KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ------------o0o------------ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI SVTH: Đỗ Hương Thảo MSSV: 60502634 CBHD: Ths. Lâm Xuân Uyên Ts. Nguyễn Thúy Hưong Bộ môn: Công Nghệ Sinh Học TP. Hồ Chí Minh, 02/2010 - 1 - MÔÛ ÑAÀU - 2 - Những năm gần đây trứng vòt muối là một trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu có ưu thế cạnh tranh, đặc biệt lượng hàng xuất khẩu trứng vòt muối tăng lên vào các dòp trung thu hàng năm. Do đó, việc rút ngắn thời gian sản xuất và kéo dài thời gian bảo quản trứng vòt muối được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm. Hiện nay, nisin đã được sử dụng như một hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn (bacteriocin), có hoạt tính cao và an toàn khi dùng trong thực phẩm được Mỹ và hơn 50 quốc gia công nhận. Tuy nhiên, dòch bacteriocin bao bọc bề mặt thực phẩm không hiệu quả, thời gian lưu lại trên thực phẩm ngắn. Ngoài ra, do bacteriocin có bản chất là protein nên dễ bò enzyme protease thủy phân. Từ những đặc điểm trên cần phải có hướng giải quyết mới để có thể cố đònh được dòch bacteriocin giúp thời gian lưu lại lâu hơn, tăng được thời gian bảo quản thực phẩm. Do đó, đề tài: “Bảo quản lòng đỏ trứng vòt muối bằng màng BC hấp phụ nisin có nguồn gốc từ Lactococcus lactis” hướng đến những mục tiêu và nội dung sau: 1. Mục tiêu chính của đề tài: - Khảo sát khả năng hấp phụ dòch bacteriocin vào màng mỏng BC - Ứng dụng màng BC hấp phụ dòch bacteriocin để bảo quản lòng đỏ trứng vòt muối 2. Nội dung nghiên cứu - Tạo màng BC - Khảo sát khả năng hấp phụ dòch bacteriocin vào màng BC. - Ứng dụng màng BC hấp phụ dòch bacteriocin để bảo quản lòng đỏ trứng vòt muối. - 3 - CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 4 - 1.1 Bacteriocin 1.2.1 Giới thiệu về bacteriocin Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất. Bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm: - Bacteriocin do vi khuẩn Gram âm tổng hợp: gồm nhiều loại protein khác nhau về kích thước, nguồn gốc vi sinh vật, kiểu tác động và cơ chế miễn dòch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là Colicin do vi khuẩn Escherichia coli tổng hợp. Khả năng ức chế của bacteriocin do vi khuẩn Gram âm tổng hợp yếu hơn bacteriocin do vi khuẩn Gram dương. - Bacteriocin do vi khuẩn Gram dương tổng hợp: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm. Chúng khác với bacteriocin của vi khuẩn Gram âm ở những điểm sau: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm. Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điểm sau: - Được tổng hợp nhờ ribosome - Tế bào chủ miễn dòch với chúng - Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh - Phổ kháng khuẩn hẹp vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn gần với giống sản xuất. Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, LAB được quan tâm nhiều do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng. 1.1.2 Phân loại - 5 - Bacteriocin do LAB sản xuất được chia thành 4 lớp: Lớp I: (Lantibiotic) những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chòu nhiệt, hoạt động trên cấu trúc màng. Lantibiotic chứa những acid amin hiếm (lanthionine, 3 – methyllanthionine) và một số acid amin khử nước. Lantibiotic có thể được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấu trúc và chức năng: - Lớp Ia: là những peptide tích điện dương, gồm từ 21-38 acid amin. Những peptide này hoạt động chủ yếu do sự phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích. Có thể chia Lantibiotic thành hai phân nhóm dựa trên kích thước , điện tích và trình tự leader peptide. - Lớp Ib: là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 acid amin. Hoạt động chủ yếu của chúng là phá vỡ chức năng của các enzyme như ức chế việc sinh tổng hợp vách tế bào của tế bào đích. Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader ở đầu N, trình tự này sẽ bò cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích peptide hoạt hóa. Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt, gồm 30-60 acid amin. Bacteriocin lớp II có phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp II có thể chia thành 3 phân lớp: - Lớp IIa: rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu N và hoạt tính kháng Listeria. - Lớp IIb: những bacteriocin lớp này cần có sự kết hợp của hai peptide trong hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh. Trong hầu hết các trường hợp, các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin nhưng hoạt tính sẽ cao hơn khi có sự diện của peptide thứ hai. - Lớp IIc: bacteriocin phụ thuộc nhân tố sec-. Phân tử bacteriocin lớp IIc được đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc nhân tố sec-. - 6 - Bacteriocin lớp IIa có tiềm năng ứng dụng trong quy mô công nghiệp nhờ khả năng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các bacteriocin lớp I (Nisin) do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng, không tiêu diệt những chủng khởi động. Pediocin PA-1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ biến nhất trong số các bacteriocin lớp IIa. Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa), bền nhiệt. Lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của bacteriocin. Bacteriocin thuộc lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm lipid và cacbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào được tinh sạch. Bacteriocin lớp IV là kết quả của sự tương tác đặc tính kỵ nước và tích điện dương của bacterocin với các phân tử khác trong dòch thô. Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc lipoprotein. Ví dụ như leuconocin S và lactocin 27. Trong 4 lớp trên thì bacteriocin của lớp I và lớp II rất phong phú và có tiềm năng thương mại. Trong các chủng LAB thì Lactococcus lactis được quan tâm nghiên cứu rất nhiều, một số chủng Lc.lactis có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin do Lc.lactis gồm hai loại: lantibiotic và các bacteriocin kích thước nhỏ, bền nhiệt không phải lantibiotic. Lactococcus có khả năng sinh tổng hợp nisin – bacteriocin duy nhất được Tổ chức nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm. Nisin sẽ phá vỡ chức năng vận chuyển của màng tế bào và tế bào chất thoát ra ngoài, nó có khả năng chống cả vi khuẩn Gram âm lẫn vi khuẩn Gram dương, ức chế sự hình thành bào tử. Nisin có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, - 7 - tế bào dinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. cũng như ức chế nảy chồi của bào tử các loài Bacillus và Clostridoum [23]. Ngoài lantibiotic, Lc. lactis còn có khả năng sinh tổng hợp những phân tử bacteriocin kích thước nhỏ và bền nhiệt, điển hình là lactococin A,B và M. Lactococin có phổ kháng khuẩn hẹp hơn nisin, chúng chỉ có thể ức chế những chủng Lactococcus khác với chủng sản xuất. 1.1.3 Nisin – Bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis Đònh nghóa Nisin là bacteriocin có chứa lantibiotic do Lc. lactis sản xuất và là bacteriocin duy nhất được tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm. Chủng sản xuất nisin đầu tiên được tìm thấy trong sữa bởi Roger (1928), Whitehead (1933), Meanwel (1943) và Hirish (1944). Từ đó người ta ước lượng được khoảng 1/3 các chủng Lc. lactis subsp. lactis có khả năng sản xuất nisin. Nisin có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. cũng như ức chế sự nảy chồi của bào tử các loài Bacillus và Clostridium. Đặc điểm • Tính chất vật lý của nisin Phân tử lượng của một phân tử nisin là 3,4 KDa. Phân tử nisin có tính phân cực với đầu N kỵ nước và đầu C ưa nước. Tính tan của nisin phụ thuộc vào pH của môi trường. Khi pH của môi trường tăng tính tan của nisin giảm mạnh. Ở điều kiện trung tính và kiềm, nisin hầu như không tan. Độ bền của nisin có quan hệ chặt chẽ với tính tan. Độ bền của nisin không chỉ phụ thuộc vào pH mà bò ảnh hưởng bởi