BÀI NGHIÊN CỨU r » Acid GQụanic A, Acid CeanQthenije, Acid Gouanic c phân lập từ Dây đòn gánh Nguyễn Văn An, Nguyên Thái An, Trấn Thị Thu, Trần Văn ơn Trường Đại học DượcHà M Đặt vấn để Cây Dây đòn gánh có tên gọi khác như: Dây gân, Dây đòn kẻ trộm, Dây kiến, có tên khoa học Gouania leptostachya DC, họ Táo ta Rhamnaceae [1], Dây đòn gánh sử dụng dân gian để chữa sưng tấy, đau nhức đòn đánh, bị thương ngã, đau người, mụn nhọt, đinh độc, bỏng, vết thương, lở ngứa [1 ] Cho đến nay, chưa có công bố thành phẩn hóa học hoạt tính sinh học thuốc Việt Nam Bài báo thông báo kết phân lập xác định cấu trúc hợp chất Acid Gouanic A (1), Acid Ceanothenic (2), Acid Gouanic c (3) từ cắn phân đoạn buthanol mẫu nghiên cứu Cấu trúc hóa học chất xác định phương pháp phổ khối lượng phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR chiều hai chiểu (1D 2D) Nguyên liệu phương pháp Nguyên liệu Mẫu Dây đòn gánh thu hái vào tháng 2/2010 xã Long Sơn, huyện Kim Bôi, tinh Hòa Bình Tên khoa học Tiến sĩTrần Văn ơn (Bộ môn Thực vật -Trường Đại học Dược HN) giám định Mẫu tiêu lưu giữ Trường ĐH Dược HN Phương pháp nghiên cứu Sắc ký lớp mỏng (TLC): SKLM thực mỏng tráng sẳn MERCK Phát vết chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm 366nm [2], [3] Sắc ký cột: Sắc ký cột tiến hành với chất hấp phụ Silica gel pha thường Sephadex LH20 Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063mm [3] Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được đo máy Bruker DRX500 Viện Hóa học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Phổ khối lượng (ESI-MS): Được đo máy LCMSD Agilent 1200 Series (USA) Viện Hóa học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Phương pháp phân lập hợp chất 29 29 29 Kết bàn luận Phẩn mặt đất dây đòn gánh nghiến nhỏ thành bột (550g), sau chiết với methanol (ngập dược liệu) nhiệt độ phòng, chiết lẩn lẩn ngày Lọc Gộp dịch lọc cất thu hổi dung môi áp suất giảm, cắn thu (32g) hòa tan hoàn toàn hỗn hợp MeOH/HjO (tỉ lệ 1:1) Sau đem chiết phân bố lẩn lượt với dung môi n- hexan n-butanol Dịch chiết phân đoạn thu hổi dung môi cho cắn tương ứng cắn phân đoạn hexan phân đoạn butanol (8,5g) 3g cắn phân đoạn butanol phân lập sắc ký cột lặp lại silica gel pha thường Sephadex LH20, thu hợp chất C1, C8 , C6 Hợp chất C8 (Acid GouanicA): Hợp chất C8 phân lập dạng tinh thể màu trắng, tan tốt CH3 OH, DMSO tan CHCI3 đun nóng nhẹ, xác định cấu trúc dựa kiện phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiểu Các kiện phổ '^C-NMR DEPT cho tín hiệu cộng hưởng 30 cacbon tương ứng với nhóm methyl, 1 nhóm methylen, nhóm methin cacbon bậc bốn Trong số ta nhận thấy có hai cacbon bậc thuộc nhóm carbonyl acid (õ^ = 180,08 179,25 ppm; C-27 C-28), cacbon bậc (ÔC 151,52ppm; C-20) nhóm methylen (ÕC110,59 ppm; C-29) với nguyên tử cacbon trạng thái lai hóa sp2 , nhóm methỵlen với nguyên tử cacbon trạng thái lai hóa sp3 liên kết với dị tố có độ âm điện lớn (õ^ = 63,33 ppm; C-1) Các nguyên tử cacbon lại đểu trạng thái lai hóa sp3 Trên