Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng phương pháp định lượng đổng thời ba thành phần cloramphenicol, dexamethason và naphazolin trong thuốc nhỏ mắt Collydexa bằng cách kết hợp toán hóa
Trang 1ứng dụng toán hóa để định lượng hỗn hợp cloramphenicol, dexamethason và naphazolin bằng quang phổ tử ngoại
Vũ Đặng Hoàng
Trường Đại học Dược Hà Nội
SUMMARY
Chemometrics (Le Classical Least Squares and Inverse Least Squares) were proposed for possible spectrophotometric quantification of ternary mixtures These chemometrics-assisted u v spectrophotometric methods were successfully oppiied to real samples containing chlommphenicol - dexomethasone - naphazoline These spectrophotometric methods were also statistically comparable to the manufacturer's HPLC in terms of accuracy and precision.
Từ khóa: toán hóa, quang phổ tử ngoại, hỗn hợp đa thành phân.
Đ ặt vấn đề
Định lượng thuốc đa thành phán bằng quang
phổ UV-VIS thường gặp nhiểu khó khán do sự đan
xen của các dải phổ thành phẩn Để khắc phục
nhược điểm này, nghiên cứu ứng dụng các thuật
toán xử lý phổ hấp thụ ở Việt Nam đã được triển
khai từ thập niên 1990 thế kỷ XX [3] Tuy nhiên, hầu
hết các công trình được công bố cho tới nay đểu sử
dụng thuật toán đạo hàm để định lượng các chế
phẩm hai thành phẩn [2] Việc ứng dụng phân tích
đa biến (multivariate analỵsis) trong lĩnh vực phân
tích dược còn khá khiêm tốn [4] Đây là điều khác
biệt với xu hướng trên thế giới: kết hợp toán hóa
(chemometrics) và phân tích phổ để định lượng các
hỗn hợp hai [7], ba [6], bốn [8] thành phần đang
ngày càng phát triển
Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng
phương pháp định lượng đổng thời ba thành phần
cloramphenicol, dexamethason và naphazolin trong
thuốc nhỏ mắt Collydexa bằng cách kết hợp toán
hóa (CLS và ILS) và phép đo quang phổ tử ngoại
Nguyên liệu và phương pháp
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc nhỏ mắt Collydexa (Công Ty cổ Phán
Dược phẩm Hà Nội) số lô 370711 có công thức:
cloramphenicol 0,02 g + dexamethason natri
phosphat 0,005 g + naphazolỉn nỉtrat 0,0025 g +
vitamin B2 0,0002 g + tá dược vừa đủ 5 ml
Chất đối chiếu, dung môi, trang thiết bị
Chất đối chiếu và dung môi
Cloramphenicol, CLO (99,2%), dexamethason natri phosphat, DEX (99,6%) và naphazolin nitrat, NAP (99,8%) do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp
Nước cất được sử dụng làm dung môi
Trang thiết bị
Máy quang phổ hai chùm tia Unicam u v 300 (ThermoSpectronic) được kết nối với máy tính (chạy trên hệ điểu hành Windows XP) với phẩn mểm chuyên dụng Vision 32 với chế độ đo:
- Start Lambda: 200 nm - Stop Lambda: 300 nm
- Data Mode: Absorbance
- Band width: 1,5 nm
- Scan Speed: Intelliscan nm/min
- Data Interval: Very high resolution
Xử lý số liệu được tiến hành trên phần mềm MATLAB 2013a (Mathworks)
Phương pháp nghiên cứu
Giả sử hỗn hợp cẩn phân tích có k cấu tử .X^), tín hiệu phân tích của hỗn hợp là y thì phương trình hổi quy đa biến mô tả quan hệ giữa y
và các biến X (i= 1,2 ,3 k ) có dạng:
về mặt lý thuyết để tìm nồng độ của k cấu tử cắn có
ít nhất k phương trình hổi quy Vì vậy thực tế sẽ cần tiến hành m thí nghiệm (m > k) với m dung dịch chuẩn hỗn hợp thì sẽ lập được m phương trình hổi quy đa biến Dạng tổng quát của hệ phương trình này như sau:
y = a + Xb Trong đó: b là vectơ chứa các hệ số của phương trình hổi quy
Trang 2y là vectơ cột chứa m giá trị y , y còn X là ma
trận có m hàng (ứng với m quan sát) và k cột (ứng
với k biến)
y =
y i
y z
y n
x =
X i , X
''mk.
