TritonX-100, sau việc loại ADN nhiễm sắc thể protein Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat Lúc phần lớn thành phần ADN nhiễm sắc thể protein tế bào bị kết tủa bị loại li tâm plasmid nằm dịch tủa tách kết tủa với ethanol hay isopropanol Đây phương pháp có hiệu để tách plasmid, thực tế hiệu tách plasmid có kích thước nhỏ cao nhiều so với plasmid có kích thước lớn (>100 Kb) Với plasmid có kích thước lớn cần thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy nguyên nhân học Với cách tách plasmid sản phẩm thu có lẫn đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp nhiễm ARN Để tránh nhiễm ARN cần xử lý với RNase (ribonuclease A) Tuy nhiên, tách theo phương pháp như: - Tách Caeseium chloride - Tách KIT QIAGENE - Tách kỹ thuật khác + Điện di plasmid gel agarose: Sau thu plasmid phải tiến hành kiểm tra trước phân tích kết điện di gel agarose để biết phổ plasmid kích thước chúng Khi tiến hành điện di nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, mM EDTA, pH 8.0) TPE (80 mM Tris- phosphats mM EDTA, pH 8.0) Sau điện di, gel nhuộm với ethidium bromide phát tia UV (310 nm) Nồng độ ethidium bromide khoảng mg/l thời gian nhuộm 10 phút Sau rửa lần nhanh nước loại ion trước nhìn UV chụp ảnh làm tài liệu Một số vấn đề cần lưu ý phân tích plasmid: gel thông thường plasmid thấy dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy dạng mạch thẳng bị cắt endonuclease Dạng di chuyển tốc độ cao siêu xoắn (Hình 1.1) Hình 1.1 Di chuyển plasmid mạch thẳng (L) siêu xoắn (OC) điện di Đôi việc tách plasmid phức tạp đặc biệt trường hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn mảnh ADN nhiễm sắc thể Trong trường hợp có nhiễm RNA chúng di động nhanh trừ trường hợp plasmid không nhầm lẫn plasmid siêu xoắn dạng plasmid đứt gãy plasmid khác Một ý khác tránh nhầm lẫn so sánh kích thước plasmid siêu xoắn dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng Thực tế so sánh plasmid siêu soắn với kích thước Khi tiến hành phân biệt chủng vi khuẩn đương nhiên thực so sánh chủng có plasmid với Cũng nên ý chủng giống đặc tính miễn dịch có chung kết phân tích plasmid Phép phân tích có hiệu mẫu có nhiều loại plasmid, nhiên phải tính đến việc plasmid bị trình bảo quản + Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế: Cho đến nay, người ta tìm thấy 400 enzym cắt hạn chế Mục đích kỹ thuật bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid Tức người ta phân biệt khác plasmid có kích thước Như vậy, xử lý plasmid với hay kết hợp số enzym cắt hạn chế kết thu đoạn ADN cắt có kích thước khác Kết có độ lặp lại cao, dễ sử dụng so sánh mẫu khác Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế sản xuất tiêu thụ thị trường, enzym có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid Thông thường xử lý enzym sau mẫu phát gel agarose polyacrylamid Tuỳ thuộc vào kích thước mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau: Bảng 1.1 Nồng độ agarose kích thước mẫu ADN tương ứng Nồng độ agarose (%) 0.3 Kích thước ADN (kb) 1-7 0.5 0.7-45 0.8 0.4-20 1.0 0.3-10 1.2 0.2-8 1.5 0.2-6 2.0 0.1-5 Theo kinh nghiệm nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ băng ADN có ý nghĩa cho so sánh không nên 10 băng nên có băng kích thước nhỏ kích thước lớn Tuy nhiên, băng lớn không nên vượt 10 băng có kích thước lớn khó di chuyển gel Trong trường hợp so sánh nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước phép phân tích dấu vân tay cho lần phân tích khác Như trình bày trên, phân tích chủng vi sinh vật dựa vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối tượng có nhiều plasmid phương pháp xử lý enzym cắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trường hợp nghiên cứu dịch tễ học chủng có phổ plasmid hay plasmid có kích thước giống Người ta ứng dụng kỹ thuật nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm (Hamburger) Các plasmid từ chủng khác có phổ khác đặc điểm cắt enzym cắt hạn chế Kết tạo mảnh ADN đặc trưng cho cá thể làm sở cho phép so sánh Tuy nhiên khó so sánh kết thu từ phòng thí nghiệm khác nhau, không dùng loại enzym cắt hạn chế Một lý cần đề cập đến xuất đột biến ngẫu nhiên vị trí enzym cắt, kết tạo khác biệt phổ thu từ mảnh cắt b Phân tích ADN nhiễm sắc thể: Phương pháp phân tích bao gồm việc tách ADN nhiễm