các yếu tố - 8 - khác: thành phần môi trường, nhiệt độ, … Nisin bò bất hoạt bởi α - chymotripsin, pancreatin và subtilopeptidase nhưng không bất hoạt bởi carboxypeptidase A, pepsin và tripsin. • Tính chất hóa học của nisin Khác với bacteriocin sản xuất từ LAB hay từ các loài vi khuẩn khác, nisin có phổ kháng khuẩn tương đối rộng. Nisin ức chế chủ yếu vi khuẩn Gram (+). Nisin ức chế tế bào sinh dưỡng và cả bào tử vi khuẩn. Hoạt tính sinh học của nisin phụ thuộc vào pH của môi trường. Hoạt tính sinh học của nisin giảm khi pH môi trường tăng. Đơn vò đo hoạt độ của nisin là IU (International unit), được đònh nghóa là hoạt tính có trong 1µg Nisaplin – nisin thương mại. 1g nisin tinh sạch chứa 40 x 10 6 IU, hay nói cách khác, hoạt tính sinh học của 40 IU tương đương với 1µg nisin tinh sạch. 1.1.4 Một vài đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bacteriocin do LAB sinh tổng hợp Để thực hiện hoạt tính gây chết, các bacteriocin thuộc lớp I và II phải thỏa mãn hai yêu cầu: tích điện dương và kỵ nước. Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3- 9. Thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11. Ở điểm đẳng điện cao cho phép chúng tương tác với bề mặt tích điện âm của tế bào vi khuẩn. Đối với các bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, các hợp chất cần thể nhận sẽ gắn phần kỵ nước vào màng vi khuẩn. Sự liên kết các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng làm mất gradient và gây chết tế bào. Tính chòu nhiệt cũng là những đặc điểm chính của bacteriocin trọng lượng thấp. Các liên kết monosulfit và disulfit trong phân tử càng nhiều thì phân tử peptide càng ổn đònh. Hầu hết dòch nổi tế bào của chủng sinh bacteriocin vẫn còn hoạt tính khi xử lý nhiệt hoặc hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực. Tuy nhiên, một vài loại bacteriocin - 9 - tạo bởi một số chủng Lactobacillus như helveticin bò bất hoạt khi xử lý nhiệt 60-100 o C trong 10 - 15 phút. 1.1.5 Quá trình sinh tổng hợp tạo bacteriocin 1.1.5.1 Cụm gen sinh tổng hợp bacteriocin Sự sinh tổng hợp bacteriocin nhờ vào một cấu trúc gen bao gồm bốn gen khác nhau mã hóa chức năng cơ bản cho việc sản xuất chất kháng khuẩn ngoại bào. Bốn gen đó bao gồm: (1) Gen cấu trúc mã hóa các prebacteriocin (2) Gen miễn dòch luôn luôn nằm kế gen bacteriocin và trên cùng đơn vò transcription. (3) Gen mã hóa ABC-transporter có chức năng vận chuyển bacteriocin ra ngoài. (4) Gen mã hóa một protein phụ cần thiết cho sự vận chuyển bacteriocin ra ngoài, có vai trò nhất đònh nhưng đến nay chưa được làm rõ. Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome. Các gen mã hóa cho việc sản xuất và miễn dòch bacteriocin thường sắp xếp thành những cụm gen operon. Hệ thống lactococcin A có hai operon được tìm thấy, trong khi đó đối với hệ thống pediocin PA- 1 điều khiển một operon bao gồm cả bốn gen tham gia đến việc sản xuất phân tử bacteriocin chủ động. Đối với những bacteriocin mạch thẳng không trải qua quá trình biến đổi (gồm plantaricin, carnobacteriocin và sakacin), chúng có những pepetide cảm ứng kích thích tổng hợp bacteriocin. Gen mã hóa các peptide này thường đònh vò trên cùng một cụm. Các cụm gen bacteriocin có thể đònh vò trên nhiễm sắc thể (subtilin và mersacidin), trên plasmid (divergicinA và sakicin A) hoặc các gen nhảy, transposon (nisin và lacticin 481). Các operon sinh tổng hợp lantibiotic thường chứa các gen mã hóa cho: prepeptide (Lan A), các enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi (Lan B,C/Lan M), - 10 - [...]