phổ khối lượng ESI-MS, pic ion [M+H]+ xuất m/z 487 (positive) pic ion [M-H]- xuất m/z485 (negative), khối lượng phân tử hợp chất C8 486 đvC Từ kiện phổ ’^C-NMR phổ khối lượng ESI-MS xác định công thức phân tử hợp chất C8 C3 (,H^ ^ (độ bội liên kết k = ) cho biết triiterpen có năm vòng với hai liên kết đôi thuộc nhóm chức axit, liên kết đôi c = CHj vòng nhóm alcol bậc Trên phổ 'H-NMR nhận biết tín hiệu cộng hưởng proton thuộc nhóm methyl gồm có nhóm xuất vùng trường cao (ô^ 0,94 - 1,73 ppm), hai tín hiệu cộng hưởng proton nhóm c = CHj xuất 4,74 4,62 ppm Hai tín hiệu proton nhóm CH pH xuất dạng doublet - doublet 3,67 3,23 ppm với số tương tác J = 3,5; 10 Hz Các proton thuộc nhóm methyl methin xuất dạng multiplet chổng chập lên vùng trường cao Vị trí nhóm thê' nguyên tử phân tử xác định kiện phổ hai chiểu HSQQ HMBC COSY Trên phổ hai chiểu 'H-'H COSY proton H-1 3,67& 3,22 (2H, dd)] tương tác với proton H-2 [ỗ^ 1,78 (1H, o)]; proton H-2 tương tác với proton H-3 [õ^ 1, (1H,0)Ì Trên phổ hai chiểu HMBC, tương tác proton H-2 với nguyên tử cacbon C-2 [ 52,46 ppm]; C-10 [49,5 ppm] C-3 [42,50 ppm].Từcác kiện phổ COSY HMBC cho phép kết luận nhóm CHjOH vị trí liên kết với cacbon số Trên phổ hai chiều HMBC, tương tác nhóm carbonyl acid C-28 [õ^ 179,28] proton vị trí C-18 [õ^ 1,7]; C-22 [6 ^ 1,39] C-16 [õ^ 1,4] cho phép kết luận nhóm carbonyl acid vị trí 17 Các tương tác nhóm carbonyl acid C-27 [õj180,08] với proton vị trí C-13 [ỗ^ 2,42] C-15 [ÕH 1,41] cho phép kết luận nhóm carbonyl acid gắn vào khung vị trí C-14 Trên phổ hai chiểu HMBC cho thấy có liên hệ HMBC proton nhóm CH2 = với tín hiệu cacbon C-19 [CH; õ( 48,5] tín hiệu cacbon C-30 [ÕC 19,22; 1,73 (s) ], điểu cho phép kết luận nhóm iso propenyl gắn vào khung vị trí C-19 Các kiện phổ nêu với việc tham khảo tài liệu cho phép kết luận cấu trúc hợp chất C8 Acid GouanicA Acid lần tìm thấy năm 2006 loài G ulmifolia [4], (bảng ) Hợp chất C6 (Acid Ceanothenic) Hợp chất C6 phân lập dạng tinh thể màu trắng, xác định cấu trúc dựa kiện phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiểu hai chiểu Từ kiện phổ ’^C-NMR, DEPT; kết hợp với phổ hai chiều HSQC HMBC ta nhận thấy cấu trúc phân tử hợp chất C6 cho tín hiệu cộng hưởng 29 cacbon tương ứng với nhóm methyl, nhóm methỵlen, nhóm methin cacbon bậc Trong số ta nhận thấy có hai cacbon bậc bốn thuộc nhóm carbonyl acid ester (õ|_ 177,22 176,83 ppm) Có nguyên tử cacbon trạng thái lai hóa sp2, có cacbon bậc (ôj 149,87 ppm), nhóm methylen (ôj 109,92 ppm) hai nhóm methin (ôj 140,66 138,63) Các nguyên tử cacbon lại đểu trạng thái lai hóa sp3 không liên kết với dị tố Phổ khối lượng ESI-MS hợp chất C6 xuất pic ion [M+H]+ xuất m/z 455 (positive), suy Số 2/2011 Nghiên Cứu duợcThông tin th u ố c i 51 BÀI NGHIÊN CỨU V Báng DữliệuphổNMRcủaCS Vi trí ỖJppm) 6,(ppiti) Vị trí ỗ^(ppm) 6g(ppm) Vị tri 6t(ppm) 6„ (ppm) 63,33 3.67/3.23 11 24,21 1,58 21 38,80 1,96/1,65 52,46 1,78 12 27,03 2,18/1,68 22 31,53 1,96/1,39 42,50 1,78 13 21,26 2,42 23 27,06 0,94 38,24 