sắc thể cắt enzym cắt hạn chế để phân biệt vi sinh vật với Một ý tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy nguyên nhân học Nói chung mảnh cắt nên có kích thước nhỏ 50 kb Việc tách mảnh cắt thực dựa vào kỹ thuật điện di trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style="text-align: justify; margintop: 6.0pt"> Như kỹ thuật dấu vân tay không áp dụng trường hợp tế bào mang plasmid mà kỹ thuật sử dụng với nhiễm sắc thể cho trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp Liên quan đến vấn đề phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết xử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật Ở cách chọn loại enzym cắt hạn chế vô quan trọng, theo cách chọn tạo nhiều mảnh cắt nên phân biệt băng riêng rẽ trường hợp khác lại tạo mảnh cắt có kích thước lớn khó tách theo kỹ thuật điện di có Các vi sinh vật khác có tỷ lệ GC khác (dao động từ 25-75%) mảnh cắt thu sau xử lý enzym cắt hạn chế khác Theo Nei M Li W H (1979) số mảnh cắt thu tính lý thuyết là: a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2 Trong đó: g - tỷ lệ GC ADN r1 - số cặp GC r2 - số cặp AT vị trí cắt enzym giới hạn sử dụng a - số vị trí cắt sử dụng enzym cắt hạn chế Mặt khác, người ta vào kết nghiên cứu vị trí cắt gene vi sinh vật làm sở cho cách chọn enzym cắt Thông thường cho phép phân tích người ta ghi số băng cắt enzym tính toán kích thước mảnh tạo thành làm sở cho phép phân tích sau Tuy nhiên, nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích phương pháp tách ADN thông thường dẫn đến thay đổi kích thước đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác có mặt plasmid lẫn tạo khác biệt giả kết phân tích, để khắc phục nhược điểm người ta phải thực phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết phân tích + Kỹ thuật điện di trường xung điện (điện di trường điện thay đổi, PFGE) - Nguyên tắc: Trước tiên mẫu đưa vào phân tích phải xử lý trước loại enzym cắt hạn chế mà có điểm cắt Kết phải tạo mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước điện di theo phương pháp thông thường mà tách kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (PulsedField Gel Electrophoresis ) Kỹ thuật PFGE lần Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu Tuy nhiên sau có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, có sai khác nhiều sở lý thuyết phương pháp nhau: Mục đích kỹ thuật tăng khả di động mảnh ADN có kích thước lớn điện trường, thành phần gel đệm không thay đổi theo phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theo phương pháp thông thường điện di liên quan đến di động mảnh ADN có kích thước khác gel agarose trường điện không đổi Kết phân tử lớn khó di động phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo tách biệt trường điện di Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả di động lại trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến mảnh ADN có kích thước khác thay đổi hướng di động Như kết mảnh có kích thước khác có khả di động khác Kích thước lớn mức độ di động chậm Sự di động khác ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước gel agarose phương pháp điện di thông thường, hình 1.2 Hình 1.2 Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau xử lý với Sma I với chủng Haemophilus ìnluenzae Tiếp theo mô tả Schwartz va Cantor, Smith Codemine (1990) đề cập đến di chuyển mảnh ADN khác hàm số tuyến tính với kích thước chúng Trên sở điều chỉnh xung điện điện trường Tuy nhiên nhân tố khác có mối tương tác lẫn ảnh hưởng đến khả di động ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose nồng độ ion đệm - Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giống phương pháp chuẩn bị ADN plasmid Một vấn đề thường xảy đứt gãy ngẫu nhiên ADN dẫn đến sai khác kết phân tích Để hạn chế điều người ta phải thực kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT (Schwartz va Cantor – 1984 Smith, Klco 1988) Theo phương pháp hỗn dịch tế bào (dịch nuôi cấy dịch huyền phù) trộn với LMT agarose 37oC Hỗn dịch xử lý với enzym chất tẩy rửa để tách ADN NST khỏi thành, màng tế bào, RNA protein Sau xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease tế bào với proteinase K N-lauroylsarcosine để loại thành phần khác tế bào Kết phần LMT agarose có chứa ADN NST dùng làm mẫu chạy gel 0.51.0% (nên làm tan 65oC) đưa lên mẫu chạy gel PFGE, tài liệu Smith (1988) mô tả chi tiết cách chuẩn bị mẫu từ tế bào có thành tế bào: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tế bào thực vật động vật Nói chung với trường hợp có thành tế bào cần đến bromide) nước hòa tan XTT (23-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide) © http://vietsciences.free.fr Dương Văn Hợp Nguyễn Lân Dũng http://vietsciences.org [...]