... độ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình BC hấp phụ dòch nisin Thời gian Chế độ lắc Màng BC hấp phụ dòch nisin ở điều kiện tối ưu Bảo quản lòng đỏ trứng vòt muối Nồng độ bacteriocin Phương pháp ĐC1: Lòng đỏ trứng vòt muối bao bên ngoài 1 lớp PE Phương pháp A: Nhúng trứng vào nisin, bao bên ngoài 1 lớp PE Phương pháp B: Bọc trứng màng BC hấp phụ dòch nisin, bao ngoài lớp PE Đánh giá chất lượng sản... Bao gói Màng BC hấp phụ nisin Sản phẩm Sơ đồ 1.1 Quy trình sản xuất lòng đỏ trứng vòt muối [4] - 27 - 1.3.2 Tiêu chuẩn trứng vòt muối Sản phẩm trứng vòt muối được đánh giá theo tiêu chuẩn 32TCN 30 – 67 1.3.2.1 Yêu cầu kỹ thuật a Nguyên liệu chính và phụ: Trứng: trứng tươi có hình bầu dục, vỏ trứng sạch không dính bẩn, có mùi hơi tanh của trứng Chiều cao buồng khí không quá 9mm màng không bò rách Lòng. .. cứu trong nước Trần Thò Tưởng An (2006), bước đầu nghiên cứu sử dụng màng mỏng BC hấp phụ bacteriocin của Lc lactis để bảo quản thòt sơ chế tối thiểu Kết quả có thể bảo quản thòt tươi 3 ngày bằng màng mỏng BC hấp phụ dòch thô bacteriocin 200 AU/ml vẫn đảm bảo chất lượng thòt theo tiêu chuẩn TCVN 7046 : 2002[1] Nguyễn Thò Mỹ Lệ (2009), đã khảo sát khả năng hấp phụ dòch bacteriocin vào màng BC để bảo quản. .. hydroxypropylmethylcellulose) Những khảo sát cho thấy màng có thể chống lại sự phát triển của L innocua và S aureus, nhưng việc thêm vào chất phụ gia để tăng khả năng thấm nước của màng là stearic acid sẽ làm giảm khả năng kháng khuẩn của nisin Nghiên cứu này đã đánh dấu khả năng ứng dụng nisin kết hợp màng bao ăn được vào lónh vực thực phẩm [19] Hudaa Neetoo và cs (2007) đã nghiên cứu tiềm năng của nisin kết hợp với màng bao... thermosphacta được cấy vào trên bề mặt mô của thòt Sau 20 ngày bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh thì mẫu được bao bọc bằng màng có chứa nisin có mật độ B thermosphacta thấp hơn mẫu đối chứng (không có nisin) [33] - 29 - Scannel và cs (2000) đã tìm hiểu khả năng hấp phụ nisin và lacticicin 3147 vào màng cellulose để bảo quản phomai và thòt jambon Đầu tiên, khi khảo sát khả năng hấp phụ của hai bacteriocin nói trên thì... không có khả năng hấp phụ tốt vào màng, trong khi đó nisin lại có khả năng thấm vào màng rất tốt và có thể ổn đònh trong vòng 3 tháng trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh Người ta bao gói phomai và thòt jambon bằng phương pháp MAP và bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh đề làm mẫu đối chứng Đối với mẫu thí nghiệm, người ta thực hiện bao gói với màng cellulose có hấp phụ nisin Sự kết hợp nisin với màng cellulose... cầu ghi trong bảng 2 Bảng 1.4 Bảng chỉ tiêu cảm quan - 28 - Tên chỉ Yêu cầu tiêu Mùi vò Lòng đỏ Trứng đã luộc chín có mùi hơi đậm mặn tự nhiên của trứng muối Không được có mùi vò lạ Lòng đỏ nguyên vẹn, hình cầu, có màu vàng đỏ và rắn, không cho phép bò vữa, bò ám đen, có những tia máu [14] 1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng bacteriocin và màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thực... của bacteriocin trong các sản phẩm làm từ sữa Một ứng dụng chính của nisin là sản xuất phomai Việc sử dụng nisin lấy từ Lactoccoci là sự lựa chọn tuyệt vời cho việc ứng dụng nisin như một thành phần phụ gia trong sản xuất phomai Davies và cs (1997) đã thử nghiệm sử dụng nisin để kiềm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn L monocytogenes gây bệnh trong phomai Kết quả cho thấy, với mẫu sử dụng nisin với nồng... sự hấp phụ nisin vào màng bao hiệu quả hơn lacticicin NK24 Hoạt động kháng khuẩn của màng bao hấp phụ bacteriocin không bò ảnh hưởng đơn lẻ bởi độ hấp phụ của bacteriocin, và bản chất tự nhiên bên trong của dung dòch chống lại vi khuẩn là nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát sự gia tăng của vi sinh vật Sự kết hợp của sodium chloride, citric acid và chất hoạt động bề mặt không làm cải thiện khả năng. .. thể bảo quản mực mốt nắng 13 ngày bằng màng BC hấp phụ dòch nisin tinh sạch 200 IU/ml vẫn đảm bảo chất lượng mực theo TCVN 5649:1992 và TCVN 5289:1992 Thời gian bảo quản mực một nắng được kéo dài thêm 8 ngày so với mẫu đối chứng [7] 1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước Siragusa và cs (1999) đã kết hợp nisin vào trong màng polyethylene dùng để bao gói chân không thòt bò tươi Hoạt động của nisin trong màng