nếu tín hiệu đo ứng với mỗi thí nghiệm có nhiều
hơn một giá trị (ví dụ đo độ hấp thụ quang một
dung dịch chuẩn hỗn hợp tại p bước sóng thay vì
một bước sóng) thì số liệu của Y sẽ là ma trận có m
dòng và p cột (y ) như sau:
>^11 >^12
>^21 3^22
y m\ y m 2
y^p
y 2 p
mp
Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường
(Classical Least Squares - CIS)
Phương pháp này còn được gọi là ma trận K
(K-matrix)
-Từ d ạ n g tổ n g q u áty = XK + e (1)
Với y là vectơ (m X 1) ; X là ma trận (m X k) và e là
vectơ s ố d ư (m x 1)
K là vectơ hệ số của phương trình hổi quy dạng
hàm (k X l) nếu y là vectơ cột biểu diễn tín hiệu đo
của một dung dịch chuẩn; K là ma trận (k X p) nếu ỵ
là số liệu dạng ma trận (m X p) biểu diễn tín hiệu của
dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thời điểm (ví dụ
đo độ hấp thụ quang tại p bước sóng)
- Nếu có giá trị nhập vào là biến độc lập X và biến
phụ thuộc y sẽ tính được giá trị hệ số Theo phương
pháp bình phương tối thiểu, ma trận hệ số K sẽ được
tính nhưsau:
K=(X^X)-^XV (2)
Với là ma trận chuyển vị của X (transpose to
matrix)
- Với mẫu chưa biết cần tìm giá trị \ từ giá trị Yq
ta sẽ c ó :
Với là ma trận chuyển vị của K
Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (Inverse Least Squares - ILS)
Phương pháp này còn được gọi ma trận p (P - matrix)
- Phương pháp này giả thiết rằng nồng độ chất phân tích là hàm của tín hiệu phân tích theo phương trình:
x = y.p + e -Trong phương pháp này, hệ số p trong phương trình hổi quỵ là thành phẩn của ma trận (m X k) được tính theo phương pháp bình phương tối thiểu suy rộng:
p = [Ýyì^ y^x
-Việc phân tích nồng độ chất chưa biết (Xq) được thực hiện bằng cách nhân trực tiếp giá trị tín hiệu đo
Yq của dung dịch cần phân tích với p
x„ = yo-P '
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn gốc CLO, DEX và NAP 1000 mg/l được pha trong nước Các dung dịch hỗn hợp chuẩn (CLO + DEX + NAP) đểu được pha từ các dung dịch gốc một thành phẩn Dung dịch thử có nồng
độ khoảng CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP 4 mg/l
Kết quả nghiên cứu
Đổ thị biểu diễn phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và chế phẩm có nồng độ tương ứng (hình 1) cho thấy CLO 40 mg/l có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất với cực đại hấp thụ tại 278,8 nm, dẫn đến
sự chồng phổ đối với DEX 10 mg/l (cực đại hấp thụ 242,2 nm) và NAP 5 mg/l (cực đại hấp thụ 220,9 nm) trong khoảng bước sóng 200 - 300 nm Hình dạng phổ dung dịch chế phẩm Collydexa, phổ hỗn hợp và phổ cộng của các dung dịch có nồng độ tương ứng (CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP 5 mg/l + vitamin B2 0,4 mg/l) có sự tương đồng trong khoảng 225 -
300 nm Giả thiết lô thuốc được kiểm tra đạt chỉ tiêu
về hàm lượng so với nhăn, có thể nhận thấy sự có mặt của vitamin B2 và các tá dược khác trong nển mẫu thuốc nhỏ mắt không gây ảnh hưởng đáng kể đến phổ hấp thụ của hỗn hợp ba thành phần (CLO
40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP 5 mg/l) Với thuật toán CLS, khoảng bước sóng 225 - 300 nm (AẦ = 1 nm)
đâ được lựa chọn cho phép định lượng Mặt khác,
8 bước sóng (225, 230, 235, 238, 240, 245, 260, 280 nm) đã được lựa chọn cho thuật toán ILS
Trang 3Bước sóng (nm)
H^inh 1 Phổ hấp thụ củơ CLO 40 mg/l DEX10 mg/l NAP 5 mg/l; phổ hỗn hợp (CLO 40 mg/l + DEX10 mg/l + NAP 5 mg/l); phổ cộng của các phổ thònh phán
(CLO 40 mg/l DEX10 mg/l vờ NAP 4 mg/l) vờ phổcủo chẽphđiĩì Collỵdexũ có nông độ tương ứng
Bảng 1 biểu diễn các dung dịch hỗn hợp chuẩn
được sửdụng cho phương pháp quang phổ tử ngoại
kết hợp với hai thuật toán CLS và ILS Sử dụng phần
mểm MATLAB để xác định các giá trị của ma trận hệ
số tương ứng để tính được nồng độ của từng thành
phần trong hỗn hợp khi biết giá trị độ hấp thụ Ví dụ
tại bước sóng 238 nm, hệ số K của thuật toán CLS
0.0103]
hệ số p của thuật toán ILS là [51,9426
là 0.0308
0.0112
12,7154 63527] Có thể nhận thấy cả hai phương
pháp quang phổ đều có độ đúng: 98 -101% và độ
lặp RSD < 2%
Trong nghiên cứu này, phương pháp HPLC của nhà sản xuất được sử dụng làm phương pháp đối chiếu (hình 2 và 3) Kết quả định lượng chế phẩm Collydexa bằng các phương pháp quang phổ và HPLC được trình bày ở bảng 2
Kiểm định thống kê ANOVA (so sánh các giá trị trung bình) và Bartlett (so sánh các phương sai) của các phương pháp quang phổ và HPLC của nhà sản xuất khi định lượng CLO, DEX và NAP trong chế phẩm cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống
kê với mức tin cậy 95%
Trang 4Bỏng 1 Các dung dịch hỗn hợp chuổn
Trung
bình
Bỏng 2 Kết quả định lượng thuốc nhỏ mât Collỵdexũ
Phương pháp
% so vởi nhãn (trung bình ± SD, n = 6)
Hình 2 Sắc kỷ đổ rủo giỏi của Collỵdexo để định lượng CLO và DEX Điểu kiện sđc kỷ: pho động: Methũnol - dung dịch KHfO^ 0,02 M (50:50); cột c 18 (5 Ịjm ; 4,6
X 150 ĩĩìm); bước sóng phát hiện 254 nm; tổc độ dòng: lỉĩìl/phúĩ; thể tích tiêm mẫu 20 ụl
Trang 5MWOI0 siỊ-m, te rn-m m ịcmỊmxềHìệmmmm
Hình 3 Sắc ký đổ rửo giỏi củơ Collỵdexo đế định lượng NAf! Điểu kiện sác kỷ: pho động: Methũĩiol - dung dịch đệm NH4N03 pH 9,5 (93:7); cột Silicơ (5 ụm; 4,6
X 150 mm); bước sóng phát hiện 265 nm; tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 ụl
Bàn luận
Hỗn hợp ba thành phẩn CLO, DEX và NAP được
chọn là một ví dụ điển hình vì có sự chổng phổ rõ
rệt trong vùng ánh sáng tử ngoại (hình 1) Do vậy,
không thể tiến hành định lượng riêng từng thành
phán trong hỗn hợp này dựa trên phương pháp
quang phổ trỵền thống Để định lượng đổng thời
hỗn hợp này, phương pháp đạo hàm tỉ đối [1] và
HPLC [5] đã được nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, hai thuật toán CLS và ILS,
được đề xuất cho phép xử lý phổ hấp thụ của hỗn
hợp đa thành phần có thể tiến hành được với phẩn
mềm xử lý số liệu MATLAB (MathVVorks) Đây là phẩn
mềm hiện đang được ứng dụng vào khá nhiểu lĩnh
vực kỹ thuật liên quan đến tính toán nhờ khả năng
tích hợp tính toán, hiển thị và lập trình trong một
môi trường dễ sử dụng và liên kết được với những
chương trình máy tính viết trên nhiều ngôn ngữ lập
trình khác
Với phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp
với toán hoá (CLS, ILS), việc lựa chọn ma trận nồng
độ và bước sóng định lượng là các yếu tố ảnh hưởng
đến độ chính xác của kết quả định lượng Vì hổn
hợp CLO, DEX và NAP (có nồng độ tương đương với
mẫu thử) có sự cộng tính ánh sáng trong khoảng
bước sóng 225 - 300 nm, nên dải bước sóng này
(AX = 1 nm) đã được sử dụng cho phép định lượng
bằng thuật toán CLS Phương pháp này ghi tín hiệu phân tích dạng ma trận nên còn được gọi là phân tích toàn phổ CLS có độ chính xác cao khi số bước sóng sử dụng tăng lên Ngược lại, với thuật toán ILS tín hiệu mẫu phân tích phải được ghi tại một số các bước sóng mà tại đó phản ánh đẩy đủ tín hiệu của tất cả các chất trong hỗn hợp Vì ma trận hệ số p tính theo thuật toán ILS là ma trận nghịch đảo nên kích thước của ma trận này phải bằng số bước sóng
sử dụng và phải nhỏ hơn số dung dịch chuẩn đem dùng Do vậy, 8 bước sóng (225, 230, 235, 238, 240,
245, 260, 280 nm) đã được lựa chọn cho thuật toán ILS
Ma trận nổng độ được quy định bởi giá trị nồng
độ trung tâm và giá trị tuỳ biến X Giá trị nồng độ trung tâm được lựa chọn sao cho tại đó độ cộng tính của phổ hấp thụ là tốt nhất Ma trận nổng độ được xây dựng với giá trị nồng độ trung tâm tương ứng với nồng độ của mẫu thử (CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP 4 mg/l) Các giá trị X có nồng độ trong khoảng ±
(20 - 25%) X nồng độ trung tâm vì các lô thuốc được lưu hành trên thị trường thường có nồng độ biến thiên trong khoảng giá trị này số lượng dung dịch hỗn hợp chuẩn được xác định theo mô hình toán học thiết kế đầy đủ - 2 mức (full factorial design - 2
Trang 6levels) với mục đích thu được tối đa thông tin về hỗn
hợp ba thành phẩn CLO + DEX + NAP với số lượng
dung dịch chuẩn ít nhất Kết quả tìm lại nồng độ các
dung dịch trong ma trận nồng độ (bảng 2) cho thấy
hai thuật toán CLS và ILS có độ chính xác cao Điểu
này cũng chứng tỏ tính phù hợp của ma trận nồng
độ được lựa chọn
Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hai thuật toán
CLS và ILS cho thấy các phương pháp quang phổ có
độ chính xác cao: độ lặp (RSD < 2%) và độ đúng (99
-101%) (bảng 4) Hai phương pháp quang phổ này
đã được ứng dụng để định lượng đổng thời CLO,
DEX và NAP trong chế phẩm Collydexa; có sử dụng
phương pháp HPLC của nhà sản xuất làm phương
pháp đối chiếu (bảng 2) Kiểm định thống kê xác
nhận không có sự khác biệt vể độ lặp (Bartlett) và
độ đúng (ANOVA) khi áp dụng cả hai phương pháp
quang phổ và HPLC để định lượng đổng thời CLO,
DEX và NAP trong chế phẩm Collydexa Điểu này
cũng cho thấy độ chính xác của các phương pháp quang phổ không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác trong thành phẩn của thuốc nhỏ mắt Collydexa
Kết luận
Nghiên cứu này cho thấy có thể định lượng đồng thời một cách chính xác các hoạt chất trong hỗn hợp ba thành phần CLO, DEX và NAP khi kết hợp toán hóa (CLS và ILS) với quang phổ tử ngoại Các phương pháp quang phổ được xây dựng có khả năng thay thế HPLC của nhà sản xuất trong kiểm nghiệm thường qui chế phẩm Collỵdexa
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được thực hiện trong để tài số 104.07-2012.58 do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam (NAPOSTED) tài trợ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1
2
4
6
Đặng Trần Phương Hồng, Trịnh Văn Quỳ (2000), Định lượng cloramphenicol,dexamethason natri photphat và naphazolin nitrat trong
thuốc nhỏ mắt Collydexa bằng quang phổ tử ngoại đạo hàm tỷ đối, Kỷ yếu Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, tr 148-152.
Vũ Đặng Hoàng (2013),Tổng quan ứng dụng quang phổ đạo hàm trong định lượng thuốc đa thành phần Phẩn 2: Các phương pháp
định lượng hỗn hợp đa thành phần bằng quang phổ đạo hàm, Tạp chí Dược học, số 53, tr 2-7.
Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Quỳ (1997), Phương pháp định lượng toàn phổ FSQ (Full spectrum Quantitation) phân tích đa cấu tử trên
máy quang phổ uv - VIS Beckman DUR - series Thông báo Kiểm nghiệm số2.
Thái Duy Thìn (2003 - 2005), Nghiên cứu phương pháp quang phổ và HPLC để định lượng các thuốc từ 2 - 5 thành phẩn, Đề tài cấp BỘYtế.
Huỳnh Kim Thoa, Võ Thị Thu Thủy (1998), Định lượng nhanh và đồng thời dexamethason, chloramphenicol và naphazolin trong một
số chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp HPLC, Tạp chí Dược học, số 6, tr 20-23.
Alberto J.N., Patricia C.D., Alejandro CO (2003), Chemometrics assisted spectroscopic determination of vitamin B6, vitamin B12 and
dexamethasone in injectables, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 31, pp 621-627.
Erdal D., Dumitru B., FerdiT (2008), Simple mathematical resolution for binary mixture of oxfendazole and oxyclozanide in bolus by
bivariate and multivariate calibrations based on the linear regression functions, Revue Roumoine de Chimie, vol 53, pp 303-312.
López-de-Alba RL, Lopez-Martinez u Cerda V., Amador-Hernandez J (2006), Simultaneous determination and classification of riboflavin, thiamine, nicotinamide and pyridoxine in pharmaceutical formulations, by UV-Visible spectrophotometry and multivariate
analysis, Journal of the Brozilian Chemical Society, vol 17, pp 715-722.
9 8 I Nghiên Cứu dược Thong tin thuoc I So 3/2014