14 61,07 24 34,22 1,03 58,87 1,18 15 29,20 2,06/1,41 25 20,41 0.95 19,65 1,39 16 35,52 2,37/1,4 26 18,31 1,18 38,54 1,45/1,38 17 57,26 27 180,08 41,81 18 52,96 1,7 28 179,25 44,87 19 48,5 3,11 29 110,59 4,74/4,62 10 49,5 20 151,52 30 19,22 1,73 1,87 Bòng Dữ liệu phổ NMR cũũ C6 STT 13C(ppm) STT 13C(ppm) STT 13C(ppm) IHÍppm) 11 22,38 1,47 21 36,56 1,30 140,87 5,98 (d,J = 5,5 Hz) 12 25,19 2,27 22 22,38 1,43 138,63 5,43 13 38,82 2,29 23 29,39 0,96 14 58,75 24 21,22 44,26 62,31 1,09 15 29,85 1,80 1,30 25 19,88 0,93 16,98 1,34/1,43 16 27,40 Ị91 130 26 17,61 0,98 33,99 1,32/1,22 17 55,10 27 176,82 18 50,88 1,6 28 177,27 19 46,64 3,0 29 18,46 20 149,87 40,64 9_ 47,26 10 50,00 1,77 khối lượng phân tử hợp chất C6 454 đvC Từ kiện phổ '^C-NMR, DEPTvà ESI-MS cho phép ta xác định công thức phân tử hợp chất C6 (độ bội liên kết k = 9) Trong cấu trúc hợp chất C6 có hai nhóm chức acid nguyên tử cacbon trạng thái lai hóa sp2 (tương ứng với liên kết đôi c = liên kết đôi c = C), phân tử C6 có tổn vòng Chúng dự đoán C6 triterpen vòng có hai nhóm chức acid Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều 'HNMR nhận biết tín hiệu cộng hưởng proton thuộc nhóm methyl gồm có nhóm xuất vùng trường cao (ỗ^ 0,85 - 1,64 ppm) Tín hiệu cộng hưởng proton nhóm CH^ với cacbon trạng thái lai hóa sp2 xuất dạng pic tù 4,69 4,66 ppm Hai tín hiệu cộng hưởng 52 IH(ppm) i Nghiên Cứu d u ợ c ĩh ô n g tin th u õ c ' Số 2/201 1,85 1,65 proton nhóm CH (C trạng thái lai hóa sp2) xuất dạng doublet 5,98 5,43 ppm đểu có số tương tác J = 5,5 Như ta dự đoán hai nhóm CH liên kết với liên kết đôi CH = CH nằm vòng cạnh Các proton thuộc nhóm methyl, methylen methin lại xuất dạng multiplet chổng chập lên vùng trường cao Vị trí nhóm nguyên tử phân tử xác định kiện phổ hai chiểu HSQC, HMBC 'H-'H COSY (bảng ) Trên phổ hai chiều HMBC, tương tác cacbon C-4 với proton hai nhóm metyl 23 [5j21,33; 0,88 (3H, s) ] 24 [ô, 29,39; 5, 0,96 (3H, s) ] cho phép kết luận có hai nhóm methyl liên kết với nguyên tử cacbon số Ta nhận thấy tương tác proton H-2 [õ^ 5,98 (1H, d, J=5,5]; H-3 [ô^ 5,43 với nguyên tử cacbon C-4 [õ^ 44,26; c bậc ] C-5 [ô^ 62,31 ; CH] C-10 [5^ 50,00; c bậc 4], điểu cho phép xác định có liên kết đôi CH = CH vòng A triterpen C6 Phổ HMBC ghi nhận mối liên hệ proton nhóm CHj = với tín hiệu cacbon C-19 [6 , 46,64]; tín hiệu cacbon C-20 [ỗ|_ 149,87] với tín hiệu proton nhóm CH vị trí C-19 [ôj, 46,64; 3,0 (1H, o) ], điểu cho phép kết luận cấu trúc hợp chất C6 có nhóm isopropenyl gắn với vòng E vị trícacbon số 19 Ngoài mói liên hệ tín hiệu cacbon nhóm cacbonyl C-27 [õ^ 176,82] với proton vị trí C-13 [õ^ 2,29]; C-12 [ô^ 2,27] C-15 [ô^ 1,80& 1,30] Tín hiệu cacbon nhóm cacbonỵl C-28 [õ,177,27] với tín hiệu proton vị trí C-18 [ô^ 1,6], C-22 [ô^ 1,43]; C-16 [ô^ 1,91 & 1,30] Như cấu trúc hợp chất C6 có hai nhóm COOH gắn vào vòng vị trí cacbon số 14 17 Từ kiện trên, kết hợp với tham khảo tài liệu [4] kiểm tra lại kiện phổ COSY, ta kết luận hợp chất C6 Acid Ceanothenic Hợp chất c (Add