... tượng vi sinh vật Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật Trong một số trường hợp vi c nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng. .. tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác Ribotyping và PFGE có chung nguyên tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí... để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support) a Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4 Hình 1.4 Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori Kỹ thuật này được thực hiện để định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật sau khi đã được... Wahl (1984) Người ta cũng đã sử dụng một số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt hoá hay có độ bền cho các phép lai Đối với công vi c định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định trên màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp Mẫu được ly giải và ADN bị biến tính, sau đó ADN được cố định trên màng khi đưa vào tủ... phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật Vi c kết hợp giữa phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn chế sẽ tạo được sự phân tích chính xác với các thông tin đáng tin cậy đối với các mẫu phân tích Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trên plasmid thì cần lưu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên cứu Khi thực hiện phép phân tích PFGE với các plasmid... lai + Chọn mẫu dò: Vi c chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai Nhìn chung các nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò Về mặt này chúng tôi đưa ra một số nội dung chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl và Amann (1991) như sau: Mẫu dò sẽ lai với ADN đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau... chất sinh màu khi có mặt enzym (chẳng hạn như Alkaline phosphatase) Lợi thế của phương pháp này là vi c phát hiện đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ phát hiện và ứng dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật Một phương pháp có thể làm tăng độ nhạy của phản ứng màu bằng cách thêm một enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống Một ví dụ cho điều này là vai trò loại nhóm phosphat của phân tử NADP... dịch tễ học vi sinh vật ở mức độ phân tử Tính hợp lý cho vi c sử dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNA ribosom có độ bảo thủ cao Cũng có thể phát hiện thấy những thay đổi chút ít trong quá trình tiến hoá đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu Gene RNA ribosom được tổ chức thành các operon mà các gene riêng rẽ mã cho các RNA kích thước 5S, 16S và 23S chúng được cách nhau bằng các... tiêu bản hiển vi Tuy nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới kính hiển vi huỳnh quang Điều đáng chú ý là phản ứng lai phải tiến hành trong thiết bị được hàn kín nhằm hạn chế vi c bay hơi... nhất là cách chọn enzym cắt hạn chế và loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder và cộng sự 1991) Tóm tắt: Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau Về nguyên tắc phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của nó Ưu điểm: - Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật - Có các mẫu dò vạn năng được ... phương pháp khác 2 Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày tiến sinh học phân tử mở khả ứng dụng hữu hiệu phân loại học nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu phương pháp truyền... đối tượng vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử áp dụng đối tượng vi sinh vật Nói chung phương pháp sinh học phân tử tập trung vào kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic + Phân tích... bền cho phép lai Đối với công vi c định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định màng cho phép lai ADN cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng