Động học enzyme

Động học Enzyme Động học Enzyme Bởi: PGS TS Đỗ Quý Hai Ý nghĩa việc nghiên cứu động học enzyme Việc nghiên cứu động học enzyme cho ta biết vấn đề sau đây: - Có thể biết chế phân tử tác động enzyme - Cho phép ta hiểu biết mối quan hệ mặt lượng trình enzyme - Thấy vai trò quan trọng mặt lý luận lẫn thực tiễn: lựa chọn đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết điều kiện tốt hoạt động enzyme, cần phải biết yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chúng - Là điều kiện cần thiết để thực tốt bước tinh chế enzyme, người ta cần phải kiểm tra mặt lượng cách xác định có hệ thống hoạt động chế phẩm enzyme giai đoạn tinh chế Động học phản ứng enzyme Ảnh hưởng nồng độ enzyme Trong điều kiện dư thừa chất, nghĩa [S] >>[E] tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [S], v= K[E] có dạng y=ax Nhờ người ta đo [E] cách đo vận tốc phản ứng enzyme xúc tác Có nhiều trường hợp môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] 1/17 Động học Enzyme Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào [E] Ảnh hưởng nồng độ chất [S] Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chất Gọi v1 vận tốc phản ứng tạo thành phức chất ES Gọi v-1 vận tốc phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E S Gọi v2 vận tốc phản ứng tạo thành E P (sản phẩm) v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2) Gọi E0 nồng độ ban đầu: [E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S] [ES] = k1[E0][S] k1 + k2 + k1[S] Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1 (Km: gọi số Michalis Menten) 2/17 Động học Enzyme Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S] Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V = k2[ES] Thay [ES] giá trị ta thu được: v= k2[E0][S] Km + [S] (4) Qua ta thấy nồng độ enzyme cao vận tốc phản ứng enzyme lớn Vận tốc đạt cực đại toàn enzyme liên kết với chất, nghĩa là: Vmax= k2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được: v = Vmax K [S] m + [S] (5) Phương trình (5) gọi phương trình Michelis Menten Km gọi số Michelis Menten đặc trưng cho enzyme Km đặc trưng cho lực enzyme với chất, Km có trị số nhỏ lực enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất Khi tăng [S] v phản ứng tăng, tăng [S] đến giá trị v đạt đến giá trị vmax không tăng ta tiếp tục tăng [S] 3/17 Động học Enzyme Khi Km = [S] v0 =1/2 Vmax Năm 1934 Lineweaver Burk, sở phương trình (5) nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, có ý nghĩa lớn việc nghiên cứu kìm hãm enzyme Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver – Burk Trong nhiều phản ứng enzyme xúc tác có hay nhiều chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng: ATP + glucose hexokinase ADP + glucose phosphate Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng chất sau: Cơ chế tạo phức thành phần 4/17 Động học Enzyme Cơ chế không tạo phức thành phần Đây trường hợp chất thứ (S2) kết hợp vào enzyme ( trạng thái E’) sau P1 tạo thành Vận tốc phản ứng trường hợp phân biệt qua số MichalisMenten chất Qua nghiên cứu động học cho thấy: Phản ứng chất (bisubstrate) thường vận chuyển nguyên tử hay nhóm chức từ chất đến chất khác Khi cho S2 không đổi, đường biểu diễn tốc độ hai trường hợp 5/17 Động học Enzyme Ảnh hưởng chất kìm hãm (inhibitior) Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không khả nâng xúc tác biến chất thành sản phẩm Nó chất kìm hãm thuận nghịch hay bất thuận nghịch Kìm hãm thuận nghịch (reversible inhibition) cạnh tranh (competitive), phi cạnh tranh (uncompetitive) hay hỗn tạp (mixed) * Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition) Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh chất chất kìm hãm tác dung lên trung tâm hoạt động enzyme, Chất kìm hãm choán chổ chất enzyme Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition) 6/17 Động học Enzyme Khi chất dư thùa, nồng độ chất kìm hãm thấp loại bỏ tác dụng chất kìm hãm, nồng độ chất thấp nồng độ chất kìm hãm cao lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver – Burk có kìm hãm cạnh tranh Người ta thấy kìm hãm phần lớn chất kìm hãm chất có tương đồng mặt hóa học ví dụ: malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatdehydrogenase, enzyme xúc tác cho biến đổi succinic acid thành fumaric acid Trường hợp đặc biệt kìm hãm cạnh tranh kìm hãm sản phẩm Trường hợp xảy sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme choán vị trí hoạt động phân tử enzyme Đường thẳng có chất kìm hãm có độ xiên lớn cắt trục tung điểm 1/ Vmax * Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition) Đặc trưng kiểu kìm hãm chất kìm hãm liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự 7/17 Động học Enzyme Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver – Burk có kìm hãm phi cạnh tranh * Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp (Mixed inhibition) 8/17 Động học Enzyme Trong đó, chất kìm hãm liên kết với enzyme tự mà liên kết với phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo sản phẩm P Hiện tượng kìm hãm phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm Tốc độ cực đại đo mặt chất kìm hãm cao có mặt chất kìm hãm Giá trị Km thay đổi không giống trường hợp cạnh tranh Tương tự ta có phương trình : Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver – Burk có kìm hãm hỗn tạp Các giá trị α , α’ định nghĩa Trường hợp α = α’ gọi không cạnh tranh (noncompetitive) Ảnh hưởng kiểu kìm hãm lên Vmax Km 9/17 Động học Enzyme Trường hợp kìm hãm enzyme nồng độ cao chất gọi “kìm hãm chất” kìm hãm urease nồng độ ure cao, có enzyme khác lactatdehydrogenase, carbonxypeptidase, lipase, pyrophotphatase, photphofructokinase (đối với ATP) Nguyên nhân tượng chưa biết rõ Đó là: + Tồn nhiều trung tâm liên kết với chất lực khác Khi nồng độ chất thấp enzyme liên kết với phân tử chất, nồng độ chất cao liên kết với nhiều chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động + Cơ chất liên kết nhờ vị trí đặc biệt enzyme Đó nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác có trung tâm điểu chỉnh + Cơ chất liên kết với chất hoạt hóa cách tách khỏi E + Cơ chất choán chổ (ngăn cản) cofactor hay coenzyme + Cơ chất ảnh hưởng đến ion lực môi trường qua làm tình chuyên hóa enzyme Kìm hãm bất thuận nghịch (irreversible inhibition) Nhiều trường hợp, chất kìm hãm có tác dụng bất thuận nghịch Đôi khó để phân biệt thuận nghịch bất thuận nghịch chất kìm hãm bất thuận nghịch hiểu chất kìm hãm thuận nghịch không cạnh tranh (noncompetitive) Nhìn chung hiệu kìm hãm phụ thuộc yếu tố: nồng độ chất kìm hãm, nồng độ enzyme , thời gian tác dụng Sau ta xét chế tương tác bất thuận nghịch điều kiện nồng độ [I]>>[E] Trường hợp Từ (2) suy [E] vào (1), đồng thời thay [I] [I0] : 10/17 Động học Enzyme Lấy tích phân ta Bằng cách lấy tích phân phương trình tốc độ, nhận biểu thức mô tả biến đổi nồng độ chất phản ứng hay sản phẩm theo thời gian Điều hữu dụng việc xác định số tốc độ bậc phản ứng Trường hợp Mặt khác: Nồng độ enzyme tự là: Thay vào đồng thời thay [I] [I0] : 11/17 Động học Enzyme Trong đó: Tương tự ta có: Trường hợp Enzyme I nhanh chóng tương tác tạo phức thuận nghịch ES, sau tiếp tục tạo phức bất thuận nghịch Thay [E] vào ta Và: 12/17 Động học Enzyme Trường hợp Ảnh hưởng chất hoạt hóa (activator) Là chất làm tăng khả xúc tác chuyển hóa chất thành sản phẩm Thông thường cation kim loại hay hợp chát hữu vitamin tan nước Ví dụ: Mg++ hoạt hóa enzyme mà chất phosphoryl hóa pyrophosphatase (cơ chất pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất ATP) Các cation kim loại có tính đặc hiệu, tính đối kháng tác dụng tuỳ thuộc vào nồng độ Tính chất hoạt hóa cation kim loại: + Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho kiểu phản ứng định + Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối 13/17 Động học Enzyme + Cation kim loại có đối kháng ion + Phụ thuộc nồng độ cation kim loại + Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích + Phụ thuộc chất cation kim loại Ảnh hưởng nhiệt độ Ta tăng vận tốc phản ứng hóa học cách tăng nhiệt độ môi trường, tượng tuân theo quy luật Vant -Hoff Điều có nghĩa tăng nhiệt độ lên 100C tốc độ phản ứng tăng lên lần Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động enzyme Đối với phản ứng enzyme xúc tác áp dụng quy luật phạm vi định,vì chất enzyme protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên 40-500C xảy trình phá hủy chất xúc tác Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng enzyme xúc tác giảm Nhờ tồn nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hóa sinh với phản ứng vô thông thường Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường khoảng từ 40-600C, có enzyme có nhiệt độ tối thích cao enzyme chủng ưa nhiệt Ảnh hưởng pH Sự phân li khác phân tử protein giá trị pH khác làm thay đổi tính chất trung tâm liên kết chất hoạt động phân tử enzyme, dẩn đến giá trị xúc tác khác phụ thuộc vào giá trị pH Như biết enzyme có pH tối thích, enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng enzyme xúc tác có dạng hình dưới: 14/17 Động học Enzyme Ảnh hưởng pH lên hoạt động enzyme Ảnh hưởng giá trị pH đến tác dụng enzyme sở sau: • Enzyme có thay đổi không thuận nghịch phạm vi pH cực hẹp • Ở hai sườn pH tối thích xảy phân ly nhóm prosthetic hay coenzyme • Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly chất • Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức định phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi lực liên kết enzyme với chất thay đổi hoạt tính cực đại Nhờ xác định Vmax Km phụ thuộc giá trị pH cho phép nhận định lại chất nhóm tham gia vào liên kết chất trình tự xúc tác Các yếu tố khác + Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác đến loại enzyme, bước sóng khác có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu Ánh sáng vùng tử ngoại gây nên bất lợi, enzyme trạng thái dung dịch bền kết tinh dạng tinh thể, nồng độ enzyme dung dịch thấp bền, tác động tia tử ngoại tăng lên nhiệt độ Ví dụ: tác động tia tử ngoại nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng hoạt tính + Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ cao tác động phá hủy mạnh Tác động mạnh dịch enzyme có nồng độ thấp Có thể tạo thành gốc tự do, từ công vào phản ứng enzyme + Sóng siêu âm: Tác động khác loại enzyme, có enzyme bị hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng * Nhận xét chung: 15/17 Động học Enzyme Độ bền phụ thuộc vào trang thái tồn enzyme, tinh khiết enzyme bền, dịch loãng độ bền kém, tác động số ion kim loại dịch với nồng độ khoảng 10-3M Ca++ làm tăng tính bền Enzyme allosteric (dị lập thể, dị không gian) Cho đến nay, người ta mô tả enzyme mà hoạt tính enzyme phụ thuộc nồng độ chất dạng hyperbol mà có dạng sigmoid enzyme dị lập thể (hình 7.10) Đối với enzyme này, nồng độ chất thấp tốc độ phản ứng tăng chậm, sau tiếp tục tăng nồng độ tốc độ nhanh chóng đạt giá trị cực đại Như ta biết, enzyme tuân theo động học Michalis-Menten hay nhiều chất liên kết vào vị trí phân tử enzyme, điều dẫn đến enzyme bão hòa chất Còn enzyme có đường cong tốc độ sigmoid xuất enzyme oligomer, nên liên kết với nhiều phân tử chất Điều có nghĩa enzyme dị lập thể có nhiều trung tâm liên kết, monomer có trung tâm liên kết Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất Người ta cho rằng, trường hợp có tính hợp tác vị trí liên kết chất phân tử enzyme oligomer Các enzyme oligomer Monod gọi enzyme dị lập thể (allosteric) Đường cong tốc độ sigmoid bị chất điều hòa (modulator) đẩy phía trái hay phải Chất điều hòa dương tức làm tăng lực enzyme allosteric với chất, ngược lại chất điều hòa âm Các chất điều hòa làm ảnh hưởng khác đến thông số động học, làm thay đổi giá trị riêng lẻ hai giá trị Km hay Vmax 16/17 Động học Enzyme Minh họa có modulator 17/17 [...]... giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối thích, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác có dạng như hình dưới: 14/17 Động học Enzyme Ảnh hưởng pH lên hoạt động của enzyme Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau: • Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp • Ở... tia tử ngoại ở nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng mất hoạt tính + Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá hủy càng mạnh Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp Có thể do tạo thành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme + Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng... ảnh hưởng * Nhận xét chung: 15/17 Động học Enzyme Độ bền phụ thuộc vào trang thái của tồn tại enzyme, càng tinh khiết thì enzyme càng kém bền, dịch càng loãng thì độ bền càng kém, tác động của một số ion kim loại trong dịch với nồng độ khoảng 10-3M như Ca++ làm tăng tính bền Enzyme allosteric (dị lập thể, dị không gian) Cho đến nay, người ta mô tả enzyme mà hoạt tính enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất... mà có dạng sigmoid là enzyme dị lập thể (hình 7.10) Đối với enzyme này, khi nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng tăng chậm, sau đó tiếp tục tăng nồng độ thì tốc độ nhanh chóng đạt giá trị cực đại Như ta đã biết, enzyme tuân theo động học Michalis-Menten thì 1 hay nhiều cơ chất cũng chỉ liên kết vào 1 vị trí trên phân tử enzyme, điều này sẽ dẫn đến enzyme bão hòa cơ chất Còn enzyme có đường cong... loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ Ví dụ: dưới tác động. . .Động học Enzyme Lấy tích phân ta được Bằng cách lấy tích phân phương trình tốc độ, có thể nhận được biểu thức mô tả sự biến đổi nồng độ chất phản ứng hay sản phẩm theo thời gian Điều này cực kì hữu dụng trong việc xác định hằng số tốc độ và bậc phản ứng Trường hợp 2 Mặt khác: Nồng độ enzyme tự do sẽ là: Thay vào trên và đồng thời thay [I] bằng [I0] : 11/17 Động học Enzyme Trong đó:... thường Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C, cũng có enzyme có nhiệt độ tối thích rất cao như những enzyme của những chủng ưa nhiệt Ảnh hưởng của pH Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme, dẩn... chất điều hòa (modulator) đẩy về phía trái hay phải Chất điều hòa dương tức làm tăng ái lực của enzyme allosteric với cơ chất, ngược lại là chất điều hòa âm Các chất điều hòa có thể làm ảnh hưởng khác nhau đến các thông số động học, làm thay đổi giá trị riêng lẻ một trong hai giá trị Km hay Vmax 16/17 Động học Enzyme Minh họa khi có modulator 17/17 ... tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của enzyme Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân... hiện khi enzyme là một oligomer, nên có thể liên kết với nhiều phân tử cơ chất Điều này có nghĩa là trên enzyme dị lập thể có nhiều trung tâm liên kết, mỗi monomer có 1 trung tâm liên kết Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất Người ta cho rằng, trong trường hợp này có tính hợp tác giữa các vị trí liên kết cơ chất trong phân tử enzyme oligomer Các enzyme oligomer này được Monod gọi là enzyme ... tác động phá hủy mạnh Tác động mạnh dịch enzyme có nồng độ thấp Có thể tạo thành gốc tự do, từ công vào phản ứng enzyme + Sóng siêu âm: Tác động khác loại enzyme, có enzyme bị hoạt tính, có enzyme. .. phản ứng enzyme xúc tác có dạng hình dưới: 14/17 Động học Enzyme Ảnh hưởng pH lên hoạt động enzyme Ảnh hưởng giá trị pH đến tác dụng enzyme sở sau: • Enzyme có thay đổi không thuận nghịch phạm vi... với enzyme tự 7/17 Động học Enzyme Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver – Burk có kìm hãm phi cạnh tranh * Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp (Mixed inhibition) 8/17 Động học Enzyme