Gouanic C) Hợp chất C1 phân lập dạng tinh thể màu trắng, tan tố t CH3 OH CHCI3 đun nóng; xác định cấu trúc dựa kiện phổ khối lượng phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiểu hai chiều Dựa kiện phổ ’^C-NMR, DEPT kết hợp với phổ hai chiểu HSQC HMBC cho thấy hợp chất C1 có tín hiệu cộng hưởng 30 cacbon tương ứng với nhóm methyl, 11 nhóm methylen, nhóm methin carbon bậc bốn Trong số tín hiệu ta nhận thấy xuất hai nhóm cacbonyl axit ( 179,34 178,59 ppm; C-27 C-28), cacbon bậc (ô^ 150,02 ppm; C-20) nhóm methylen (ôj 109,78 ppm; C-29)với nguyên tửcacbon trạng thái lai hóa sp2 , nhóm methylen với nguyên tử cacbon trạng thái lai hóa sp3 liên kết với dị tố có độ âm điện lớn (õ( = 62,62 ppm; C-3) Các nguyên tử cacbon lại trạng thái lai hóa sp3 Phổ khối lượng ESI-MS, pic ion [M+H]+ xuất m/z 487 (positive) pic ion [M-H]- xuất m/z 485 (negative), khối lượng phân tử hợp chấtCI là486đvC Từ kiện phổ '^C-NMR phổ khối lượng ESI-MS xác định công thức phân tử hợp chất C1 (độ bội liên kết k = ) cho biết triterpen có năm vòng với hai liên kết đôi thuộc nhóm chức axit, liên kết đôi c = CHj vòng nhóm alcol bậc Trên phổ 'H-NMR nhận biết tín hiệu cộng hưởng proton nhóm methyl gồm có tín hiệu xuất vùng trường cao (õ^ 0,8 - 1,7 ppm), hai tín hiệu cộng hưởng proton nhóm CHj = xuất (ô^ 4,73 4,60 ppm Hai tín hiệu proton nhóm CHjOH xuất dạng doublet-doublet 3,67 3,26 ppm với số tương tác J = 4,5 11,5 Hz Các proton thuộc nhóm methylen methin xuất vùng trường cao dạng multiplet chồng chập lên Dữ kiện phổ hai chiều HSQC cho phép xác định mối liên hệ trực tiếp tín hiệu cacbon proton Phân tích kiện phổ hai chiểu COSY ta nhận thấy mối liên hệ tín hiệu proton 1,75 ppm (H-2) với proton vị trí 1,82 1,65 ppm (H-1 a H-1 b); 3,67 3,26 ppm (H-3a H-3b) Như ta có mảnh phân tửCHj - CH - CHjOH Tín hiệu proton vị trí õ 1,69 ppm (CH ; H-30) liên hệ với hai proton Bảng 3: Dữ liệu phổ M R ả o c Vị trí ỗ£(ppm) ỗ,(ppm ) Vị trí ỗ jp p m ) 6„(ppm ) Vị trí St(ppm) 6,(pp m ) 41,3 1,82(0); 1,65(0) 25.5 2,03;1,66 1,61(0); 1,41(0) 1,75 27,9 2,01(0); 1,40(0) 21 22 37.0 50,8 11 12 31,4 1,26(0) 62,6 3,67; 3,26 13 39,7 2,32(d) 23 26,3 0,9 37,5 57,2 14 59,7 24 33,3 1,00 1,14 15 30,2 1,95(o);l,3(o) 25 19,6 0,88 18,3 1,66;1,31 16 34,0 2,36(0); 1,40(0) 26 17,5 1,03 36,9 1,97(0); 1,41(0) 17 55,9 27 179 40,6 18 51,5 1,63 28 178 43,4 19 46,8 3,07(đd) 29 109 10 47,7 20 150 30 18,7 1,80 1,6 SỐ 2/2011 Nghiên Cứu duợcThóng tín th u õ c 53 BÀI NGHIÊN CỨU vị trí 4,73 ppm (H-29a) 4,60 ppm (H-29b) (liên hệ allỵl), phân tử hợp chất C1 tồn đoạn mảnh CH3 - c = CHj Tương tự, từ kiện phổ COSY ta nhận thấy tồn mảnh - CH2 -C H - ( H - H ;H 1 -H ;H -H ) mảnh - CH^ - CH^ - CH M H22 - H21 - HI 9) Từ kiện ta xác định hợp chất C1 triterpen có hai vòng cạnh Phổ HMBC ghi nhận mối liên hệ tín hiệu cacbon bậc sp2 (õ^ 150; C-20) với tín hiệu proton 3.07 (H-19) Như ta xác định nhóm isopropenyl gắn vào vòng vị trí C-19 Trên phổ HMBC ta nhận thấy mối liên hệ tín hiệu cacbon õ( 37,5 ppm (C4) với proton 1,00 ppm (CH^; H 24) 0,9 ppm (CH3; H-23) 1,75 ppm (CH; H-2) 1,14 (CH; H-5); tín hiệu cacbon ỖC 50,8 (C-2) liên hệ với proton 0,9 (H-23); 1,14 (H-5), ta xác định nhóm CHpH gắn vào vòng vị trí cacbon sỗ vị trí cacbon số có nhóm CH3 Ngoài ra, phổ HMBC ta nhận thấy mối liên hệ tín hiệu cacbon nhóm cacbony 179,34 với tín hiệu proton vị trí ÔH 2,32 (H-13) 1,95 (H-15a); tín hiệu cacbon ÕC 178,59 với tín hiệu proton vị trí ÔH 1,63 (H-18), ÕH 1,26 (H-22) 1,40 (H-16b) Như ta xác định hai nhóm chức acid gắn vào vòng vị trícacbonsố 14 17 Ta xác định mối liên hệ HMBC tín hiệu cacbon õ( 47,7 (C-10) với tín hiệu proton nhóm CH3 0,88 (H-25); 40,6 với tín hiệu proton ^ 1.03; có hai nhóm CH3 gắn vào vong vị trí cacbon số 10 Kết hợp tham khảo số tài liệu [4], [5] xác định hợp chất C1 có cấu trúc hình Hợp chất lẩn đắu tiên tìm thấy tự nhiên có cấu trúc gắn với cấu trúc Acid Gouanic A B, nên đặt tên C1 Acid Gouanic c Kết luận Từ phân đoạn butanol tách phân đoạn từ dịch chiết methanol phẩn mặt đất Dây đòn gánh, ba hợp chất Acid Gouanic A (1), Acid Ceanothenic (2), Acid Gouanic c (3) phân lập Hợp chất C1 lần tìm thấy tự nhiên có cấu trúc gẩn với cấu trúc Acid Gouanic A B, nên đặt tên Acid Gouanic c Cấu trúc hóa học chúng xác định phương pháp phổ 1D-, 2D-NMR, phổ khối lượng so sánh với liệu phổ công bố Cả hợp chất lẩn đẩu tiên phân lập từ Dây đòn gánh Những kết thu nêu tiền đề gợi mở cho nghiên cứu tương lai SUMMARY From th e n-butanol extract o f th e herba o f th e p la n t Gouania leptostachya DC, three natural com pounds: Acid Gouanic A (1), Acid Ceanothenic (2), Acid Gouanic c (3) were isolated Their chemical structures were id e ntified by co m b in a tio n o f 1D-, 2D- NMR, MS in reference to th e literature All o f these com pounds were isolated fo r th e first tim e from this plant TÀI LIỆUTHAM KHẢO Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, Tập 2, tr 1518 Dược điển Việt Nam III (2002), Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.454-455 Nguyễn Văn Đàn - Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, NXB Y học Hà Nội Giacomelli SR, MaldanerG, Stùckerc, Marasdulo ulmifolia, Planta Med 73(5):499-501 Kennelly EJ, Lewis WH, Winter RE, Johnson Nat.Prod.; 56 (3):402-10 c, Schm idtJ,Wessjohann L, Dalcol II, Morel AF (2007),Triterpenoidsfrom Gouania s, Elvin-Lewis M, Gossling J (1993), Triterpenoid saponins from Gouania lupuloides J ... c u tr c Acid Gouanic A B, nên đặt tên C1 Acid Gouanic c Kết luận Từ phân đoạn butanol tách phân đoạn từ dịch chiết methanol phẩn mặt đất Dây đòn gánh, ba hợp chất Acid Gouanic A (1), Acid Ceanothenic... Acid Ceanothenic (2), Acid Gouanic c (3) phân lập Hợp chất C1 lần tìm thấy tự nhiên c c u tr c gẩn với c u tr c Acid Gouanic A B, nên đặt tên Acid Gouanic c Cấu tr c hóa h c chúng x c định phương... hợp chất C6 Acid Ceanothenic Hợp chất c (Add Gouanic C) Hợp chất C1 phân lập dạng tinh thể màu trắng, tan tố t CH3 OH CHCI3 đun nóng; x c định c u tr c dựa kiện phổ khối lượng phổ c ng hưởng từ